CN104569267A

CN104569267A - 一种检测啤酒中n-二甲基亚硝胺含量的方法

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Publication number: CN104569267A
Application number: CN201410855709.XA
Authority: CN
Inventors: 吴平谷; 沈向红; 王立媛; 胡争艳
Original assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Current assignee: Zhejiang Center for Disease Control and Prevention
Priority date: 2014-12-31
Filing date: 2014-12-31
Publication date: 2015-04-29
Anticipated expiration: 2034-12-31
Also published as: CN104569267B

Abstract

本发明公开了一种检测啤酒中N-二甲基亚硝胺的方法：取啤酒样品加入D6-N-二甲基亚硝胺内标，加入氯化钠溶解至饱和，然后用二氯甲烷萃取，萃取液浓缩后用环己烷溶解，得溶解液用SILICA/PSA固相萃取柱净化，二氯甲烷洗脱收集，洗脱液定容，取1.0ul进样，用气相色谱-质谱联用仪分析检测，利用内标法建立标准曲线，检测、计算得到啤酒中N-二甲基亚硝胺的含量。本发明采用二氯甲烷提取后进行SILICA/PSA固相萃取净化，有效的除去干扰物质，除去干扰物质能力强。采用气相色谱-低分辨质谱法测定，对仪器的要求低，成本低，方法容易推广应用。本发明实施例验证在增加干扰离子44、73条件下，仍然能准确测定目标物，表明本发明方法定性的可靠性。

Description

一种检测啤酒中N-二甲基亚硝胺含量的方法

(一)技术领域

本发明涉及一种检测啤酒中N-二甲基亚硝胺含量的方法。

(二)背景技术

酒类、肉及鱼类腌制品、豆制品等食品中含有N-二甲胺亚硝基、N-二乙胺亚硝基等等。亚硝胺类化合物有一定的急性毒性、强致癌性，主要引起肝坏死出血，其致癌性更为人们所关注，迄今已发现的亚硝胺有300多种，；其中N-二甲基亚硝胺是极具代表性的物质之一。食物中的亚硝胺的来源如下：(1)腌制时盐中亚硝酸盐的作用，如咸鱼、咸肉等；(2)在加热干燥时，空气中氮气被氧化成氮氧化物的作用，如啤酒、奶粉、豆制品。近年来对于挥发性亚硝胺的检测显示食品和饮料以及肉类、酒类中存在的N-二甲胺亚硝胺在ug/kg或ug/L数量级，所以需要建立一种高灵敏度和高选择性的方法对痕量N-二甲胺亚硝胺进行检测。

啤酒在酿造过程中生成的微量亚硝胺主要为N-二甲基亚硝胺。啤酒在我国消费量大，N-二甲基亚硝胺的存在是对食品安全的潜在危害因子，我国曾规定啤酒中N-二甲基亚硝胺的限量值为3μg/L。对于啤酒中N-二甲基亚硝胺的检测，国家标准GB/T5009.26—2003前处理采用常规液一液萃取法和蒸馏法,该方法作为传统的前处理技术，能较好地完成目标组分的分离,但通常需要多次萃取、长时间蒸馏才能保证回收率，并需要进一步的转移、浓缩，操作较为繁琐，前处理都费时费力，并且溶剂消耗量大。GB/T5009.26—2003规定仪器检测方法有气相色谱热能检测器法、高分辨气质联用法，最新食品安全国家标准《食品中N－亚硝胺类化合物的测定》征求意见稿采用三种方法：第一法为气相色谱－氮化学反光检测器法、第二法为气相色谱-热能分析仪法、第三法为气相色谱高分辨质谱法，这些方法最大缺点就是对仪器的特异性要求高，国内很少有几个检测机构拥有上述仪器,很难推广应用，且仪器成本高，例如高分辨质谱仪价格在几百万，采购成本太高。因此该标准形同虚设，很难被接受。

(三)发明内容

本发明拟建立一种简便的啤酒中N-二甲基亚硝胺前处理方法，然后采用气相色谱低分辨质谱法进行定性与定量分析，实验表明，本方法耗时少，溶剂消耗少，简便、快速、定性定量准确，适合啤酒中N-二甲基亚硝胺的检测。

本发明采用的技术方案是：

一种检测啤酒中N-二甲基亚硝胺含量的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)体积为M mL的啤酒样品加入D6-N-二甲基亚硝胺内标，加入氯化钠溶解至饱和，然后用二氯甲烷萃取，取二氯甲烷萃取液、干燥后用氮气吹气浓缩，所得浓缩液用环己烷溶解，得溶解液；

(2)取SILICA/PSA固相萃取柱，先依次用二氯甲烷、环己烷淋洗活化柱子，然后将步骤(1)的溶解液全部上柱，先用二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，再用二氯甲烷洗脱收集，所得洗脱液用氮气吹至0.5mL,加入1mL甲醇，继续吹至1mL，即为待测样液，取1.0μL进样，用气相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待测样液的总离子流色谱图、N-二甲基亚硝胺的质量色谱图和D6-N-二甲基亚硝胺内标的质量色谱图；N-二甲基亚硝胺的特征离子为42、43、74，其中74为N-二甲基亚硝胺的定量离子；D6-N-二甲基亚硝胺内标的特征离子为46、80，其中80为D6-N-二甲基亚硝胺内标的定量离子；

(3)配制不同浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液，且每种浓度的N-二甲基亚硝胺标准品溶液中均加有相同质量的D6-N-二甲基亚硝胺内标，其中加入的D6-N-二甲基亚硝胺内标质量与步骤(1)加的D6-N-二甲基亚硝胺内标质量相同，用气相色谱-质谱联用仪分析检测，检测条件与待测样液相同，获得标准品溶液的总离子流色谱图和质量色谱图，以N-二甲基亚硝胺的定量离子74色谱峰和D6-N-二甲基亚硝胺内标的定量离子80色谱峰的峰面积为之比为纵坐标，以N-二甲基亚硝胺标准品的浓度与D6-N-二甲基亚硝胺内标的浓度比为横坐标，制作得到N-二甲基亚硝胺标准曲线；根据待测样液中N-二甲基亚硝胺的定量离子74色谱峰和D6-N-二甲基亚硝胺内标的定量离子80色谱峰的峰面积之比，结合标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的含量C，并按以下公式计算得到啤酒样品中N-二甲基亚硝胺的含量X

X＝C*1mL/M mL＝C/M

所述步骤(1)中，所述体积为M mL的啤酒样品加入D6-N-二甲基亚硝胺内标，加D6-N-二甲基亚硝胺内标的用量一般是使啤酒样品中D6-N-二甲基亚硝胺内标的浓度为3～20μg/L。

所述步骤(1)中，啤酒样品在使用前一般需要用超声脱气，去除气泡，这是本领域技术人员公知的。

所述步骤(1)中，二氯甲烷的体积用量一般与啤酒样品的体积比为1～2：1，优选1.5：1。

所述步骤(1)中，浓缩液一般为0.01～0.1mL，用1mL的环己烷溶解。

所述步骤(2)中，先依次用二氯甲烷、环己烷淋洗活化柱子，二氯甲烷的体积用量一般以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g，环己烷的体积用量一般以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g。

溶解液全部上柱后，先用二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂的体积用量一般以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g。

所述步骤(2)中，淋洗除杂后，再用二氯甲烷洗脱收集，用于洗脱的二氯甲烷的体积用量一般以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g。

本发明所述SILICA/PSA固相萃取柱为常规的固相萃取柱，有不同的体积规格，根据待检测啤酒样品的量选择合适规格的柱子即可。可直接于市场购买获得。

进一步，所述步骤(1)优选按以下步骤操作：

(1)取10mL啤酒，加入100μL 2.0mg/L内标D6-N，N-二甲基亚硝胺标准应用液，即200ng内标D6-N，N-二甲基亚硝，混匀，加入3.0g氯化钠溶解至饱和，加入15mL二氯甲烷，涡旋提取2min，然后10000rpm离心4min，弃去上层水相，二氯甲烷层经无水硫酸钠脱水后，室温氮气吹干至0.01mL～0.1mL，然后加入1mL环己烷，超声混匀，得到溶解液。

进一步，所述步骤(2)优选按以下步骤操作：

(2)取SILICA/PSA玻璃柱，规格为1000mg/6mL，表示其中填料量为1000mg，玻璃柱的体积为6mL；先依次用3mL二氯甲烷、5mL环己烷淋洗活化柱子，然后将步骤(1)的溶解液全部过柱，先用5mL二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，再用5mL二氯甲烷洗脱收集，所得洗脱液氮气吹至0.5mL,加入1mL甲醇，继续吹至1mL，为待测样液，取1.0μL进样，用气相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待测样液的总离子流色谱图、N-二甲基亚硝胺的质量色谱图和D6-N-二甲基亚硝胺内标的质量色谱图。

所述步骤(3)中，气相色谱色谱柱优选为INNOWAX毛细管色谱柱或等同色谱柱，规格为30m(柱长)×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)，进样口温度180～230℃，初始温度设定30～50℃，8-15℃/min程序升温至130℃，氦气作载气，恒流模式进行色谱分离；不分流进样，进样量为1～2μL。

质谱可采用低分辨质谱仪，离子源采用EI源模式，离子源温度为200～230℃，监测N-二甲基亚硝胺的42、43、74离子，监测D6-N-二甲基亚硝胺的46、80离子，其中N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺定量离子分别为74和80，另外可增加干扰物质离子44和73。

本发明将啤酒样品加D6-N-二甲基亚硝胺内标后，经过二氯甲烷萃取，SILICA/PSA固相萃取柱净化、洗脱，洗脱液浓缩后，采用气相色谱—质谱仪测定。本发明为全新的啤酒中N-二甲基亚硝胺含量的测定方法，该方法具有较好的选择性与准确性，且对仪器的要求低，方便推广应用。

本发明方法的有益效果在于：(1)采用二氯甲烷提取后进行SILICA/PSA固相萃取净化，有效的除去干扰物质，比常见的蒸馏净化时间短、实际用量少，且除去干扰物质能力强。(2)采用气相色谱-低分辨质谱法测定，对仪器的要求低，成本低，方法容易推广应用。(3)本发明实施例验证在增加干扰离子44、73条件下，仍然能准确测定目标物，表明本发明方法定性的可靠性，采用D6-N-二甲基亚硝胺内标法，提高方法定量准确性。

本方法定量限为2.0μg/L，检出限为0.7μg/L，完全可以满足啤酒中N-二甲基亚硝胺限量值要求。

(四)附图说明

图1 N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺标准品溶液的定量离子的质量色谱图，图1中，A图为内标D6-N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为80，B图为N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为74，C图为N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺合并的质量色谱图m/z为80和m/z为74。

图2啤酒样品加N-二甲基亚硝胺标准品的加标样液B的质量色谱图，图2中，A图为内标D6-N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为80，B图为N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为74，C图为N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺合并的质量色谱图，m/z为80和m/z为74。

图3为啤酒样品加N-二甲基亚硝胺标准品的加标样液B在10.389min处的质谱图。

图4啤酒空白样品的质量色谱图，图4中，A图为内标D6-N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为80，B图为N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为74，样品中未检出N-二甲基亚硝，C图为N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺合并的质量色谱图，m/z为80和m/z为74。

(五)具体实施方式

下面以具体实施例来对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。

实施例1：

(1)啤酒提取：取100mL啤酒，在超声波清洗机中超声脱气5min，然后量取10mL至50mL离心管内，加入100μL 2.0mg/L内标D6-N，N-二甲基亚硝胺标准应用液，即200ng内标D6-N，N-二甲基亚硝，混匀，加入3.0g氯化钠溶解至饱和，加入15mL二氯甲烷，涡旋提取2min，然后10000rpm离心4min，弃去上层水相，二氯甲烷层经无水硫酸钠脱水后，室温氮气吹干至0.1mL以下(不能干)，然后加入1mL环己烷，超声混匀，得到溶解液待净化。

(2)啤酒净化：取SILICA/PSA玻璃柱(1000mg/6mL)，先依次用3mL二氯甲烷、5mL环己烷淋洗活化柱子，然后将溶解液全部过柱，先用5mL二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，最后用5mL二氯甲烷洗脱收集，所得洗脱液氮气吹至0.5mL,加入1mL甲醇，继续吹至1mL，为待测样液，取1.0μL进样GC/MS分析。

气相色谱色谱柱为INNOWAX毛细管色谱柱，规格为30m(柱长)×0.25mm(内径)×0.25μm(膜厚)，进样口温度180～230℃，初始温度设定30～50℃，8-15℃/min程序升温至130℃，氦气作载气，恒流模式进行色谱分离；不分流进样，进样量为1～2μL。

气相色谱质谱型号为Agilent6890GC/5973MS，离子源采用EI源模式，离子源温度为200～230℃，监测N-二甲基亚硝胺的42、43、74离子，监测D6-N-二甲基亚硝胺的46、80离子，其中N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺的定量离子分别为74和80，另外在质谱检测中增加干扰物质离子44和73。

啤酒空白样品的质量色谱图如图4所示，图4中，A图为内标D6-N-二甲基亚硝胺质量色谱图m/z为80，B图为N-二甲基亚硝胺质量色谱图m/z为74，空白样品中未检出N-二甲基亚硝，C图为N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺合并的质量色谱图，m/z为80和m/z为74。

(3)制作标准曲线：方法分别取5μL、25μL、50μL、100μL、250μL、500μL 2.0mg/LN-二甲基亚硝胺使用液，分别加入100μL 2.0mg/L内标D6-N-二甲基亚硝胺标准应用液，即200ng内标D6-N，N-二甲基亚硝，用甲醇定容至1mL，获得10μg/L-1000μg/L标准品溶液，分别进样GC/MS分析，检测条件与步骤(2)相同，测N-二甲基亚硝胺的42、43、74离子，监测D6-N-二甲基亚硝胺的46、80离子，其中N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺的定量离子分别为74和80，另外增加干扰物质离子44和73。N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺标准品溶液的定量离子的质量色谱图如图1所示，图1中，A图为内标D6-N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为80，B图为N-二甲基亚硝胺质量色谱图，m/z为74，C图为N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺合并的质量色谱图m/z为80和m/z为74。

以N-二甲基亚硝胺74离子峰和内标D6-N，N-二甲基亚硝胺80离子峰的峰面积之比为纵坐标Y，以标准品溶液中N-二甲基亚硝与内标D6-N-二甲基亚硝胺的浓度比为横坐标X，制作标准曲线，回归方程为Y＝2.0X，相关系数r＝0.999。

实施例2

取啤酒空白样品10mL，加入100μL 2.0mg/LN-二甲基亚硝胺使用液，得到啤酒加标样液A，啤酒加标样液A中N-二甲基亚硝胺的加标浓度为20μg/L。

取啤酒空白样品10mL，加入25μL 2.0mg/LN-二甲基亚硝胺使用液，得到啤酒加标样液B，啤酒加标样液B中N-二甲基亚硝胺的加标浓度为5μg/L。

分别取啤酒加标样液A和啤酒加标样液B，按照实施例1的步骤(1)～(2)操作：

(1)量取10mL至50mL离心管内，加入100μL 2.0mg/L内标D6-N，N-二甲基亚硝胺标准应用液，即200ng内标D6-N，N-二甲基亚硝，混匀，加入3.0g氯化钠溶解至饱和，加入15mL二氯甲烷，涡旋提取2min，然后10000rpm离心4min，弃去上层水相，二氯甲烷层经无水硫酸钠脱水后，室温氮气吹干至0.1mL以下(不能干)，然后加入1mL环己烷，超声混匀，得到溶解液待净化。

(2)啤酒净化：取SILICA/PSA玻璃柱(1000mg/6mL)，先依次用3mL二氯甲烷、5mL环己烷淋洗活化柱子，然后将溶解液全部过柱，先用5mL二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，最后用5mL二氯甲烷洗脱收集，所得洗脱液氮气吹至0.5mL,加入1mL甲醇，继续吹至1mL，即为待测样液，取1.0μL进样GC/MS分析。GC/MS条件同实施例1。监测N-二甲基亚硝胺的42、43、74离子，监测D6-N-二甲基亚硝胺的46、80离子，其中N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺的定量离子分别为74和80，另外在质谱检测中增加干扰物质离子44和73。

啤酒样品加N-二甲基亚硝胺标准品的加标样液B的质量色谱图如图2所示，图2中，A图为内标D6-N-二甲基亚硝胺的质量色谱图，m/z为80，B图为N-二甲基亚硝胺的质量色谱图，m/z为74，C图为N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺合并的质量色谱图，m/z为80和m/z为74。

质量控制：N-二甲基亚硝胺质谱定性定量离子和定性离子比例在要求范围之内，根据经验保留时间定性时间窗口一般在0.02min，由于N-二甲基亚硝胺分子量小，42、43、74定性定量离子容易受到其他物质干扰，另外42、43、74容易受44、73峰干扰，本方法选择44、73为干扰离子同时进行监测。要求样品N-二甲基亚硝胺出峰处，43、44碎片强度小于42(除去本底)；73碎片强度小于74.

图3为啤酒样品加N-二甲基亚硝胺标准品的加标样液B在10.389min处的质谱图。质谱图可以看出，即使增加干扰物质离子44和73，也未检出44和73峰，表示本发明提取、净化方法很好的去除了干扰物质离子。

根据待测样液中N-二甲基亚硝胺和D6-N-二甲基亚硝胺内标的定量离子色谱峰的峰面积之比，结合实施例1的标准曲线，计算得到待测样液中N-二甲基亚硝胺的含量C，并按以下公式计算得到加标样液A和啤酒加标样液B中N-二甲基亚硝胺的含量X

X＝C*1mL/10mL＝C/10

啤酒加标样液A和啤酒加标样液B在步骤(2)净化得到的待测样液A跟B分别连续进样6次，测定值以及准确度、精密度计算结果见表1.

表1 啤酒加标测定准确度及精密度(n＝6)

Claims

1.一种检测啤酒中N-二甲基亚硝胺含量的方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

X＝C*1mL/M mL＝C/M

。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述体积为MmL的啤酒样品加入D6-N-二甲基亚硝胺内标，加入的D6-N-二甲基亚硝胺内标的用量是使啤酒样品中D6-N-二甲基亚硝胺内标的浓度为3～20μg/L。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，二氯甲烷的体积用量与啤酒样品的体积比为1～2：1。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，浓缩液的体积为0.01～0.1mL，然后用1mL的环己烷溶解，得溶解液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，取SILICA/PSA固相萃取柱，先依次用二氯甲烷、环己烷淋洗活化柱子，二氯甲烷的体积用量以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g，环己烷的体积用量以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g；然后将步骤(1)的溶解液全部上柱，先用二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，再用二氯甲烷洗脱收集，得到洗脱液；二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂的体积用量以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g；用于洗脱的二氯甲烷的体积用量以SILICA/PSA固相萃取柱中固体填料的质量计为3～6mL/g。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，气相色谱色谱柱为INNOWAX毛细管色谱柱，规格为30m柱长×0.25mm内径×0.25μm膜厚，进样口温度180～230℃，初始温度设定30～50℃，8-15℃/min程序升温至130℃，氦气作载气，恒流模式进行色谱分离；不分流进样，进样量为1～2μL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中，质谱离子源采用EI源模式，离子源温度为200～230℃，监测N-二甲基亚硝胺的42、43、74离子，监测D6-N-二甲基亚硝胺的46、80离子，其中N-二甲基亚硝胺、D6-N-二甲基亚硝胺的定量离子分别为74和80。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)按以下步骤操作：

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(2)按以下步骤操作：(2)取SILICA/PSA玻璃柱，填料量为1000mg，先依次用3mL二氯甲烷、5mL环己烷淋洗活化柱子，然后将步骤(1)的溶解液全部过柱，先用5mL二氯甲烷、环己烷体积比1：9的混合溶剂淋洗除杂，再用5mL二氯甲烷洗脱收集，所得洗脱液氮气吹至0.5mL,加入1mL甲醇，继续吹至1mL，为待测样液，取1.0μL进样，用气相色谱-质谱联用仪分析检测，得到待测样液的总离子流色谱图、N-二甲基亚硝胺的质量色谱图和D6-N-二甲基亚硝胺内标的质量色谱图。