CN113607702A - 一种基于锰离子诱导的比率型荧光反应检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白活性的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶和心肌钙蛋白。以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了发射强蓝色荧光、稳定性好的左多巴纳米颗粒，在Mn2+引发聚集后蓝色波长荧光降低，黄色波长荧光增强。利用Mn2+对P3O10 5‑的亲和力强于LFC表面的羟基，实现了比率型(F550/F460)荧光降低。但在ALP催化水解下，P3O10 5‑能迅速转化为磷酸根离子，从而实现比率型荧光增强检测ALP。我们以心肌钙蛋白为靶向抗原，ALP作为标记酶构建了一个比率型免疫荧光传感平台。该比率型传感平台在人血清中对ALP活性检测仍表现出快速的响应和良好的回收率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建及其分析应用，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP) 和心肌钙蛋白，属于纳米生物传感技术领域。
背景技术
碱性磷酸酶(ALP)是一种膜结合酶，广泛表达于肝、骨、肠、胎盘、肾脏等组织。它主要负责从各种蛋白质和非蛋白质底物中水解和转化磷酸单酯。作为公认的生物标志物，碱性磷酸酶在细胞周期生长、凋亡和信号转导途径等许多重要的生理和病理过程中发挥着重要作用。
此外，由于其具有高度的催化活性，广泛的底物特异性，容易与抗体结合，温和的反应条件和良好的稳定性等优点，ALP被广泛用作酶联免疫吸附测定(ELISA)中的标记酶，以产生可检测信号。因此，实现对ALP活性的高灵敏度和高选择性检测，对于ALP相关疾病的诊断和基于ALP的ELISA平台的开发具有重要意义。目前，有多种方法用于检测ALP，例如：比色法、化学发光法、电化学发光法及表面增强共振拉曼散射等方法。上述的方法存在一些不足：复杂的步骤，低灵敏度及长的响应时间。因此，实现对碱性磷酸酶的高选择性和高灵敏度检测将有利于临床相关疾病的诊断、监测与治疗。
为了克服这些不足，这里我们将采用温和的合成条件、简便的合成步骤构建了一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台，该检测方法兼具快速响应、高选择性和灵敏度高的优点。
发明内容
本发明解决的技术问题是：为了克服现有技术的不足，提出一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)和心肌钙蛋白的方法。所述方法可以通过温和的合成条件、简单的合成步骤、便宜的合成原料制备出具有发射强蓝色荧光的纳米颗粒，通过比率型荧光值(F550/F460)与浓度的线性关系实现对碱性磷酸酶的高灵敏度检测。同时，又利用ALP 在酶联免疫中作为标记酶的特性，构建了ALP引发的比率型荧光免疫传感器并应用于心肌钙蛋白I型的检测。
为了解决本发明的技术问题，提出的技术方案为：一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的左多巴纳米颗粒 LFC,Mn2+的加入导致LFC的快速聚集，导致468nm处的荧光强度随着Mn2+浓度的增加而减弱，而550nm处的荧光强度增强；将不同浓度的Mn2+分别加入到左多巴和乙二胺混合溶液中；震荡摇匀，通过荧光光谱仪进行荧光光谱测试，通过F550/F460荧光强度变化检测锰离子。
优选的，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC，在Mn2+引发聚集后造成了荧光发射波长的改变；将不同浓度的Mn2+分别加入400μL混合溶液中，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，当 LFC/Mn2+与P3O10 5-孵育时，P3O10 5-与Mn2+配位，取代了LFC/Mn2+中的锰离子，导致LFC荧光比值(F550/F460)降低，当ALP加入传感体系时，ALP水解P3O10 5-生成磷酸从而释放Mn2+，游离的Mn2+再次诱导LFC聚集，使得LFC的荧光比值(F550/F460)增强，故基于荧光左多巴纳米颗粒的发射转变策略可快速、灵敏的检测ALP。
优选的，室温条件下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入40μL P3O10 5-(300μM)与0-800mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μL Tris-HCl 缓冲溶液，再依次加入100μM的左旋多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光值F550/F460分析。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，反应15min后，通过比率型荧光值F550/F460与碱性磷酸酶浓度的线性关系，计算复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率，为了进一步验证设计的比率型荧光传感器对真实样品进行分析的能力，在人血清中实现了对ALP的定量分析检测，结果表明，该方法的回收率在96％至103％之间，适用于高灵敏测定复杂样品中的碱性磷酸酶。
优选的，首先，单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；孵育清洗后，加入不同浓度的心肌钙蛋白I型，孵育清洗后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后, TBST清洗数次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中孵育，然后加入 pH＝9的Tris-HCl缓冲液和三聚磷酸钠盐，从而构成三明治式夹心免疫传感器；接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行比率型荧光值分析。
优选的，首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL， 37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊抗/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后，TBST清洗五次，然后加入 Tris-HCl缓冲液，HRP标记的兔羊二抗和过氧化氢25℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入左多巴和乙二胺；在室温下15分钟后进行比率型荧光值分析。
优选的，首先，1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育 1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后往各孔中分别加入200ng/mL 的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶 100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗数次，取 ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入pH＝9的 Tris-HCl缓冲液50μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫传感器；接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl 缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15min，进行比率型荧光值分析。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：所述的基于比率型荧光酶联免疫传感平台的应用，在真实水样中进行锰离子含量检测。
为了解决本发明的技术问题，提出的另一技术方案为：根据所述的方法制备检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白的试剂盒。
一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子，以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的 LFC，在Mn2+引发聚集后实现了蓝色荧光向黄色荧光的转换。将不同浓度的Mn2+水溶液分别加入400μL混合溶液中。震荡摇匀，反应15 mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光检测。
以下对本发明做出进一步说明。
将16μL左旋多巴(10mM)和40μL乙二胺(10g/mL)加入8000μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，得到LFC。混合均匀后，将不同浓度的Mn2+水溶液分别加入400μL混合溶液中。震荡摇匀，反应 15mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光检测，激发波长为385nm。绘制荧光扫描图、荧光强度散点图和标准曲线图。在相同条件下，考察了几种常见金属离子(如Ag+、Zn2+、Cr3+、Ca2+、Cd2+、 Co2+、Al3+、Ni2+、Mg2+、Ba2+、K+、Fe2+、Fe3+、Pd2+、Hg2+、Cu2+)对Mn2+的选择性。结果表明该方法对Mn2+的具有很好的特异性。所有离子的浓度均为2μM。
一种基于锰离子诱导的比率型荧光反应检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中，加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，15分钟反应后，通过比率型荧光值(F550/F460)与碱性磷酸酶浓度的线性关系，获得在复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率。
室温下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入40μL P3O10 5-(300 μM)与0-800mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μLTris-HCl缓冲溶液，再依次加入100μM的左多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15mins 后，通过荧光光谱仪对其进行荧光比率型检测，激发波长为385nm。
一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感器在复杂环境体系中检测碱性磷酸酶的方法，室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，反应15分钟后，通过比率型荧光值与碱性磷酸酶浓度的线性关系，获得在复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率。为了进一步验证设计的传感器对真实样品进行分析的能力，在人血清中实现了对ALP的检测。与标准加入方法比较，所发展的方法对ALP检测的回收率在96％至103％之间。以下对本发明做出进一步说明。
在构建一种锰离子诱导的比率型荧光传感器在复杂环境体系中实时检测碱性磷酸酶的荧光传感时，所述缓冲溶液的pH为7.4， Tris-HCl缓冲溶液的浓度为10mM，三聚磷酸钠盐的浓度为160μM，左多巴的浓度为100μM，锰离子的浓度为2μM；取40μL Tris-HCl 缓冲溶液，pH为9.0,分别加入1.6mM三聚磷酸钠盐的与0-200 mU/mL碱性磷酸酶，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30 μL于270μL Tris-Hcl缓冲溶液中，加入1％的人体血清，再依次加入 100μM的左多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15分钟后，通过荧光光谱仪测量绘制荧光强度图，记录加碱性磷酸酶前后比率型荧光值的变化情况。
一种基于碱性磷酸酶构建的比率型荧光免疫传感器检测心肌肌钙蛋白I型的方法，在96孔板中，捕获抗体与抗原相结合，随后抗原与一抗相连接，一抗又与ALP标记的驴羊二抗相连构建一个三明治式夹心免疫传感器，最后加上荧光底物，通过形成荧光有机物的比率型荧光值的变化来实现对心肌钙蛋白I型的定量检测。
以下对本发明做出进一步说明。
首先，1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后往各孔中分别加入200ng/mL的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶100 μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2 移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，，然后加入pH＝9的Tris-HCl 缓冲液50μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行比率型荧光值分析。
本发明的有益效果：
本发明的方法以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中通过缩合反应生成具有强蓝色荧光的左多巴纳米颗粒(LFC)。基于制备的 LFC设计了一种检测ALP活性的比率型荧光传感器，实现了对ALP 的高选择性、高灵敏度的检测，其检测限为0.1mU/mL。在碱性磷酸酶(ALP)的催化水解下，P3O10 5-能迅速转化为磷酸根离子，从而使得黄色荧光增强。我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，以碱性磷酸酶作为标记酶构建了一个ALP引发的比率型荧光酶联免疫试剂盒，实现对心肌钙蛋白I型的定量检测。该传感器还成功应用于人体血清中 ALP活性的检测，这些研究有助于糖尿病、乳腺癌等疾病的研究与治疗。
(1)一种基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台的构建，用于灵敏和选择性地检测碱性磷酸酶(ALP)活性和心肌钙蛋白，属于纳米生物传感技术领域。该方法以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了发射强蓝色荧光、稳定性好的左多巴纳米颗粒 (LFC)，在Mn2+引发聚集后蓝色波长荧光降低，黄色波长荧光增强。利用Mn2+对P3O10 5-的亲和力强于LFC表面的羟基，实现了比率型荧光降低(F550/F460)。ALP的催化水解下，P3O10 5-能迅速转化为磷酸根离子，从而实现比率型荧光增强检测ALP。我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，ALP作为标记酶构建了一个免疫荧光传感平台。该比率型传感平台在人血清中对ALP活性和心肌钙蛋白检测仍表现出良好的回收率。
(2)以左多巴和乙二胺为原料，在室温水相中通过缩合反应生成具有强蓝色荧光的左多巴纳米颗粒。该纳米颗粒的制备过程简单、快速且无需加热及复杂的后处理步骤。
(3)室温水相合成的左多巴纳米颗粒荧光强度稳定且分散性良好。纳米颗粒在Mn2+的诱导下易聚集从而导致其荧光颜色的转变。这种荧光比率型传感器降低了背景荧光的干扰，并且实现了对Mn2+的高选择性、高灵敏度的检测，其检测限为10nM。
(4)基于荧光左多巴纳米颗粒设计了一种高选择性、高灵敏度检测ALP的比率型荧光传感器，其检测限为0.1mU/mL。该传感器依赖于Mn2+对荧光左多巴纳米颗粒的诱导作用、三聚磷酸钠对锰离子的螯合作用以及ALP对三聚磷酸钠的水解作用，从而实现对ALP 的定量检测。此外，我们将该传感器成功应用于真实水样中锰离子的检测及人体血清中ALP的活性检测。
(5)在相同条件下，考察了几种常见金属离子(如Ag+、Zn2+、Cr3+、 Ca2+、Cd2+、Co2+、Al3+、Ni2+、Mg2+、Ba2+、K+、Fe2+、Fe3+、Pd2+、 Hg2+、Cu2+)对Mn2+的选择性。所有离子的浓度均为2μM。如图8、图9。表明该方法对Mn2+的检测具有特异性。
(6)左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC。
附图说明
下面结合附图对本发明的实施例作进一步说明。
图1为实施1中左多巴纳米颗粒的透射图片；
图2为实施1中左多巴纳米颗粒的粒径分布图片；
图3为实施1中左多巴纳米颗粒的透射局部放大图；
图4为实施2中LFC在不同情况下的荧光光谱图；
图5为实施3中锰离子定量光谱图；
图6为实施3中锰离子定量散点图；
图7为实施4中对锰离子的选择性光谱图；
图8为实施4中对锰离子的选择性柱状图；
图9为实施5中EDTA螯合锰离子定量光谱(先加)；
图10为实施5中EDTA螯合锰离子定量散点图(先加)；
图11为实施5中EDTA螯合锰离子定量光谱(后加)；
图12为实施5中EDTA螯合锰离子定量散点图(后加)；
图13为实施6中锰离子诱导左多巴纳米颗粒聚集以及 EDTAEDTA螯合锰离子时间光谱图；
图14为实施7中不同浓度三聚磷酸钠的荧光发射光谱图；
图15为实施7中不同浓度三聚磷酸钠的荧光强度散点图；
图16为实施8中不同浓度的碱性磷酸酶的荧光发射光谱图；
图17为实施8中不同浓度的碱性磷酸酶的荧光强度散点图；
图18为实施9中碱性磷酸酶的选择性的荧光强度变化柱状图
图19为实施11中不同浓度的心肌钙蛋白I型的荧光发射光谱图；
图20为实施11中不同浓度的心肌钙蛋白I型的荧光强度散点图；
图21为实施11中不同浓度的心肌钙蛋白I型的标准曲线图
图22为实施12中心肌钙蛋白I型选择性的荧光强度变化柱状图
图23本发明的示意图
具体实施方式
以下结合附图对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述实施例。
实施例1：在400μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.4)中加入0.8μL 左旋多巴(10mM)和2μL EDA(10g/mL)，轻轻摇晃至均匀，形成左多巴纳米颗粒。取一定量的左多巴纳米颗粒冷冻干燥，使用透射电镜 (TEM)表征。在400μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.4)中加入0.8μL左旋多巴(10mM)和2μL EDA(10g/mL)，将不同浓度的Mn2+水溶液加入上述混合溶液中轻轻摇晃至均匀。取一定量的上述溶液冷冻干燥，使用透射电镜(TEM)表征。如图1，图2和图3。从透射电镜和粒径分布可以看出单独存在的LFC粒径约为7.5nm,呈均匀分散的点状纳米颗粒。加入锰离子后，LFC发生聚集。
实施例2：在400μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH7.4)中加入0.8μL 左旋多巴(10mM)和2μL EDA(10g/mL)。充分混合后，在室温下混合 15min后检测荧光强度。另一组，将Mn2+水溶液(200nM)分别加入上述400μL混合溶液中。震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测,如图4。
实施例3：将16μL左旋多巴(10mM)和40μL乙二胺(10g/mL) 加入8000μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，得到LFC。混合均匀后，将不同浓度的Mn2+水溶液分别加入400μL混合溶液中。震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测，激发波长为385nm。绘制荧光扫描图、荧光强度散点图和标准曲线图，如图5、图6。表明该方法对Mn2+的检测范围为0-2000nM,检测限为10nM。
实施例4：将16μL左旋多巴(10mM)和40μL乙二胺(10g/mL) 加入8000μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，得到LFC。混合均匀后，将不同浓度的Mn2+水溶液分别加入400μL混合溶液中。室温下混合15min后检测荧光强度。在相同条件下，考察了几种常见金属离子(如Ag+、Zn2+、Cr3+、Ca2+、Cd2+、Co2+、Al3+、Ni2+、Mg2+、 Ba2+、K+、Fe2+、Fe3+、Pd2+、Hg2+、Cu2+)对Mn2+的选择性,所有离子的浓度均为2μM，如图7、图8。表明该方法对Mn2+的检测具有特异性。
实施例5：根据EDTA与Mn2+的螯合作用，加入EDTA，LFC对 Mn2+的荧光响应是可逆的。当EDTA与离子的摩尔比为1：1时，采用预混合和后混合策略，EDTA能快速螯合除Mn2+以外的其他金属离子。推测在低摩尔比时，该体系中Mn2+与LFC的相互作用比EDTA 与Mn2+的相互作用强得多。然而，随着EDTA浓度的增加，EDTA 逐渐螯合Mn2+形成络合物，破坏了LFC的聚集。如图9、图10、图 11、图12所示，Mn2+的加入导致LFC的快速聚集，导致468nm处的荧光强度随着Mn2+浓度的增加而减弱，而550nm处荧光强度随着 Mn2+浓度的增加而增强。
实施例6：将1μL左旋多巴(10mM)和2.5μL乙二胺(10g/mL)加入500μL Tris-HCl缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，得到LFC。混合均匀后，ex＝385检测15分钟内的实时荧光强度变化，接着将Mn2+(2μM) 水溶液加入上述混合溶液中,混合均匀后，ex＝385检测15分钟内的实时荧光强度变化，接着将EDTA(12μM)水溶液加入上述混合溶液中,混合均匀后，ex＝385检测15分钟内的实时荧光强度变化。如图 13所示，LFC在470nm处呈现强蓝色荧光，而在550nm处基本无发射。随着锰离子的加入，470nm处的蓝光逐渐降低并伴随着550nm 处黄光的增强，这一过程证明了锰离子诱导LFC荧光转变。当锰离子诱导LFC产生稳定黄光后，向体系中加入EDTA，LFC在550nm 处的荧光强度逐渐降低并伴随着470nm处的荧光增强，这说明EDTA作为锰离子的强螯合剂，能够迅速将复合物中的锰离子夺出，导致聚集的LFC再度分散。
实施例7：室温下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入不同浓度的P3O10 5-与2μM的锰离子，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μLTris-HCl缓冲溶液，再依次加入100μM的左多巴，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测，激发波长为385nm。绘制荧光发射图、荧光强度散点图，如图14、图15。
实施例8：室温下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入40μL P3O10 5-(300μM)与0-800mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μL Tris-HCl 缓冲溶液，再依次加入100μM的左多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行荧光强度检测，激发波长为385nm。绘制荧光发射图、荧光强度散点图，如图16和图17。表明该方法对碱性磷酸酶的检测范围为0-1000mU/mL,检测限为0.1 mU/mL。
实施例9：将不同浓度的碱性磷酸酶加入40μL P3O10 5-(300μM) 的Tris-HCl＝缓冲液(pH为9.0)中，37℃作用30min。然后将40μL 碱性磷酸酶P3O10 5-混合溶液加入到LFC/Mn2+体系中。孵育15min后，记录LFC的荧光强度。在相同条件下，测定了胰蛋白酶、焦磷酸酶(PPase)、酪氨酸酶(TYR)、牛血清白蛋白(BSA)、葡萄糖氧化酶(GOD)、胃蛋白酶和COD等一系列竞争性酶或蛋白对碱性磷酸酶(ALP)的选择性，所有物质的浓度均为200mU/mL(如图18)。表明该方法对碱性磷酸酶的检测具有特异性。
实施例10:为了进一步验证设计的纳米开关对真实样品进行连续分析的能力，检测了人血清中的ALP。为了评估所提出的方法，以1％人体血清的样品作为实际样本，对不同浓度的ALP加标的标准溶液进行了回收率实验。在真实样品根据线性范围分别添加不同浓度的ALP标准溶液(5、10、15、20、50、100、200mU/mL)进行了回收实验。样品的回收率列于表1。结果表明，该方法的回收率在 95.7％％至103.69％之间，适用于高灵敏测定复杂样品中的碱性磷酸酶。
表1.为实施例10中血清样品中碱性磷酸酶活度的恢复效率
实施例11：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4 ℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育1 小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后加入不同浓度的cTnI溶液 100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊抗/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗4次，取 ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，用TBST冲洗4次，防止特异性结合的发生，然后加入pH＝9的Tris-HCl缓冲液50
μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行荧光强度分析并绘制免疫荧光试剂盒的实时荧光扫描图和标准曲线，如图19，图20和图21。该方法同时应用于心肌钙蛋白的检测，检测范围为0.1-150ng/mL，检测限为0.1ng/mL。
实施例12：1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜。孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点。随后，37℃孵育 1小时，用TBST去除牛血清白蛋白。然后往各孔中分别加入200 ng/mL的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h。结束孵化后,TBST清洗五次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入pH＝9 的Tris-HCl缓冲液50μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化 0.5h，从而构成三明治式夹心免疫。接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl 缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行荧光强度分析，如图22。表明该方法对心肌钙蛋白的检测具有特异性。
实施例13：为了拓展该传感器的实际应用，在真实水样中(如湖水、自来水、矿泉水)进行了锰离子含量检测。分别将不同浓度的标准锰离子加入三种真实水样中进行回收率实验，实验结果表明，通过该方法测定出的锰离子的含量与加入的标准浓度具有良好的一致性，其回收率在95.97％-104.28％之间，如表2。表明水中干扰物质对锰离子检测的影响较小。
表2.为真实水样中锰离子的回收率
通过以上实施例和实验数据，可以得出：设计了一种锰离子诱导的比率型荧光免疫传感器，用于ALP标记的的高灵敏度检测。该比率型荧光传感器表现出以下突出的特性。首先，LFC表面丰富的，锰离子诱导使LFC聚集使荧光比值(F550/F460)增强，而羟基，锰离子与P3O10 5-赋予的聚集之间的竞争相互作用导致荧光比值(F550/F460) 降低，P3O10 5-与ALP作用释放的锰离子导致LFC聚集并再次实现荧光比值(F550/F460)增强。我们以心肌钙蛋白I型为靶向抗原，ALP 作为标记酶构建了一个比率型荧光免疫传感平台。该比率型传感平台在人血清中对ALP活性和心肌钙蛋白检测都表现出良好的检测效果。因此，我们开发的比率型荧光免疫传感器提供了一种有前途的ALP 标记的酶联免疫分析的方法，在临床诊断中具有潜在应用。
本发明的不局限于上述实施例所述的具体技术方案，凡采用等同替换形成的技术方案均为本发明要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子的方法，其特征在于：以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的左多巴纳米颗粒LFC,Mn2+的加入导致LFC的快速聚集，导致460nm处的荧光强度随着Mn2+浓度的增加而减弱，550nm处荧光强度增强；将不同浓度的Mn2+水溶液分别加入到左多巴和乙二胺混合溶液中；震荡摇匀，通过荧光光谱仪对锰离子进行荧光强度检测，通过比率型荧光值F550/F460变化检测锰离子。
2.根据权利要求1所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测锰离子的方法，其特征在于：以左旋多巴和乙二胺为原料，在室温水相中合成了荧光强度高、稳定性好的LFC，在Mn2+引发聚集后造成了荧光发射波长的改变；将不同浓度的Mn2+分别加入400μL混合溶液中，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对荧光光谱测试，根据比率型荧光值F550/F460对锰离子定量检测。
3.根据权利要1所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：当LFC/Mn2+与三聚磷酸根离子P3O10 5-孵育时，P3O10 5-与Mn2+配位，取代了LFC/Mn2+中的锰离子，导致LFC荧光强度的减弱，当ALP加入传感体系时，ALP水解P3O10 5-生成磷酸从而释放Mn2+，游离的Mn2+再次诱导LFC聚集，恢复了LFC的发射，故基于荧光左多巴纳米颗粒的发射转变，通过比率型荧光值F550/F460可快速、灵敏的检测ALP。
4.根据权利要求2所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：室温条件下，取40μL Tris-HCl缓冲溶液，pH为9.0,分别加入40μL P3O10 5-(300μM)与0-800mU/mL碱性磷酸酶，震荡摇匀，在37℃条件下孵化反应0.5h后，取孵化液30μL于270μL Tris-HCl缓冲溶液，再依次加入100μM的左旋多巴，2μM的锰离子，震荡摇匀，反应15mins后，通过荧光光谱仪对其进行比率型荧光值F550/F460分析。
5.根据权利要求4所述的基于锰离子诱导的比率型荧光传感平台检测碱性磷酸酶的方法，其特征在于：室温条件下，在Tris-HCl缓冲溶液中加入一定量的人体血清，再加入一定量的三聚磷酸钠溶液与不同浓度的碱性磷酸酶孵化反应，再加入左多巴和乙二胺，反应15min后，通过比率型荧光值F550/F460与碱性磷酸酶浓度的线性关系，计算复杂体系中对碱性磷酸酶浓度检测的恢复效率，为了进一步验证设计的比率型荧光传感器对真实样品进行分析的能力，在人血清中实现了对ALP的定量分析检测，结果表明，该方法的回收率在96％至103％之间，适用于高选择性、高灵敏测定复杂样品中的碱性磷酸酶。
6.根据权利要求3所述的基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，加入牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；孵育清洗后，加入不同浓度的心肌钙蛋白I型，孵育清洗后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后,TBST清洗数次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中孵育，然后加入pH＝9的Tris-HCl缓冲液和三聚磷酸钠盐，从而构成三明治式夹心免疫传感器；接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15分钟，进行比率型荧光值F550/F460分析。
7.根据权利要6所述的基于锰离子诱导的比率型荧光酶联免疫传感平台检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，一系列的单克隆抗体被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗4次，每孔加入200μM牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后将不同浓度的cTnI溶液100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的cTnI后，取抗山羊抗/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后，TBST清洗五次，然后加入Tris-HCl缓冲液，HRP标记的兔羊二抗和过氧化氢25℃孵化1h，从而构成三明治式夹心免疫；最后，使用TBST冲洗，并在孔板中加入左多巴和乙二胺，在室温下15分钟后进行比率型荧光值F550/F460分析。
8.根据权利要求7所述的基于比率型荧光酶联免疫传感平台检测心肌钙蛋白I型的方法，其特征在于：首先，1μg/mL的单克隆抗体100μL被注入到96孔板中4℃孵化过夜；孵育后，用TBST冲洗数次，每孔加入200μL牛血清白蛋白，防止孔板表面出现非特异性结合位点；随后，37℃孵育1小时，用TBST去除牛血清白蛋白；然后往各孔中分别加入200ng/mL的心肌钙蛋白I型，甲胎蛋白，溶酶体酵解素，胃蛋白酶，胰蛋白酶100μL，37℃孵育1h，用TBST去除未结合的上述物质后，取抗山羊/Ab2移入孔板中37℃孵育1h；结束孵化后，TBST清洗数次，取ALP标记的驴羊二抗移入孔板中37℃孵育1h，然后加入pH＝9的Tris-HCl缓冲液50μL，加入三聚磷酸钠盐200μM于37℃孵化0.5h，从而构成三明治式夹心免疫传感器；接着，加入pH＝7.4的Tris-HCl缓冲液250μL，加入左多巴和锰离子混合均匀后反应15min，进行比率型荧光值F550/F460分析。
9.根据权利要求1所述的基于比率型荧光酶联免疫传感平台的应用，其特征在于：在真实水样中进行锰离子含量检测。
10.根据权利要求1-8所述的方法制备检测碱性磷酸酶、心肌钙蛋白的试剂盒。
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