CN115418221A - 一种检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备及检测方法 - Google Patents

一种检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备及检测方法，制备方法包括合成谷胱甘肽功能化石墨烯量子点和配制谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液，检测方法包括标准溶液中有机磷含量的检测、待检样品制备和待检样品中有机磷含量的检测。本发明基于PET原理，以QDs为基础材料，构建特异性识别当归有机磷农药残留的新型光学荧光传感器，重点研究荧光探针分子的结构设计与合成、荧光增强效应及荧光检测选择性和灵敏度、荧光探针的识别与荧光响应机制等关键问题，建立一种简单、快速、准确且有效的当归农残检测的新方法，实现对中药材中有机磷农药残留的原位实时动态荧光检测与成像分析。

Description

一种检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备及检测方法
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，具体涉及一种检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备及检测方法。
背景技术
当归是甘肃省大宗栽培的药材。随着种植面积增加、规模化产区形成和种植年限延长，其根部病虫害发生发展日益严重。中药材根部病虫害的防控特点是施药方式多、农药用量大、易受土壤屏障影响。有机磷农药（organophosphorus pesticides, OPPs）因具种类多、广谱性、药效好、残留低等优点而被广泛应用于当归栽培中，对保障药材产量和质量起到一定积极作用。但由于OPPs的过量或不规范使用，不仅导致了当归的种植成本加大，还对当归质量安全、中医临床用药安全和产区生态安全构成威胁。但目前当归有机磷农残的检测仍以传统检测方法为主，存在操作过程繁杂、耗时、对仪器及工作人员要求较高等缺点，不适用于有机磷农残的现场快速检测。
OPPs通常是指含磷元素的磷（膦）酸酯或硫代膦酸酯类有机化合物。即便是在传统高毒有机磷杀虫剂被限制使用的情况下，OPPs仍然作为重要类别农药之一，其涵盖杀虫剂、杀菌剂及除草剂等。OPPs可被人体吸收，经由皮肤、呼吸道、消化道等途径，在体内与胆碱酯酶（CHE）形成磷酰化胆碱酯酶，CHE活性受到不可逆的抑制，使酶失去分解乙酰胆碱（Ach）作用，致组织中神经递质Ach过量累积，导致神经处于过度兴奋，引起功能失调而中毒。OPPs残留中毒后的人会出现头痛、头昏等症状，严重者会出现昏迷和抽搐甚至危及生命。
当归药材病虫害的防控存在着施药集中、方式多、农药用量大、防效不稳定等问题，农残污染途径主要有：使用农药造成的直接污染；叶面喷药时散落于“大气-土壤-水”界面而被药用作物再吸收所造成的间接污染；前茬作物种植过程中使用的长残效OPPs被后茬药用作物再吸收而形成的二次污染；在药材加工、贮藏、运输等过程中造成的再污染和通过食物链造成的污染。受这些因素的影响，使得当归药材OPPs残留风险加大。
量子点（QuantμM Dots，QDs），属于荧光半导体纳米粒子，是一种零维的纳米材料，是近年来最具发展潜力的新型纳米材料之一，量子点以其特殊的结构和良好的性能被广泛研究，常见的量子点有硫化镉（CdS）、硒化镉（CdSe）、碲化镉（CdTe）、硫化锌（ZnS）和砷化铟（AsIn）等二元复合物。相对于传统有机荧光材料，量子点具备宽且连续的激发光谱、窄且对称的发射光谱、高而稳定的发光效率以及非常强的抗光漂白能力等优势，并且量子点具备大的斯托克位移，因而可显著避免荧光发射和激发之间的光谱重叠，可提高荧光信号的检测灵敏度和稳定性。由于量子限制效应的作用，通过合成技术可控制量子点的尺寸及其化学组分，在单激发光源下即可得到发射光谱从可见光到近红外区域的纳米粒子。这一性质有利于在多组分分析检测体系中实现单一光源激发下的多色检测及定量分析应用，量子点作为一种新型的荧光纳米材料已被广泛应用于传感器的构建，服务于环境污染物监测、生物小分子检测、蛋白质分析、生物成像等科研领域。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备及检测方法，以解决上述问题，构建灵敏度高、线性范围宽、光学成像性能好的当归有机磷农药残留快速检测技术体系。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
S1、将柠檬酸和谷胱甘肽混合，加热液化后透析，透析后蒸发抽干得到固体，将固体溶解得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液；
S2、将谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液稀释后，依序加入FeCl3、Tris-HCl缓冲溶液和植酸，混合均匀后，再加入乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶并混合均匀，在37℃下孵育60min，得到GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器。
为了进一步实现本发明，S1包括：
（1）合成谷胱甘肽功能化石墨烯量子点：
将0.50g柠檬酸和0.15g谷胱甘肽混合，加热至220-280℃，液化变为棕色后透析10h，得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点，室温下避光保存；
（2）配制谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液：
将谷胱甘肽功能化石墨烯量子点蒸发至粘稠，真空泵抽干，将得到固体中加入100mL去离子水溶解得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液。
为了进一步实现本发明，S2中所述谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液用去离子水稀释至浓度为5 mg•L-1。
为了进一步实现本发明，所述FeCl3的浓度为7.5-20µmol•L-1，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.01mol•L-1，植酸的浓度为0.25-2.5µmol•L-1，乙酰胆碱的浓度为2.5-6.5µmol•L-1，乙酰胆碱酯酶的浓度为10.0U/mL，胆碱氧化酶的浓度为1.0U/mL。
为了进一步实现本发明，所述缓冲溶液为pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
一种使用当归有机磷农残荧光传感器检测的方法，包括如下步骤：
S1、标准溶液中有机磷含量的检测：
取9mL GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器7份，分别添加浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5和10µmol•L-1的蝇毒磷标准溶液样品，混合均匀后，在室温下孵育0-100min后，在342nm的激发下，用荧光分光光度计测定标准溶液样品在发射波长340-550nm处的荧光强度，根据标准溶液样品的浓度与相对荧光强度F/F0的关系建立线性关系图；
S2、待检样品制备：
精密称取当归粉5.0g，置于50 mL带塞锥形瓶中，用25mL甲醇对样品进行两次超声提取，每次20min，合并提取溶液并通过滤纸过滤，然后将滤液减压浓缩至干，将残留物在50mL的100µmol•L-1蝇毒磷溶液中复溶，得到待检样品；
S3、待检样品中有机磷含量的检测：
取9mL GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器4份，分别添加浓度梯度为0、0.5、1.0和2.0μmol L-1的待检样品，混合均匀后，在37℃下孵育80min后，在342nm的激发下，用荧光分光光度计测定标准溶液样品发射波长340-550nm处的荧光强度，根据得到的标准线性关系图计算样品溶液中有机磷的的含量。
本发明相较于现有技术的有益效果为：
本发明建立了基于谷胱甘肽功能化石墨烯量子点（GQDs@GSH）的荧光传感器对当归中有机磷（OPPs）残留量的检测方法。所提出策略的方案如图1所示，GQDs@GSH可以通过光诱导电子转移（PET）过程被Fe3+猝灭。由于植酸（PA）具有很强的还原和螯合能力，Fe3+可以还原为Fe2+，形成PA/Fe2+络合物，从而使猝灭的荧光恢复。乙酰胆碱（ACh）可被乙酰胆碱酯酶（AChE）和胆碱氧化酶（ChOx）水解和氧化，产生强氧化性过氧化氢（H2O2）。H2O2可以破坏PA/Fe2+的螯合结构，释放Fe2+离子，进一步氧化为Fe3+，从而再次导致荧光猝灭。OPP的存在会抑制乙酰胆碱酯酶的活性，进而抑制H2O2的生成，从而使荧光再次开启。基于该策略，将制备的荧光传感器应用于当归中使用最广泛的OPP之一蝇毒磷（coumaphos）的检测。
本发明通过简单的热解过程，合成的GQDs@GSH具有高荧光量子产率和优异的荧光特性。通过“off-on-off-on”荧光机制，实现了当归中coumaphos的检测。积极的结果表明所提议的策略是有效和可靠的，并可能提供对中药残留有机磷农药检测有益的参考和启示。
本发明基于PET原理，以QDs为基础材料，构建特异性识别当归有机磷农药残留的新型光学荧光传感器，重点研究荧光探针分子的结构设计与合成、荧光增强效应及荧光检测选择性和灵敏度、荧光探针的识别与荧光响应机制等关键问题，建立一种简单、快速、准确且有效的当归农残检测的新方法，实现对中药材中有机磷农药残留的原位实时动态荧光检测与成像分析。
常规荧光探针荧光寿命短、荧光强度较小，合成过程复杂，探针量子产率低，灵敏度差、甚者有生物毒性，本发明基于构建量子产率高、细胞穿透能力和生物相容性好、有潜在的双光子荧光特性，可视化的荧光探针，建立GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChO）荧光传感器，阐明与有机磷分子的构效关系、识别与荧光响应机制及其影响和调控因素，以期为构建基于荧光传感器的当归有机磷农残检测提供理论依据，也为中药材的质量控制提供技术支持和参考方法。
附图说明
图1为本发明中GQDs@GSH检测有机磷农药残留的原理示意图。
图2为本发明中GQDs@GSH的结构表征：
(a) GQDs@GSH的TEM图像和尺寸分布；
(b) GQDs@GSH完整的XPS的光谱图；(c) C 1s, (d) O 1s, (e) N 1s, (f) Si 的高分辨率光谱；
图3为本发明中GQDs@GSH的光学特性：
(a) GQDs@GSH的紫外-可见吸收（黑色直线）和荧光发射光谱（黑色断点线），其中插图是GQDs@GSH溶液在UV灯光下的照片；
(b) GQDs@GSH的三维荧光光谱；
图4为本发明中GQDs@GSH时间分辨荧光衰减曲线；
图5为本发明中Fe3+诱导的荧光猝灭实验结果：
(a) Fe3+和其他干扰物对GQDs@GSH荧光强度的响应；
(b) 孵育时间对GQDs@GSH/Fe3+荧光强度的影响；
(c) 不同浓度Fe3+的GQDs@GSH/Fe3+的荧光发射光谱；
(d) 不同浓度Fe3+与GQDs@GSH/Fe3+的F/F0线性关系图；
图6为本发明中PA引发的荧光变化实验结果：
(a) PA和其他干扰物对GQDs@GSH/Fe3+体系的荧光强度响应；
(b) 孵育时间对GQDs@GSH/Fe3+/PA体系荧光强度的影响；
(c) 不同浓度的PA的GQDs@GSH/Fe3+/PA的荧光发射光谱；
(d)不同浓度PA与GQDs@GSH/Fe3+/PA的F/F0线性关系图；
图7为本发明中乙酰胆碱引发的荧光变化实验结果：
(a) 孵育时间对GQDs @GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)体系荧光强度的影响；
(b) 不同浓度的ACh的GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)的荧光光谱；
(c) 不同浓度ACh与GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)的F/F0线性关系图；
图8为本发明中有机磷农药蝇毒磷引起的荧光变化实验结果：
(a) pH对GQDs@GSH，GQDs@GSH/Fe3+体系，GQDs@GSH/Fe3+/PA体系，GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)体系，GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)/coumaphos体系荧光强度的影响；
(b) 孵育时间对GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)/coumaphos荧光强度的影响；
(c) GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)/coumaphos与不同浓度coumaphos的荧光发射光谱；
(d) 不同浓度coumaphos与GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)/coumaphos的F/F0线性关系图；
图9为本发明中当归中有机磷农药引发的荧光变化实验结果：
(a) 当归中不同加标浓度coumaphos的GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)荧光光谱；
(b) 当归中不同加标浓度的coumaphos与GQDs@GSH/Fe3+/PA/(ACh+AChE+ChOx)/的F/F0线性关系图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
一种用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，包括如下步骤：
S1、将柠檬酸和谷胱甘肽混合，加热液化后透析，透析后蒸发抽干得到固体，将固体溶解得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液：
（1）合成谷胱甘肽功能化石墨烯量子点：
将0.50g柠檬酸和0.15g谷胱甘肽混合，加热至220-280℃，液化变为棕色后透析10h，得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点，室温下避光保存；
（2）配制谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液：
将谷胱甘肽功能化石墨烯量子点蒸发至粘稠，真空泵抽干，将得到固体中加入100mL去离子水溶解得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液；
S2、将谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液用去离子水稀释至浓度为5 mg•L-1后，依序加入浓度为7.5-20µmol•L-1的FeCl3、浓度为0.01mol•L-1 pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液和浓度为0.25-2.5µmol•L-1的植酸，混合均匀后，再加入的浓度为2.5-6.5µmol•L-1乙酰胆碱、浓度为10.0U/mL的乙酰胆碱酯酶和浓度为1.0U/mL的胆碱氧化酶并混合均匀，在37℃下孵育60min，得到GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器。
一种使用当归有机磷农残荧光传感器检测的方法，包括如下步骤：
S1、标准溶液中有机磷含量的检测：
取9mL GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器7份，分别添加浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5和10µmol•L-1的蝇毒磷标准溶液样品，混合均匀后，在室温下孵育0-100min后，在342nm的激发下，用荧光分光光度计测定标准溶液样品在发射波长340-550nm处的荧光强度，根据标准溶液样品的浓度与相对荧光强度F/F0的关系建立线性关系图；
S2、待检样品制备：
精密称取当归粉5.0g，置于50 mL带塞锥形瓶中，用25mL甲醇对样品进行两次超声提取，每次20min，合并提取溶液并通过滤纸过滤，然后将滤液减压浓缩至干，将残留物在50mL的100µmol•L-1蝇毒磷溶液中复溶，得到待检样品；
S3、待检样品中有机磷含量的检测：
取9mL GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器4份，分别添加浓度梯度为0、0.5、1.0和2.0μmol L-1的待检样品，混合均匀后，在37℃下孵育80min后，在342nm的激发下，用荧光分光光度计测定标准溶液样品发射波长340-550nm处的荧光强度，根据得到的标准线性关系图计算样品溶液中有机磷的的含量。
实验例：
仪器与材料
1 仪器
瞬态荧光光谱仪（美国HORIBA公司）；PerkinElmer Lambda 750S型紫外分光光度计（美国珀金埃尔默公司）；Nexus 870傅里叶变换红外光谱仪（美国Thermo Nicolet公司）；FEI Tecnai G2 TF20透射电子显微镜（美国FEI公司）；Thermo Fisher ScientificEscalab 250Xi（美国赛默飞公司）；Smart APEX Ⅱ（德国Bruker公司）。
2 试剂
谷胱甘肽、柠檬酸（C6H8O7•H20）、植酸、硫酸奎宁、乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶、胆碱氧化酶、甲醇、丙酮、2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇（Tris）、蝇毒磷、KCl、FeCl3、CuCl2、MnCl2、PbCl2、NaCl、CaCl2、MgCl2、胆固醇、葡萄糖、赖氨酸、色氨酸和苯丙氨酸；当归由甘肃中医药大学王引权教授鉴定，为伞形科多年草本植物当归Anglicasinensis（Oliv.）Dields的干燥根，购买于甘肃中药材批发市场；实验用水均为去离子水，所有使用的化学试剂均为分析试剂级。
实验例1、GQDs@GSH的合成和结构分析：
将0.50 g柠檬酸和0.15 g谷胱甘肽混合，置于50 mL圆底烧瓶中用加热套加热至220 ℃（220，240，260，280℃），3 min（1，3，5，10min）左右液化，溶液颜色由无色变为淡黄色，2 min内变为棕色，然后溶于50 mL超纯水中透析10 h，得到纯GQDs@GSH，室温下避光保存。将合成的GQDs@GSH置于圆底烧瓶中，旋蒸至粘稠，真空泵抽至干，得0.1986 gGQDs@GSH固体，用100 mL蒸馏水溶解，浓度1986 mg/L，作为GQDs@GSH母液。
1、GQDs@GSH表征
因GQDs@GSH是量子点，不具备具体的化学式，故通过透射电子显微镜（TEM），紫外-可见分光光度法（UV），红外光谱（FTIR），X射线光电子能谱（XPS）和荧光对其光学性能、形貌及相关基团进行表征。
利用透射电镜对GQDs@GSH形态方面进行了研究。如图2a所示，GQDs@GSH呈球形颗粒，分布均匀。大约有100个颗粒，GQDs@GSH颗粒的尺寸分布计算为1.1-3.4 nm，平均尺寸为2.3 nm（图2a，插图）；GQDs@GSH表面的化学和元素组成进一步通过XPS表征四个主峰，如图2b所示，283、400、532和166 eV分别归因于C1s、N1s、O1s和S2p，表明GQDs@GSH中存在C、N、O和S元素。此外，在光谱中还可以观察到400 eV的S 2p峰和166 eV的N 1s峰。这证实了谷胱甘肽在GQD上的成功修饰。图2c揭示了C 1s的六种类型的碳原子高分辨率光谱，284.6、285.2、285.8、286.5、287.2和288.5 eV处的峰值可归因于C-C/C=C、C-S、C-N、C-O、C=O和O=C-OH。O1s光谱（图 2d）可以在以下位置拟合三个峰530.5 eV、531.7 eV 和533 eV的结合能，分配给 C=O，C-O，O=C-O。N 1s光谱（图 2e）显示了三种氮状态，即吡啶氮(N-C, 399.5 eV)、吡咯氮(N-C=C, 400.4 eV)和石墨氮（NH，401.6 eV）。S 2p光谱的结合能（图 2f）是163.6 eV (S2p3/2)和164.8 eV (S 2p1/2)，是C-S-C。
GQDs@GSH的光学性质通过UV-vis和荧光光谱确认。GQDs@GSH的紫外-可见光谱显示在342 nm处的具有吸收峰（图 3a，黑直线），与荧光光谱中的最大激发峰值相同。GQDs@GSH最大激发峰为342 nm，发射峰在420 nm（图 3a，黑色断点线）。荧光表征表明，GQDs@GSH水溶液在可见光下无色，但在365 nm的紫外线照射下能发出强烈的蓝色荧光（图 3a，插图）。图3b所示为GQDs@GSH的三维荧光光谱，表现出单个发射峰，并且荧光特征峰位于ex/em=342 nm/420 nm，强度为6.90×106，没有发现其他荧光峰，因此表明合成的GQDs@GSH不含其他荧光物质。
2、量子产率及荧光动力学特性
GQDs@GSH的量子产率参照文献方法进行计算。用0.1 mol•L-1 H2SO4溶解硫酸奎宁作为标准溶液使用（其荧光量子效率为54%），GQDs@GSH的量子产率（Q）按以下公式（1）计算。
Q＝QRISARηS 2/（IRASηR 2） （1）
A表示吸光度，I表示荧光强度，η表示溶剂的折射系数（其中ηS 2/ηR 2＝1，R和S分别表示参比硫酸奎宁和样品）
以硫酸奎宁为标准，GQDs@GSH的荧光量子产率为33.9%。如此高的产量可以归因于GQD上GSH的表面改性。人们认为GQD的羧基和环氧基是非辐射电子-空穴复合中心，导致GQD的无效发射。谷胱甘肽的氨基可以与GQD的初始羧基和环氧基相互作用，从而减少辐射电子-空穴复合中心的数量。此外，谷胱甘肽作为GQD的保护层可以提高其耐化学降解性。
3、时间分辨荧光衰减分析
GQDs@GSH、GQDs@GSH/Fe3+、GQDs@GSH/Fe3+/PA、GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）、GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）/coumaphos荧光动力学曲线通过双指数函数（2）可以得到很好的拟合。拟合得到两个荧光寿命组分，分别为长寿命组分τ1和短寿命组分τ2，α1和α2分别为荧光寿命组分的振幅，并通过式（3）计算得到平均寿命。
Figure 422294DEST_PATH_IMAGE001
（2）
Figure 64016DEST_PATH_IMAGE002
（3）
为了进一步了解荧光猝灭机理，在不同的条件下对GQDs@GSH时间分辨荧光衰减进行了分析，衰减曲线如图4所示。结果列于表1中。GQDs@GSH为2.08 ns，但在存在Fe3+的情况下下降到1.19 ns，表明Fe3+通过动态淬灭过程淬灭了GQDs@GSH。将PA添加到GQDs@GSH/Fe3+系统的寿命从1.19ns增加到1.95ns。由于PA的还原和螯合特性，Fe3+对PA的亲和力高于GQDs@GSH，从而抑制了Fe3+的荧光猝灭效应，进而使荧光开启。通过逐步添加ACh、AChE和ChOx到GQDs@GSH/Fe3+/PA体系中，寿命从1.95 ns下降到1.72 ns。这可能是由于产生H2O2，H2O2将Fe2+氧化为Fe3+，从而恢复Fe3+的荧光猝灭效应。Coumaphos可以抑制AChE活性并进一步抑制H2O2的产生，因此可以抑制Fe3+的猝灭作用。最后，观察到在添加coumaphos后，GQDs@GS/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）体系寿命从1.72ns增加到1.82ns。分析结果表明，量子点的表面结构显著影响其激发态。
Figure 383526DEST_PATH_IMAGE003
实验例2、Fe3+诱导的荧光猝灭实验：
1、GQDs@GSH/Fe3+体系合成
（1）用移液枪取5μLGQDs@GSH母液
（2）配置不同浓度的FeCl3母液（75μM，95μM，125μM，150μM，180μM，200μM），分别用移液枪取200μL
（3）200μL，pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液（0.1 mol•L-1）
分别将（1）（2）（3）用去离子水稀释至2.0 mL，计算最终（1）GQDs@GSH得终浓度5mg•L-1，（2）分别得FeCl3终浓度（7.5、9.5、12.5、15、18、20 μmol•L-1），涡旋混匀后，在室温下放置8 min后收集荧光光谱，最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。考察不同时间、pH值及共存物质对GQDs@GSH/Fe3+体系的影响。
2、pH值的影响
将（1）与200μL，200μMFeCl3混合并分别用pH=（5.02，5.72，6.37，6.8，7.24，7.96，8.36，8.69，9.15）溶液稀释至2.0 mL，计算FeCl3终浓度20μM，涡旋混匀后，在室温下放置8min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。
如图8a所示，pH值对GQDs@GSH/Fe3+体系影响不大。
3、时间的影响
将（1）、（2）与200μL，200μMFeCl3用去离子水稀释至2.0 mL，计算FeCl3终浓度20μM，涡旋混匀后，在室温下放置（0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12min）后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm 处的荧光强度。
如图5b所示，添加Fe3+后，GQDs@GSH荧光强度随着时间的推移而下降，在8 min时达到最小值，然后下降趋势趋于稳定。因此，选择8 min作为Fe3+和GQDs@GSH反应时间。
4、共存物质的影响
分别用移液枪取200μL，200μMCu2+、Mg2+、Zn2+、Fe2+、Ca2+、Pb2+、K+、Na+，分别与（1）、（3）混合，用去离子水稀释至2.0 mL，计算各共存物质的终浓度20μM，分别考察对GQDs@GSH荧光猝灭效果的影响。
如图5a所示研究了Fe3+和其它金属离子，包括Cu2+、Mg2+、Zn2+、Hg2+、Fe2+、Ca2+和Pb2+对GQDs@GSH荧光响应的影响，GQDs@GSH可以被Fe3+以高选择性有效淬灭，而其他离子对GQDs@GSH几乎没有影响，荧光猝灭效应可能主要由GQDs@GSH激发态电子转移引起，这为后续的荧光分析奠定了基础。
图5c显示了GQDs@GSH在不同的Fe3+浓度下。随着Fe3+浓度从7.5µmol•L-1增加到20µmol•L-1，荧光强度降低，在20µmol•L-1时达到最低。因此，选择20 µmol•L-1作为最佳猝灭浓度，在该浓度下荧光强度降低97.0%。此外，在7.5-20µmol•L-1范围内，相对荧光强度（F/F0）与Fe3+浓度之间存在良好的线性关系，确定系数（R2）为0.9935（图5d）。
实验例3、PA引发的荧光变化实验：
1、GQDs@GSH/Fe3+/PA体系合成
（1）用移液枪取5μLGQDs@GSH母液
（2）用移液枪取200μL，200μM的FeCl3
（3）200μL，pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液（0.1 mol•L-1）
（4）配置不同浓度的PA母液（2.5μM，5μMGQDs@GSH，10μM，17.5μM，20μM，25μM），分别用移液枪取200μL
分别将（1）-（4）用去离子水稀释至2.0 mL，计算最终（1）GQDs@GSH终浓度5 mg•L-1，（2）FeCl3终浓度20μM，（4）分别得PA终浓度（0.15、0.5、1、1.75、2、2.5μmol•L-1），涡旋混匀后，在室温下放置20 min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。考察不同时间、pH值及共存物质对GQDs@GSH/Fe3+/PA体系的影响
2、pH值的影响
（1）、（2）与200μL，25μM的PA混合并分别用pH=（5.02，5.72，6.37，6.8，7.24，7.96，8.36，8.69，9.15）溶液稀释至2.0 mL，计算PA终浓度2.5μM，涡旋混匀后，在室温下放置20min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。
如图8a所示，GQDs@GS/Fe3+/PA与其他系统相比pH值对其影响较大，pH值为7.4时系统的荧光强度最高。
3、时间的影响
（1）-（3）与200μL，25μM的PA混合，用去离子水稀释至2.0 mL，计算PA终浓度2.5μM，分别在（30，25，19，17，15，13，11，9，7，5，3，1）min检测GQDs@GSH/Fe3+/PA荧光强度变化。
图6b显示了PA存在时的荧光强度随时间的变化。荧光强度趋于增加，并在20 min时达到平台，这意味着Fe3+和PA之间的相互作用达到平衡。
4、共存物质的影响
分别用移液枪取200μL，25μM的胆固醇、葡萄糖、赖氨酸、苯丙氨酸与（1）-（3）混合，用去离子水稀释至2.0 mL，计算各共存物质的终浓度2.5μM，分别考察对GQDs@GSH/Fe3+荧光效果的影响。
研究了PA和其他4种物质（胆固醇、葡萄糖、赖氨酸和苯丙氨酸）对GQDs@GSH/Fe3+体系荧光恢复的影响。图6a中的结果表明GQDs@GSH/Fe3+体系只对PA有反应，PA可以恢复猝灭的荧光。
如图6c所示，随着PA浓度从0.25 µmol•L-1增加到2.5 µmol•L-1，荧光强度增加，因此，2.5 µmol•L-1选择作为荧光回收浓度，荧光回收率甚至超过75.0%。图6d表明，在0.25-2.5mol•L-1范围内，F/F0和PA浓度之间存在良好的线性关系，R2为0.9978。因此，采用20 min的反应时间和2.5 µmol•L-1 PA使荧光开启。
实验例4、乙酰胆碱引发的荧光变化实验：
1、GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）体系合成
（1）用移液枪取5μLGQDs@GSH母液
（2）用移液枪取200μL，200μM的FeCl3
（3）200μL，pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液（0.1 mol•L-1）
（4）用移液枪取200μL，25μM的PA
（5）取2.0 mL（10.0 U/mL）的AChE、2.0 mL1.0 U/mLChOx
（6）配置不同浓度的ACh母液（25µM、30µM、40µM、50µM、60µM、65µM），分别用移液枪取1000μL
分别将（1）-（6）用去离子水稀释至10.0 mL，计算最终（1）GQDs@GSH终浓度5 mg•L-1，（2）FeCl3终浓度20μM，（4）PA终浓度2.5μmol•L-1，（6）得ACh终浓度（2.5、3、4、5、6、6.5μmol•L-1），涡旋混匀后，在室温下放置60 min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm 处的荧光强度。
乙酰胆碱酯酶和ChOx可以水解和氧化乙酰胆碱酯酶，并产生H2O2，这可能导致GQDs@GSH/Fe3+/PA荧光重新猝灭。
2、pH值的影响
（1）、（2）、（4）和（5）与1000μL，65μM的ACh混合并分别用pH=（5.02，5.72，6.37，6.8，7.24，7.96，8.36，8.69，9.15）溶液稀释至10.0 mL，计算ACh终浓度6.5μM，涡旋混匀后，在室温下放置60 min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。
如图8a所示，pH值对GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）体系影响不大。
3、孵育时间的影响
（1）-（5）与1000μL，65μM的ACh混合，用去离子水稀释至10.0 mL，计算ACh终浓度6.5μM，分别在（0，5，10，15，20，30，40，50，60，90） min检测GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光强度变化。
如图7a所示，荧光强度GQDs@GSH随着反应时间的延长而降低，并在60min时达到平衡。
如图7b所示，荧光强度随着乙酰胆碱浓度从2.5 µmol•L-1增加而降低，随后保持稳定。因此，选择6.5 µmol•L-1作为最佳ACh浓度。在2.5-6.5 µmol•L-1范围内，F/F0和ACh浓度之间存在良好的线性关系，R2为0.990 7（图7c）。
实验例5、有机磷农药蝇毒磷引起的荧光变化实验：
1、GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）/coumaphos体系合成
（1）用移液枪取5μLGQDs@GSH母液
（2）用移液枪取200μL，200μM的FeCl3
（3）200μL，pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液（0.1 mol•L-1）
（4）用移液枪取200μL，25μM的PA
（5）取2.0 mL（10.0 U/mL）的AChE、2.0 mL1.0 U/mLChOx
（6）用移液枪取1000μL，65μM的Ach
（7）配置不同浓度的coumaphos母液（1µM、2µM、5µM、10µM、25µM、50µM、100 µM），分别用移液枪取1000μL
分别将（1）-（7）用去离子水稀释至10.0 mL，计算最终（1）GQDs@GSH终浓度5 mg•L-1，（2）FeCl3终浓度20μM，（4）PA终浓度2.5μmol•L-1，（6）得ACh终浓度6.5μmol•L-1，（7）coumaphos得终浓度（0.1、0.2、0.5、1、2.5、5、10 μmol•L-1），涡旋混匀后，在室温下放置80min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm 处的荧光强度。
2、pH值的影响
（1）、（2）、（4）、（5）和（6）与1000μL 100μM的coumaphos混合并分别用pH=（5.02，5.72，6.37，6.8，7.24，7.96，8.36，8.69，9.15）溶液稀释至10.0 mL，计算coumaphos终浓度10μM，涡旋混匀后，在室温下放置80 min后收集荧光光谱。最后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。
对各种条件下pH值对荧光强度的影响进行了研究。如图8a所示，GQDs@GSH荧光强度在pH=5~8的范围内几乎没有变化，但在更碱性的条件下下降。GQDs@GS/Fe3+/PA与其他系统相比pH值对其影响较大，pH值为7.4时系统的荧光强度最高。因此，使用pH值为7.4的Tris缓冲溶液作为coumaphos整个荧光测定的介质。
3、孵育时间的影响
（1）-（6）与1000μL，100μM的coumaphos混合，用去离子水稀释至10.0 mL，计算coumaphos终浓度10μM，分别在（100，80，60，40，30，20，10，0）min检测GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）/coumaphos荧光强度变化。
在coumaphos存在下，由于乙酰胆碱酯酶对乙酰胆碱酯酶的抑制作用，乙酰胆碱酯酶催化的乙酰胆碱酯酶水解反应将受到抑制，从而减少H2O2的生成，进一步使猝灭的荧光再次恢复。图8b显示了coumaphos和乙酰胆碱酯酶的孵育时间对荧光强度的影响。荧光强度随时间从0 min增加到80 min，有波动趋势，最后趋于稳定。因此，选择80 min作为培养时间。图8c表明，荧光强度随着coumaphos浓度从0.1 µmol•L-1增加到10.0 µmol•L-1而增加。图8d清楚地表示了在0.1-10.0 µmol•L-1范围内F/F0和coumaphos浓度之间的线性关系。回归方程为F/F0=0.0006X+0.0310，R2为0.991 2。根据LOD=3σ/s（n=6）公式，检测限（LOD）计算为0.075µmol•L-1，其中σ是空白溶液的标准偏差，s是校准曲线的斜率。这些值远低于大多数荧光化学传感器（见表2）。
Figure 254829DEST_PATH_IMAGE004
实施例、当归中有机磷农药引发的荧光变化实验：
精密称取当归粉5.0 g，置于50 mL带塞锥形瓶中。然后用25 mL甲醇对样品进行两次超声提取（每次20 min）。合并提取溶液并通过滤纸过滤。然后将滤液减压浓缩至干。将残留物在50 mL的100 μmol L-1coumaphos溶液中复溶，用移液枪分别取0、50μL、100μL 和 200μL，在37°C下孵育80 min。
coumaphos终浓度分别为0、0.5、1.0和2.0 μmol L-1，与20 µmol•L-1FeCl3和0.01mol•L-1 pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液与5 mg•L-1 GQDs@GSH、2.5 µmol•L-1PA溶液混合。然后，加入2.0 mL（10.0 U/mL）的AChE、1.0 mL6.5 μmol L-1ACh和2.0 mL1.0 U/mLChOx混合，并保持在37°C，80min后在342 nm的激发波长下测定340-550 nm处的荧光强度。
通过标准加入法对提出的“off-on-off-on”机制在实际样品当归中coumaphos的测定的适用性进行了进一步评估。将最终浓度分别为0、0.5、1.0、2.0 µmol•L-1的coumaphos加入当归提取液中。将加标样品与乙酰胆碱酯酶孵育80 min，然后进行coumaphos的荧光测定。如图9所示为荧光强度对加入真实样品的coumaphos呈线性响应，回归方程为F/F0=0.110 1X+0.027 2，R2为0.9907。低、中、高水平的回收率分别为96.9%、87.4%和93.3%，RSD低于3.75%。结果如表3所示。阳性结果表明，所提出的荧光传感策略可用于定量检测RAS真实样品中的coumaphos。
Figure 250860DEST_PATH_IMAGE005
。

Claims (6)

1.一种用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将柠檬酸和谷胱甘肽混合，加热液化后透析，透析后蒸发抽干得到固体，将固体溶解得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液；
S2、将谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液稀释后，依序加入FeCl3、Tris-HCl缓冲溶液和植酸，混合均匀后，再加入乙酰胆碱、乙酰胆碱酯酶和胆碱氧化酶并混合均匀，在37℃下孵育60min，得到GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器。
2.如权利要求1所述的用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述S1包括：
（1）合成谷胱甘肽功能化石墨烯量子点：
将0.50g柠檬酸和0.15g谷胱甘肽混合，加热至220-280℃，液化变为棕色后透析10h，得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点，室温下避光保存；
（2）配制谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液：
将谷胱甘肽功能化石墨烯量子点蒸发至粘稠，真空泵抽干，将得到固体中加入100mL去离子水溶解得到谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液。
3.如权利要求2所述的用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，其特征在于：S2中所述谷胱甘肽功能化石墨烯量子点母液用去离子水稀释至浓度为5 mg•L-1。
4.如权利要求3所述的用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述FeCl3的浓度为7.5-20µmol•L-1，Tris-HCl缓冲溶液的浓度为0.01mol•L-1，植酸的浓度为0.25-2.5µmol•L-1，乙酰胆碱的浓度为2.5-6.5µmol•L-1，乙酰胆碱酯酶的浓度为10.0U/mL，胆碱氧化酶的浓度为1.0U/mL。
5.如权利要求4所述的用于检测当归有机磷农残的荧光传感器的制备方法，其特征在于：所述缓冲溶液为pH=7.4的Tris-HCl缓冲溶液。
6.一种使用权利要求1-5中任一项制备得到的荧光传感器检测当归有机磷农残的方法，其特征在于包括如下步骤：
S1、标准溶液中有机磷含量的检测：
取9mL GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器7份，分别添加浓度梯度为0.1、0.2、0.5、1、2、5和10µmol•L-1的蝇毒磷标准溶液样品，混合均匀后，在室温下孵育0-100min后，在342nm的激发下，用荧光分光光度计测定标准溶液样品在发射波长340-550nm处的荧光强度，根据标准溶液样品的浓度与相对荧光强度F/F0的关系建立线性关系图；
S2、待检样品制备：
精密称取当归粉5.0g，置于50 mL带塞锥形瓶中，用25mL甲醇对样品进行两次超声提取，每次20min，合并提取溶液并通过滤纸过滤，然后将滤液减压浓缩至干，将残留物在50mL的100µmol•L-1蝇毒磷溶液中复溶，得到待检样品；
S3、待检样品中有机磷含量的检测：
取9mL GQDs@GSH/Fe3+/PA/（ACh+AChE+ChOx）荧光传感器4份，分别添加浓度梯度为0、0.5、1.0和2.0μmol L-1的待检样品，混合均匀后，在37℃下孵育80min后，在342nm的激发下，用荧光分光光度计测定标准溶液样品发射波长340-550nm处的荧光强度，根据得到的标准线性关系图计算样品溶液中有机磷的的含量。
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