CN108931516A - 节省进样量的系统参数优化方法及血清元素定量分析方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种节省进样量的系统参数优化方法及血清元素定量分析方法，该方法包括步骤：(1)用浓度为1％的HNO3将血清直接稀释不同倍数制成不同浓度待测液，同时加入内标元素Y，内标浓度为200ng/mL；(2)确定信号采集延迟时间：将进样系统的信号采集延迟时间分别设置为不同值，然后在不同信号采集延迟时间下分别检测待测液，分析测定值随信号采集延迟时间的变化趋势，确定最佳信号采集延迟时间。本发明采用直接稀释的前处理方法，对ICP‑OES进样技术进行优化，本发明方法较默认方法节省80％的血清样品和74％的检测时间，且测定结果准确、可靠，提高了血清样本利用效率，有利于多组学同步研究的顺利开展。

Description

节省进样量的系统参数优化方法及血清元素定量分析方法

技术领域

本发明涉及血清元素定量分析领域，尤其是涉及一种节省进样量的系统参数优化方法及血清元素定量分析方法。

背景技术

随着元素对人体健康的作用越发的受到人们重视，如何高效利用血清进行多元素定量分析已成为分析检测领域一个重要的课题。生命科学的研究已进入多组学时代，金属组学、基因组学、代谢组学等研究都需消耗较多血液样品。然而研究中收集的血清样品量通常十分有限，尤其是婴幼儿的采血量会更加受限，往往仅为0.01-0.03毫升的足跟血或者指血。若仅进行常规金属组学元素分析就消耗较多的血清样品，将会限制血清多组学同步研究。

微波消解已广泛应用于样品前处理，但血清样品中元素含量较低，微波消解过程会引入外来元素污染及易挥发元素损失，且操作成本高，不适于大规模样品检测。相关研究表明采用直接稀释法对血清样品进行前处理可满足检测需，但需选择合适的稀释倍数以减少基体干扰。电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)或质谱仪等在进行常规样品分析时，较多的待测液浪费在浸润管路(进样系统的一部分)，只有小部分待测液产生的信号真正被检测器收集。

在使用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)或质谱仪等进行多元素定量分析时，如何在多元素定量分析结果准确可靠的前提下，降低样品进样量，节省检测时间成为一个亟待解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于：针对现有技术存在的问题，提供一种节省进样量的系统参数优化方法及血清元素定量分析方法，解决现有进样系统的默认使用方法样品进样量大，且检测时间长的问题。

本发明的发明目的通过以下技术方案来实现：

一种节省进样量的系统参数优化方法，该方法包括步骤：

(1)用浓度为1％的HNO3将血清直接稀释不同倍数制成不同浓度待测液，同时加入内标元素Y，内标浓度为200ng/mL；

(2)确定信号采集延迟时间：将进样系统的信号采集延迟时间分别设置为不同值，然后在不同信号采集延迟时间下分别检测待测液，分析测定值随信号采集延迟时间的变化趋势，确定最佳信号采集延迟时间。

优选的，不同倍数为在10～100万倍中任意选择的若干倍数。

优选的，检测过程中，进样系统连续曝光多次，并分别报告多次曝光测定值，分析多次曝光测定值的平均值随信号采集延迟时间的变化趋势，确定最佳信号采集延迟时间。

优选的，该方法包括步骤：

(3)确定采样留置时间：按照最佳信号采集延迟时间设定信号采集延迟时间，进样管置于待测液时开始测定，测定时将进样管分别留置于待测液内不同时间后取出置于清洗液中，分析测定值随采样留置时间的变化趋势，确定最佳采样留置时间。

优选的，将进样管分别留置于待测液内不同时间包括10秒、12秒、14秒……120秒。

优选的，检测过程中，进样系统连续曝光多次，并分别报告多次曝光测定值，分析多次曝光测定值的平均值随采样留置时间的变化趋势，确定最佳采样留置时间。

优选的，该方法包括步骤：

(4)确定最小取样量：根据最佳信号采集延迟时间和最佳采样留置时间确定血清最小取样量。

一种血清元素定量分析方法，该方法包括步骤：

(1)采用40倍直接稀释进行血清样品前处理；

(2)将电感耦合等离子体发射光谱仪的信号采集延迟时间定为28秒；

(3)将电感耦合等离子体发射光谱仪的采样留置时间定为24秒；

(4)将电感耦合等离子体发射光谱仪的最小进样量设置为0.60mL；

(5)利用设定好的电感耦合等离子体发射光谱仪进行微量血清元素定量分析。

与现有技术相比，本发明采用直接稀释的前处理方法，对ICP-OES进样技术进行优化，本发明方法较默认方法节省80％的血清样品和74％的检测时间，且测定结果准确、可靠，提高了血清样本利用效率，有利于婴幼儿血中多元素检测以及多组学同步研究的顺利开展。

附图说明

图1为对比不同信号采集延迟时间下钾元素的信号强度；

图2对比不同采样留置时间下钾元素的信号强度。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。

实施例

本实施例提供一种节省进样量的系统参数优化方法，本发明所指系统不仅仅是电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)的进样系统：日本岛津公司(Shimadzu)，ICPE9800。但本方法适用于所有公司所生产的ICP-OES，同时还可以推广应用于所有公司生产的电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS)的进样系统。此外，检测元素也不限于Na、S、P，K、Ca、Fe、Mg、Zn、Cu、Y等10个元素。本实施例仅以电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP-OES)作为举例。

基于本方法得到的参数，通过优化ICP-OES血清多元素定量分析过程中前处理方法、信号采集延迟时间和采样留置时间，可减少血清样品消耗量和检测时间，提高样品使用效率。下面举个例子对本发明方法做详细说明：

1、本方法的主要试剂包括ICP-OES和ICP-MS可以检测的所有元素，本实施例仅以下几种元素作为举例：

(1)单元素标准溶液：

Na、S、P，K、Ca、Fe、Mg、Zn、Cu、Y。

(2)质量控制标准物质：

Trace Elements Serum L-1，挪威SERO公司，REF：201405，LOT：1309438。

2、本方法中ICP-OES工作条件：

表1 ICP-OES工作条件

3、样品前处理

用浓度为1％的HNO3将血清稀释10～100万倍中的任意选择的若干倍数，如：10倍、40倍、80倍；1万倍、2万倍、3万倍；80万倍、90万倍、100万倍，等。本实施例仅举例：用浓度为1％的HNO3将血清稀释为10倍、20倍和40倍制成不同浓度待测液，同时加入内标元素Y，内标浓度为200ng/mL。

4、确定最小进样体积：

(41)确定信号采集延迟时间：将ICPE 9800信号采集延迟时间分别设置成14秒、16秒、18秒……32秒等，在不同信号采集延迟时间下分别检测待测液。检测过程中，仪器连续曝光三次，并分别报告三次曝光测定值。默认情况下，最终测定结果是三次曝光测定值的平均值。以钾元素为参考元素，分析钾元素三次曝光测定值随信号采集延迟时间的变化趋势，确定最佳信号采集延迟时间。

(42)确定采样留置时间：按照上一步结果设定信号采集延迟时间，进样管置于待测液时开始测定。测定时将进样管分别留置于待测液内10秒、12秒、14秒……120秒后取出置于清洗液中。以钾元素为参考元素，分析钾元素三次曝光测定值随采样留置时间的变化趋势，确定最佳采样留置时间。

(43)确定最小取样量：根据信号采集延迟时间和采样留置时间确定血清最小取样量。

5、建立标准曲线

根据血清中各待测元素的浓度，配制标准溶液，应用本研究所建方法测定标准溶液，建立各元素标准曲线。各元素标准溶液浓度见表2。

表2标准曲线中各元素的浓度

6、实验结果：

(61)测定不同稀释倍数的血清样品，结果表明血清样品直接稀释10倍和20倍时，精密度较差，稀释40倍时精密度较好(见表3)。同时，稀释10倍和20倍时易造成ICP-OES进样系统堵塞及ICP火焰熄灭，稀释40倍时则有效避免上述情况。因此，采用40倍直接稀释进行血清样品前处理。

表3不同稀释倍数下各元素精密度(n＝10)

(62)信号采集延迟时间

对比不同信号采集延迟时间下钾元素的信号强度。结果见图1。

由图1可知，三次曝光测定值随信号采集延长时间的增加变化不同。第一次曝光测定值在信号采集延迟时间为14s-24s内快速升高，26s后达到稳定。第二次曝光测定值在信号采集延迟时间为14s-18s内快速升高，20s后达到稳定。第三次曝光测定值在信号采集延迟时间为14s-32s内均保持稳定。

已知每次曝光时间为5s，则三次曝光的信号采集时间为15s。当信号采集延迟时间设置较短时，虽测定已开始，但血清待测液并未到达ICP火焰或其信号未达到平衡。因此，只有当血清待测液进入到ICP中且信号达到稳定时，检测器才应采集信号。根据第一次曝光测定值的趋势可知，信号采集延迟时间大于28秒时，三次曝光所采集的信号均为血清待测液的稳定信号。因此，将最佳信号采集延迟时间定为28秒。

(63)采样留置时间

对比不同采样留置时间下钾元素的信号强度。结果见图2。

由图2可知，三次曝光测定值随采样留置时间的增加变化不同。第一次曝光测定值在10s-28s内均保持稳定。第二次曝光测定值在10s-16s内快速升高，之后达到稳定。第三次曝光测定值在10s-14s内保持在1550左右，14s-22s内快速升高，之后达到稳定。

当采样留置时间较短时，进入到仪器内的待测液无法满足三次曝光所需体积。根据第三次曝光测定值的趋势可知，当采样留置时间大于24秒时，三次曝光所采集的信号均为血清待测液的稳定信号。因此，将最佳采样留置时间定为24秒。

(64)最小进样量

将进样管插入某一血清稀释液内，记录10分钟内血清稀释液消耗体积。结果可知10分钟约消耗11.8mL血清稀释液，则每秒约消耗20μL血清稀释液。由采样留置时间为24秒可知，完成一次检测约需0.48mL血清稀释液，即12μL血清原液。鉴于进样过程中有部分待测液会残留在进样管或EP管中，故在实际操作中取15μL血清于EP管中，用1％HNO3稀释40倍至0.60mL待测。

(65)进样系统清洗时间

采用本研究所建方法进行测定，调整清洗时间为10，15，20，秒，观察清洗效果发现，清洗15秒以上时，信号已回到基线水平。

以下通过标准曲线相关系数、日内精密度、日间精密度、加标回收实验和人血清标准物质测定等方法学实验，验证并评价本方法的准确性与可靠性：

1、标准曲线线性

各元素的标准曲线方程及相关系数如表4所示。

表4各元素标准曲线方程及相关系数

2、检测限和定量下限

在最佳实验条件下，连续测定11份空白溶液，以11次空白值的3倍标准偏差对应浓度为各元素的检出限，10倍标准偏差对应浓度为各元素的定量下限(见表5)。

表5各元素检出限与定量下限

3、方法精密度

应用该方法对相同血清样品进行六次独立测定，计算测定结果的相对标准偏差得到日内精密度；应用该方法对相同的血清样品连续测定六天，计算测定结果的相对标准偏差得到日间精密度(见表6)。

表6各元素精密度(n＝6)

注：*：mg/mL，#：μg/mL

从表6可知，Na、S、K、P、Ca、Mg、Fe、Cu和Zn元素的日内精密度RSD均小于2％，日间精密度RSD均小于3％。

4、加标回收率

加标回收实验是在测定样品的同时，于某一样品的子样中加入一定量的标准物质并进行测定，将其测定结果扣除样品的测定值，得到加标回收率(见表7)。

表7各元素加标回收率(n＝6)

注：*：μg/mL，#：ng/mL

由表7可知，Na、S、K、P、Ca、Mg、Fe和Cu元素的加标回收率均在100.0％-105.0％之间，Zn元素的加标回收率均为110.5％。

5、血清标准物质检测

通过对人血清标准物质中的Na、P、K、Ca、Mg、Fe、Zn和Cu元素进行测定来评价该方法的准确性(见表8)。

表8血清标准物质测定结果(n＝6)

注：*：μg/mL，#：ng/mL

由表8可知，Na、P、K、Ca、Mg、Fe、Zn和Cu元素的人血清标准物质测定值都在参考值范围内，该人血清标准物质不含S元素。

综上可知，采用1％HNO3对血清进行10倍或20倍稀释后测定结果精密度较差，且易造成进样系统堵塞，而40倍稀释时则可获得长期稳定的测定结果。进样时间为24秒，清洗时间为15秒时即可完成血清中9种元素的定量分析，血清稀释液消耗量为0.48mL，相对应的血清原液消耗量为12μL(0.012mL)，样品检测周期为39秒。在上述实验条件下，9种元素标准曲线相关系数r均大于0.9999，日内精密度RSD均小于2％，日间精密度RSD均小于3％，加标回收率在100％-110.5％之间，人血清标准物质测定值均在参考范围内。

任何样品在进行检测之前都需要经过一定的前处理，徐进力等人的研究表明，采用直接稀释进行前处理时，如果稀释倍数较低，进样系统易发生堵塞进而影响检测结果的准确性；如果稀释倍数过大，则又会因元素含量过低而达不到理想的灵敏度，其分析信号强度将显著减弱，检测结果会产生较大的误差。稀释倍数较低条件下，随着检测样品数量的增加，无机盐会沉积在炬管、雾化器和雾化室中，导致样品测定值产生波动。这与本研究的结果一致，将血清直接稀释10倍和20倍时，进样系统易堵塞并导致ICP火焰熄火，且血清样品在较低稀释倍数下测定结果稳定性较差。因此本研究选用40倍稀释是相对合理的血清稀释倍数。当然，对于浓度较低的待测元素，在样品数不多的前提下也可以采用10倍或者20倍稀释，其相对标准偏差小于4％(参见表3)。

应用ICP-OES进行常规测定时，为保证检测结果的可靠性，通常会将曝光时间设置较长，并将进样管长时间留置于待测液内，直至检测结束后才移至清洗液。本研究所用仪器默认设置信号采集延迟时间为30秒，曝光时间每次30秒、清洗时间30秒，且需在待测液充满管路后才能开始检测过程，因此默认条件下测定一个样品至少需150秒，而实际测定过程往往更长。本研究所建方法将信号采集时间与检测时间相结合，利用浸润管路的溶液进行测定，只需进样24秒即可准确测定。此外，由于进样体积减少，故只需15秒即可完成清洗过程。因此，采用本方法只需39秒即可完成一个检测周期，相较默认方法节省80％的样品消耗量和74％的检测时间，且测定结果准确、可靠。

常规方法进行血清多元素分析时，往往需要0.2mL-0.5mL血清才能完成一个样品的测定。李海龙进行血清中多种元素的电感耦合等离子体发射光谱法直接测定实验时，提取0.4mL血清，直接稀释定容到10.0mL后上机测定。李萌进行血清多元素分析时，取0.5mL血清处理后定容到2.1mL后上机测定。严海英利用微波消解测定疾病人群血清中的微量元素时，取1.0mL血清，前处理后定容到10.0mL上机测定。本研究建立的微量血清多元素定量分析方法仅需约15μL血清，显著减少了测定过程中血清样本消耗量和测定时间，或有望实现指血、足跟血、耳血中多元素定量分析，进而满足婴幼儿人群的检测需求。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(1)用浓度为1％的HNO3将血清直接稀释不同倍数制成不同浓度待测液，同时加入内标元素Y，内标浓度为200ng/mL；

(2)确定信号采集延迟时间：将进样系统的信号采集延迟时间分别设置为不同值，然后在不同信号采集延迟时间下分别检测待测液，分析测定值随信号采集延迟时间的变化趋势，确定最佳信号采集延迟时间。

2.根据权利要求1所述的一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，不同倍数为在10～100万倍中任意选择的若干倍数。

3.根据权利要求1所述的一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，检测过程中，进样系统连续曝光多次，并分别报告多次曝光测定值，分析多次曝光测定值的平均值随信号采集延迟时间的变化趋势，确定最佳信号采集延迟时间。

4.根据权利要求1所述的一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(3)确定采样留置时间：按照最佳信号采集延迟时间设定信号采集延迟时间，进样管置于待测液时开始测定，测定时将进样管分别留置于待测液内不同时间后取出置于清洗液中，分析测定值随采样留置时间的变化趋势，确定最佳采样留置时间。

5.根据权利要求4所述的一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，将进样管分别留置于待测液内不同时间包括10秒、12秒、14秒……120秒。

6.根据权利要求4所述的一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，检测过程中，进样系统连续曝光多次，并分别报告多次曝光测定值，分析多次曝光测定值的平均值随采样留置时间的变化趋势，确定最佳采样留置时间。

7.根据权利要求1所述的一种节省进样量的系统参数优化方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(4)确定最小取样量：根据最佳信号采集延迟时间和最佳采样留置时间确定血清最小取样量。

8.一种血清元素定量分析方法，其特征在于，该方法包括步骤：

(1)采用40倍直接稀释进行血清样品前处理；

(2)将电感耦合等离子体发射光谱仪的信号采集延迟时间定为28秒；

(3)将电感耦合等离子体发射光谱仪的采样留置时间定为24秒；

(4)将电感耦合等离子体发射光谱仪的最小进样量设置为0.60mL；

(5)利用设定好的电感耦合等离子体发射光谱仪进行微量血清元素定量分析。