CN117723688A - 一种水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法 - Google Patents

一种水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法，涉及分析检测技术领域。本发明利用甲酸‑乙腈水溶液为提取剂对待测水产品进行提取，能够同时实现吲哚、3‑吲哚乙酸、3‑甲基吲哚、吲哚‑3‑甲醛、吲哚‑4‑甲醛和吲哚‑5‑甲醛6种吲哚类物质的同时高效提取；利用HLB固相萃取净化，能够显著降低待测样品液中杂质的量，提高后续高效液相色谱串联质谱的检测结果准确度。本发明采用高效液相色谱串联质谱检测并采用APCI离子源，检测结果准确度高、灵敏度高。而且，本发明提供的检测方法实现了6种吲哚类物质的高灵敏度检测，检测指标全面，根据6种吲哚类物质总含量的变化趋势能够为快速评价冷藏条件下水产品质量提供依据。

Description

一种水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，具体涉及一种水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法。
背景技术
生鲜商品，特别是水产品易腐烂变质，难保鲜等特性而出现产品品质降低，或者变质导致损耗高。生鲜水产品的品质及其保鲜不仅是消费者关注的重点，更是直接影响消费者的身体健康的食品安全问题。
水产品富含各种脂肪、蛋白质和微量元素等营养物质且水分含量高，死后为微生物提供了有利的生长环境，由于这些腐败菌和各种蛋白酶的水解作用下，造成肌原纤维脆弱、断裂，水产品肌肉失去固有弹性逐渐变软，水产品进入自溶阶段，特别是虾蟹类水产自融现象特别明显，导致部分组织中的蛋白质分解成氨基酸，为腐败微生物的繁殖提供了有利的条件。由于水产品中腐败微生物的作用，将氨基酸分解成氨、醛类和生物胺类等具有不良风味的腐败特征产物，导致水产品具有腐败特征的臭味。根据水产品腐败过程中产生的化学物质等变化来对水产品的新鲜度进行评价。因此，利用水产品在储存过程中形成的化学物质常被用作评价肉类新鲜度的化学指标。针对目前水产品品质与其体内化学物质快速建立评价水产品品质的方法具有重要意义。
目前，吲哚类物质常用的检测方法有液相色谱法、气相色谱法和液相色谱串联质谱法，其前处理主要有直接提取法、液液萃取法和固相萃取法等，例如现有技术“刘志航,李平亮,周斐,等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测植物叶片中吲哚-3-乙酸及其3种氧化产物[J].分析测试学报,2017,36(6):6.”、“刘悦,贾曼,崔婧,等.超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法同时检测细胞培养基中3种色氨酸代谢物[J].中国食物与营养,2019,25(2):4.”、“侯建波,谢文,曾淦宁,等.高效液相色谱法测定虾肉及虾制品中吲哚含量[J].理化检验：化学分册,2015(1):4.”、“高效液相色谱法同时测定妊娠合并乙型肝炎患者血浆中的吲哚与3-甲基吲哚[J].色谱,2017,35(7):6.”、“康乐,何建昇,郭俊俊,等.UPLC-MS/MS法测定人粪便中吲哚及其两种代谢物的方法研究[J].大众标准化,2020(17):4.”以及“Verplanken K,Wauters J,Vercruysse V,et al.Development and validation ofaUHPLC-HR-Orbitrap-MS method for the simultaneous determinationofandrostenone,skatole and indole in porcine meat and meatproducts[J].FoodChemistry,2016,190:944-951.”等。然而，水产制品中含高蛋白物质，对于水产品复杂基质样品，生物样本基质干扰大，导致目前的样品前处理方法针对的目标物相对单一，不能实现吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛多种吲哚类物质的同时高效提取，进而导致检测结果不准确。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法。本发明提供的前处理方法能够同时实现吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛6种吲哚类物质的同时高效提取，大大提高了水产品中吲哚类物质的检测结果准确性和灵敏度。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种水产品中吲哚类物质的前处理方法，包括以下步骤：
将待测水产品和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；
将所述提取液上样到HLB固相萃取柱中，利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液。
优选的，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的体积分数为0.1～0.2％，乙腈的体积分数为75～85％；
所述待测水产品与甲酸-乙腈水溶液的料液比为1g：4～6mL。
优选的，所述混合提取包括依次进行均质提取和振荡提取；所述均质提取的转速为10000～12000r/min，时间为1～2min；所述振荡提取的速度为180～240r/min，时间为8～15min。
优选的，所述混合提取后，还包括对得到的提取体系进行离心分离，所得上清液为提取液。
优选的，所述第一乙腈水溶液中乙腈的体积分数为8～12％；
所述甲酸-乙腈混合液中甲酸的体积分数为0.1～0.2％。
优选的，所述提取液在上样前先用水进行稀释，得到稀释提取液；所述提取液与水的体积比为1：4～5。
优选的，所述浓缩后还包括将所得浓缩液进行第二乙腈水溶液定容；
所述浓缩液的体积占提取液体积的35％以下；
所述第二乙腈水溶液中乙腈的体积分数优选为40～60％。
本发明还提供了一种水产品中吲哚类物质的检测方法，包括以下步骤：
将待测水产品、同位素内标工作溶液和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；
将所述提取液进行HLB固相萃取柱净化，得到待测样品液；所述HLB固相萃取柱净化包括利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液；
将所述待测样品液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到吲哚类物质的检测结果；所述高效液相色谱串联质谱检测采用的质谱离子源为APCI离子源；所述吲哚类物质包括吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛中的一种或几种。
优选的，所述高效液相色谱串联质谱的高效液相色谱检测条件包括：色谱柱为C18色谱柱，柱温为30～40℃，流动相A为0.1～0.2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相流速为0.25～0.35mL/min，进样量为1～2μL，洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：
0～3min，所述流动相A的体积分数为70～80％；
3～5min，所述流动相A的体积分数由70～80％匀速降低至5～10％；
5～8min，所述流动相A的体积分数为5～10％；
8～8.0min，所述流动相A的体积分数由5～10％匀速增加至70～80％；
8.1～12min，所述流动相A的体积分数为70～80％。
优选的，所述高效液相色谱串联质谱的质谱检测条件包括：电离模式为APCI正离子模式，扫描方式为多反应监测，气帘气压力为25psi，离子喷雾电压为5500V，雾化温度为400℃，雾化气压力为30psi。
本发明利用甲酸-乙腈水溶液为提取剂对待测水产品进行提取，能够同时实现吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛6种吲哚类物质的同时高效提取。本发明将提取液上样至HLB固相萃取柱中，利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，即可得到待测样品液。本发明利用HLB固相萃取进行净化，能够显著降低待测样品液中其他杂质的量，提高后续高效液相色谱串联质谱的检测结果准确度，且操作简单。
本发明提供的检测方法，在前处理过程中，利用甲酸-乙腈水溶液为提取剂对待测水产品和同位素内标物进行提取，能够同时实现吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛6种吲哚类物质的同时高效提取；利用HLB固相萃取进行净化，能够显著降低待测样品液中其他杂质的量；在前处理过程中加入同位素内标物，采用高效液相色谱串联质谱法检测，并在质谱中采用APCI源，大幅度降低了生物样品的机质效应和干扰，有效提升了水产品中吲哚类物质的高效液相色谱串联质谱的检测结果准确性、精密度和灵敏度，且检测效率快，操作简单。本发明研究了黑鱼和明虾中的吲哚类物质的变化趋势，发现水产品中吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛、吲哚-5-甲醛等化合物的含量与贮藏时间呈线性相关，可以根据水产品中吲哚类物质含量的变化来评价水产品的新鲜程度，检测上述6种吲哚类物质的总含量有助于快速评价冷藏条件下水产品的质量，可作为市售冷鲜水产品新鲜度表征的潜在生物标记物，为冷链生鲜运输保鲜提供了技术参考。而且，相较于现有的吲哚类物质的检测方法，本发明能够同时准确、高灵敏度检测6种吲哚类物质，本发明提供的检测方法的表征指标更加全面，表征效率更高，结果更加准确。
如实施例测试结果所示，6种吲哚类物质能够在8min内得到有效分离，相关系数(r)均达到0.99以上，吲哚、3-吲哚乙酸和3-甲基吲哚检出限为2μg/kg，定量限为5μg/kg，吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛的检出限为1μg/kg，定量限为2μg/kg，平均回收率在63.18～102.58％之间，相对标准偏差(RSD)为2.2～9.5％。说明本发明提供的检测方法回收率高、操作简便、灵敏度较好，能够准确定性和定量水产品中低浓度的吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛6种吲哚类物质，为进一步准确检测水产品中吲哚类物质含量提供了有效的技术手段。经过多次试验后，确定当黑鱼中吲哚类物质总含量≤100μg/kg时为新鲜鱼肉，当吲哚类物质总含量＞100μg/kg时为相对不新鲜鱼肉；当明虾中吲哚类物质总含量≤250μg/kg时为新鲜虾肉，当吲哚类物质总含量＞250μg/kg时为相对不新鲜虾肉，为冷链生鲜运输保鲜提供了技术参考。
附图说明
图1为吲哚类物质的总离子流图，其中，1为吲哚-3-甲醛，2为3-吲哚乙酸，3为吲哚-4-甲醛，4为吲哚-5-甲醛，5为吲哚，6为3-甲基吲哚；
图2为吲哚类物质分别用HLB柱和PRiME HLB柱进化后的回收率结果图；
图3为吲哚类物质的基质效应图；
图4为黑鱼样品中吲哚类物质浓度随时间变化情况图；
图5为虾样品中吲哚类物质浓度随时间变化情况图；
图6为鱼虾肉不同放置时间的感官对比图，其中，a)为黑鱼样品，b)为明虾样品。
具体实施方式
本发明提供了一种水产品中吲哚类物质的前处理方法，包括以下步骤：
将待测水产品和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；
将所述提取液上样到HLB固相萃取柱中，利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液。
若无特殊说明，本发明使用的材料和设备均为本领域市售商品。
本发明将待测水产品和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液。
在本发明中，所述待测水产品优选包括虾和/或鱼，所述虾优选包括明虾；所述鱼优选包括黑鱼。在本发明中，所述虾在使用前优选先除去虾头、虾尾和虾壳，然后采用绞肉机制成肉泥。在本发明中，所述鱼在使用前优选先除去鱼皮和鱼骨，然后采用绞肉机制成肉泥。在本发明中，所述待测水产品的肉泥优选在-22～-18℃条件下冷冻保存。
在本发明中，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的体积分数优选为0.1～0.2％，更优选为0.1～0.15％，乙腈的体积分数优选为75～85％，更优选为80％。
在本发明中，所述待测水产品与甲酸-乙腈水溶液的料液比优选为1g：4～6mL，更优选为1g：5mL。
在本发明中，所述混合提取优选包括依次进行均质提取和振荡提取。在本发明中，所述均质提取的转速优选为10000～12000r/min，更优选为11000～12000r/min；所述均质提取的时间优选为1～2min，更优选为1～1.5min。在本发明中，所述振荡提取的速度优选为180～240r/min，更优选为200～220r/min；所述振荡提取时间优选为8～15min，更优选为9～10min，所述振荡提取优选在摇床上进行。
所述混合提取后本发明优选还包括对得到的提取体系进行离心分离，所得上清液为提取液。在本发明中，所述离心分离的转速优选为8000～10000r/min，更优选为8000～9000r/min；所述离心分离的时间优选为5～8min，更优选为6～7min。
得到提取液后，本发明将所述提取液上样到HLB固相萃取柱中，利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液。
在本发明中，所述提取液在上样优选前先用水进行稀释，得到稀释提取液。在本发明中，所述提取液与水的体积比优选为1：4～5，更优选为1：4～4.5，进一步优选为1:4。
在本发明中，所述HLB固相萃取柱在使用前优选先进行活化，所述活化优选为有机溶剂活化和有机溶剂水溶液冲洗，所述有机溶剂优选包括甲醇和/或乙腈；所述有机溶剂水溶液中有机溶剂的体积分数优选为8～12％，更优选为9～11％，进一步优选为10％，所述有机溶剂水溶液中有机溶剂优选包括乙腈。
在本发明中，所述稀释提取液在HLB固相萃取柱中的流速优选为1～2滴/秒，待稀释提取液完全通过后，将盛放稀释提取液的容器用第一乙腈水溶液冲洗，然后再将冲洗过盛放稀释提取液的容器的第一乙腈水溶液对HLB固相萃取柱进行冲洗。在本发明中，所述第一乙腈水溶液中乙腈的体积分数优选为8～12％，更优选为9～10％。在本发明中，所述第一乙腈水溶液的用量优选为1～2mL，更优选为1～1.5mL。
在本发明中，所述吹干优选为氮气吹干。
在本发明中，所述甲酸-乙腈混合液中甲酸的体积分数优选为0.1～0.2％，更优选为0.1～0.15％。在本发明中，所述提取液与甲酸-乙腈混合液的体积比优选为1：2～3，更优选为1:2.5。
在本发明中，所述浓缩优选为氮吹浓缩，所述浓缩的温度优选为35～45℃，更优选为40℃，本发明对于所述浓缩的时间没有特殊限定，浓缩至所得浓缩液的体积占提取液体积的35％以下即可。
所述浓缩后，本发明优选还包括将所得浓缩液进行第二乙腈水溶液定容，得到待测样品液。在本发明中，所述第二乙腈水溶液中乙腈的体积分数优选为40～60％，更优选为45～50％。在本发明中，定容后的待测样品液与提取液的体积比优选为0.5～1：1，更优选为0.5～0.8：1。
所述定容后，本发明优选还包括将定容后的溶液依次进行超声、涡旋和采用0.22μm有机微孔滤膜过滤。在本发明中，所述超声的时间优选为30～60s，更优选为30s；所述涡旋的转速优选为360～480r/min，更优选为400～450r/min，所述涡旋的时间优选为1～2min。
本发明还提供了一种水产品中吲哚类物质的检测方法，包括以下步骤：
将待测水产品、同位素内标工作溶液和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；
将所述提取液进行HLB固相萃取柱净化，得到待测样品液；所述HLB固相萃取柱净化包括利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液；
将所述待测样品液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到吲哚类物质的检测结果；所述高效液相色谱串联质谱检测采用的质谱离子源为APCI离子源；所述吲哚类物质包括吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛中的一种或几种。
在本发明将待测水产品、同位素内标工作溶液和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；将所述提取液进行HLB固相萃取柱净化，得到待测样品液；所述HLB固相萃取柱净化包括利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液。
在本发明中，所述待测水产品的前处理方法与前述前处理方法的区别仅在于添加了同位素内标工作溶液，其他前处理方法与前述前处理方法相同，在此不再一一赘述。在本发明中，所述同位素内标工作溶液中的同位素内标物优选为吲哚-3-甲醛-13C，所述同位素内标工作溶液的浓度优选为1.6～2.4μg/mL，更优选为1.8～2.2μg/mL，进一步优选为2μg/mL。在本发明中，所述待测水产品和同位素内标物的质量比优选为1g：0.2～0.3μg，更优选为1g：0.25μg。
在本发明中，所述高效液相色谱串联质谱的高效液相色谱检测条件优选包括：色谱柱为C18色谱柱，更优选为Agilent EclipsePlus C18RRHD色谱柱或Waters CORTECS UPLCC18色谱柱；柱温为30～40℃，更优选为35℃；流动相A为0.1～0.2％甲酸水溶液，更优选为0.1～0.15甲酸水溶液；流动相B为乙腈；流动相流速为0.25～0.35mL/min，更优选为0.3mL/min；进样量为1～2μL，更优选为1.5～2μL；洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：0～3min，所述流动相A的体积分数为70～80％；3～5min，所述流动相A的体积分数由70～80％匀速降低至5～10％；5～8min，所述流动相A的体积分数为5～10％；8～8.0min，所述流动相A的体积分数由5～10％匀速增加至70～80％；8.1～12min，所述流动相A的体积分数为70～80％；所述洗脱程序更优选为：0～3min，所述流动相A的体积分数为75％；3～5min，所述流动相A的体积分数由75％匀速降低至5％；5～8min，所述流动相A的体积分数为5％；8～8.0min，所述流动相A的体积分数由5％匀速增加至75％；8.1～12min，所述流动相A的体积分数为75％。
在本发明中，所述高效液相色谱串联质谱的质谱检测条件优选包括：电离模式为APCI正离子模式，扫描方式为多反应监测(MRM)，气帘气压力为25psi，离子喷雾电压为5500V，雾化温度为400℃，雾化气压力为30psi；所述气帘气优选为氮气，所述雾化气优选为氮气。在本发明中，所述吲哚类物质和同位素内标物的母离子、子离子、碰撞电压(CE)和去簇电压(DP)优选如表1所示：
表1吲哚类物质和同位素内标物的母离子、子离子、碰撞电压(CE)和去簇电压(DP)
在本发明中，所述高效液相色谱串联质谱对所述待测样品液进行检测优选包括定性检测和定量检测。
在本发明中，所述定性检测的步骤优选包括：将所述待测样品液和标准曲线溶液按照高效液相色谱检测的条件和质谱检测的条件进行测定，记录待测样品液和标准曲线溶液中吲哚类物质的色谱保留时间，当待测样品液中检出与某标准曲线溶液中的吲哚类物质标准品保留时间一致的色谱峰(变化范围在±2.5％之内)，并且待测样品液色谱图中所选择的监测离子对的相对丰度比与相当浓度标准溶液的离子相对丰度比(k)的偏差不超过表2规定的范围，可以确定试样中检出相应化合物。
表2为定性时相对离子丰度的最大允许偏差。
表2定性时相对离子丰度的最大允许偏差
相对离子丰度/％ ＞50 20-50 10-20 ≤10
允许相对偏差/％ ±20 ±25 ±30 ±50
在本发明中，所述标准曲线溶液为吲哚标准品、3-吲哚乙酸标准品、3-甲基吲哚标准品、吲哚-3-甲醛标准品、吲哚-4-甲醛标准品、吲哚-5-甲醛标准品和同位素内标物标准品的混合溶液。在本发明中，各吲哚类物质标准品的具体规格优选详见表3，各吲哚类物质标准品的纯度优选≥98％。在本发明中，所述标准曲线溶液中同位素内标物的浓度优选为80～120μg/L，更优选为100μg/L；其他吲哚类物质标准品的浓度依次为8～12μg/L、16～24μg/L、40～60μg/L、80～120μg/L和160～240μg/L，更优选依次为9～11μg/L、18～22μg/L、45～55μg/L、90～110μg/L和180～220μg/L，进一步优选为10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L和200μg/L。在本发明中，所述标准曲线溶液中的溶剂优选包括甲醇、乙腈和水。
表3吲哚类物质标准品的具体规格
在本发明中，所述标准曲线溶液的配制方法优选包括以下步骤：
配制800～1200μg/mL各吲哚类物质的标准储备溶液；
配制1.6～2.4μg/mL吲哚类物质混合标准溶液；
配制160～240μg/L吲哚类物质混合标准工作溶液；
配制1.6～2.4μg/mL同位素内标工作溶液；
配制标准曲线溶液。
在本发明中，所述800～1200μg/mL各吲哚类物质的标准储备溶液的配制方法优选包括以下步骤：精密称取吲哚标准品8.00～12.00mg(精确至0.01mg)，用甲醇超声溶解并定容至10mL，摇匀，得到浓度为800～1200μg/mL的吲哚标准储备液，4℃保存，有效期3个月。按照吲哚标准储备液的配制方法分别配制3-吲哚乙酸标准储备液、3-甲基吲哚标准储备液、吲哚-3-甲醛标准储备液、吲哚-4-甲醛标准储备液和吲哚-5-甲醛标准储备液。在本发明中，各标准储备液中吲哚类物质的浓度独立地更优选为900～1100μg/mL，进一步优选为1000μg/mL。
在本发明中，所述1.6～2.4μg/mL吲哚类物质混合标准溶液的配制方法优选包括以下步骤：分别精密移取吲哚标准储备液、3-吲哚乙酸标准储备液、3-甲基吲哚标准储备液、吲哚-3-甲醛标准储备液、吲哚-4-甲醛标准储备液、吲哚-5-甲醛标准储备液各0.020mL于10mL容量瓶中，甲醇溶液定容，得到1.6～2.4μg/mL吲哚类物质混合标准溶液。在本发明中，所述1.6～2.4μg/mL吲哚类物质混合标准溶液中各吲哚类物质的浓度独立地更优选为1.8～2.2μg/mL，进一步优选为2.0μg/mL。
在本发明中，所述160～240μg/L吲哚类物质混合标准工作溶液的配制方法优选包括以下步骤：精密移取吲哚类物质混合标准溶液1.0mL于10mL容量瓶中甲醇溶定容，得到160～240μg/L的吲哚类物质混合标准工作溶液。在本发明中，所述吲哚类物质混合标准工作溶液中各吲哚类物质的浓度独立地更优选为180～220μg/L，进一步优选为200μg/L。
在本发明中，所述1.6～2.4μg/mL同位素内标工作溶液的配制方法优选包括以下步骤：准确4.00～6.00mg称取同位素内标物，用甲醇超声溶解，甲醇稀释定容至5mL，得到800～1200μg/mL同位素内标储备溶液；精密移取同位素内标储备溶液0.02mL，甲醇定容至10mL，得到1.6～2.4μg/mL同位素内标工作溶液。在本发明中，所述同位素内标储备溶液中同位素内标物的浓度更优选为900～1100μg/mL，进一步优选为1000μg/mL。在本发明中，所述同位素内标工作溶液中同位素内标物的浓度更优选为1.8～2.2μg/mL，进一步优选为2μg/mL。
在本发明中，所述配制标准曲线溶液的配制优选包括以下步骤：将160～240μg/L吲哚类物质混合标准工作溶液或1.6～2.4μg/mL吲哚类物质混合标准溶、1.6～2.4μg/mL同位素内标溶液混合，利用甲酸-乙腈-水溶液定容，得到标准曲线溶液。在本发明中，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的体积分数优选为0.1～0.2％，更优选为0.1～0.15％，乙腈的体积分数优选为40～60％，更优选为50％。在本发明中，所述标准曲线溶液的具体配制如表4所示：
表4标准曲线配制表
在本发明中，所述定量检测优选包括：吲哚-3-甲醛使用内标法定量，吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛使用外标法定量。本发明对于所述内标法定量和外标法定量没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的内标法定量和外标法定量的方法即可。在本发明中，所述吲哚类物质的线性关系优选如表5所示：
表5吲哚类物质的线性关系
化合物 线性方程 r
吲哚 y＝524.71x+2393.00 0.9931
3-吲哚乙酸 y＝2224.11x-1709.49 0.9968
3-甲基吲哚 y＝656.74+492.16 0.9968
吲哚-3-甲醛 y＝0.021x+0.0565 0.9985
吲哚-4-甲醛 y＝25966.57x+19201.38 0.9985
吲哚-5-甲醛 y＝11894.01x+1.42×105 0.9951
为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对水产品中吲哚类物质的前处理方法和检测方法进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
实验材料、试剂和仪器设备如下：
主要化学品：乙腈，色谱纯，上海沪试；甲酸，色谱纯，上海沪试；甲醇，色谱纯，上海沪试；Milli-QAdvantageA10超纯水，色谱级，自制。乙腈和甲酸的百分含量均为体积分数。
主要标准品如表3所示。
仪器设备：液质联用仪，AB SCIEX Triple Quad 5500；高效液相色谱仪，岛津LC-20A；天平，XPE205；台式离心机，Multifuge X1；往复振荡摇床，IKAHS260；超声波清洗器，KH-500DV；旋涡混合器，QT-1。
实施例1
1、标准溶液配制
准确称取吲哚、3-甲基吲哚、3-吲哚乙酸、吲哚-4-甲醛、吲哚-3-甲醛、吲哚-5-甲醛各10.00mg分别置于10mL容量瓶中，甲醇超声使溶解后定容至刻度线，振荡摇匀，得到1000μg/mL的各吲哚类物质标准储备溶液，准确标识后冰箱4℃冷藏保存。
用移液枪精密移取吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛、吲哚-5-甲醛的标准储备液各0.020mL于10mL容量瓶中，甲醇溶液定容至刻度线，得到2.0μg/mL的吲哚类物质混合标准溶液；再用移液枪吸取2.0μg/mL混合标准溶液1.0mL于10mL容量瓶中甲醇溶定容，得到200μg/L的吲哚类物质混合标准溶液。
2、同位素内标工作溶液配制
准确称取吲哚-3-甲醛-13C 5.00mg于5mL容量瓶中，超声溶解，用甲醇定容至刻度线，振荡摇匀，得到1000μg/mL的同位素内标储备溶液，并转移入样品瓶，准确标识后4℃冷藏保存。
用移液枪准确吸取样品瓶中同位素内标储备溶液0.02mL于10mL容量瓶中，甲醇溶定容，得到2μg/mL的同位素内标工作溶液。
3、标准曲线溶液配制和标准曲线
分别准确移取200μg/L和2μg/mL的吲哚类物质混合标准品溶液，用0.1％甲酸-50％乙腈水溶液配制成10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L系列标准浓度，其中同位素内标浓度为100μg/L，标准曲线溶液配制方法如表6所示。
表6标准曲线溶液配制表
4、高效液相色谱条件
色谱柱：Agilent EclipsePlus C18 RRHD(2.1×100mm，1.8μm)；进样量：2.0μL；柱温：35℃；流动相A：0.1％甲酸水溶液；流动相B：乙腈；流动相流速：0.3mL/min；梯度洗脱程序见表7。
表7梯度洗脱程序
5、质谱条件
电离模式：APCI正离子模式；扫描方式：多反应监测(MRM)；气帘气(氮气)：25psi；离子喷雾电压：5500V；雾化温度：400℃；雾化气：30psi；吲哚类物质和同位素内标物的母离子、子离子、碰撞电压(CE)和去簇电压(DP)如表1所示。
在上述LC-MS/MS检测条件下，6种吲哚类物质的总离子流图如图1所示，由图1可知，经过调整后6种吲哚类物质的保留时间稳定，峰形良好，其中出峰顺序分别为吲哚-3-甲醛(1)、3-吲哚乙酸(2)、吲哚-4-甲醛(3)、吲哚-5-甲醛(4)、吲哚(5)和3-甲基吲哚(6)。
6、线性关系、检出限和定量限
将标准曲线溶液配制进行LC-MS/MS检测，以6种吲哚类物质的质量浓度为横坐标，定量离子对的峰面积为纵坐标进行线性回归，并以3倍信噪比(S/N＝3)对应的吲哚类物质含量作为方法检出限，以10倍信噪比(S/N＝10)所对应的吲哚类物质含量作为方法定量限，线性关系、检出限和定量限结果见表8。
表8吲哚类物质的线性关系、检出限和定量限
化合物 线性方程 r 检出限(μg/kg) 定量限(μg/kg)
吲哚 y＝524.71x+2393.00 0.9931 2 5
3-吲哚乙酸 y＝2224.11x-1709.49 0.9968 2 5
3-甲基吲哚 y＝656.74+492.16 0.9968 2 5
吲哚-3-甲醛 y＝0.021x+0.0565 0.9985 1 2
吲哚-4-甲醛 y＝25966.57x+19201.38 0.9985 1 2
吲哚-5-甲醛 y＝11894.01x+1.42×105 0.9951 1 2
由表8可知，6种吲哚类物质在10～200μg/L浓度范围内的线性相关系数(r)均大于0.99，线性关系均比较好。吲哚、3-吲哚乙酸和3-甲基吲哚检出限为2μg/kg，定量限为5μg/k。吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛的检出限为1μg/kg，定量限为2μg/kg。
实施例2
1、样品前处理
样品制备：购买市售鲜活明虾和黑鱼，明虾去头、去尾、去壳，黑鱼去皮、去骨，采用绞肉机制成肉泥，-18℃冷冻保存。
提取：准确称取样品肉泥2.0g于50mL离心管中，精密加入0.25mL的2μg/mL同位素内标工作溶液，再加入9.5mL 0.1％甲酸-80％乙腈-水溶液，在12000r/min条件下均质1min，在摇床上振荡摇匀10min后，再以8000r/min的转速离心5min，上清液为提取液。
HLB固相萃取柱净化：准确移取2.0mL提取液于20mL离心管，加入8mL水稀释混匀，得到稀释提取液。HLB固相萃取柱采用甲醇活化，用10％乙腈水溶液冲洗，将稀释提取液通过HLB柱，提取液保持1滴/秒的流速通过，待提取液完全通过后，离心管残留液采用2mL10％乙腈水溶液冲洗并过HLB固相萃取小柱，待液体完全通过后吹干固相萃取柱，用5mL所得浓缩液残留液用50％乙腈水溶液定容至1.0mL，超声30s，在420r/min条件下涡旋1min，采用0.22μm有机微孔滤膜过滤，收集中段滤液作为待测样品液进行LC-MS/MS测试。
2、加标回收率试验
以鱼肉、虾肉样品进行了加标回收率试验，分别添加相当于20μg/kg(低浓度)、100μg/kg(中浓度)和250μg/kg(高浓度)3个浓度的混合标准品溶液，每个浓度设定3个重复实验。按上述样品前处理方法和实施例1的检测条件进行测试。测得结果扣除样品本底值后计算回收率。鱼肉中6种吲哚类物质在3种浓度下的具体平均回收率和相对标准偏差(RSD)见表9，虾肉中6种吲哚类物质在3种浓度下的具体平均回收率和相对标准偏差(RSD)见表10。
表9鱼肉样品加标回收率试验(n＝3)
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表10虾肉样品加标回收率试验(n＝3)
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由表9可知，鱼肉的中6种吲哚类物质的平均回收率在63.18～102.58％之间，相对标准偏差(RSD)在1.6～10.2％之间。由表10可知，虾肉的中6种吲哚类物质的平均回收率在70.52～96.57％之间，相对标准偏差(RSD)在2.1～9.3％之间。说明本发明提供的前处理方法和检测方法的回收率满足分析检测的需要，可以用于水产品中吲哚类物质的含量准确检测。
3、精密度试验
在鱼肉的样品中添加100μg/kg的混合标准品溶液，每一水平做6次平行，进行方法的精密度试验。鱼肉中6种吲哚类物质的具体平均回收率和相对标准偏差(RSD)见表11。
表11精密度试验(n＝6，100μg/kg)
化合物 平均回收率(％) RSD(％)
吲哚 71.78 9.5
3-吲哚乙酸 68.77 2.4
3-甲基吲哚 69.98 2.2
吲哚-3-甲醛 94.90 5.3
吲哚-4-甲醛 70.75 2.6
吲哚-5-甲醛 89.49 3.7
由表11可知，该浓度的6种吲哚类物质的回收率相对标准偏差在2.2～9.5％之间，说明本发明提供的方法的精密度和准确度较好，符合分析检测的需要。
实施例3
1、质谱检测条件的选择
实验采用吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛、吲哚-5-甲醛等6种吲哚类物质1μg/mL的纯标准品溶液在ESI源正离子模式下进行质谱条件分析，在进行一级质谱分析(Q1扫描)时发现3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛、吲哚-5-甲醛5种吲哚类物质能够检测到相应的母离子，但是其子离子响应相对比较低，而吲哚在ESI条件下母离子响应也相对较低。
因此，更换为APCI源，在正离子模式下进行质谱条件分析。使用浓度为1μg/mL的纯标准品溶液来进行质谱条件的优化。经参数优化后进行一级质谱分析(Q1扫描)，确定物质的准分子离子峰[M+H]+，以其分子离子作为母离子，然后对其进行二级质谱分析(Q3扫描)，从中选取出丰度较强、干扰较小的子离子作为定性离子对。然后在多反应监测(MRM)模式下优化碰撞电压、去簇电压质谱参数，最终得到的标准品对应母离子和子离子碰撞电压(CE)、去簇电压(DP)值如表1所示。
2、色谱条件的优化
不同色谱柱对吲哚物质的分离效果存在差异，试验考察了AgilentEclipsePlusC18RRHD(2.1×100mm，1.8μm)、Waters CORTECS UPLCC18(2.1×100mm，1.6μm)、Waters BEHC18色谱柱(100mm×2.1mm，1.7μm)、WatersAtlantis@T3色谱柱(100mm×2.1mm,5.0pm)对吲哚类物质的分离效果，其他LC-MS/MS检测条件与实施例1相同。结果表明：Waters BEH C18色谱柱多个组分不能分离，影响定量灵敏度，WatersAtlantis@T3色谱柱的色谱峰形拖沓，Waters CORTECS UPLCC18色谱柱分离效果较好，但是峰形有点拖尾，而AgilentEclipsePlusC18RRHD在MRM模式下可以对6种组分实现较好的分离，且各色谱峰峰形较好，目标物相互干扰小。选用Agilent EclipsePlus C18RRHD作为分离色谱柱。
对甲醇、乙睛、甲酸溶液(甲酸浓度为0.1％)、甲酸铵溶液(甲酸浓度为0.1％)进行多组合考察对吲哚类物质的分离效率和灵敏度，其他LC-MS/MS检测条件与实施例1相同。结果发现：水相中加入甲酸能改善峰形并提高APCI源的离子化效率，且色谱峰形也得到进一步改善，经考察后含0.1～0.2％甲酸均可以提升目标物的相应。实验中采用0.1％甲酸和乙腈作为流动相体系。
3、提取剂的选择
由于水产品中基质十分复杂，其中含有丰富的蛋白质和脂肪类物质，在实验过程中会干扰目标物的分析，所以为了能够提高目标物质的回收率，在选择提取剂时应当考虑提取剂对蛋白质变性沉淀的效果。在已有实验中对于水产品中目标物质的提取常常选用盐酸、高氯酸、三氯乙酸酸性溶剂作为脱蛋白剂，但是仅仅使用这些酸性溶剂进行来对水产品脱蛋白的效果并不是十分理想，在提取液中仍然残留着很多干扰性杂质，所以如果在酸性液体脱蛋白处理后再增加固相萃取步骤进行净化，则可以获得更好的除杂效果。另外，考虑到如果在操作过程中强酸溶液没有被完全净化，那么当进行大批量样品处理后强酸溶液会进入质谱，可能会腐蚀仪器，造成严重的后果。
为解决上述问题，有部分研究以甲醇、乙腈、乙酸乙酯作为提取剂采用实施例2的方法进行了试验，分别考察了这三种溶剂对虾肉和虾干中吲哚的提取效果，实验结果表明，在这3种提取剂中乙腈对吲哚类物质的提取效率最高，回收率达到85％以上；而乙酸乙酯的提取效率是最低的，在60～83％之间。因此，为了能够更有效地沉淀水产品中的蛋白质，减少提取液中的杂质含量，提高方法的回收率，选择乙腈作为提取剂。
尽管乙腈作为非离子化的溶剂对吲哚类物质具有一定的提取效果，但是对水溶性较好的吲哚类物质提取效果存在一定影响，实验考察了采用不同的提取剂70％乙腈水溶液、80％乙腈水溶液、90％乙腈水溶液、甲酸-70％乙腈水溶液(分别含0.1％甲酸，0.2％甲酸，0.3％甲酸，0.5％甲酸)、甲酸-80％乙腈水溶液(分别含0.1％甲酸，0.2％甲酸，0.3％甲酸，0.5％甲酸)、甲酸-90％乙腈水溶液(分别含0.1％甲酸，0.2％甲酸，0.3％甲酸，0.5％甲酸)，吲哚类物质的提取效率变化情况。实验发现在纯乙腈中加入一定比例的水和甲酸可以改善提取效果，且含80～90％乙腈溶液含0.1～0.2％甲酸溶液效果较好，最终选择含0.1％甲酸-80％乙腈水溶液作为提取剂进行实验，结果表明水产品中6种吲哚类物质低浓度(20μg/kg)情况下的回收率也能够达到60％以上。
4、固相萃取柱的选择
对目标物(6种吲哚类物质)进行富集与净化，去除样品中的杂质，将有利于降低基质对检测结果的影响，从而提高灵敏度。在研究中通常运用固相萃取法进行富集与净化，考虑到吲哚类物质具有极性这一化学特性考察了C18柱和HLB固相萃取柱对吲哚类物质进行净化，实验发现，使用C18固相萃取柱净化部分组分保留相对较差；而吲哚在HLB固相萃取柱内的保留相对而言则比较强，采用纯乙腈便可以将吲哚洗脱下来，而且具有较好的净化效果。
实验考察HLB和/>PRiME HLB对物质的保留情况时发现，在浓缩过程中因为氮吹将流出液浓缩至全干，部分吲哚类目标物发生降解或部分目标物质残留在试管壁上未溶解，所以造成回收率偏低的问题。于是在实验中氮吹浓缩至全干调整为吹至近干，当到0.7mL以下时便可以进行复溶。
调整后这两种柱子对水产品中6种吲哚类物质的提取效果如图2所示，由图2可知，采用HLB柱和PRiME HLB柱净化过程中，3-吲哚乙酸、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛的回收率都比较好，但是在使用/>PRiME HLB柱净化后，吲哚和3-甲基吲哚的回收率仍然很低，难以满足分析检测需求，需要进一步进行条件的优化。在下一步实验中，将继续对该方法进行优化。因此，最终选择HLB作为固相萃取柱。
5、基质效应考察
在基于液相-质谱的方法分析生物样本的药物时，由于样品的一些共同提取物使目标化合物的离子化效率增强或是被抑制影响。净化过程中很难达到彻底消除，且同一基质的不同样品间基质效应也有所不同。但是基质效应的大小取决于方法中所采用的离子源。试验采用鱼肉和虾肉样品按实施例2的方法处理，获得样品基质溶液。再用移液枪准确吸取0.75mL样品基质溶液准确加入0.25mL200μg/L吲哚类物质混合标准溶液，得到浓度为50μg/L的基质混合标准溶液。采用移液枪准确吸取0.75mL空白溶剂准确加入0.25mL 200μg/L吲哚类物质混合标准溶液，得到浓度为50μg/L的空白溶剂混合标准溶液，测定样品基质、样品基质标准溶液和采用空白溶剂标准溶液各目标物的峰面积，样品基质标准溶液与样品基质吲哚类物质的峰面积差值与空白溶剂标准溶液对应吲哚类物质的峰面积比值乘以100作为基质效应评估值，结果见图3。
由图3可知，不同基质对吲哚类物质的基质作用不明显，基质效应在80～110％之间，基质效应不明显。这可能是与采用的离子源有关，相较于ESI源，APCI源的基质效应相对不易受到基质效应的影响。因此，试验采用0.1％甲酸-50％乙腈水溶液配制标准曲线。
本发明通过优化前处理过程中的提取剂和固相萃取净化技术，建立了完善的前处理技术，提高了水产品中吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛6种吲哚类物质的回收率、准确度高、精密度高，灵敏度高，操作简单。
实施例4
实际样品分析和鲜度判定
在实施例2已建立的实验条件下，购买市售鲜活明虾和黑鱼，明虾去头、去尾、去壳，黑鱼去皮、去骨，采用绞肉机制成肉泥，各分成10份后装入封口包装袋中(每份约25g)，其中各取一份放入-60℃低温冰箱速冻，保持其样品的状态；其余样品放置于4℃冰箱中，分别于4h、8h、24h、36h、2d、3d、5d、7d和9d时取出1份样品立即放入-60℃低温冰箱速冻，保持其样品状态。所得样品按照实施例2的方法(前处理和检测)进行检测，考察6种吲哚类物质浓度随时间的变化规律，黑鱼样品的测定结果见表12和图4，明虾样品的测定结果见表13和图5。
表12黑鱼样品中吲哚类物质浓度的测定(μg/kg)
由表12和图4可知，黑鱼样品和明虾样品中自身含有吲哚类物质，随着储存时间的延长，吲哚物质的种类和含量随时间的增长而增加，比如黑鱼肉在24h内未产生吲哚、3-吲哚乙酸和吲哚-3-甲醛，在24h后随时间推移逐步产生吲哚，3-吲哚乙酸和吲哚-3-甲醛等物质，总量也在不断上升。
表13明虾样品中吲哚类物质浓度的测定(μg/kg)
由表13和图5可知，虾肉中初始含有少量的吲哚、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛，而3-吲哚乙酸和吲哚-3-甲醛随着放置时间增长开始产生，吲哚类物质的总量也随时间的增长而增加。两类样品在储存过程中均没有见得到3-甲基吲哚。相对于明虾，黑鱼样品中6种吲哚类物质的浓度相对较低，吲哚类物质总量随时间增长而增长，明虾样品中6种吲哚类的浓度相对较高，吲哚类物质总量也随着时间增长，而且放置2d后吲哚类物质总量随时间增长的速度逐渐变快，说明鱼肉和虾肉中的吲哚类物质不断积累，新鲜程度不断在下降。
鱼虾肉不同放置时间的感官对比如图6所示，其中，a)为黑鱼样品，b)为明虾样品。通过观察样品的状态，从感官上可以发现，鱼肉自3d之后腥味开始加重，鱼肉色泽褪去，颜色逐渐泛黄，而且肉质变得松散，液体增多，虾肉则自2d后腥味加重，颜色逐渐泛红，说明鱼肉、虾肉正在发生变质。嗅觉、视觉感官上发生的变化与实验测得的吲哚类物质总量变化趋势基本一致，表明在4～8℃下冷藏2d后，鱼肉和虾肉的新鲜程度开始下降。
因此，可以根据水产品中吲哚类物质含量的变化来评价水产品的新鲜程度，经过多次试验后，确定当黑鱼中6种吲哚类物质总含量≤100μg/kg时为新鲜鱼肉，6种吲哚类物质总含量＞100μg/kg时为相对不新鲜鱼肉。确定当明虾中6种吲哚类物质总含量≤250μg/kg时为新鲜虾肉，6种吲哚类物质总含量＞250μg/kg时为相对不新鲜虾肉。
随机在网上购买鱼、虾生鲜产品各20批，共计40批样品分析，并记录收样时快递包装的状态。样品按照实施例2的方法(前处理和检测)进行检测，其中鱼肉样品吲哚类物质大部分在35.7～125.3μg/kg之间，均保持较新鲜的状态。其中一个样品检出吲哚类物质总量为223.5μg/kg，新鲜度较差。虾样品吲哚类物质大部分在65.7～268.3μg/kg之间，样品的新鲜状态比较好。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，还可以根据本发明实施例在不经创造性劳动前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (10)

1.一种水产品中吲哚类物质的前处理方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测水产品和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；
将所述提取液上样到HLB固相萃取柱中，利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液。
2.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的体积分数为0.1～0.2％，乙腈的体积分数为75～85％；
所述待测水产品与甲酸-乙腈水溶液的料液比为1g：4～6mL。
3.根据权利要求1或2所述的前处理方法，其特征在于，所述混合提取包括依次进行均质提取和振荡提取；所述均质提取的转速为10000～12000r/min，时间为1～2min；所述振荡提取的速度为180～240r/min，时间为8～15min。
4.根据权利要求3所述的前处理方法，其特征在于，所述混合提取后还包括对得到的提取体系进行离心分离，所得上清液为提取液。
5.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述第一乙腈水溶液中乙腈的体积分数为8～12％；
所述甲酸-乙腈混合液中甲酸的体积分数为0.1～0.2％。
6.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述提取液在上样前先用水进行稀释，得到稀释提取液；所述提取液与水的体积比为1：4～5。
7.根据权利要求1所述的前处理方法，其特征在于，所述浓缩后还包括将所得浓缩液进行第二乙腈水溶液定容；
所述浓缩液的体积占提取液体积的35％以下；
所述第二乙腈水溶液中乙腈的体积分数优选为40～60％。
8.一种水产品中吲哚类物质的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
将待测水产品、同位素内标工作溶液和甲酸-乙腈水溶液进行混合提取，得到提取液；
将所述提取液进行HLB固相萃取柱净化，得到待测样品液；所述HLB固相萃取柱净化包括利用第一乙腈水溶液进行冲洗，吹干HLB固相萃取柱，然后利用甲酸-乙腈混合液进行洗脱，收集洗脱液后浓缩，得到待测样品液；
将所述待测样品液进行高效液相色谱串联质谱检测，得到吲哚类物质的检测结果；所述高效液相色谱串联质谱检测采用的质谱离子源为APCI离子源；所述吲哚类物质包括吲哚、3-吲哚乙酸、3-甲基吲哚、吲哚-3-甲醛、吲哚-4-甲醛和吲哚-5-甲醛中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱的高效液相色谱检测条件包括：色谱柱为C18色谱柱，柱温为30～40℃，流动相A为0.1～0.2％甲酸水溶液，流动相B为乙腈，流动相流速为0.25～0.35mL/min，进样量为1～2μL，洗脱方式为梯度洗脱，所述梯度洗脱的程序如下：
0～3min，所述流动相A的体积分数为70～80％；
3～5min，所述流动相A的体积分数由70～80％匀速降低至5～10％；
5～8min，所述流动相A的体积分数为5～10％；
8～8.0min，所述流动相A的体积分数由5～10％匀速增加至70～80％；
8.1～12min，所述流动相A的体积分数为70～80％。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱串联质谱的质谱检测条件包括：电离模式为APCI正离子模式，扫描方式为多反应监测，气帘气压力为25psi，离子喷雾电压为5500V，雾化温度为400℃，雾化气压力为30psi。
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