CN104098659A - 一种重组slo蛋白及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种重组SLO蛋白及其制备方法。所述的制备方法包括：1)SLO基因的扩增及SLO-pGEX-2T表达质粒的构建；2)重组表达质粒转染大肠杆菌及阳性工程菌的筛选；3)阳性工程菌的扩大培养和诱导表达；4)表达菌液的收集、裂解并采用DEAE-Sepharose阴离子交换柱纯化技术纯化目的重组蛋白。本发明采用pGEX-2T表达质粒与SLO基因进行重组，然后转染大肠杆菌，经过发酵每升菌液可以获得100mg以上的可溶性重组SLO蛋白，产率高；采用DEAE-Sepharose阴离子交换柱纯化技术，两次纯化操作即可获得纯度大于90％的重组SLO蛋白，与亲和层析相比，处理量更大，成本更低。

Description

一种重组SLO蛋白及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种重组SLO蛋白及其制备方法，属于生物技术领域。
背景技术
溶血链球菌溶血素O(streptolysin O，SLO)是由绝大多数A群溶血链球菌菌株和许多C、G群溶血链球菌菌株分泌的一种蛋白质。85～90％链球菌感染的患者，于感染后2～3周至病愈后数月到1年内可检出SLO抗体。风湿热病人血清中的SLO抗体显著增高，活动性病例升高更为显著，一般其效价在1：400以上。因此，检测SLO抗体含量对链球菌新近感染或风湿热的临床诊断有很重要的意义。
从天然的溶血链球菌菌株中提取SLO存在如产量低、操作风险大、不易于工业化生产等不足。近年来，已有通过基因重组SLO的技术，如公开号为CN101302526A的发明专利，公开了一种可溶性溶血链球菌溶血素O基因、该基因表达的重组蛋白及其制备方法，该发明运用基因工程技术从溶血链球菌基因组中克隆得到截短的SLO基因，连接到表达载体上再转化入宿主细胞表达纯化大量稳定的r－sSLO蛋白，克服了天然提取的各种缺点，有利于以该蛋白为原材料制备各种试剂的标准化。但该发明在重组蛋白纯化时采用亲和纯化技术，生产成本较高，不易于产业化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种重组SLO蛋白及其制备方法。本发明所述方法采用pGEX-2T表达质粒与SLO基因序列重组，结合DEAE-Sepharose阴离子交换柱纯化技术，不仅产率高，而且所得重组SLO蛋白的纯度大于90％。
本发明所述的重组SLO蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
上述重组SLO蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)SLO基因的扩增及表达质粒的构建
根据SLO的基因序列设计引物，PCR扩增该基因并与pMD-18T载体连接，转染感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性工程菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，将正确的阳性质粒双酶切获得扩增的SLO核苷酸序列并与表达质粒pGEX-2T连接，构建SLO-pGEX-2T表达质粒；
2)重组表达质粒转染大肠杆菌及阳性工程菌的筛选
将构建的SLO-pGEX-2T表达质粒转染感受态大肠杆菌BL21，筛选阳性工程菌进行培养，从所得菌液中筛选出表达目的蛋白的阳性工程菌；
3)阳性工程菌的扩大培养和诱导表达
将所得的表达目的蛋白的阳性工程菌进行扩大培养后再进行诱导表达，得到表达菌液；
4)表达菌液的收集、裂解和目的重组蛋白的纯化
将所得表达菌液离心，沉淀用bufferA溶解后再裂解，裂解后加入Lysisbuffer，静置，离心，上清液透析后上DEAE-Sepharose阴离子交换柱，收集流出液，重复一次上柱操作，得到纯度大于90％的重组SLO蛋白。
更为具体的制备方法包括以下步骤：
1)根据SLO的基因序列设计引物，PCR扩增该基因并与pMD-18T载体连接，转染感受态大肠杆菌DH5α，涂板后筛选阳性工程菌，并对其扩大培养，然后提取质粒做双酶切及DNA测序验证，将验证正确的阳性质粒双酶切获得扩增的SLO核苷酸序列并与表达质粒pGEX-2T连接，构建SLO-pGEX-2T表达质粒；
2)将构建的SLO-pGEX-2T表达质粒转染感受态大肠杆菌BL21，涂板后筛选若干阳性工程菌，并将其分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，35～40℃条件下摇床培养12～16h，之后每管加入IPTG诱导，控制IPTG的终浓度为0.1～2mmol/L，30～32℃条件下摇床诱导5～8h，收集菌液，取样做SDS-PAGE电泳检测，筛选出表达目的蛋白的阳性工程菌；
3)将所得的表达目的蛋白的阳性工程菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，35～40℃条件下摇床培养12～16h，所得菌液接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，35～40℃条件下摇床进行扩大培养，直至菌液在600nm处的吸光值介于0.7～1之间，之后将IPTG加入菌液中，使IPTG终浓度为0.1～2mmol/L，30～32℃条件下摇床诱导5～8h，得到表达菌液；
4)所得表达菌液离心，沉淀用bufferA溶解，然后将菌液进行超声波裂解，在裂解后的菌液中加入等体积的Lysis buffer，静置，离心，上清液用Dialysis buffer进行透析，透析后的上清样上DEAE-Sepharose阴离子交换柱，收集流出液，重复一次上柱操作，得到纯度大于90％的重组SLO蛋白。
上述制备方法的步骤1)中，所述SLO的基因序列是应用现有常规基因技术从溶血链球菌基因组中克隆得到截短的SLO基因，其序列如SEQ ID NO：1所示；根据该SLO基因序列设计的引物分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
与现有技术相比，本发明的特点在于：
1、选择经优化筛选的表达质粒，采用pGEX-2T表达质粒与SLO基因进行重组，然后转染大肠杆菌，经过发酵每升菌液可以获得100mg以上的可溶性重组SLO蛋白，产率高；
2、采用DEAE-Sepharose阴离子交换柱纯化技术，两次纯化操作即可获得纯度大于90％的重组SLO蛋白，与亲和层析相比，不仅处理的菌液大，而且成本远低于亲和层析，更适合工业化生产。
附图说明
图1为PCR扩增的SLO核苷酸序列的电泳检测图，其中，1表示检测样本，M表示marker；
图2为构建的SLO-pGEX-2T表达质粒的双酶切电泳检测图，其中，1～3均为检测样本，M表示marker；
图3为经纯化步骤所得的重组SLO蛋白的SDS-PAGE检测图，其中Marker表示蛋白Marker，Sample表示酶切后的重组SLO蛋白样品；
图4为重组SLO蛋白的WB(蛋白免疫印迹实验)检测图，其中marker表示蛋白marker，sample表示酶切后的重组SLO蛋白样品。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不局限于这些实施例。
实施例1：重组SLO蛋白的制备
1)SLO基因的扩增及表达质粒的构建
根据SLO的基因序列设计引物，PCR扩增该基因并与pMD-18T载体连接，转染感受态大肠杆菌DH5α，涂板后筛选阳性工程菌，并对其扩大培养(培养基为含氨苄青霉素的LB培养基，37℃条件下摇床培养12h)，然后提取质粒做双酶切及DNA测序验证，将验证正确的阳性质粒双酶切获得扩增的SLO核苷酸序列并与表达质粒pGEX-2T连接，构建SLO-pGEX-2T表达质粒，该表达质粒的双酶切鉴定图如图2所示；该步骤中，
所述SLO的基因序列如SEQ ID NO：1所示；
根据上述SLO的基因序列设计的引物中，上游引物如SEQ ID NO：2所示，下游引物如SEQ ID NO：3所示；
2)重组表达质粒转染大肠杆菌及阳性工程菌的筛选
将构建的SLO-pGEX-2T表达质粒转染感受态大肠杆菌BL21，涂板后筛选若干阳性工程菌，并将其分别接种于5mL含100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm条件下摇床培养12h，之后每管加入IPTG使其终浓度为1mmol/L，30℃、200rpm条件下摇床诱导6h，收集菌液，取样做SDS-PAGE电泳检测，筛选出表达目的蛋白的阳性工程菌；
3)阳性工程菌的扩大培养和诱导表达
将所得的表达目的蛋白的阳性工程菌接种于50mL含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm条件下摇床培养12h，之后将所得菌液接种于1000mL含有100ug/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、220rpm条件下摇床培养，直至菌液在600nm处的吸光值介于0.7～1之间；然后将经过过滤消毒的IPTG加入到上述菌液中，使IPTG终浓度为1mmol/L，30℃、200rpm条件下摇床诱导6h，得到表达菌液；
4)表达菌液的收集、裂解和目的重组蛋白的纯化
所得表达菌液离心，收集沉淀，沉淀用buffer A(50mM Tris-HClPH7.9+1mM EDTA+100mM NaCl)溶解，然后进行超声裂解，在裂解后的菌液中加入等体积的Lysis buffer(50mM Tris-HCl PH7.9+1％Tween-20+1mM EDTA)，静置1h，离心，收集上清液，将收集的上清液用Dialysis buffer(50mMTris-HCl PH7.9+1mM EDTA)进行透析，透析后所得的上清样上DEAE-Sepharose阴离子交换柱，收集流出液，流出液再过一次DEAE-Sepharose阴离子交换柱，收集流出液，得到纯度大于90％的重组SLO蛋白，SDS-PAGE分析，结果如图3和图4所示；所得重组SLO蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
5)重组SLO蛋白的鉴定
采用WB法和间接ELISA法，检测样本为人ASO高值血清和人正常血清，操作参照WB和间接ELISA法的规范步骤进行，结果显示重组SLO蛋白能特异的区分两种样本血清，且反应灵敏很高。

Claims (5)

1.一种重组SLO蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.权利要求1所述的重组SLO蛋白的制备方法，包括以下步骤：
1)根据SLO的基因序列设计引物，PCR扩增该基因并与pMD-18T载体连接，转染感受态大肠杆菌DH5α，筛选阳性工程菌并提取质粒做双酶切及DNA测序验证，将正确的阳性质粒双酶切获得扩增的SLO核苷酸序列并与表达质粒pGEX-2T连接，构建SLO-pGEX-2T表达质粒；
2)将构建的SLO-pGEX-2T表达质粒转染感受态大肠杆菌BL21，筛选阳性工程菌进行培养，从所得菌液中筛选出表达目的蛋白的阳性工程菌；
3)将所得的表达目的蛋白的阳性工程菌进行扩大培养后再进行诱导表达，得到表达菌液；
4)所得表达菌液离心，沉淀用bufferA溶解后再裂解，裂解后加入Lysis buffer，静置，离心，上清液透析后上DEAE-Sepharose阴离子交换柱，收集流出液，重复一次上柱操作，得到纯度大于90％的重组SLO蛋白。
3.根据权利要求2所述的重组SLO蛋白的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
1)根据SLO的基因序列设计引物，PCR扩增该基因并与pMD-18T载体连接，转染感受态大肠杆菌DH5α，涂板后筛选阳性工程菌，并对其扩大培养，然后提取质粒做双酶切及DNA测序验证，将验证正确的阳性质粒双酶切获得扩增的SLO核苷酸序列并与表达质粒pGEX-2T连接，构建SLO-pGEX-2T表达质粒；
2)将构建的SLO-pGEX-2T表达质粒转染感受态大肠杆菌BL21，涂板后筛选若干阳性工程菌，并将其分别接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，35～40℃条件下摇床培养12～16h，之后每管加入IPTG诱导，控制IPTG的终浓度为0.1～2mmol/L，30～32℃条件下摇床诱导5～8h，收集菌液，取样做SDS-PAGE电泳检测，筛选出表达目的蛋白的阳性工程菌；
3)将所得的表达目的蛋白的阳性工程菌接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，35～40℃条件下摇床培养12～16h，所得菌液接种于含氨苄青霉素的LB培养基中，35～40℃条件下摇床进行扩大培养，直至菌液在600nm处的吸光值介于0.7～1之间，之后将IPTG加入菌液中，使IPTG终浓度为0.1～2mmol/L，30～32℃条件下摇床诱导5～8h，得到表达菌液；
4)所得表达菌液离心，沉淀用bufferA溶解，然后将菌液进行超声波裂解，在裂解后的菌液中加入等体积的Lysis buffer，静置，离心，上清液用Dialysis buffer进行透析，透析后的上清样上DEAE-Sepharose阴离子交换柱，收集流出液，重复一次上柱操作，得到纯度大于90％的重组SLO蛋白。
4.根据权利要求2或3所述的重组SLO蛋白的制备方法，其特征在于：步骤1)中，所述SLO的基因序列如SEQ ID NO：1所示。
5.根据权利要求2或3所述的重组SLO蛋白的制备方法，其特征在于：步骤1)中，根据SLO的基因序列设计的引物分别如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
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