CN115151633A - 多潜能干细胞衍生的多巴胺能亚型神经元祖细胞的体外扩增 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于扩增多巴胺能神经元祖细胞的方法和组合物，包括使用至少具有以下成分的组合物和培养基：FGF、SHH信号转导激动剂、经典Wnt信号转导激动剂和Wnt‑C59。所述方法包括使多巴胺能神经元祖细胞与包含FGF、SHH信号转导激动剂、经典Wnt信号转导激动剂和Wnt‑C59的培养基接触，以产生扩增的多巴胺能神经元祖细胞群。

Description

多潜能干细胞衍生的多巴胺能亚型神经元祖细胞的体外扩增

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年12月9日提交的美国临时申请第62/945,366号的权益，该申请通过引用全文纳入本文。

关于联邦资助研究或开发的声明

本发明是在美国国立卫生研究院授予的NS076352和NS096282的政府支持下完成的。政府对本发明享有某些权利。

背景技术

美国有100多万帕金森病(PD)患者。PD是由中脑多巴胺(DA)神经元的缺失引起的。目前的治疗方法包括L-多巴和脑深部刺激的使用，可以治疗症状，但不能阻止疾病的进展。因此，有必要开发新的疗法来阻止/逆转疾病进程或再生PD中丢失的神经元。人多潜能干细胞(hPSC)为产生真正多巴胺神经元提供了一个有希望的来源，用于开发帕金森病的疾病修饰疗法。这可通过构建基于人多巴胺神经元的药物发现平台来实现，该平台用于鉴别预防或延迟DA神经元变性过程的药物，或移植DA神经元以替换PD患者的变性细胞。

为了通过高通量筛选(HTS)发现药物，或者为数百或数千名患者进行细胞移植治疗，需要数十亿个DA神经元。产生大量DA神经元的一种方法是从大量干细胞开始。这种策略需要多批次产生DA神经元，但这会在批次之间产生差异。另一种方法是通过生长因子扩增诱导的DA神经元祖细胞，但目前用于扩增命运定向(fate-commited)祖细胞的方法总是会导致失去其原来的命运特性，即DA神经元特性的丧失。特别是，诱导DA神经元祖细胞产生大型投射神经元(如中脑多巴胺神经元)的能力在两到四代内消退，并被其他神经元群体所取代。

因此，持续需要改进方法和组合物，以产生大量适合分化为多巴胺神经元的一致DA神经元祖细胞，它们的量足以进行高通量筛选和细胞治疗。

发明内容

本文描述的方法、组合物和试剂盒解决了多巴胺能神经元祖细胞常规扩增方案的上述缺点。

在第一方面中，本文提供了一种用于扩增多巴胺能神经元祖细胞的方法。该方法可包括或基本上由以下组成：将多巴胺能神经元祖细胞与包含成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、Hedgehog(Hh)信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt-C59的培养基接触，以产生扩增的多巴胺能神经元祖细胞群。Hh信号转导的激动剂可从由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHH C25II、C24-SHH、嘌吗啡胺、Hg-Ag及其衍生物组成的组中选择。经典Wnt信号转导的小分子激动剂可以是糖原合成酶激酶3抑制剂。糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、靛玉红-3′-单肟、5-碘-靛玉红-3′-单肟、坎帕罗酮、SB-415286、SB-216763、2-苯胺基-5-苯基-1,3,4-噁二唑、(Z)-5-(2,3-甲撑二氧基苯基)咪唑啉-2,4-二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314、锂盐或其组合。糖原合成酶激酶3抑制剂可以是CHIR99021，并且可以约0.01微摩尔(μM)到约1毫摩尔(mM)的浓度存在于培养基中。CHIR99021可以约0.6μM的浓度存在于培养基中。WNT-C59可以约0.2微摩尔(μM)至约2μM的浓度存在于培养基中。WNT-C59可以约0.5μM的浓度存在于培养基中。多巴胺能神经元祖细胞在体外可扩增至少300倍。培养基可进一步包含神经补剂B27。多巴胺能神经元祖细胞在体外可扩增至少1000倍。在一些实施方式中，培养基包含约50ng/ml FGF8b、约25ng/ml SHH、约0.6μMCHIR99021和约0.5μM WNT-C59。多巴胺能神经元祖细胞可传代培养至少6次而不丢失表型或基因型。培养基可以是化学组成明确的、无血清且不含异种物质的。

在另一方面，本文提供了根据本发明方法获得的基本上纯的人多巴胺能神经元祖细胞群。

在另一方面中，本文提供包含FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt-C59的组合物。组合物还可包含B27。在一些情况下，该组合物基本上由FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt-C59组成。在一些情况下，该组合物基本上由FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂、Wnt-C59和B27组成。经典Wnt信号转导的小分子激动剂可以是糖原合成酶激酶3抑制剂，选自CHIR99021、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、靛玉红-3′-单肟、5-碘-靛玉红-3′-单肟、坎帕罗酮、SB-415286、SB-216763、2-苯胺基-5-苯基-1,3,4-噁二唑、(Z)-5-(2,3-甲撑二氧基苯基)咪唑啉-2,4-二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314、锂盐或其组合。Hedgehog(Hh)信号转导的激动剂可从由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHHC25II、C24-SHH、嘌吗啡胺、Hg-Ag及其衍生物组成的组中选择。组合物可配制成细胞培养基。

通过下面的描述，将更好地理解本发明的这些和其他特征、目的和优点。在以下说明书中，参照构成说明书的一部分的附图，其中以说明性方式非限制性显示了本发明的实施方式。优选实施方式的描述并不旨在限制本发明并涵盖所有修改、等效方式和备选方案。因此，为了解释本发明的范围，应参考本文所述的权利要求。

通过引用纳入

本说明书中提到的所有发表物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的发表物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。

附图简要说明

当考虑以下的详细描述时，本发明将被更好地理解，并且除了上述内容之外的特征，方面和优点将变得显而易见。这样的具体实施方式参考了以下附图，其中：

图1A-1E证明多巴胺能神经元祖细胞和神经元的高效产生。(图1A)从hPSC衍生DANPC的过程示意图。(图1B)DA NPC共同表达DA转录因子。(图1C)DA NPC进一步成熟成为DA神经元。(图1D)来自hPSC DA神经元的诱导效率。(图1E)DA NPC衍生的DA神经元的功能特性。

图2A-2G显示鉴定FGF8和SHH以扩增DA NPC。(图2A)概述促进DA扩增的化合物测试过程的示意图。(图2B)随细胞数量增加，吸光度的定量((读出基线)*10)。(图2C)评估孔对孔和板对板之间的变化。(图2D)SHH和FGF8不同浓度组合下细胞增殖的定量(吸光度：(读出基线)*10)。(图2E)细胞染色显示在不同浓度的SHH和FGF8组合下处理后DA特征性标志物的保持。(图2F)在扩增后维持DA特性和发育潜力。(图2G)在有限的传代数内保持DA特性和发育潜力。

图3A-3D显示了通过基于小分子的筛选来鉴定其他候选分子。(图3A)概述候选化合物的化学筛选和验证流程的示意图。(图3B)显示诱导DA细胞增殖的小分子库最高命中的图。(图3C)DA标志物的细胞染色揭示，WNT-C59是小分子文库筛选的有效候选分子，能够在保持DA特性的同时扩增细胞群。(图3D)当使用小分子混合物和递增WNT-C59浓度的不同组合处理时，DA群体扩增的定量。

图4A-4E表明，扩增的DA NPC保留DA特性，并进一步成熟为DA神经元。(图4A)使用FSCWB混合物高效扩增DA NPC的示意图。(图4B)使用该方法生成大量DA NPC。(图4C)在扩增过程中，细胞染色显示维持DA特性。(图4D)进一步表征P6 DA NPC。(图4E)定量扩增的DANPC及其在不同传代时成熟为DA神经元的发育潜能。

图5A-5H对DA NPC衍生的神经元进行电生理分析。(图5A)P1和P6多巴胺能神经元的电压门控内向和外向电流，包括内向钠电流的放大图。(图5B)P1和P6神经元的I-V曲线。(图5C)P1和P6神经元动作电位的自发放电。将神经元保持在0pA，连续记录30分钟，以监测sAP放电。(图5D)诱发动作电位：给神经元注入30pA的电流1秒，在P1和P6产生诱发动作电位。(图5E)在P1和P6衍生的神经元中，通过注入一系列1秒的电流阶跃(范围为-5pA至65pA)，观察到诱发动作电位。(图5F-5H)P1和P6的膜电容(Cm)、膜电阻(Rm)和静息膜电位相似。未观察到显著变化(未配对t检验，P>0.05)。

图6A-6D对扩增的DA NPC进行RNA-seq分析。(图6A)扩增的DA NPC的主要成分分析。(图6B)亚型神经元祖细胞特征性标志物的分析。(图6C)大多数改变的基因表达的GO分析。(图6D)扩增DA NPC的分层(hierarchal)聚类结果。PSC：多潜能干细胞；FNPC：前脑神经元祖细胞，和scMNPC：脊髓运动神经元祖细胞。

图7A-7C证明了扩增的DA NPC在PD小鼠中的移植和小鼠行为恢复。(图7A)PD小鼠模型移植及行为学试验方案。(图7B)组织学分析显示，PD模型小鼠脑内大多数表达纤维的人胞质共表达TH。(图7C)移植后不同时间点的圆筒和安非他命诱导旋转行为测试定量。在这两种情况下，移植后5个月观察到显著改善。

图8为从hPSC衍生DA神经元过程的示意图。

图9A-9D描述了FGF8和SHH优化期间DA特性维持的表征。(9A)测试不同剂量的FGF8和SHH对DA扩增的作用。(9B)细胞染色显示，当使用优化浓度的扩增化合物FGF8和SHH时，DA特性被保持。(图9C-图9D)细胞染色显示扩增的DA NPC维持其发育能力，成熟为DA神经元。

图10A-10B显示测试FGF2和CHIR99021的DA扩增潜力。(图10A)测试不同剂量的FGF2用于DA扩增。(图10B)测试不同剂量的CHIR用于DA扩增。

图11A-11B表明，当使用含有B27的化学混合物时，DA NPC的扩增增强。(图11A)将B27添加到FSCW混合物中进一步将扩增潜力提高了3倍。(图11B)在传代过程中使用FSCWB混合物可增加细胞数。

图12显示安非他命诱导的旋转试验的定量。

尽管本发明可以进行大量的改变和采用替代形式，但在附图和以下详述中以示例的方式显示了本发明的示例性实施方式。但是应当理解，示例性实施方式的描述并不旨在将本发明的范围限制在所揭示的特定形式，反之，本发明应涵盖所附权利要求书所限定的本发明范围内的所有变化、等价形式和替代形式。

发明详述

本发明至少部分涉及发明人意外开发的改进方法，用于在30天内将人类干细胞衍生的DA神经元祖细胞扩增1000倍。如本发明所示，化学筛选和属性测试用于鉴定对DA神经元祖细胞的扩增有少量益处的小分子，然后对已鉴定的小分子进行组合测试，以鉴定那些在组合中提供更大作用的小分子。在本申请中所述的化学混合物存在下扩增的DA神经元祖细胞保留相同的DA神经元特性，并且在最佳可得的帕金森病小鼠模型中测试时具有与起始物质相同的治疗效力。通过使用这种混合物，一批100-1000万个DA神经元祖细胞将产生10-100亿个细胞，足以进行高通量筛选或细胞治疗。目前所述的方法和组合物允许中脑多巴胺神经元祖细胞在几周内前所未有地在体外扩增1000倍。

这一发现代表着相对于当前最先进方法的重大进步。特别是，这些方法能够产生一致的大群DA神经元用于细胞替代治疗，尤其是当通过FACS纯化少量DA神经元祖细胞时。扩增方法还可以生成一致的大群DA神经元，用于DA变性疾病的建模，并用于DA神经元的高通量筛选，以用于药物开发和验证。

因此在第一个方面，本发明提供了体外扩增多巴胺能神经元祖细胞(DA NPC)的方法，优选适用于药物筛选用途和再生细胞治疗的DA NPC。这些方法可以实现富集或纯化的人DA NPC的可规模化的工业化生产。在示例性实施方式中，该方法包括将人多巴胺能神经元祖细胞体外接触包含多个小分子或其他化合物的化学混合物，这些小分子或化合物促进DA NPC增殖，同时维持多巴胺能特性和分化为功能性多巴胺能神经元的能力。在一些情况下，多个小分子或化合物包括成纤维细胞生长因子(FGF)、Hedgehog信号转导通路(也称为音猬“SHH”信号转导通路)的激动剂、经典Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的激动剂和Wnt-C59(Porcupine(PORCN)的强抑制剂，是Wnt信号转导的关键调节剂)。在一些实施方式中，所述多个分子还包括B27，B27是一种无血清营养补剂，可促进体外培养神经元的长期存活。

在一些实施方式中，多个小分子或化合物是包含以下试剂的混合物：FGF8、SHH、CHIR99021和WNT-C59。这种小分子或化合物的组合在本文中称为“FSCW混合物”或“FSCW”。

在一些实施方式中，FSCW混合物进一步包含B27以形成“FSCWB混合物”。B27补剂可从各种商业供应商处获得，如ThermoFisher。在一些实施方式中，FSCWB混合物是指包含以下小分子或化合物的化学混合物：FGF8b、SHH、CHIR99021、WNT-C59和B27。

如本文所用，术语“多巴胺能神经元祖细胞”或“多巴胺能神经元祖先细胞(DANPC)”是指将成熟或能够成熟为多巴胺能神经元的祖细胞或前体细胞。优选地，这些术语是指可以形成中脑多巴胺能神经元的基本同质细胞群的神经元祖细胞亚群。多巴胺能神经元祖细胞的特征是OTX2、FOXA2和SOX6(中脑DA神经元发育的关键决定子)的高水平表达，以及其他标志性多巴胺能神经元基因(包括LMX1A、EN1和CORIN)的表达，但基本上不表达前脑、脊髓或后脑标志物。

如本文所用，术语“扩增”及其语法变体指诱导培养的多巴胺能神经元祖细胞群增殖至少2、3、4、5、6或更多代，或至少2、3、4、5、6或更多周，没有细胞特性的改变，也没有DA神经元祖细胞特性或分化为功能性DA神经元的能力的丧失。扩增包括细胞增殖而不分化或失去细胞特性或分化潜力。如实施例中所述，在FSCW和FSCWB混合物存在下培养的DA NPC可在6代中扩增1000倍，而不会分化，也不会显著丧失DA特性，同时保留产生功能性DA神经元的潜力。DA特性的保留可通过任何适当的方法进行评估，包括但不限于检测多巴胺能神经元祖细胞生物标记物的表达，如OTX2、FOXA2、SOX6、LMX1A、EN1和CORIN，并确认前脑、脊髓或后脑标志物的表达丧失。可以使用任何合适的方法评估神经元功能，如全细胞膜片钳记录。也可通过测定移植的扩增DA NPC在帕金森病小鼠模型中拯救运动缺陷的能力评估DA功能。

有益地，FGF是FGF8b或其衍生物和/或变体，其中其每个衍生物和/或变体具有一个或多个SHH信号转导激活剂活性。在一些实施方式中，FGF8b以约25ng/ml至约200ng/ml的浓度存在于培养基中(例如，约25、50、75、100、125、150、175、200ng/ml)。

有益地，WNT-C59以约0.2微摩尔(μM)至约10μM(例如，约0.2μM、0.3μM、0.4μM、0.5μM、0.6μM、0.7μM、0.8μM、0.9μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、6μM、7μM、8μM、9μM、10μM)的浓度存在于培养基中。在一些实施方式中，WNT-C59以约0.5μM的浓度存在于培养基中。

可使用任何典型的Hedgehog(Hh)信号转导通路的激动剂。示范性Hg信号转导激动剂包括但不限于Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、C25-SHH、C24-SHH、嘌吗啡胺、Hg-Ag及其衍生物和/或变体，其中每种衍生物和/或变体具有一种或多种SHH信号转导激活剂活性。在一些实施方式中，Hh信号转导激动剂是重组音猬(SHH)或其变体。在一些实施方式中，Hh信号转导激动剂是从嘌吗啡胺、SAG、GSA-10、20(S)-羟基胆固醇[20(S)-OHC]或其衍生物或变体中选择的小分子。嘌吗啡胺可从多家商业化合物供应商处获得(如TocrisBioscience、Stemgent)。嘌吗啡胺通过直接靶向Smoothened(“Smo”)活化Hedgehog(Hh)信号转导通路，Smo是Hh信号转导通路的关键组成部分。Sinha等人，Nature Chem.Biol.2:29-30(2006)。然而，由于其毒性，与其他Hh信号转导激动剂相比，嘌吗啡胺较不优选。其他可用于激活Hh信号转导的Smo小分子激动剂包括例如SAG(“Smoothened激动剂”)。Hh途径激动剂SAG是一种细胞渗透性氯苯并噻吩化合物，可调节Smo与其下游效应物的偶联。在某些情况下，Hedgehog(Hh)信号转导的激动剂是喹啉酮GSA-10(Hadden等人，(2014)ChemMedChem 9:27–37)或合成氧固醇(OHC)，如20(S)-羟基胆固醇[20(S)-OHC]。OHC可作用于Smo胞外结构域(ECD)中富含半胱氨酸的结构域，正调节Hh信号转导。

当Hh途径激动剂为重组SHH或其变体时，培养基优选包含约10ng/ml至约100ng/ml之间的量的SHH，且更优选包含约25ng/ml至约50ng/ml SHH。因此，重组SHH可在约10ng/ml至约100ng/ml SHH的体外培养物的最终浓度下，更优选在约25ng/ml至约50ng/ml SHH的最终浓度下与DA NPC接触。

可以使用经典Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的任何小分子激动剂。在某些情况下，Wnt/β-连环蛋白信号转导通路激动剂是GSK3抑制剂。通过抑制GSK3，CHIR99021激活典型的Wnt信号转导通路。据报道，CHIR99021通过Wnt信号转导抑制小鼠和人胚胎干细胞(ESC)的分化。有关综述，见Wray和Hartmann，《细胞生物学趋势》22:159-168(2012)。另一种可以使用的GSK3抑制剂是，例如，Wnt/β-连环蛋白信号转导激动剂6-溴-铱-3′-肟(“BIO”)。见Meijer等人,Chem.Biol.10(12):1255-66(2003)。本文所述的GSK3抑制剂可从化合物的商业供应商处获得(如Selleckchem、Tocris Bioscience)。在一些实施方式中，从由CHIR99021和6-溴-铱-3′-肟组成的组中选择GSK3抑制剂。在一些实施方式中，激动剂是CHIR99021(CHIR)。当激动剂为CHIR99021时，培养基优选包含约0.01微摩尔(μM)至约1毫摩尔(mM)CHIR99021，且更优选包含约0.6μM CHIR99021。

在一些实施方式中，多个小分子或化合物是包含以下小分子或化合物的混合物：FGF8、SHH、CHIR99021和WNT-C59。这种小分子或化合物的组合在本文中称为“FSCW混合物”或“FSCW。”

在一些实施方式中，FSCW混合物还包含B27，B27是一种可促进体外培养神经元长期存活的无血清营养补剂，形成“FSCWB混合物”。B27补剂可从各种商业供应商处获得，如ThermoFisher。在一些实施方式中，FSCWB混合物是指包含以下小分子或化合物的化学混合物：FGF8b、SHH、CHIR99021、WNT-C59和B27。B27可在体外培养中以约1％至约5％B27的最终浓度与DA NPC接触。如实施例中所述，在FFSCWB混合物存在下培养的DA NPC可在6代中扩增1000倍，而不会显著丧失DA特性，同时保留产生功能性DA神经元的潜力。

如本文所指的术语“细胞培养基”(本文也称为“培养基”或“基质”或“培养基质”)是用于培养细胞的培养基，其含有维持细胞活力和支持增殖的营养物。细胞培养基可以适当组合包含以下任何一种：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖、抗生素、血清或血清替代物，以及其他组分，例如肽生长通常用于特定细胞类型的细胞培养基。通常用于特定细胞类型的细胞培养基是本领域技术人员已知的。可使用的示例性细胞培养基包括MATRIGEL^TM基质(BD Biosciences，NJ)上或在

表面上的mTESR-1培养基(StemCellTechnologies，Inc.，Vancouver，California)或Essential 8(E8)培养基(LifeTechnologies，Inc.)，或在Johansson和Wiles CDM中添加胰岛素、转铁蛋白、脂质和聚乙烯醇(PVA)作为牛血清白蛋白(BSA)的替代品。商用培养基的示例还包括但不限于杜氏改良伊氏培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、基础伊氏培养基(BME)、敲除DMEM、高级DMEM/FI2、RPM1 1640、翰氏F-10、翰氏F-12、a-最小必需培养基(aMEM)、格氏最小必需培养基(G-MEM)、Iscove改良杜氏培养基，或经改良用于多能细胞的通用培养基，如X-VIVO(Lonza)。

在一些实施方式中，培养基进一步含有一种或多种补剂可能是有利的，例如，血清、敲除血清替代物(KSR)、胎牛血清(FBS)、Glutamax、非必需氨基酸、β-巯基乙醇(β-ME)、核苷、核苷酸、N2补剂、Glutamax、牛血清白蛋白(BSA)及其组合。本文所用的“补充的”指组合物，例如，包含补充成分的培养基，而非将补充物引入培养基的行为。

在一些实施方式中，最好使用化学成分确定的培养基。如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”和“化学成分确定的培养基质”可互换使用，并指含有完全公开或可鉴定成分的配方的培养基，其精确量已知或可鉴定，并且可单独控制。因此，如果(1)所有培养基成分的化学和结构特性未知，(2)培养基中含有未知量的任何成分，或(3)两者都未知，则培养基不是化学成分确定的。通过使用化学成分确定的培养基来使培养条件标准化，将细胞在细胞培养过程中接触到的物质批之间或批次之间(batch-to-batch)变化的可能性降至最低。因此，当添加到在化学成分确定的条件下培养的细胞和组织中时，各种分化因子的作用更容易预测。如本文所用，术语“无血清”是指不含或基本不含从动物(例如，胎牛)血液中获得的血清的细胞培养物质。一般来说，在没有动物源性物质的情况下(即在没有异种物质的条件下)培养细胞或组织可以减少或消除跨物种病毒或朊病毒传播的可能性。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及天然产生的氨基酸聚合物，包含修饰残基的那些，和非天然产生的氨基酸聚合物。

获得多巴胺能神经元祖细胞(DA NPC)

要扩增的DA NPC可以从各种来源获得。例如，DA NPC可通过干细胞分化产生，如美国专利公开文本20140248696(通过引用整体纳入本文)所述，其描述了通过神经上皮细胞定向分化产生包括中脑多巴胺能神经元祖细胞在内的神经元亚型特异性祖细胞群的方法。干细胞可以是多潜能干细胞、诱导的多潜能干细胞、多能干细胞、单能干细胞或其组合。将干细胞(包括多潜能干细胞)分化诱导为包含多巴胺能神经元祖细胞的细胞群的方法不受限制，并且对于本领域的从业人员来说其方法是可得和已知的。

本文中，适用于本发明方法的“多潜能干细胞”是具有分化为所有三个胚层细胞能力的细胞。适用于本文的合适的多潜能干细胞包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导多潜能干细胞(iPS)。本文中，“胚胎干细胞”或“ESC”指衍生自囊胚内细胞团的多潜能干细胞或多潜能干细胞群。参见例如Thomson等，Science 282:1145-1147(1998)。这些细胞表达Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81，呈致密的菌落，核质比高，核仁明显。ESC可从WiCell研究所(WiCell研究所(WiCell Research Institute)，威斯康星州麦迪逊)等渠道购买。本文中，术语“诱导多潜能干细胞”或“iPS细胞”指如下所述的多潜能干细胞或多潜能干细胞群：它们可能分化自不同的体细胞来源、就一组特定的潜能(potency)决定因子而言可能不同、用于分离它们的培养条件可能不同，但与它们各自的分化来源体细胞基本上遗传相同，并表现出与高潜能细胞(如ESC)相似的特征，如本文所述。参见例如Yu等，Science318:1917-1920(2007)。

诱导多潜能干细胞表现出与ESC相似的形态特征(如圆形、大核仁和少细胞质)和生长特征(如倍增时间约17到18小时)。此外，iPS细胞表达多潜能细胞特异性标志物(例如Oct-4、SSEA-3、SSEA-4、Tra-1-60或Tra-1-81，但不表达SSEA-1)。然而，诱导多潜能干细胞并非直接衍生自胚胎。本文中，“非直接衍生自胚胎”表示用于产生iPS细胞的起始细胞类型是非多潜能(non-pluripotent)细胞，例如多能(multipotent)细胞或终末分化细胞，例如从出生后个体获得的体细胞。

可通过组织活检或其他组织取样方法从目标组织获得或分离用于重编程为诱导多潜能干细胞的对象特异性体细胞。在一些实施方式中，在用于本发明的三维组织构建物之前，在体外操纵受试者特异性细胞。例如，在根据本发明的方法分化为视网膜祖细胞之前，可扩增、分化、基因修饰、接触多肽、核酸或其他因子、冷冻保存或以其他方式修饰受试者特异性细胞。

在一些实施方式中，细胞可以是自体或异体细胞(相对于要治疗的受试者或可能接受细胞的受试者而言)。因此，可从怀疑患有或发展神经退行性疾病或神经病变的哺乳动物获得体细胞或成年干细胞，并且如此获得的细胞可转化(重新编程)为使用本文所述的组合物和方法扩增的DA NPC。

在一些实施方式中，在无异种细胞培养基中培养上述任何细胞。对于临床治疗而言，最重要的是衍生细胞群中没有异种物质，即没有非人细胞、细胞片段、血清、蛋白质等。在没有动物源性物质的情况下(即在没有异种物质的条件下)培养细胞或组织可以减少或消除跨物种病毒或朊病毒传播的可能性。

在促进分化为DA神经元祖细胞的条件下培养hPSC(如hESC或HIPS)之前，可以在没有饲养细胞层(如成纤维细胞层)的情况下在适合hPSC增殖的基质上培养hPSC，如MATRIGEL^TM,玻连蛋白、玻连蛋白片段或玻连蛋白肽或

在一些实施方式中，在没有饲养细胞层时，HPSC至少传代1次到至少约5次。用于hPSC传代和维护的合适培养基包括但不限于

和E8^TM培养基。在一些实施方式中，在无氙条件下维持和传代hPSC，其中细胞培养基是化学成分确定的培养基，例如E8或mTeSR，但细胞维持在完全确定的无氙基质上，例如人类重组玻连蛋白或

(或另一种类型的自涂覆基质)。在一个实施方式中，将hPSC维持在E8培养基中，并在人重组玻连蛋白或其片段、人重组玻连蛋白肽或化学成分确定的自涂覆基质(如

)上传代。

任何适当的方法都可用于检测本文所述细胞类型特征性生物标志物的表达。例如，可以使用例如RNA测序、免疫组织化学、聚合酶链式反应、qRT-PCR或检测或测量基因表达的其他技术来检测一个或多个生物标志物的存在或不存在。用于评估上述标志物的合适方法在本领域中是众所周知的，并且包括例如用于评估RNA水平上的基因表达的qRT-PCR、RNA-测序等。分化细胞特性也与多能性标志物如NANOG和OCT4的下调(相对于人ES细胞或诱导多潜能性干细胞)有关。用于评估细胞群中标志物的蛋白质水平表达的定量方法也是本领域所知的。例如，通常用流式细胞术来确定给定细胞群中表达或不表达目标蛋白标志物的细胞的比例。在一些实施方式中，通过本发明方法获得的扩增DA神经元祖细胞群包含至少80％、85％、90％、95％和优选至少98％的DA NPC，其表达DA NPC的特征性生物标志物：OTX2、FOXA2、SOX6、LMX1A、EN1和CORIN。

细胞治疗

在另一方面，本文提供了根据本发明方法扩增的多巴胺能神经元祖细胞在再生医学领域中有效用于提供已丢失的多巴胺能细胞的方法。这些细胞可用于治疗的疾病包括帕金森病。

在一些实施方式中，例如通过基于表面标记的分选(例如，FACS)从异质细胞群中分离DA神经元祖细胞，并且分离出的DA神经元祖细胞根据本发明的方法进行扩增，从而产生具有足够数量的DA神经元祖细胞的纯或基本纯的群体用于细胞治疗。如实施例中所述，当在帕金森病金标准小鼠模型中测试时，通过本发明方法扩增的DA神经元祖细胞保留相同的DA神经元特性，并具有与起始物质相同的治疗效力。有利的是，这些方法还可以扩增祖细胞，以产生DA神经元，而没有通过常规扩增方法观察到的批次间的变化。

在一些实施方式中，扩增的多巴胺能神经元祖细胞使用任何合适的方案分化为多巴胺能神经元(DA)，如Chen等人，Cell Stem Cell 18(6):817-826(2016)所述的中脑DA神经元产生方法。在一些实施方式中，修改Chen 2016的方法，从方法的第9天开始，使用包含重组SHH(C25II，100ng/ml)、FGF8b(100ng/ml)和CHIR99021(0.4μM)的培养基4天。在第14天后，培养基包含重组SHH(C25II，100ng/ml)、FGF8b(100ng/ml)，并且细胞可以在该培养基中维持1-2周。

药物开发方法

在另一方面，本发明提供了生产和使用DA神经元祖细胞扩增群体的方法，用于高通量筛选候选试验物质和鉴定具有减缓、阻止和/或逆转神经变性疾病进展的治疗活性的试剂。这些药物可用于治疗有需要的受试者的神经退行性疾病。在一些实施方式中，可以筛选如本文所述获得的DA神经元祖细胞的扩增群体，以鉴定调节神经发育和/或引起神经毒性的物质。

在示例性实施方式中，所述方法使用根据本发明方法获得的DA神经元祖细胞的扩增群体来筛选药物试剂、小分子试剂等。例如，扩增的DA神经元祖细胞群分化为DA神经元，DA神经元接触测试物质。可以对接触的DA神经元进行研究，以检测神经元在接触测试物质后生物学性质的变化。

筛选方法可以包括或基本上由以下组成：(a)使测试试剂接触DA神经元祖细胞的扩增群体或通过分化扩增的祖细胞群体获得的DA神经元群体；和(b)检测试剂对DA神经元或扩增群体的祖细胞的影响(例如，破坏或以其他方式改变神经细胞类型的神经发育、形态或功能，或分化)。在一些实施方式中，筛选方法包括筛选候选化合物，以确定促进人多巴胺能神经元发育、形态和/或寿命的测试试剂。在一些事实方式中，可筛选候选化合物对人神经细胞类型或组织的毒性。在一些实施方式中，检测包括检测试剂对此类细胞和组织的形态或寿命的至少一种积极或消极影响，其中增加或减少人神经细胞类型或组织的寿命，或对人神经细胞类型或组织的形态有积极或消极影响的试剂被认为对人神经管或神经组织的发育有影响。在一些实施方式中，检测包括执行选自下组的方法：RNA测序、基因表达谱、转录组分析、细胞增殖分析、代谢组分析、检测报告物或传感器、蛋白质表达谱、福斯特共振能量转移(FRET)、代谢概况分析和微透析。在一些实施方式中，可筛选该试剂对基因表达的影响，检测可包括分析相对于未接触的仿生神经花结(neural rosettes)或其衍生的细胞的差异基因表达。

在示例性实施方式中，检测和/或测量在测试化合物暴露于(例如接触)一个或多个仿生神经花结后至少一种基因表达水平的正或负变化包括使用例如RNA测序的全转录组分析。在这种情况下，可以使用例如数据处理软件程序(如Light Cycle、RSEM(通过最大期望的RNA-Seq)、Excel和Prism)计算基因表达。见Stewart等人,PLoS Comput.Biol.9:e1002936(2013)。当合适时，可使用ANOVA分析、Bonferroni校正方差分析或双尾斯氏t检验进行统计比较，其中值在P<0.05时具有显著性。可用任何合适的方法从神经构建物中分离RNA或蛋白质。例如，可分离总RNA并反转录以获得用于测序的cDNA。

如本文所述，本发明的方法优于用于药物开发筛选的标准体外和体内方法。特别是，本文所述方法为筛选测试物质提供了灵敏、可重复和可量化的方法。可快速在DA神经元纯群体上筛选测试物质的治疗活性，与使用其他方法获得的神经元进行筛选相比具有更高的重复性和可预测性。事实上，体外筛选方法可以在不需要人受试者或动物模型的情况下进行。这些方法可以经济地进行(例如，使用需要最少测试物质量的多孔板)，并且容易适应高通量方法(例如，使用机器人或其他自动化过程)。这些方法是体内动物分析的更好代替，体内动物分析是可量化的分析，但容易出错，需要大量动物，并且不容易在实验室之间进行标准化或可规模化以进行高通量筛选。基于动物分析的缺点促使包括食品和药物管理局(FDA)和美国农业部在内的监管机构促进开发基于细胞的模型，该模型包括更具生理相关性的人细胞，并具有大规模定量体外建模和筛选应用所需的灵敏性和一致性(美国国立卫生研究院，2008年)。

如本文所用，“测试物质”不受特别限制，包括例如单一化合物，如天然化合物、有机化合物、无机化合物、蛋白质、抗体、肽和氨基酸，以及化合物文库、基因库表达产物、细胞提取物、细胞培养上清、发酵微生物产物、海洋生物提取物、植物提取物、原核细胞提取物、单细胞真核生物提取物和动物细胞提取物。这些可能是纯化产品或粗纯化产品，如植物、动物和微生物的提取物。测试化合物可包括FDA批准的和FDA未批准的药物(包括在后期动物试验或人临床试验中失败的药物)，其毒性特征已知或未知。此外，生产测试物质的方法不受特别限制；测试物质可分离自天然材料，通过化学或生化方法合成，或通过基因工程制备。“测试物质”还包括上述物质的混合物。

在接触本文所述的DA神经元祖细胞的扩增群体之前，可将测试化合物溶解在溶剂，例如二甲基亚砜(DMSO)中。在一些实施方式中，鉴定试剂包括分析扩增群体已接触细胞的生物活性中正或负变化，包括但不限于基因表达、蛋白质表达、细胞活力和细胞增殖。例如，微阵列方法可用于在使多种测试化合物接触扩增群体之前、期间或之后分析基因表达谱。在一些情况下，本发明的方法还包括其他分析，例如代谢分析和蛋白质表达谱分析。

生产制品

在另一方面，本文提供一种试剂盒，其包含一种或多种用于获得DA神经元祖细胞扩增群体的组分。试剂盒的组分可包括一种或多种组合物，其包含促进DA神经元祖细胞体外扩增的小分子或化合物，例如“FSCW”混合物或“FSCWB”混合物。试剂盒还可包含化学成分确定的培养基和一种或多种其它培养基组分或补剂。在一些实施方式中，试剂盒还包含使用DA神经元祖细胞扩增群体筛选测试物质的说明，以鉴定对DA神经元产生特定影响的物质。在一些实施方式中，该试剂盒还包含用于细胞治疗的DA神经元祖细胞扩增群体的分化说明。

除非另外定义，否则，本文中所使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的含义。虽然可采用与本文所述类似或等同的任何方法和材料实施或测试本发明，但本文描述了优选的方法和材料。

在本说明书和权利要求书中，术语“包括”和“包含”是开放式的术语，应被解释为表示“包括但不限于”。这些术语涵盖了限定性更强的术语“主要由……组成”和“由……组成”。除非上下文另有明确说明，本文和所附权利要求书所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数含义。因此，术语“一个”(或“一种”)、“一种或多种”和“至少一种”在本文中可以互换使用。还应当注意，术语“包括”、“包含”、和“具有”可以互换使用。

如本文所用，“基本上由……组成的培养基”是指含有指定成分和对其基本特性无重大影响的成分的培养基。

如本文所用的“约”是指在所述浓度范围、密度、温度或时间范围的5％之内。或者，并且特别是在生物系统中，术语“约”和“大约”可以表示在给定值的一个数量级内的值，优选在给定值的5倍之内，更优选在给定值的2倍之内。除非另有说明，否则本文给出的数量是近似的，这意味着当没有明确说明时，可以推断出术语“约”或“大约”。

在考虑以下非限制性实施例的基础上，能够更完整地理解本发明。

实施例

实施例1-来自hPSC的多巴胺能亚型神经元祖细胞基于小分子的扩增拯救帕金森 病小鼠

该实施例说明了发明人的开发并验证基于小分子的混合物以及用于在不丧失DA-NPC特性或发育潜力的情况下扩增人多潜能干细胞(hPSC)衍生的DA神经元祖细胞(DA-NPC)的方法。如本文所述，DA NPC在存在小分子混合物的情况下，在体外和移植到帕金森病小鼠模型后保留了其特性和发育潜力。这种策略可以促进增殖，但可以维持祖细胞的命运特性，促进其在高通量分析和细胞治疗中的应用。

结果

DA NPC从hPSC被高效诱导：之前已经开发了一种高效将hPSC分化为DA神经元的方案(Chen等人，2016；Xi等人，2012)(图1A)。在该条件下，DA NPC在hPSC分化的3-4周内出现，DA特征转录因子(LMX1A/OTX2、LMX1A/FOA2和LMX1A/CORIN/EN1>80％；LMX1A/EN1>50％)的共免疫染色证明了这一点(图1B)。成熟两周后(图8)(Chen等人，2016)，DA NPC发育出广泛的神经突，并共表达成熟的DA神经元标志物，包括TUJ1、MAP2和酪氨酸羟化酶(TH)(图1C-1D)。电生理记录显示分化神经元的功能成熟，如典型的Na⁺/K⁺电流、动作电位和低频自发放电模式所示(图1E)。

FGF8和SHH不足以扩增DA NPC：为了确定DA NPC是否可扩增以及如何扩增，首先建立了一种基于CKK8的细胞数量测定方法。该分析基于平板阅读器的吸光度读数，通过监测线粒体活性来估计总细胞数，线粒体活性用于候选分子的初步筛选/测试并验证命中率(图2A)。

首先通过在每个孔中增加DA NPC的数量来确定最佳铺板密度。CKK8吸光度与细胞数量的增加在20000到120000个细胞/孔之间呈线性关系。当铺板密度超过120000个细胞/孔时，吸光度达到平台(图2B)。使用20000个细胞/孔进行后续分析。使用该最佳接种密度(20000个/孔)，检查了孔与孔之间以及板与板之间的变化(图2C)。没有明显的孔与孔之间以及板与板之间的变化(图2C)。因此，该分析在该接种密度下是一致的。

FGF8和SHH对于诱导DA NPC的特性至关重要(Chen等人，2016；Xi等人，2012)。因此测定了FGF8和SHH在维持DA特性的同时扩增DA NPC的能力。通过使用不同的剂量组合(25、50和100ng/ml的SHH加上25、50、100和200ng/ml的FGF8)，在FGF8的较高剂量(100或200ng/ml)下，DA NPC的数量显著增加(图2D)。然而，如LMX1A和OTX2的共表达缺失所示，扩增的NPC丢失DA-NPC特性(图2E)。当FGF8剂量为50ng/ml，SHH剂量为25ng/ml时，DA NPC以1:3的比例略微扩增一代，在5天的扩增过程中，LMX1A和OTX2的共表达没有丢失(图2D-2F；图9A-9B)。然而，在FGF和SHH的这种组合下，当通过第3次传代进一步扩增DA NPC时，DA NPC的增殖率降低，即使其保留了DA特性(图2G；图9C-9E)。

据报道，FGF2和CHIR99021用于扩增泛NPC或特定NPC(Du等人，2015；Taupin等人，2000)。在10-200ng/ml的剂量下，单独使用FGF2可诱导显著的细胞增殖，但在5天中的一次传代中导致LMX1A和OTX2的共表达丧失(图10A)。同样，CHIR单独在一定剂量范围内扩增DANPC，但DA NPC特性(LMX1A和OTX2的共同表达)仅在狭窄的剂量窗口(0.6μM)内保留。较低或较高的CHIR浓度导致DA特性丧失(图10B)，这与之前的报道一致，即CHIR沿着前后轴(AP)和背腹轴(DV)形成神经细胞特性(Tao和Zhang，2016)。因此，需要新组分来进一步扩增DANPC。

化学筛选确定了另一种扩增DA NPC的化合物：以FGF8+SHH为基础条件，FGF8+SHH+DMSO为对照，FGF8+SHH+1为筛选模式，建立了化学筛选平台。利用标准化筛选平台(图3A)，筛选了约1200个小分子(Tocris Total)，并鉴定了吸光度比中值吸光度大于提高2倍的前5种候选化合物(图3B)。通过对扩增后的细胞手动计数(1代；5天；比例1:3)验证这些候选物，发现这五种中只有一种命中，即作为WNT拮抗剂的WNT-C59在诱导扩增后保持DA特性，LMX1A和OTX2的共表达证明了这一点(图3C)。在2μM处，WNT-C59在FGF8+SHH的顶部诱导了5倍扩增(图3D)。我们将其称为“FSW”混合物。

DA NPC通过优化的混合物进行扩增：由于WNT-C59是WNT拮抗剂，并且由于低剂量(0.6μM)的CHIR可扩增DA NPC，但不会改变细胞特性(图10B)，假设将CHIR添加到FSW混合物中(产生“FSCW”混合物)可能产生加成效应。事实上，与使用FSW相比，观察到细胞数量进一步增加了50％(图3D)。由于WNT-C59和CHIR对WNT通路的影响相反，通过从0μM开始滴定剂量，直到导致细胞死亡(在20μM时观察到)来优化WNT-C59的剂量(图3D)。WNT-C59在浓度为0.5μM的混合物中发挥最大效果(图3D)。通过调整培养基补剂进一步优化了小分子混合物。添加B27(产生“FSCWB”混合物)进一步将细胞数量增加3倍(图3E)。使用优化的“FSCWB”混合物，在6孔板的一个孔中从100万开始扩增DA NPC，并在细胞群达到70％至90％汇合时每5天以1:3的比例传代细胞。通过6次传代，DA NPC在混合物存在的情况下扩增了约1000倍(图3F)。

扩增的DA NPC保留细胞特性和分化潜能：为了确定扩增的细胞是否保留DA NPC特性，在第1、3、6和8代对细胞进行FOXA2和OTX2表达的免疫染色。此外，对SOX6细胞进行染色；SOX6是中脑DA神经元发育的一个关键决定物，通过与OTX2协调来确定神经元祖细胞阶段黑质DA神经元亚群(Panman等人，2014)。如SOX6/FOXA2/OTX2单阳性和三阳性细胞的定量所示，大部分细胞表达这些标志物(三阳性：第1、3和6代分别为72.2％、71.8％和68.4％)(图4C和4E；图11B)，表明维持了DA-NPC的特性。进一步扩增导致三阳性细胞比例逐渐减少，到第8代时达到50％以下。因此，使用我们的FSCWB混合物使NPC扩增6代，使其能够扩增1000倍。第6代扩增祖细胞的DA特性还通过其与其他标志性DA基因的共表达得到进一步证实，这些基因除SOX6、FOXA2和OTX2外还包括LMX1A、EN1和CORIN(图4D)。

为了确定扩增后的DA NPC是否保留分化潜力，在扩增5天/代后从第1、3和6代分化NPC。定量分析表明，超过50％的细胞在第1、3和6代表达TH(图4E)，表明它们是DA神经元。

进行全细胞记录以分析第1代和第6代多巴胺能神经元的功能活动。当受到去极化电压阶跃刺激时，两代都显示出电压门控的内向和外向电流(图5A)。被动膜特性分析表明，P1和P6之间没有任何显著差异，除了非电压＝-30mV时(图5B)。同样，P1和P6衍生的神经元都显示出动作电位的自发放电(图5C)。电流阶跃刺激神经元时，在两代中都观察到诱发动作电位(图5D和5E)。第1代和第6代DA神经元的自发动作电位和诱发动作电位之间无统计学差异(图5F-5H)。

综上所述，DA NPC在6代中扩增了1000倍，但没有显著丧失DA特性，并保留生成功能性DA神经元的潜力(图4A)。

全局基因表达分析证实DA NPC的特性：由于有丝分裂原的作用，区域特异性神经元祖细胞的扩增常常导致位置特性的改变。因此，对第1、3、6和8代的DA NPC以及未分化的PSC、前脑NPC和脊髓NPC进行RNAseq分析，这些NPC是根据公开的方案(Li等人，2009年，Du等人，2015年)从相同的PSC产生的，作为对照。主要成分分析(PCA)表明，DA NPC保留着与其他区域特异性NPC(前脑NPC和脊髓NPC)不同的DEG。对不同代次产生的DA NPC进行了主成分分析(PCA)。DA NPC与未诱导的多潜能干细胞或其他亚型神经元祖细胞不同(图6A)。通过深入观察，在不同的组分分组分析子集下，第1、3和6代的DA NPC比第8代的DA NPC分组更近(图6A)，表明DA NPC的基因表达模式至少维持了6代。

DEG分析表明，DA NPC在6代中表达了类似水平的DA相关基因，包括OTX2、EN1、FOXA2、LMX1A和CORIN，而EN1、LMX1A和CORIN的表达强度在第8代下降(图6B)。这种基因表达模式的变化与细胞水平的观察结果一致。在DA-NPC扩增的6代中，没有多潜能性、前脑或脊髓基因的表达，进一步证实了在扩增过程中维持中脑(DA)特性(图6B)。

对第8代和第6代的基因表达进行比较后发现，大多数上调的基因被归为HOX家族相关基因(图6C)，这表明随着扩增，区域特性向更尾轴的方向转移。下调幅度最大的基因富集在激素、离子转运、离子通道活性等基因类别周围(图6C)。分层聚类表明，扩增后的DANPC紧密聚集在一起，在相关性距离所反映的整体表达模式方面彼此相同，不同于未分化的PSC、前脑NPC和脊髓NPC(图6D)。这些结果为操纵DA NPC进一步扩增的相关途径提供了基础。

扩增的DA NPC移植拯救PD小鼠的运动缺陷：为了确定扩增的DA祖细胞是否像未扩增的DA祖细胞一样保留治疗潜力，将第6代扩增的DA祖细胞移植到成年SCID小鼠的纹状体中，所述SCID小鼠如前所述通过向黑质注射6-羟多巴胺(6-OHDA)(也称为氧化多巴胺或2,4,5-三羟基苯乙胺)而受损(图7A)(Chen等人，2016)。6-OHDA是一种神经毒性合成有机化合物，广泛用于诱导帕金森病(PD)的主要细胞过程，如氧化应激、神经变性、神经炎症和凋亡性神经元死亡。

行为分析表明，接受培养基注射的PD小鼠(对照组)在移植后1、3、4和5个月的圆筒测试和安非他命诱导的旋转试验中没有显示出变化。五个月时的组织学检查显示移植脑的纹状体中存在移植物，如hNu+细胞所示。>80％的人特异性纤维(由STEM121标记)与多巴胺能神经元标志物TH共标记(图7B)。移植后3个月的圆筒测试和安非他命诱导的旋转显示，接受扩增的DA NPC移植的患者单侧前肢接触减少(图7C)。这些结果表明，DA祖细胞在FSCWB混合物中扩增并移植到纹状体后，保留了恢复PD小鼠运动功能的能力。

意义

本文公开了一种化学混合物，其用于将DA NPC扩增1000倍。扩增后的DA NPC通过维持中脑底板特征和DA NPC的基因表达谱来维持其特性。它们在体外和体内表现出与未扩增细胞相似的分化为DA神经元的能力，有助于PD小鼠模型运动功能的恢复。扩增谱系定向的NPC的能力能够生产大量质量一致的专门NPC，促进其在药物开发和细胞治疗中的应用。

神经元祖细胞的扩增通常通过在FGF2和/或EGF存在的情况下培养细胞来实现。然而，这种方法会导致祖细胞区域特性乃至扩增细胞命运的丢失。已显示，通过使用小分子混合物对脊髓运动神经元祖细胞的背腹轴特性进行严格调节，可以在增殖过程中维持脊髓运动神经元祖细胞的特性(Du等人，2015)。也有报道称扩增了功能性非神经细胞类型的祖细胞。特别是，已经证明，通过与器官匹配的间充质共培养或化学诱导去分化来扩增胰腺祖细胞和肝细胞祖细胞是可行的(Sneddon等人，2012年；Fu等人，2019年)。为了维持中脑DA祖细胞，维持祖细胞的腹侧中脑特性至关重要。有趣的是，本文中鉴定的关键分子是一种WNT拮抗剂。不受机理限制，DA NPC在CHIR存在的情况下扩增时倾向于尾轴化(后脑)，WNT-C59中和CHIR的尾轴化作用，从而平衡祖细胞的延缘尾轴身份。当然，WNT-C59也可能调节祖细胞的背腹轴特性。这表明需要调整SHH的浓度。这样，DA NPC的命运在一段时间的增殖过程中得以维持。

通过本文公开的方法，没有实现DA NPC持续的自我更新。然而，扩增程度具有重要的隐含价值。从100万个祖细胞开始，用本文公开的方法扩增1000倍后，将产生10亿个细胞。这将为HTS或细胞治疗产生足够数量的质量一致的细胞。这对于目前尚未高效分化的细胞类型特别有用。此外，在进行扩增培养的群体中，观察到非神经细胞元和非DA神经元细胞的增加，这就进一步要求开发一种专门用于扩增DA神经元祖细胞的化学混合物。在这种实施方式中，可以分离(例如，通过基于表面标志物的分拣)祖细胞，并使用本文描述的方法进行扩增，从而产生足够数量的靶细胞。另一方面，这些发现表明了亚型特异性神经元祖细胞自我更新的信号转导通路，例如通过平衡使用WNT激动剂和拮抗剂精细调节WNT信号转导通路，以维持特定亚型细胞的命运。这些发现为通过探索确定的自我更新相关信号转导通路，为作为未来研究的最终目的的实现亚型神经元祖细胞的自我更新铺平了道路。

总的来说，这些研究结果证明了在培养皿中通过基于小分子的化学方法以富集方式扩增罕见亚型特定神经元群体的可行性。以这项扩增DA亚型神经元祖细胞的研究为例，本文中为使用小分子化学方法扩增定向祖细胞的策略和原则可适用于其他亚型神经元祖细胞、其他组织类型或细胞品系。

方法

HPSC培养：人胚胎干细胞(品系H9，第20-40代)如前所述进行培养(Chen等人，2016)。简而言之，每周使用分散酶(Dispase)(1mg/ml，Gibco)传代细胞，并将其铺在一层辐照过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)上。hPSC培养基由DMEM/F12基础培养基、20％敲除血清替代品(KSR)、0.1mMβ-巯基乙醇、1mM l-谷氨酰胺、非必需氨基酸(Gibco)和4ng/ml FGF-2(R&D Systems)组成。

DA NPC的生成和扩增：DA NPC如前所述生成，尤其是从第9天开始添加FGF8b(Chen等人，2016；Xi等人，2012)(图1A)。产生的DA NPC作为第一代在涂覆有MATRIGEL^TM(1:30；PBS稀释并储存在4℃中以供2周内使用)的6孔板上以1×10⁶细胞/孔传代。过夜后，将培养基换成扩增培养基中的FSCW混合物。FSCW混合物含有FGF8b(50ng/ml；Peprotech)、SHH(25ng/ml；Peprotech)、CHIR(0.6μM；Tocris)和WNT-C59(0.5μM：Tocris)。扩增培养基由DF12基础培养基(ThermoFisher)、B27(100X；ThermoFisher)、Glutamax(100X；ThermoFisher)和NEAA(100X；ThermoFisher)组成。细胞按1:3的比例每5天传代一次。为了消化细胞，将培养物在用PBS稀释的EDTA(1:100；Thermo)中37℃孵育5分钟，然后使用细胞提升器(康宁)添加2mlDF12基础培养基抬升细胞，将细胞收集到离心管中。在1000rpm下离心2分钟并去除上清液后，将细胞重悬浮在含有FSCW混合物的扩增培养基中，并如上所述将其接种到涂覆平板上。过夜添加Y27632(10uM；Tocris)以提高细胞存活率。

免疫染色和定量：用PBS漂洗盖玻片/微孔上的细胞，并在4％多聚甲醛中固定20分钟。用PBS漂洗两次后，用0.3％Triton处理细胞10分钟，然后用10％驴血清处理细胞1小时，然后在4℃下和一抗孵育过夜。接着，在室温下用荧光偶联二抗(Life Technologies)孵育细胞1小时。细胞核用Hoechst(Ho)(Sigma-Aldrich)染色。用尼康A1R-Si激光扫描共焦显微镜(尼康，日本东京)拍摄图像。使用的一抗包括以下：山羊抗OTX2(1:1000，R&D)、兔抗LMX1A(1:500，Abcam)、山羊抗OTX2(1:500，R&D systems)、山羊抗FOXA2(1:500，Santa Cruz)、小鼠抗EN1(1:200，4G11-C，DSHB)、大鼠抗Corin(1:100，R&D systems)、兔抗TH(1:500，Pel-Freez Biologicals)、小鼠抗TUJ1(1:500，Santa Cruz Biotechnology)、小鼠抗MAP2(1:200，Sigma-Aldrich)、兔抗GIRK2(1:80，Alomone Labs)，兔抗SOX6(1:1000，Sigma-Aldrich)，小鼠抗Stem121(1:500，Clonetech)。为了定量DA NPC群体，在Hoechst完全标记的细胞核中计数细胞。分析三种独立培养物(n＝3)。

定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)：RNA用Qiagen RNeasy试剂盒提取并定量。使用Bio-Rad iScript(1708891)将500ng RNA用于反转录。iTaq通用SYBR Green Supermix(1725124)用于qPCR反应。值对GAPDH标准化。

电生理学：用全细胞膜片钳记录接种在玻璃盖玻片上的神经元。使用Multiclamp700B放大器和pClamp 11.0软件(Molecular Devices,Palo Alto,CA)进行数据采集。使用Clampfit 11.0进行离线分析。在所有实验中，可耐受高达25MΩ的串联电阻。膜片钳实验的所有试剂均购自Sigma。在含有(mM)：148NaCl、4.2KCl、5葡萄糖、5HEPES、1CaCl2、0.5MgCl2、pH 7.4和NaOH，310–320mOsm的人工脑脊液(ACSF)中测量电压钳和电流钳记录。使用P-97Sutter移液管拔出器(Sutter instruments，CA)拔出OD(外径)1.5mm xID(内径)0.86mm的贴片玻璃移液管(Sutter instruments)。记录电极(3–6MΩ)填充有内部溶液(以mM计)：130K-葡萄糖酸盐、6KCl、3NaCl、0.5MgCl2、5HEPES、2EGTA、1Mg-ATP、0.5Na-GTP、1磷酸肌酸钠、pH 7.3的KOH、280–290mOsm。以-70mV夹持细胞用于神经元电流测量。在电压钳模式下，通过注入250ms的去极化电压，从-100mV到+60mV，增量为10mV，诱发神经元电流。对于电流钳实验，细胞保持在0pA。在电流钳模式下，通过注入一系列1秒的电流阶跃(从-5pA到65pA，增量为5pA)诱发动作电位。对自发神经元放电进行30分钟的评估。

帕金森病小鼠的产生：如前所述进行帕金森病建模(Chen等人，2016)。简而言之，用O₂蒸发的异氟醚气体麻醉SCID小鼠(12周龄)。然后将动物头部固定在立体定向框架(Kopf仪器)中，并将1μl 6-OHDA(3mg/ml)通过微量注射泵(Steolting)缓慢注射到黑质中(坐标A.P.＝-2.9mm。M.L.＝+1.1mm，D.V.＝-4.5mm)。PD建模一个月后，所有动物均接受行为测试以评估其运动行为，在安非他命诱导旋转测试中显示每分钟旋转6次以上的动物用于细胞移植。

DA NPC移植：用Accutase(Innovative Cell Technologies)消化第6代的DA NPC，并在含有BDNF(20ng/ml)、B27(1:50)和ROCKi的人工脑脊液aCSF中重悬浮(200000个细胞，2μl/只小鼠)(Chen等人，2016)。用1％～2％的异氟醚吸入麻醉动物。在立体定向指导下，手动将约2x10⁵个细胞缓慢注入同侧纹状体(坐标A.P.＝+0.6mm，M.L.＝+1.8mm，D.V.＝-3.2mm)。

安非他命诱导的旋转测试：安非他命诱导的旋转如前所述(Chen等人，2016年)。给予动物5mg/kg安非他命(1mg/ml浓度下5μl/g，腹膜内，Sigma-Aldrich)，并在注射10分钟后放入旋转室。用摄像机记录旋转行为90分钟，并由不知道受试者ID的研究人员进行分析。数据表示成每分钟平均同侧净旋转数。

圆筒测试：将受试者放置在丙烯酸圆筒中，并用摄像机记录其运动3分钟。计算同侧和对侧前肢触碰圆筒壁的次数。数据显示为同侧触碰占总触碰(同侧+对侧)的百分比。最小触碰次数为20。

脑切片的免疫组化分析：在移植后的指定时间点，用过量的戊巴比妥(250mg/kg，腹膜内)处死动物，并用40ml生理盐水，然后用4％冰冷的磷酸盐缓冲的多聚甲醛心内灌注。然后快速取出大脑，并在4％多聚甲醛中4℃固定约4小时，然后依次浸入20％和30％PBS缓冲蔗糖溶液中，直至下沉。用低温恒温器(Leica)切割冠状切片(30μm)，保存在-20℃的低温保护剂缓冲液中，并进行如上所述的免疫染色。

统计学分析：在GraphPad中进行统计学分析。用斯氏t检验计算显著性。数据表示成平均值+/-SEM。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

已经结合目前被认为是最实用和优选的实施方式描述了本发明。然而，本发明通过图示方式呈现，且并不打算局限于所公开的实施方式。因此，本领域技术人员将认识到，本发明旨在涵盖如所附权利要求所述的本发明精神和范围内的所有修改和替代布置。

Claims (20)

1.一种扩增多巴胺能神经元祖细胞的方法，包括将多巴胺能神经元祖细胞与包含成纤维细胞生长因子8b(FGF8b)、Hedgehog(Hh)信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和WNT-C59的培养基接触，以产生扩增的多巴胺能神经元祖细胞群。

2.如权利要求1所述的方法，其中Hh信号转导激动剂选自由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHH C25II、C24-SHH、嘌吗啡胺、Hg-Ag及其衍生物组成的组。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述经典Wnt信号转导的小分子激动剂是糖原合成酶激酶3抑制剂。

4.如权利要求3所述的方法，其中糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、靛玉红-3′-单肟、5-碘-靛玉红-3′-单肟、坎帕罗酮、SB-415286、SB-216763、2-苯胺基-5-苯基-1,3,4-噁二唑、(Z)-5-(2,3-甲撑二氧基苯基)咪唑啉-2,4-二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314、锂盐或其组合。

5.如权利要求3所述的方法，其中该糖原合成酶激酶3抑制剂是CHIR99021且以约0.01微摩尔(μM)至约1毫摩尔(mM)的浓度存在于培养基中。

6.如权利要求5所述的方法，其中CHIR99021以约0.6μM的浓度存在于培养基中。

7.如权利要求1所述的方法，其中WNT-C59以约0.2微摩尔(μM)至约2μM的浓度存在于培养基中。

8.如权利要求7所述的方法，其中WNT-C59以约0.5μM的浓度存在于培养基中。

9.如权利要求1所述的方法，其中所述多巴胺能神经元祖细胞在体外扩增至少300倍。

10.如权利要求1所述的方法，其中该培养基进一步包含神经补剂B27。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述多巴胺能神经元祖细胞在体外扩增至少1000倍。

12.如权利要求1所述的方法，其中该培养基包含约50ng/ml FGF8b、约25ng/ml SHH、约0.6μM CHIR99021、约0.5μM WNT-C59。

13.如权利要求1所述的方法，其中所述多巴胺能神经元祖细胞可在不丢失表型或基因型的情况下进行至少6次传代培养。

14.如权利要求1所述的方法，其中该培养基是化学确定的、无血清且不含异种物质。

15.如权利要求1所述的方法获得的基本纯的人多巴胺能神经元祖细胞群。

16.一种组合物，其包含FGF8b、Hh信号转导激动剂、经典Wnt信号转导小分子激动剂和Wnt-C59。

17.如权利要求16所述的组合物，其进一步包含B27。

18.如权利要求16所述的组合物，其中经典Wnt信号转导的小分子激动剂是糖原合成酶激酶3抑制剂，选自CHIR99021、1-氮杂坎帕罗酮、AR-A014418、靛玉红-3′-单肟、5-碘-靛玉红-3′-单肟、坎帕罗酮、SB-415286、SB-216763、2-苯胺基-5-苯基-1,3,4-噁二唑、(Z)-5-(2,3-甲撑二氧基苯基)咪唑啉-2,4-二酮、TWS119、CHIR98014、SB415286、Tideglusib、LY2090314及锂盐或其组合。

19.如权利要求16所述的组合物，其中Hedgehog(Hh)信号转导激动剂选自由Smoothened激动剂(SAG)、SAG类似物、SHH、SHH C25II、C24-SHH、嘌吗啡胺、Hg-Ag或其衍生物组成的组。

20.如权利要求16所述的组合物，其配制为细胞培养基。

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