CN106153752A - 一种利用离子液体提取/hplc检测荷叶中荷叶碱的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用离子液体提取/HPLC检测荷花叶中荷叶碱的方法，其包括以下步骤：(1)样品萃取：称取荷叶粉末样品放入带有搅拌子的容器中，加入固液比为1:20～60的离子液体溶液，200～600w微波功率下微波辅助提取2～12min；(2)检测：采用HPLC进行检测，HPLC色谱条件为：采用Kromasil ODS-C18柱，4mm×250mm,5um；流动相为乙腈-水-三乙胺-冰醋酸；流速为0.5～1ml/min；检测波长为270nm；柱温为25℃。该方法简便、快捷、准确，重复性好，适合于荷花叶中荷叶碱的含量测定。

Description

一种利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法

技术领域

本发明涉及中药材活性成分检测领域，尤其涉及一种利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法。

背景技术

荷叶为多年生水生草本睡莲科植物莲的叶，上表面深绿色或黄绿色，较粗糙；下表面淡灰棕色，较光滑，有粗脉21至22条，处中心向四周射出，中心有突起的叶西峡钱基。我国荷叶资源丰富，除青海、西藏外，各地均有分布，以长江、黄河和珠江等三大流域分布最广。中医学认为，荷叶性味苦涩性平，归肝、脾、胃、心经，有清暑利湿、升发清阳、凉血止血等功效，用于暑热烦渴，暑湿泄泻，脾虚泄泻，血热鼻屺，便血便漏。现代药理研究证明荷叶的浸剂或煎剂能直接扩展血管、抑制高胆固醇血症和动脉粥样硬化从而具有降压、降脂减肥、抗心率失常等多种生理功能。

生物碱是一类天然的有机化合物，是一类除蛋白质、肽类、氨基酸及维生素B以外的存在于生物体内的含有氮碱基的环状化合物，能与酸结合成盐。大多数生物碱为无色结晶形固体，不溶于水，但与酸结合后易溶于水，有明显的熔点和旋光性，苦味，挥发性不强。荷叶含有莲碱(Roemerine)、原荷叶碱(Pronuciferine)和荷叶碱(Nuciferine)等多种生物碱及维生素。其中，荷叶碱是一种阿朴啡型生物碱(如下式所示)，为荷叶中的主要降脂活性成分，能促进脂肪的分解，同时具有利尿通便、通肠毒、降脂除油、清暑解热等作用，能明显降低血清中甘油三醇和胆固醇含量，具有调节血脂的保健作用，能够降血脂作用、抗自由基、抑制高胆固醇血症和动脉硬化等药疗、食疗功效，而且还具有抗有丝分裂的作用，有较强的抑菌效果，现代医学广泛应用于肥胖症和高血压症，是开发天然、特效、安全减肥药品和减肥食品最具潜力的天然产物之一。

传统方法以有机试剂为溶剂采用加热回流、索氏提取、超声提取等方法来提取荷叶 中的荷叶碱，传统方法需要较高的温度和相当长的提取时间才能达到提取荷叶碱的目的，而较高的温度或者长时间的提取可能导致目标产物分解，使提取率降低。离子液体是由一种含氮杂环的有机阳离子和一种无机阴离子组成的盐，在室温或室温附近温度下呈液态，与传统的有机溶剂和电解质相比，离子液体具有以下优点：几乎没有蒸汽压、不挥发、无色、无味；有较大的稳定温度范围，较好的化学稳定性及较宽的电化学稳定点位窗口；通过阴阳离子的设计可调节其对无机物、水、有机物及聚合物的溶解性，并且其酸度可调至超酸。利用离子液体的上述优点，对现有的荷叶碱提取方法进行改进，从而形成一套完善的荷叶中荷叶碱提取、检测方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种荷叶碱提取率较高、检测结果准确且稳定性较高的利用离子液体提取/HPLC检测荷花叶中荷叶碱的方法。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品萃取：称取荷叶粉末样品放入带有搅拌子的容器中，加入固液比为1:20～60的离子液体溶液，200～600w微波功率下微波辅助提取2～12min；

(2)检测：采用HPLC进行检测，HPLC色谱条件为：采用Kromasil ODS-C18柱，4mm×250mm,5um；流动相为乙腈-水-三乙胺-冰醋酸；流速为0.5～1ml/min；检测波长为270nm；柱温为25℃。

离子液体是由一种含氮杂环的有机阳离子和一种无机阴离子组成的盐，在室温或室温附近温度下呈液态，又称为温室离子液体、室温熔融盐、有机离子液体等，本发明中所述离子液体溶液由体积比为1:1～9的离子液体和甲醇混合而成，所述离子液体为[Bmin]Br(溴化3-甲基-1-丁基咪唑)、[Bmim]BF₄(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐)、[Bmim]PF₆(1-丁基-3-甲基咪唑六氟硼酸盐)、[Hmim]PF₆(1-已基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐)、[Dmim]PF₆(1-癸基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐)中的至少一种。

与甲醇做萃取溶液相比，离子液体的加入明显影响荷叶中荷叶碱的萃取效果，但影响的大小与离子液体的种类有关。离子液体溶液所具有的强萃取能力与其自身的性质有关，一方面，离子液体具有多种分子作用力和强的溶解能力，尤其是氢键作用力、极性作用力、离子电荷作用力等，这些作用有助于荷叶碱在离子液体溶液中溶解，从而使荷叶碱从荷叶中能有效地被萃取出来；另一方面，离子液体是由有机阳离子和有机或无机阴离子组成的有机盐，对微波具有强的吸收和转化能力团，能有效提高离子液体溶液对微波的吸收和转化，使溶剂和样品迅速升温，所以能够快速萃取出荷叶中荷叶碱，因此作为优选，所述离子液体溶液中的离子液体为[Bmim]BF₄，该[Bmim]BF₄与甲醇的体积 比为1:9。

作为优选，所述步骤(1)中荷叶粉末样品与离子液体溶液的固液比为1:30。

作为优选，所述步骤(1)中微波功率为400w，提取时间为10min，提取温度为60℃。

作为优选，所述步骤(2)中的流动相中乙腈-水-三乙胺-冰醋酸的体积比为56:44:1:0.5，流速为1ml/min。

与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明中利用离子液体与甲醇混合形成离子液体溶液作为萃取剂，结合微波辅助提取，避免了现有的荷花叶荷叶碱提取中目标产物分解、提取率较低的问题，从而获得满意的提取率，结合HPLC检测技术，使得荷花叶中荷叶碱含量在5.00～70.00ug×ml-1的范围内呈良好的线性关系，加标回收率在92.3％到102.7％之间，相对标准偏差小于11％，该方法简便、快捷、准确，重复性好，适合于荷叶中荷叶碱的含量测定。

附图说明

图1为实施例1的1-2中荷叶碱标准曲线图；

图2为实施例2的2-1中不同离子液体溶液对萃取荷花叶中荷叶碱效果的影响；

图3为实施例2的2-1中[Bmim]BF₄离子液体溶液的HPLC图谱；

图4为实施例2的2-2中离子液体浓度对荷花叶中荷叶碱提取率的影响；

图5为实施例2的2-2中[Bmim]BF₄在V_离子液体/V_甲醇(1:9)的HPLC图谱；

图6为实施例2的2-3中不同微波功率对荷花叶中荷叶碱提取率的影响；

图7为实施例2的2-3中微波功率400w时的HPLC图谱；

图8为实施例2的2-4中萃取时间对荷花叶中荷叶碱萃取率的影响；

图9为实施例2的2-4中萃取时间为10min时的HPLC图谱；

图10为实施例2的2-5中液固比对荷叶碱萃取率的影响；

图11为实施例2的2-5中液固比为30时的HPLC图谱；

图12为对比例中回流萃取的HPLC图谱；

图13为对比例中超声萃取的HPLC图谱。

具体实施方式

以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：检测条件

1-1、HPLC色谱条件

HPLC色谱条件为：采用Kromasil ODS-C₁₈柱(4mm×250mm,5um)，流动相为乙腈- 水-三乙胺-冰醋酸(56:44:1:0.5)；流速：1ml×min^-1；检测波长：270nm；柱温：25℃。

1-2、标准曲线的制备

精密量取荷叶碱标准品(中国药检所)10mg，定容在10ml的容量瓶中备用，在分别配置成浓度为0.005mg/ml、0.01mg/ml、0.03mg/ml、0.05mg/ml、0.07mg/ml荷叶碱标准品溶液，采用HPLC法测定荷叶中荷叶碱含量。以峰面积为纵坐标，荷叶碱浓度为横坐标制作标准曲线，荷叶碱标准品浓度及其所对应的峰面积如表1所示。结果显示荷叶碱在5.00-70.00ug×ml^-1的范围内呈良好的线性关系，回归方程为：y＝27935x-18.841，R²＝0.9994，如图1所示。

表1荷叶碱标准品浓度及其所对应的峰面积

实施例2：样品萃取

将干燥的荷叶样品(浙江舟山芝林大药房)粉碎、过20目筛备用；精确称取1.0g荷叶粉末样品置于圆地烧瓶内，接着加入离子液体溶液，放入搅拌子，在60℃下微波辅助提取。

2-1、离子液体种类的选择

采用V_离子液体/V_甲醇(体积比为1:5)的[Bmin]Br、[Bmim]BF₄、[Bmim]PF₆、[Hmim]PF₆、[Dmim]PF₆6种离子液体溶液为萃取溶液，荷叶粉末样品与上述离子液体溶液的固液比为1:30，在微波功率400w下微波辅助提取10min。各离子液体溶液所对应的封面积如表1所示，不同萃取溶液对萃取荷叶中荷叶碱的影响如图2所示。

表2离子液体溶液所对应的封面积

由图2可知，[Bmin]Br、[Bmim]BF₄、[Bmim]PF₆三种离子液体形成的萃取溶液对荷叶碱的萃取率高于甲醇，其中[Bmim]BF₄比另外两种离子液体更显优势，[Hmim]PF₆和甲醇的萃取率相当，[Dmim]PF₆对荷叶碱的提取效果较差，低于其他四种离子液体和甲醇，而[Bmim]BF₄对荷叶碱的提取率高于其他四种离子液体。进一步可以看出，荷叶碱的萃取率与离子液体的阳离子和阴离子有关，其中对于[Bmin]Br、[Bmim]BF₄、[Bmim]PF₆三种离子液体具有相同的阳离子，不同的阴离子得到了不同的萃取率，阴离子影响从大到小的顺序是BF₄ ^->Br^->PF₆ ^-；对于阴离子相同的[Bmim]PF₆、[Hmim]PF₆、[Dmim]PF₆三种离子液体，[Bmim]PF₆对荷叶碱的萃取率略高，这表明阴离子对荷叶碱 萃取率的影响比烷基链长短对荷叶碱的影响要大。

与甲醇做萃取溶液相比，离子液体的加入明显影响荷叶中荷叶碱的萃取效果，并且影响的大小与离子液体的种类有关。离子液体所具有的强萃取能力与其自身的性质有关，一方面，离子液体具有多种分子作用力和强的溶解能力，尤其是氢键作用力、极性作用力、离子电荷作用力等，这些作用有助于荷叶碱在离子液体溶液中溶解，从而使荷叶碱从荷叶中能有效地被萃取出来。另一方面，离子液体是由有机阳离子和有机或无机阴离子组成的有机盐^[，对微波具有强的吸收和转化能力团，能有效提高离子液体溶液对微波的吸收和转化，使溶剂和样品迅速升温，所以能够快速萃取出荷叶中荷叶碱。综上，上述六种离子液体中选择[Bmim]BF₄与甲醇混合而作为萃取溶液，[Bmim]BF₄离子液体溶液的HPLC图谱如图3所示。

2-2、离子液体浓度的选择

分别以V_离子液体/V_甲醇1:1、1:3、1:5、1:7、1:9、1:29的[Bmim]BF₄离子液体溶液为萃取溶液^[21]，以固液比1:30、功率400w、微波辅助提取10min。各离子液体溶液浓度对应的峰面积表3，不同离子液体浓度对荷叶碱萃取率的影响如图4所示。

表3离子液体浓度对应的峰面积

由图4可知，当V_离子液体/V_甲醇从1:1～1:9时，荷叶碱萃取率从0.507％～0.525％变化，萃取率提高了3.6％；当V_离子液体/V_甲醇从1:29～1:9时，荷叶碱萃取率0.505％～0.525％变化，萃取率提高了4％。当V_离子液体/V_甲醇大于1:29时，增加离子液体溶液的浓度，荷叶碱的萃取率减小。

由于离子液体溶液浓度越大，溶液的粘度越大、扩散能力越差，溶解速率越小，并且离子液体更难渗入到荷叶样品基质的内部，因此当离子液体浓度大于1:29时，荷叶碱的萃取率减少。当离子液体浓度小于1:29时，同样荷叶碱萃取率同样降低，因为离子液体能够有效的吸收微波，使溶剂和样品迅速升温，所以能够快速萃取出荷叶中荷叶碱，但是由于离子液体浓度的降低，不能够更有效的吸收微波，因此萃取能力下降。综上，V_离子液体/V_甲醇为1:9时为最佳离子液体浓度，离子液体[Bmim]BF₄在V_离子液体/V_甲醇为1:9时的HPLC图谱如图5所示。

2-3、微波功率的选择

分别以微波功率200w、300w、400w、500w、600w为微波辅助萃取功率，以[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)为萃取溶液，以固液比为1:30、萃取10min。各微波功率所对应的峰面积如表4所示，萃取完毕后各微波功率所对应的萃取液温度(℃)如表5所示，不同微波功率对荷叶萃取率的影响如图6所示。

表4微波功率所对应的峰面积

表5微波功率所对应的萃取液温度

由图6可知，当微波功率从200w增加至400w时，荷叶碱的萃取率从0.45％增加到0.52％，萃取率提高了15.6％，而当微波功率高于400w后，荷叶碱的萃取率开始下降。萃取率随微波功率变化的原因为：微波功率的增大，导致植物细胞分子运动加剧，加速了有效成分的溶解和释放，故提取量增大，但是当微波的功率达到一定程度时，溶解的杂质含量也相应增加，从而使有效成分的溶解量减少，提取量下降。并且，由表5可知，随着微波辐射功率的提高，萃取溶液的温度也随着升高，萃取溶液温度的升高有助于有效物质从样品基质中萃取出来，但功率过高，萃取溶液在短时间内温度迅速升高，温度过高可能导致有效物质分解，并且由于在相同的萃取时间内，功率过低，升温较慢，在萃取过程中满足不了萃取目的，若温度过高，升温较快，将在较短的时间内达到预设的温度，并在萃取过程中长时间保持在较高的温度，时间过长同样会导致有效物质的分解。因此，选择400w为最佳微波萃取功率，微波功率400w的HPLC图谱如图7所示。

2-4、萃取时间的选择

分别选择2min、4min、6min、8min、10min、12min为萃取时间，以微波功率400w照射，以[Bmim]BF₄V_离子液体/V_甲醇(1:9)为萃取溶液，在固液比为1:30、萃取10min条件下进行检测。各时间所对应的峰面积如表6所示，不同萃取时间对荷叶碱萃取率的影响如图8所示。

表6时间所对应的峰面积

对萃取时间而言，由于微波技术加热的快速高效，一般10min内能萃取完样品中的目标物。本实施例中，如图8所示，当2min～10min时，荷叶碱萃取率不断增加，萃取率从0.481％增加到0.52％，10min比2min增加了8.1％；当时间超过10min后，荷叶碱萃取率下降，萃取率从0.52％下降到0.514％，12min比10min下降了1.2％。因此在60℃下萃取10min，荷叶碱萃取率最大，原因在于：时间过短，则萃取不完全，时间过长，荷叶碱 将可能被降解。综上所述，萃取时间10min为最佳萃取时间，萃取时间10min的HPLC图谱如图9所示。

2-5、荷叶粉末样品与萃取溶液的液固比选择

分别以液固比20、30、40、50、60(即固液比1:20、1:30、1:40、1:50、1:60)的[Bmim]BF₄为萃取溶液，以微波功率400w、萃取时间10min、V_离子液体/V_甲醇(1:9)辅助萃取。各液固比所对应的峰面积如表7所示，不同液固比对荷叶碱萃取率的影响如图10所示。

表7液固比所对应的峰面积

由图10可知，当液固比从20增加到30时，荷叶碱萃取率从0.457％增加到0.524％，增加了14.7％；当液固比再增加时，萃取率不再增加。对于液固比而言，液固比越小，样品与[Bmim]BF₄溶液接触越充分，越容易扩散，萃取液就越完全。当液固比增加到一定程度后，萃取率的增加很小，是因为溶剂已将有效物质充分提取，再增加萃取溶剂以无法增加有效物质的萃取率。并且在微波辅助萃取中，液固比过大不利于有效物质萃取率的提高，这是因为在一定的萃取时间内，萃取溶液体积过大，萃取溶液的温度不能达到充分萃取有效物质的目的，液固比为30时的HPLC图谱如图11所示。

综上，由实施例2获得最佳萃取条件如下：V_离子液体/V_甲醇(1:9)的[Bmim]BF₄离子液体为萃取溶液、微波功率400w、微波萃取10min、液固比为30、温度设定60℃。

实施例3：回收率和精密度

在上述最佳萃取条件下，萃取荷叶叶中的荷叶碱，在室温下保留一个星期，进行日间精密和日内精密度度实验。在6天内每隔两天测试一次，一次重复测定3次；在13小时内每隔4小时测定一次，一次重复测定3次。实验结果表明，2天内测定的峰面积的标准偏差小于3.5％，4小时内测定的峰面积的标准偏差小于1.8％，表明精密度良好，是可靠的，稳定的。结果如表8所示，在三个水平下其回收率在92.3％到102.7％之间，相对标准偏差小于11％。结果表明，本发明中的利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法是准确和可靠的。

表8荷叶碱回收率实验

对比例：微波萃取与常规萃取技术的比较

以V_离子液体/V_甲醇(1:9)的[Bmim]BF₄离子液体溶液为萃取溶剂，对应用微波萃取技术、超声萃取技术和回流萃取技术萃取荷叶碱进行对比，结果如表9所示。

表9微波萃取和常规萃取技术的比较

由表9可知，与回流萃取和超声萃取相比，利用微波萃取可在较短时间内达到较高的萃取率。回流萃取120min的萃取率与超声萃取30min的萃取率相似，高于超声萃取4.2％，高于回流萃取11.1％，其原因与微波萃取的特殊基质有关。微波技术是采用“体加热”方式快速加热溶剂和样品基质，而回流萃取是通过热传导的方式首先加热溶剂，再通过溶剂实现对样品的加热，需要一段时间才能升到萃取所需的温度，所以回流萃取需要较长的萃取时间才能有效萃取出目标化合物。回流萃取的HPLC如图12所示，超声萃取的HPLC如图13所示。

Claims (6)

1.一种利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)样品萃取：称取荷叶粉末样品放入带有搅拌子的容器中，加入固液比为1:20～60的离子液体溶液，200～600w微波功率下微波辅助提取2～12min；

(2)检测：采用HPLC进行检测，HPLC色谱条件为：采用Kromasil ODS-C18柱，4mm×250mm,5um；流动相为乙腈-水-三乙胺-冰醋酸；流速为0.5～1ml/min；检测波长为270nm；柱温为25℃。

2.如权利要求1所述的利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于，所述离子液体溶液由体积比为1:1～9的离子液体和甲醇混合而成，所述离子液体为[Bmin]Br、[Bmim]BF₄、[Bmim]PF₆、[Hmim]PF₆、[Dmim]PF₆中的至少一种。

3.如权利要求2所述的离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于，所述离子液体溶液中的离子液体为[Bmim]BF₄，该[Bmim]BF₄与甲醇的体积比为1:9。

4.如权利要求1或2或3所述的利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于，所述步骤(1)中荷叶粉末样品与离子液体溶液的固液比为1:30。

5.如权利要求1或2或3所述的利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于，所述步骤(1)中微波功率为400w，提取时间为10min，提取温度为60℃。

6.如权利要求1或2或3所述的利用离子液体提取/HPLC检测荷叶中荷叶碱的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的流动相中乙腈-水-三乙胺-冰醋酸的体积比为56:44:1:0.5，流速为1ml/min。