CN107607656B - 溴氰虫酰胺及代谢物j9z38在鱼肉中的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法，包括：提取，净化，测定，进行添加回收率试验，得到溴氰虫酰胺和J9Z38的添加回收率和相对标准偏差(RSDs)；检出溴氰虫酰胺和J9Z38的最小检出量；得出溴氰虫酰胺、J9Z38在鱼肉中的最低检测浓度。本发明建立了鱼肉中溴氰虫酰胺及其代谢物J9Z38的分析检测方法；采用乙腈提取，正己烷除去鱼肉中脂肪等杂质，净化分离效果好，本方法的前处理过程相对简单，回收率高，重复性好，净化分离效果好，而且最低检测浓度比较低，适合于溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的分析检测。

Description

溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法

技术领域

本发明涉及农药检测，尤其涉及溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法。

背景技术

溴氰虫酰胺(Cyantraniliprole)是杜邦公司继氯虫苯甲酰胺后的另一个新型邻氨基苯甲酰胺类杀虫剂。它具有高效、低毒、作用机制新颖、对非靶标生物安全、对现有杀虫剂无交互抗性等特点。溴氰虫酰胺尤其对刺吸式口器害虫具有优异的防效，具有广阔的应用前景，引起人们的广泛关注。

溴氰虫酰胺的化学名称为3-溴-1-(3-氯-2-吡啶基)-N-{4-氰基-2-甲基-6-[(甲基氨基)羰基]苯基}-1H-吡唑-5-甲酰胺；化学结构式为

分子式C₁₉H₁₄BrClN₆O₂，分子量473.7。溴氰虫酰胺为白色粉末，熔点168～173℃，相对密度(20℃)1.387g/cm³，不易挥发。水中溶解度(20℃)0～20mg/L，其他溶剂中的溶解度，2.383g/L(甲醇)，5.965g/L(丙酮)、0.576g/L(甲苯)、5.338g/L(二氯甲烷)，1.728g/L(乙腈)。

溴氰虫酰胺在植物体和动物体中的典型代谢物为J9Z38，结构式为：

分子式为C₁₉H₁₂BrClN₆O，分子量457。

目前，有关溴氰虫酰胺检测方法的报道有：溴氰虫酰胺在谷物(水稻、小麦、玉米)、蔬菜(黄瓜、番茄、小白菜、辣椒、豇豆、生菜)、水果(苹果、葡萄、柑橘)等植物源农产品、土壤和水中的检测方法。但是关于溴氰虫酰胺和代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法，能够对鱼肉中溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38进行检测，满足农药残留分析中对准确度、精密度和灵敏度的要求。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是：一种溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法，包括以下步骤：

(1)提取：称取鱼肉样品2g，置于50mL离心管中，加入提取液即2mL0.1％甲酸水和20mL乙腈，在6000rpm条件下匀浆30s，加入1g无水乙酸钠和2g无水硫酸镁，剧烈摇动30s，在4000rpm条件下离心5min；

(2)净化：移取离心管中提取液10mL置于分液漏斗中，第一次加入30mL净化液正己烷，剧烈摇动1min，静置20min，待分液漏斗中液体分层后，弃去上层净化液，分液漏斗中第二次加入30mL净化液正己烷，剧烈摇动1min，静置20min，待分液漏斗中液体分层后，弃去上层净化液，收集分液漏斗中的提取液于平底烧瓶中，在40℃条件下浓缩干，定容至5mL，过0.22μm有机针式滤器，待测定；

(3)测定：配制0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/L的溴氰虫酰胺和J9Z38标准溶液，分别进样1μL，获得UPLC-MS/MS的响应值，以浓度-峰面积绘制溴氰虫酰胺标准溶液曲线、J9Z38标准溶液曲线；

(4)设定溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中添加浓度为0.02、0.1和10.0mg/kg时，进行添加回收率试验，分别得到溴氰虫酰胺和J9Z38的添加回收率和相对标准偏差(RSDs)；

(5)采用超高效液相色谱串联质谱仪检出溴氰虫酰胺和J9Z38的最小检出量；

(6)根据溴氰虫酰胺和J9Z38在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，以及鱼肉中溴氰虫酰胺和J9Z38按最低添加浓度添加的样品在仪器上响应值均大于仪器的3倍信号噪音比，得出溴氰虫酰胺、J9Z38在鱼肉中的最低检测浓度。

超高效液相色谱条件是：

色谱柱：Waters acquity

BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；

流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液＝80/20；

流速：0.2mL/min；

柱温：40℃；

进样量：1μL；

质谱条件是：

离子源：ESI⁺；

定量模式：MRM模式；

毛细管电压：4.0KV；

雾化气流量：3.0L/min；

加热气流量：10.0L/min；

Interface温度：300℃；

DL温度：250℃；

Heat Block温度：400℃；

干燥气流量：10L/min；

溴氰虫酰胺定量离子对：475.10>286.00，定性离子对：475.10>444.10；

J9Z38定量离子对：456.80>188.00；定性离子：456.80>299.00。

本发明的有益效果是：本发明建立了鱼肉中溴氰虫酰胺及其代谢物J9Z38的分析检测方法；采用乙腈提取，正己烷除去鱼肉中脂肪等杂质，净化分离效果好(发明的核心)，本方法的前处理过程相对简单，回收率高，重复性好，净化分离效果好，而且最低检测浓度比较低，适合于溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的分析检测。

附图说明

图1是溴氰虫酰胺和J9Z38的添加回收率和相对标准偏差。

图2是溴氰虫酰胺的标准曲线图。

图3是J9Z38的标准曲线图。

图4是溴氰虫酰胺(0.2mg/L)、J9Z38(0.2mg/L)标准溶液色谱图。

具体实施方式

本发明公开了一种溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法，该方法所采用到的主要仪器和化学试剂有：

超高效液相色谱串联质谱仪UPLC-MS/MS(超高效液相色谱仪型号为LC-30AD，质谱仪型号为LCMS-8050，岛津公司)、

SPS 402F型电子天平：(梅特勒－托利多(常州)测量技术有限公司)、

IKA T18型分散器(德国IKA实验室)、

TD5A-WS型台式大容量低速离心机(金南仪器制造有限公司)、

R-201型旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公司)、

HH-4型恒温水浴锅(江苏金坛市江南仪器厂)、

SHZ-D(Ⅲ)型循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)、

TYZD-ⅡA型振荡器(姜堰市天仪电子仪器有限公司)

甲醇(分析纯500mL，天津市大茂化学试剂厂)、

丙酮(分析纯500mL，上海凌峰化学试剂有限公司)、

乙腈(分析纯500mL，上海凌峰化学试剂有限公司)、

无水乙酸钠(分析纯500g，温州市化学用料厂)、

无水硫酸镁(分析纯500g，天津市福晨化学试剂厂)、

正己烷(分析纯500mL，国药集团化学试剂有限公司)、

Cleanert MAS-Q净化管(2mL，C₁₈ 50mg，PSA 50mg，PC 50mg，MgSO₄150mg，型号为MS-9PP0250，天津博纳艾杰尔科技有限公司)、

Cleanert NANO CARB净化管(150mg/1mL，型号为IC-NN1510-S，天津博纳艾杰尔科技有限公司)、

Cleanert C₁₈-N-SPE小柱(500mg/6mL，型号为185006-N，天津博纳艾杰尔科技有限公司)、

Cleanert NH₂-SPE小柱(500mg/6mL，型号为NH5006，天津博纳艾杰尔科技有限公司)、

乙腈(色谱纯4L，默克股份两合公司)、

甲酸(色谱纯500mL，美国ROE Scientific Inc)、

有机针式滤器(0.22μm，型号为TQP-61322,天源科技公司)、

注射器(2mL，常州悦康医疗器材有限公司)。

其中，仪器的条件是：

超高效液相色谱条件：

色谱柱：Waters acquity

BEH C18(1.7μm，2.1×100mm)；

流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液＝80/20；

流速：0.2mL/min；

柱温：40℃；

进样量：1μL。

质谱条件：

离子源：ESI⁺；

定量模式：MRM模式；

毛细管电压：4.0KV；

雾化气流量：3.0L/min；

加热气流量：10.0L/min；

Interface温度：300℃；

DL温度：250℃；

Heat Block温度：400℃；

干燥气流量：10L/min；

溴氰虫酰胺定量离子对：475.10>286.00，定性离子对：475.10>444.10；

J9Z38定量离子对：456.80>188.00；定性离子：456.80>299.00。

本发明的具体检测操作如下：

提取：称取样品2g(精确至0.01g)置于50mL离心管中，加入2mL 0.1％甲酸水和20mL分析纯乙腈，在6000rpm条件下匀浆(IKA T18型分散器)30s。加入1g无水乙酸钠和2g无水硫酸镁，剧烈摇动30s。在4000rpm条件下离心(TD5A-WS型台式大容量低速离心机)5min。

甲醇振荡提取、乙酸乙酯振荡提取、乙腈振荡提取、乙腈匀浆均可以作为本发明的提取液，但4种提取液的提取效率有所差异，甲醇振荡提取溴氰虫酰胺和J9Z38的提取率分别为6％和11％，提取率达不到要求。乙酸乙酯振荡提取溴氰虫酰胺和J9Z38的提取率分别为66％和64％，提取率达不到要求。乙腈振荡提取溴氰虫酰胺和J9Z38的提取率分别为66％和93％，提取率达不到要求。乙腈匀浆提取溴氰虫酰胺和J9Z38的提取率为85％和86％，提取率能够达到要求。综合考虑提取率、提取时间等因素，乙腈匀浆提取为最优提取条件，因此，确定乙腈匀浆提取作为溴氰虫酰胺和J9Z38在鱼肉中的提取方法。

净化：准确移取离心管中乙腈10mL置于分液漏斗中，第一次加入30mL正己烷，剧烈摇动1min，静置20min。待分液漏斗中液体分层后，弃去上层正己烷。分液漏斗中第二次加入30mL正己烷，剧烈摇动1min，静置20min。待分液漏斗中液体分层后，弃去上层正己烷，收集分液漏斗中的乙腈于平底烧瓶中，在40℃条件下浓缩干(R-201型旋转蒸发器)，用色谱纯乙腈定容至5mL，过0.22μm有机针式滤器(型号为TQP-61322)，待测定。

在选定净化液时，对比Cleanert MAS-Q净化管(2mL，PSA 50mg，C₁₈ 50mg，MgSO₄150mg)、Cleanert MAS-Q净化管(2mL，PSA 50mg，C₁₈ 50mg，PC 8mg，MgSO₄ 150mg)、CleanertMAS-Q净化管(2mL，PSA 50mg，C₁₈ 50mg，PC 50mg，MgSO₄ 150mg)、正己烷液液分配等4种净化条件对鱼肉中溴氰虫酰胺和J9Z38净化效果的影响。结果表明，经过MS-9PA0203型CleanertMAS-Q净化管(2mL，PSA 50mg，C₁₈ 50mg，MgSO₄ 150mg)净化后，溴氰虫酰胺和J9Z38的回收率分别为60％和97％，回收率达不到要求。经过MS-9PP0265型Cleanert MAS-Q净化管(2mL，PSA 50mg，C₁₈ 50mg，PC 8mg，MgSO₄ 150mg)净化后，溴氰虫酰胺和J9Z38的回收率分别为60％和73％，回收率达不到要求。经过MS-9PP0250型Cleanert MAS-Q净化管(2mL，PSA50mg，C₁₈ 50mg，PC 50mg，MgSO₄ 150mg)净化后，溴氰虫酰胺和J9Z38的回收率分别为6％和2％，回收率达不到要求。经过正己烷液液分配净化后，溴氰虫酰胺和J9Z38的回收率分别为110％和102％，回收率能够达到要求；而且净化后液体为无色，去除杂质的效果很好。综合考虑回收率、去除杂质效果和操作过程等因素，正己烷液液分配为最优净化条件，因此，确定正己烷液液分配作为溴氰虫酰胺和J9Z38在鱼肉中的净化方法。

用色谱纯乙腈配制0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/L的溴氰虫酰胺和J9Z38标准溶液，分别进样1μL，获得UPLC-MS/MS的响应值，以浓度-峰面积绘制溴氰虫酰胺标准溶液曲线，见图2，其回归方程为y＝9835407.97x+24039.88(R²＝0.9999)；J9Z38标准溶液曲线，见图3，其回归方程为y＝1601429.98x+2065.58(R²＝1.0000)。

根据溴氰虫酰胺、J9Z38在超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)上的响应情况，溴氰虫酰胺、J9Z38在鱼肉样品中设定了3档添加浓度(0.02、0.1和10mg/kg)，每档添加浓度设5个重复。

按上述提取、净化及测定步骤，进行添加回收率试验。得到鱼肉样品中溴氰虫酰胺、J9Z38的添加回收率和相对标准偏差(RSDs)，见图1。

由图1可知，溴氰虫酰胺在鱼肉中添加浓度为0.02、0.1和10.0mg/kg时，平均回收率分别为107％、102％和96％，相对标准偏差分别为3.7％、3.5％和3.6％。J9Z38在鱼肉中添加浓度为0.02、0.1和10.0mg/kg时，平均回收率分别为93％、88％和93％，相对标准偏差分别为3.1％、4.0％和5.3％。

超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)对溴氰虫酰胺、J9Z38的最小检出量均为5×10^-12g。

根据溴氰虫酰胺、J9Z38在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，以及鱼肉中溴氰虫酰胺、J9Z38最低添加浓度0.02mg/kg的样品在仪器上响应值均大于仪器的3倍信号噪音比，得出：溴氰虫酰胺、J9Z38在鱼肉中的最低检测浓度均为0.02mg/kg。

本发明建立了鱼肉中溴氰虫酰胺及其代谢物J9Z38的分析检测方法。本发明的溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在0.005～1.0mg/L浓度范围内呈良好的线性关系；溴氰虫酰胺在鱼肉中平均回收率为96％～107％，相对标准偏差为3.5％～3.7％。J9Z38在鱼肉中平均回收率为88％～93％，相对标准偏差为3.1％～5.3％，溴氰虫酰胺、J9Z38在鱼肉中的最低检测浓度均为0.02mg/kg，本发明操作简便，准确可靠、可满足农药残留分析的要求，并可用于大量样品的快速检测。

Claims (1)

1.溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中的检测方法，其特征是，包括以下步骤：

(1)提取：称取鱼肉样品2g，置于50mL离心管中，加入提取液即2mL0.1％甲酸水和20mL乙腈，在6000rpm条件下匀浆30s，加入1g无水乙酸钠和2g无水硫酸镁，剧烈摇动30s，在4000rpm条件下离心5min；

(2)净化：移取离心管中提取液10mL置于分液漏斗中，第一次加入30mL净化液正己烷，剧烈摇动1min，静置20min，待分液漏斗中液体分层后，弃去上层净化液，分液漏斗中第二次加入30mL净化液正己烷，剧烈摇动1min，静置20min，待分液漏斗中液体分层后，弃去上层净化液，收集分液漏斗中的提取液于平底烧瓶中，在40℃条件下浓缩干，定容至5mL，过0.22μm有机针式滤器，待测定；

(3)测定：配制0.005、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0mg/L的溴氰虫酰胺和J9Z38标准溶液，分别进样1μL，获得UPLC-MS/MS的响应值，以浓度-峰面积绘制溴氰虫酰胺标准溶液曲线、J9Z38标准溶液曲线；

(4)设定溴氰虫酰胺及代谢物J9Z38在鱼肉中添加浓度为0.01、0.2和10.0mg/kg，进行添加回收率试验，分别得到溴氰虫酰胺和J9Z38的添加回收率和相对标准偏差RSDs；

(5)采用超高效液相色谱串联质谱仪检出溴氰虫酰胺和J9Z38的最小检出量；

(6)根据溴氰虫酰胺和J9Z38在超高效液相色谱串联质谱仪上的响应情况，以及鱼肉中溴氰虫酰胺和J9Z38按最低添加浓度添加的样品在仪器上响应值均大于仪器的3倍信号噪音比，得出溴氰虫酰胺、J9Z38在鱼肉中的最低检测浓度；

所述超高效液相色谱串联质谱仪的色谱条件是：

色谱柱：Waters acquity

BEH C18 1.7μm，2.1×100mm；

流动相：乙腈/0.1％甲酸水溶液＝80/20；

流速：0.2mL/min；

柱温：40℃；

进样量：1μL；

所述超高效液相色谱串联质谱仪的质谱条件是：

离子源：ESI⁺；

定量模式：MRM模式；

毛细管电压：4.0KV；

雾化气流量：3.0L/min；

加热气流量：10.0L/min；

Interface温度：300℃；

DL温度：250℃；

Heat Block温度：400℃；

干燥气流量：10L/min；

溴氰虫酰胺定量离子对：475.10>286.00，定性离子对：475.10>444.10；

J9Z38定量离子对：456.80>188.00；定性离子：456.80>299.00。

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