CN105717211A - 一种氟唑菌苯胺残留量的gc-ms/ms测定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氟唑菌苯胺残留量的GC?MS/MS测定方法，该方法主要用于测定粮谷、动物源性食品等复杂基质食品农产品中残留的氟唑菌苯胺含量的方法。用乙腈或含1%乙酸的乙腈溶液均质提取样品中残留的氟唑菌苯胺，C₁₈/PSA固相萃取柱净化浓缩后，气相色谱串联质谱（GC?MS/MS）检测，采用不含待测农药的空白基质溶液建立校正的标准工作曲线，外标法定量。本方法平均回收率为81.0%～89.7%，平均相对标准偏差（RSD）为5.8%～8.8%，检出限低于0.65μg/kg，具有操作简便、快速、去杂效果好、灵敏度高、特征性强、重复性好、定性定量准确的优点。能满足美国、欧盟、日本等国家对相应产品安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

Description

一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法

技术领域

本发明涉及一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，更具体地说是采用气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)定性定量测定粮谷、猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉等动物肌肉及制品等复杂基质的动植物源性食品中残留的氟唑菌苯胺含量的方法，属于农药残留量的测定技术领域。

背景技术

氟唑菌苯胺是由巴斯夫公司开发的琥珀酸脱氢酶抑制剂类杀菌剂，通用名：penflufen；试验代号：BYF14182；化学名称：N-[2-(1,3-二甲基丁基)苯基]-5-氟-1,3-二甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺；外观：灰白色粉末状固体；熔点：111℃；沸点：沸点前分解；分解温度：320℃；蒸气压：1.2×10^-6Pa(25℃)；分配系数：Kow logP＝3.3(20℃，pH＝7)；亨利常数：1.05×10^-5Pa·m³·mol-1(25℃)。溶解度：在水中的溶解度为10.9mg/L(20℃)；在正己烷中的溶解度为1.6g/L，甲苯中为62g/L，丙酮中为139g/L，甲醇中为126g/L，乙酸乙酯中为96g/L，二甲亚砜中为162g/L(以上均为20℃)；CAS登录号：494793-67-8。相对分子质量317.41；分子式C₁₈H₂₄FN₃O，化学结构式为：

氟唑菌苯胺是拜耳公司开发的又一个吡唑酰胺类杀菌剂，于2006年申请专利，主要用于种子处理，对多种植物病原真菌具有良好活性。该杀菌剂为琥珀酸脱氢酶(SDH)抑制剂，主要作用于呼吸链电子传递复合体Ⅱ，阻断能量代谢。经过处理后的种子在萌发过程中可以吸收氟唑菌苯胺，并通过木质部传导到植物体的其他部位，从而起到保护作物的作用。氟唑菌苯胺是一个种子处理杀菌剂，用于马铃薯、玉米、水稻、棉花、小麦、大麦、苜蓿、蔬菜、豆类以及油菜等种子，可以防治种传、土传的担子菌和子囊菌病害，主要有丝核菌(Rhizoctonia spp.)和黑粉菌素(Ustilago spp.)等引起的马铃薯黑痣病、小麦纹枯病、水稻纹枯病、油菜菌核病、小麦散黑穗病、小麦腥黑穗病、玉米小斑病等病害。可与丙硫菌唑、甲霜灵、噻虫胺、肟菌酯等复配，不仅可以防治病虫害，还可以延缓抗性产生与发展。氟唑菌苯胺于2011年在英国获得首个全球登记，2012年又在美国和加拿大取得其登记批准，在澳大利亚及很多国家获得登记，具有很广阔的应用前景。

随着氟唑菌苯胺的登记、推广和使用，作为我国主要出口市场的美国等国家制定了其在蔬菜、水果、粮谷和畜产品等食品农产品中的最大允许残留量(MRL)，2012年5月14日，美国新增对农药戊苯吡菌胺(Penflufen)的残留限量要求，残留限量要求规定如下：

欧盟、日本等国家规定若田间使用农药没有在该国家登记，没有制定相应的残留限量标准时，出口至其国家的食品农产品包括畜禽肉等动物源性食品中残留限量均实行0.01mg/L的“一律标准”。

现阶段，对氟唑菌苯胺残留量测定方法的研究较少，报道的检测方法主要为蔬菜和水果中氟唑菌苯胺残留检测方法，这些检测方法均采用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)测定蔬菜和水果中氟唑菌苯胺残留量的检测方法，使用LC-MS/MS测定食品农产品中农药残留具有快速、简便、灵敏度高等优点，但由于其价格较昂贵，很多检测机构、企业或科研院所未配置该仪器或配置台数较少，由于不同的化合物采用LC-MS/MS检测时，需使用不同的流动相或色谱柱，这样需要不断更换色谱柱、流动相并耗费比较长的时间对系统进行平衡，这一定程度上制约了LC-MS/MS的应用。使用气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)分析食品农产品中农药残留具有快速、简便、灵敏度高、选择性强等优点，可实现几百种农药的多残留分析，但迄今为止未见食品农产品中氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS检测方法的报道，由于粮谷、动物源性食品等食品农产品基质比较复杂，须建立净化效果良好的样品前处理方法和仪器分析条件才能满足检测要求，因此，建立气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)定性和定量分析粮谷和动物源性食品中氟唑菌苯胺残留量的检测方法具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，主要用于测定粮谷、动物源性食品等复杂基质食品农产品中氟唑菌苯胺残留量。

为实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，包括如下步骤：

(1)提取

称取混匀样品于具塞离心管中，加入适量水复苏后，定量加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质或振荡超声提取，然后加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，剧烈涡旋1min后离心。

(2)净化

移取一定体积样品提取液，浓缩至1mL左右，经C₁₈/PSA固相萃取柱净化，乙腈洗脱，收集洗脱液，取部分洗脱液浓缩至干后，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂溶解定容，过膜后，待气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)检测。

(3)标准工作溶液的配制

将不含氟唑菌苯胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理时，得样品提取净化残渣，加入适量溶剂和标准溶液，涡旋混匀，配制成至少3个浓度的氟唑菌苯胺系列标准工作液。

(4)气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)测定

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行GC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入GC-MS/MS进行测定，测得样品液中氟唑菌苯胺的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中氟唑菌苯胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟唑菌苯胺残留量。若上机溶液中氟唑菌苯胺残留量超过线性范围上限，需用定容溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

步骤(1)中样品若为含水量较少的样品，提取前须加适量水充分浸润。

步骤(1)中采用乙腈提取时加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时加入乙酸钠盐析。

步骤(2)中进行C₁₈/PSA固相萃取净化，乙腈洗脱时，洗脱体积为6～8mL。

步骤(4)中气相色谱条件为：色谱柱：HP-5MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；进样口温度250℃；载气：He，不分流模式进样，进样量：1μL；恒流模式，流速1.2mL/min；升温程序：初温60℃保持2min，以每分钟20℃的速度升至200℃，然后以每分钟2℃的速度升至220℃，再以每分钟20℃的速度升至280℃，保持10min；传输线温度：290℃。

步骤(4)中质谱条件为：电离模式：电子轰击电离(EI，70eV)；离子源温度280℃；碰撞气：氩气；多反应监测扫描方式MRM，监测参数为：

步骤(4)中测定样液和基质标准工作溶液时，若样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

本发明的有益效果在于：

本发明利用分散固相萃取技术，建立了简便、快速并能有效避免样品中基质干扰的样品前处理方法，将此前处理方法结合GC-MS/MS应用于粮谷、动物源性食品中氟唑菌苯胺定性确证和定量检测，平均回收率为81.0％～89.7％，平均相对标准偏差(RSD)为5.8％～8.8％，检出限低于0.65μg/kg，具有操作简便、快速、准确、灵敏度高及重复性好的优点。能满足美国、欧盟、日本等国家对相应产品安全检测的技术要求，为保障我国人民食品安全及对外出口贸易健康发展提供有力的技术支撑。

附图说明

图1为添加在空白猪肉基质中的氟唑菌苯胺标液的GC-MS/MS选择离子色谱图。

图2为不含氟唑菌苯胺的猪肉空白样品的GC-MS/MS选择离子色谱图。

图3为以不含氟唑菌苯胺的猪肉空白样品为基质配制的氟唑菌苯胺标准工作曲线。

具体实施方式

现以以下实施实例来说明本发明，但并不是限制本发明的范围。

实施例中使用的仪器与试剂

T18Basic均质器(IKA，Germany)；CR21GⅢ离心机(日立，Japan)；MS3基本型旋涡混合器(IKA，Germany)；TurboVap LV型样品自动浓缩仪(Caliper，USA)；7890N气相色谱-5977C质谱仪(Agilent，USA)；C₁₈/PSA固相萃取柱(6mL，500mg/500mg)购于天津博纳艾杰尔科技有限公司。

试剂

乙腈、丙酮、正己烷(HPLC级，Merke，Germany)；乙酸(HPLC级，CNW，Germany)；无水硫酸镁、氯化钠和乙酸钠为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司。

标准物质：纯度99.5％，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司。

实施例1：小麦中氟唑菌苯胺残留量的检测

(1)样品前处理

提取

称取经充分混匀的5g小麦样品(研磨成面粉)于50mL离心管中，加入20mL水复苏30min后，准确加入20mL含1％乙酸的乙腈溶液，振荡提取20min，超声提取5min，加入3g无水硫酸镁和2g乙酸钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取8mL乙腈提取液于40℃旋蒸或氮气吹至近干，加入1mL乙腈涡旋后，待净化。

净化

用5mL乙腈预洗C₁₈/PSA固相萃取柱，当液面到达吸附剂的顶部时，将上述提取溶液转入柱中，用2mL乙腈洗涤试管，并将洗涤液移入SPE柱中，待溶液达到吸附剂顶部时，加入4mL乙腈至柱子上进行洗脱，洗脱液全部接收到定量试管中，用乙腈定容至10mL，取1mL净化液用氮气吹干后，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂定容至1mL，过0.22μm滤膜后，待GC-MS/MS测定。

(2)标准工作溶液的配制

准确称取25±0.1mg标准品于25mL容量瓶中，用乙腈溶解，定容得1000.0μg/mL标准储备液；移取1.0mL标准储备液置于100mL容量瓶中，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂定容得到10.0μg/mL标准中间液；将不含氟唑菌苯胺的小麦空白样品按上述前处理步骤处理，取8mL空白提取净化液，浓缩至干后，加入8mL体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂涡旋溶解，用该溶液最终配制成1、2、5、10、20、50μg/L基质标准工作溶液。

(3)气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)测定

将不同浓度梯度的标准工作液分别注入GC-MS/MS，以外标法进行氟唑菌苯胺含量的定量分析，即以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线；在相同条件下将样品提取液注入GC-MS/MS进行测定，测得样品液中氟唑菌苯胺的色谱峰面积，代入标准工作曲线，得到样品液中氟唑菌苯胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟唑菌苯胺残留量。

其中色谱条件为：

色谱柱：HP-5MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm。

进样口温度：250.0℃，进样模式：不分流进样，进样量：1μL。

载气：He，恒流模式，流速1.2mL/min。

炉箱升温程序：初温60℃保持2min，以每分钟20℃的速度升至200℃，然后以每分钟2℃的速度升至220℃，再以每分钟20℃的速度升至280℃，保持10min。

传输线温度：290℃。

其中，质谱参数为：

电离模式：电子轰击电离，即EI模式，能量70eV。

离子源温度：280℃；碰撞气：氩气。

扫描方式：多反应监测(SRM)扫描模式；MRM检测参数见表1。

表1：实施例1的MRM检测参数

^*为定量离子对。

定性鉴定：在相同的条件下，如果样液中农药色谱峰保留时间与标准溶液中相应农药保留时间相一致，并且在扣除背景后的样品质谱图中，所选择的离子均出现，而且离子丰度比与标准溶液的离子丰度比相一致，则可判断样液中存在这种农药；若上述两个条件不能同时满足，则判断不含该种农药。

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线如表2。

表2小麦空白基质中氟唑菌苯胺的标准工作曲线

名称	保留时间(min)	回归方程	相关系数
				氟唑菌苯胺	20.15	Y＝30560X-3703.3	0.9995

加标回收率和重复性：

在不含氟唑菌苯胺的小麦中加入10、20和200μg/kg3个浓度水平的氟唑菌苯胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定。将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表3。由表3可以看出，在3个加标水平上，氟唑菌苯胺的平均回收率为85.4％～89.7％，平均相对标准偏差(RSD)为5.8％～8.8％，说明本发明方法的回收率较高，重复性好。

表3氟唑菌苯胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：

将不同浓度的氟唑菌苯胺基质标准工作溶液注入GC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(小麦的浓缩倍数为0.2倍)计算检出限，氟唑菌苯胺的检出限为0.51μg/kg。

实施例2：猪肉中氟唑菌苯胺残留量的检测

(1)样品前处理

提取

称取经充分混匀的5g猪肉样品于50mL离心管中，加入5mL水混匀，放置30min，准确加入20mL乙腈，均质提取2min，加入3g无水硫酸镁和2g氯化钠，涡旋1min后，7000r/min离心5min。离心后，取8mL乙腈提取液于40℃旋蒸或氮气吹至约1mL，待净化。

净化

用5mL乙腈预洗C₁₈/PSA固相萃取柱，当液面到达吸附剂的顶部时，将上述提取溶液转入柱中，用2mL乙腈洗涤试管，并将洗涤液移入SPE柱中，待溶液达到吸附剂顶部时，加入4mL乙腈至柱子上进行洗脱，洗脱液全部接收到定量试管中，用乙腈定容至10mL，取1mL净化液用氮气吹干后，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂定容至1mL，过0.22μm滤膜后，待GC-MS/MS测定。

(2)标准工作溶液的配制

将1000μg/mL标准溶液用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂稀释成10μg/mL标准中间液，将不含氟唑菌苯胺的猪肉空白样品按上述前处理步骤处理，取8mL空白提取净化液，浓缩至干后，加入8mL体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂涡旋溶解，用该溶液最终配制成1、2、5、10、20、50μg/L基质标准工作溶液。

(3)气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)测定

操作步骤、色谱和质谱条件与上述小麦样品中氟唑菌苯胺的测定一致。

定性鉴定：同上述小麦样品中氟唑菌苯胺的测定一致。

线性关系：

以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到标准工作曲线为Y＝34677X+4267.2，相关系数为0.9996。

加标回收率和重复性：

在不含氟唑菌苯胺的猪肉中加入10、20和200μg/kg 3个浓度水平的氟唑菌苯胺标准溶液，待农药添加30min后按上述处理步骤进行残留量测定，将测定浓度与农药理论添加浓度进行比较，得到农药添加回收率，每个添加水平平行测定6次，得其相对标准偏差，测定结果见表4。由表4可以看出，在3个加标水平上，氟唑菌苯胺的平均回收率为81.0％～84.5％，平均相对标准偏差(RSD)为6.1％～6.8％，说明本发明方法的回收率高，重复性好。

表4氟唑菌苯胺的回收率和重复性(n＝6)

检出限：

将不同浓度的氟唑菌苯胺基质标准工作溶液注入GC-MS/MS，以最低浓度基质标准溶液色谱峰的3倍信噪比和样品处理过程的浓缩倍数(猪肉的浓缩倍数为0.2倍)计算检出限，氟唑菌苯胺的检出限为0.65μg/kg。

以上的实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)提取

称取混匀样品于具塞离心管中，加适量水后，加入乙腈或含1％乙酸的乙腈溶液均质或振荡超声提取后，加入氯化钠或乙酸钠中的一种和无水硫酸镁，剧烈涡旋1min后离心；

(2)净化

移取一定体积样品提取液，浓缩至1mL左右，经C₁₈/PSA固相萃取柱净化，乙腈洗脱，收集洗脱液，取部分洗脱液浓缩至干后，用体积比为1/1的丙酮/正己烷混合溶剂溶解定容，过膜后，待气相色谱串联质谱(GC-MS/MS)检测；

(3)标准工作溶液的配制

将不含氟唑菌苯胺的同种类基质空白样品按上述步骤(1)、(2)处理，得样品提取净化残渣，加入适量溶剂和标准溶液，涡旋混匀，配制成至少3个浓度的氟唑菌苯胺系列标准工作液；

(4)测定和结果计算

将步骤(3)中的各浓度梯度的标准工作液进行GC-MS/MS测定，以标准工作液的色谱峰面积对其相应浓度进行回归分析，得到基质标准工作曲线；在相同条件下将步骤(2)中净化后的样品液注入GC-MS/MS进行测定，测得样品液中氟唑菌苯胺的色谱峰面积，代入基质标准工作曲线，得到样品液中氟唑菌苯胺含量，然后根据样品液所代表试样的质量计算得到样品中氟唑菌苯胺残留量；若上机溶液中氟唑菌苯胺残留量超过线性范围上限，需用定容溶剂将上机溶液浓度稀释至线性范围之内。

2.根据权利要求1所述的一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中样品若为含水量较少的样品，提取前须加适量水充分浸润。

3.根据权利要求1所述的一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(1)中采用乙腈提取时需加入氯化钠盐析，采用含1％乙酸的乙腈溶液提取时需加入乙酸钠盐析。

4.根据权利要求1所述的一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(2)中进行C₁₈/PSA固相萃取净化，乙腈洗脱时，洗脱体积为6～8mL。

5.根据权利要求1所述的一种氟唑菌苯胺残留量的GC-MS/MS测定方法，其特征在于，步骤(4)中GC-MS/MS分析条件为：色谱柱：HP-5 MS毛细管色谱柱，柱长30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm；进样口温度250.0℃；载气：He，不分流模式进样，进样量：1μL；恒流模式，流速1.2mL/min；升温程序：初温60℃保持2min，以每分钟20℃的速度升至200℃，然后以每分钟2℃的速度升至220℃，再以每分钟20℃的速度升至280℃，保持10min；传输线温度：290℃；电离模式：电子轰击电离(EI，70eV)；离子源温度280℃；碰撞气：氩气；多反应监测扫描方式MRM，监测参数为：