CN111380845A - 一种香豆素类探针在二氧化硫定量检测中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种香豆素类探针在二氧化硫定量检测中的应用，并建立了比色检测方法，可快速检测二氧化硫残留量的大小和范围值，且检测范围大，实现了中药材中二氧化硫残留的定量检测。

Description

一种香豆素类探针在二氧化硫定量检测中的应用
技术领域
本发明属于二氧化硫残留检测领域，具体涉及一种香豆素类探针在二氧化硫定量检测中的应用。
背景技术
在中药材的加工过程中，硫磺熏蒸方法常用于中药材的防虫、防霉、防腐、保持水分和增加外观色泽等，但大量的使用硫磺熏蒸，会造成二氧化硫残留量过大，进一步危害人体健康，如实验研究表明，过量的SO2残留可对肠胃、肝脏及免疫系统等造成损害。根据文献记载，加工中需要用硫磺熏蒸的药材有：人参(糖参、生晒参)、黄连(云连)、川贝母、浙贝母、白芷、白及、牛膝、山药、泽泻、天麻、天冬、天花粉、天南星、乌头(白附片)、半夏、葛根、山奈、百合、白附子、金银花、菊花(亳菊、怀菊)、甘遂。在贮藏中使用硫磺杀虫、防虫的中药材更多，有文献记载的大约有50种。《中国药典》2015版一部中药材二氧化硫残留量规定：照二氧化硫残留量测定法，山药、天冬、天花粉、天麻、牛膝、白及、白术、白芍、党参、粉葛这些传统习用硫熏的中药材不得过400mg/kg。其他中药材中药材及饮片二氧化硫残留量不得超过150mg/kg。
目前，对于二氧化硫检测的荧光探针，所涉及的反应机理主要有乙酰丙酮酸酯的加成、醛基加成、其他双键的麦克尔加成、C＝N键异构化等，如光致诱导电子转移、分子内电荷转移、荧光共振能量转移、C＝N键异构化、聚集导致荧光增强和羧酸螺环开关等机理。现有技术中也报道了一些属于上述反应机理的检测用化合物和检测方法，但都仅仅是有无的检测，还没有一种定量检测和低浓度(或含量)检测方法。同时，探针的选择性和灵敏度有限，导致检测结果准确度不高。因此，寻找一种具有高选择性和灵敏度的荧光探针，并实现对残留二氧化硫进行定量检测，甚至研究出对应的快速检测装置具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种香豆素类探针在二氧化硫定量检测中的应用，以香豆素衍生物作为荧光探针，实现二氧化硫残留的定量检测和低含量检测。
由于在中性水溶液及中药材中二氧化硫以其两种衍生物亚硫酸氢根和亚硫酸根的平衡形式存在，故本发明提供一种高选择性和灵敏度的检测中药材中亚硫酸根和亚硫酸氢根的荧光探针和相应检测方法。
荧光探针通常由两部分组成：识别基团和信号基团。由于二氧化硫气体在中药材中以SO3 2-和/或HSO3 -的形式存在，基于SO3 2-和/或HSO3 -的亲核性，将双键作为识别基团用于检测HSO3 -，作为香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，用于检测中药材中，或其他有可能存在二氧化硫残留的产品中的二氧化硫残留量。
本发明所研究的香豆素衍生物SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针是以荧光共振能量转移(FRET)的双键麦克尔加成机理进行的，SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针与SO2的反应是加成反应，反应位点是香豆素环外双键和噻唑环内双键部分。由于SO2易溶于水，而在中性水溶液及中药材中二氧化硫以其两种衍生物亚硫酸氢根和亚硫酸根的平衡形式存在，因此常将SO2转换成SO3 2-或HSO3 -进行检测。在弱酸或弱碱性条件下亚硫酸氢盐、亚硫酸盐与本发明香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针反应生成香豆素衍生物的磺酸盐荧光化合物，荧光强度比与其浓度呈正比。
本发明所研究的香豆素衍生物的SO3 2-和/或HSO3 -探针本身具有很强的荧光，在可见光下呈红色，在紫外光下呈紫红色，其与SO3 2-结合后，阻断了分子内电子转移，在可见光下呈黄色，在紫外光下呈绿色，显色程度与SO3 2-浓度成正相关。因此通过显色程度可反映出SO3 2-浓度，根据SO3 2-浓度与SO2浓度转化关系进一步可反映出待测样品中SO2残留，从而实现可视化荧光检测SO3 2-。
本发明提供了香豆素衍生物作为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的应用，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure BDA0002403142980000021
本发明还提供一种SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针组合物，包括结构式如下的香豆素衍生物：
Figure BDA0002403142980000022
本发明还提供一种二氧化硫残留检测方法，以香豆素衍生物为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，对二氧化硫进行定量检测，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure BDA0002403142980000023
进一步地，上述检测方法可用于检测残留有二氧化硫产品中的二氧化硫残留，所述产品包括中药材、食品。
进一步地，上述应用需对被检测的产品进行预处理，处理方法包括以下内容：
将产品与水、盐酸混合加热至沸腾，以羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液为吸收液收集SO2气体。
进一步地，是将香豆素衍生物溶液与吸收了SO2的吸收液混合，通过混合后吸收液的颜色判断SO3 2-的浓度，得出中药材样品中二氧化硫残留量。
进一步地，是观察混合后1500～1800s时溶液的颜色。
在本发明的具体实施方式中，对产品进行预处理的方法还可以是：将产品与50％乙醇的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液混合超声处理得提取液。
进一步地，将香豆素衍生物溶液与提取液混合，通过混合后提取液的颜色判断SO3 2-的浓度，得出中药材样品中二氧化硫残留量。
进一步地，是观察混合后1500～1800s时溶液的颜色。
进一步地，上述观察溶液颜色判断SO3 2-的浓度的方法是将溶液的颜色与标准比色卡进行比对得出。
更进一步地，混合后将需将溶液pH值调至6～8，优选7.4。
本发明还提供了上述香豆素衍生物的制备方法，包括如下内容：
(1)将4-(二乙氨基)水杨醛与丙二酸二乙酯反应得到中间体1，哌啶做催化剂，其中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：(2～3)：(0.2～0.4)；
(2)将中间体1通过环化反应得到中间体2；
(3)将中间体2通过Vilsmeier-Haack反应得到中间体3；
(4)将中间体3与苯并噻唑-2-乙腈反应得到权利要求1所述的香豆素衍生物，哌啶做催化剂，其中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：(2～3)：(0.5～1.5)，反应温度为0～10℃。
进一步地，步骤(1)中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：2.4：0.35，溶剂为乙醇。
进一步地，步骤(2)的反应条件为以乙酸：浓盐酸体积比为1：(0.8～1.2)的溶液为溶剂，在80～140℃下反应；其中，乙酸：浓盐酸体积比优选1：1，反应温度优选120℃；
进一步地，步骤(3)的反应条件为以DMF：POCl3体积比为(3～5):1的溶液为溶剂，在50～75℃下反应；其中，DMF：POCl3体积比优选4:1，反应温度优选65℃；
进一步地，步骤(4)中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1，反应温度为0～5℃，溶剂为乙醇。
所述浓盐酸是指市售的浓度为36％～38％的浓盐酸。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种新的SO3 2-和/或HSO3 -探针，并建立了比色检测方法，可快速检测二氧化硫残留量的大小和范围值，且检测范围大，实现了中药材中二氧化硫残留的定量检测。
附图说明
图1是本发明探针紫外滴定曲线图(在缓冲溶液(DMF:buffer＝1:1)中探针XDST2与SO3 2-(0,1,2,4,6,8,10,15,20,40,60,80,100,120,160,200,220,250,300,350,400equiv.)的紫外滴定曲线)；
图2是本发明探针荧光滴定曲线图(在缓冲溶液(DMF:buffer＝1:1)中探针XDST2与SO3 2-(0,1,2,4,6,8,10,15,20,40,60,80,100,120,160,200,220equiv.)的荧光滴定曲线(λex＝370nm,λscan＝370-700nm))；
图3是检测时间考察图；
图4是检测不同浓度的二氧化硫溶液的紫外动力学吸收图；
图5是75～85mg/L二氧化硫溶液的检测时间考察图；
图6是pH条件考察图；
图7是探针用量考察图；
图8是检测溶剂考察图；
图9是检测温度考察图；
图10是可见光(a)和365nm紫外光(b)下探针XDST2离子选择性显色结果；
图11是检测重复性考察图；
图12是本发明探针检测紫外吸收光谱(在缓冲溶液(DMF:buffer＝1:1)中探针XDST2与SO3 2-(0,10,30,50,70,80,90,100mg/L)的紫外吸收光谱)；
图13是本发明探针检测荧光吸收光谱(在缓冲溶液(DMF:buffer＝1:1)中探针XDST2与SO3 2-(0,10,30,50,70,80,90,100mg/L)的荧光吸收光谱(λex＝370nm,λscan＝370-700nm))；
图14是探针XDST2检测二氧化硫衍生物SO3 2-的机理及相应1H-NMR谱；
图15是标准比色卡(a)可见光下二氧化硫标准对照液显色图；b)365nm紫外光下二氧化硫标准对照液显色图)；
图16是未硫熏的中药材的检测结果(图中分别是可见光和365nm紫外光下的照片)。
具体实施方式
下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明。以下所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
本实施例中所述“当量”，是指以某一物质的用量(物质的量)为基础(即1当量)，其它物质与该物质的用量(物质的量)比值。
实施例1
化合物XDST2：
Figure BDA0002403142980000041
的合成方法如下：
(1)取4-(二乙氨基)水杨醛(25g，129.53mmol)，2.4当量丙二酸二乙酯(47.14ml，310.872mmol)，100ml无水乙醇加入反应器中，待溶解后加入0.35当量的哌啶(4.143ml)。反应约6h完全，回收溶剂，浓缩得黄色油状物中间体1，柱层析，环己烷与乙酸乙酯为洗脱剂，收集洗脱液，浓缩至干，即得黄色晶体状中间体1(19.875g，收率53.09％)。
(2)19.875g中间体1溶于比例为V:V＝1:1的乙酸与Conc.HCl溶液中，乙酸与Conc.HCl溶液的混合溶液作反应溶剂，溶剂共300ml，120℃下反应16h，反应完全后降至室温，加入8倍量水，乙酸乙酯萃取，合并有机相，饱和碳酸氢钠洗至中性，无水硫酸钠干燥，浓缩得黄色粘稠液体，取出常温自然冷却，即得黄色固体物质中间体2(14.806g，收率99.21％)。
(3)取14.806g中间体2(68.23mmol)在34.2ml的DMF-POCl3(V:V＝4:1)体系中将温度调整到65℃反应12小时，反应完全后将反应液降至室温，加入8倍量水，分散液放入4℃冰箱重结晶，抽滤，真空干燥，即得黄色固体物中间体3(10.712g，收率64.08％)。
(4)称取2.394g中间体3(9.771mmol)，2.4当量苯并噻唑-2-乙腈和1当量哌啶，并量取20ml无水乙醇，加入到50ml反应器，0℃下反应4.5h，停止反应，用稀HCl调pH至中性，加入适量硅胶，浓缩至干，柱层析，二氯甲烷:甲醇为洗脱剂，梯度洗脱，收集洗脱液，浓缩至干，即得红色粉末状探针样品XDST2(3.002g，收率76.61％)。
并进行1HNMR和高分辨质谱测定，表征最终产物结构。合成路线如下：
Figure BDA0002403142980000051
7-(二乙氨基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-羧化物(中间体1)：得黄色晶体，收率53.09％，MS m/z＝290.1361(M+1)；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.14(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),1.28(t,3H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.45～3.50(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),4.20～4.25(q,2H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),6.52～6.53(d,1H,1.5Hz,CHCCH),6.75～6.77(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.60～7.63(d,1H,J1＝7.5Hz,CHCH),8.53(s,1H,CH)。
7-(二乙氨基)-香豆素(中间体2)：得黄色固体，收率99.21％，MS m/z＝218.1174(M+1)；1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.12(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.39～3.45(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),5.97～5.99(d,1H,10.9Hz,CH＝CH),6.50～6.51(d,1H,J＝1.5Hz,CHCCH),6.66～6.69(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.41～7.43(d,1H,7.5Hz,CHCH),7.80～7.82(d,1H,J＝10.9Hz,CH＝CH)。
7-(二乙氨基)-2-氧-2H-苯并吡喃-3-甲醛(中间体3)：得黄色固体，收率64.08％，MS m/z＝246.1127(M+1)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.15(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.48～3.54(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),6.60～6.61(d,1H,1.5Hz,CHCCH),6.81～6.84(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.67～7.69(d,1H,J1＝7.5Hz,CHCH),8.41(s,1H,-1.0Hz,H>C＝C<C-H),9.89(s,1H,CHO)。
(E)-2-(苯并噻唑-2-乙腈)-3-(7-(二乙氨基)-香豆素)丙烯腈(目标探针XDST2)：得红色粉末，收率76.61％，MS m/z＝402.1261(M+1)。1H-NMR(400MHz,DMSO-d6)δ:1.18(t,6H,J＝8.0Hz,H-CH2CH2),3.52～3.58(q,4H,J＝8.0Hz,H-CHCH3),6.68(d,1H,J＝1.5Hz,CHCCH),6.85～6.88(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCCH),7.49(d,1H,J＝7.5Hz,CHCH),7.51～7.61(m,2H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝7.5Hz,CHCH,J3＝1.5Hz,CHCCH),7.64(s,1H,CH),7.66(s,1H,CH),8.07～8.09(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCHCH),8.16～8.18(dd,1H,J1＝7.5Hz,CHCH,J2＝1.5Hz,CHCHCH)。
对照例1
1、步骤(1)中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：1.2：0.35，其余反应条件同实施例1，步骤(1)的产率为30.25％。
2、步骤(4)中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：1.2：1.0，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为38.5％。
3、步骤(4)中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：0.35，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为45.6％。
4、步骤(4)中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1.0，反应温度为室温(25℃左右)，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为50.3％。
5、步骤(4)中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1.0，反应温度为60℃，其余反应条件同实施例1，步骤(4)的产率为48.2％。
对照例中的各个实验仅是发明人在探索最佳合成路线中，众多实验中的几例，通过对照例1中的各个试验可以看出，本发明合成方法中的物料的用量比、反应温度等反应条件，相互搭配发挥了协同增效作用，使得产率得到了显著提升。
实施例2荧光探针检测器应用于中药材二氧化硫残留量测定
建立一种基于香豆素结构类比率型荧光探针检测SO3 2-及中药材中二氧化硫残留量的方法，由于探针反应快，灵敏，这将会缩短检测时间，提高检测效率。其中比率型荧光探针可以消除溶剂等因素引起的光谱干扰，从而降低对测定结果的影响。
此部分的工作包括对探针的荧光光谱进行测定，建立荧光探针的检测限及线性，得出初步的待测物与荧光强度间比例关系，其次再对探针检测条件进行优化，离子选择性进行考察，检测机理进行确证，检测动力学考察等。然后再对该探针检测方法进行方法学考察并用于中药材二氧化硫残留量测定，对该方法进行评价，得出检测方法。
以下所述探针XDST2为
Figure BDA0002403142980000061
SO3 2-和/或HSO3 -探针。
1.1二氧化硫标准溶液的制备
分别称取亚硫酸钠0，0.098，0.196，0.294，0.392，0.490，0.588，0.686，0.784，0.882，0.980，1.078，1.176，1.274，1.372，1.470mg，依次加N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液2.5ml配成0，10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110，120，130，140，150mg/L的二氧化硫标准溶液。照2015版《中国药典》四部通则2331项下收载的二氧化硫残留量测定法进行试验，结果确定了所配制二氧化硫标准溶液质量浓度的准确性。其中SO2的质量浓度和亚硫酸钠浓度之间的关系如下：
(1)SO3 2-浓度与SO2浓度的转换关系式：
Figure BDA0002403142980000071
Figure BDA0002403142980000072
Figure BDA0002403142980000073
其中，V溶’：表示N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲提取溶液(pH＝7.40,10mmol)的体积；V溶：表示N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)的体积；CSO2质：表示SO2质量浓度(mg/L)。
(2)SO2的质量浓度与药典浓度之间的关系式：
CSO2×V溶＝mSO2
所以药典浓度为：
Figure BDA0002403142980000074
其中，V溶为中药材SO2吸收液的体积；m药材为待测药材质量。
1.2单因素试验考察及性质研究
1.2.1荧光探针XDST2对SO3 2-检测限度的考察
分别取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，以及一系列当量浓度的标准二氧化硫对照液2.5mL，调节pH至7.40，依次分别加入到10mL比色瓶中，摇匀，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，分别放入UV-1800紫外-可见分光光度计和F-7000荧光光谱仪，测定其紫外及荧光滴定曲线，扫描结果如图1～2所示。
从探针XDST2的紫外滴定曲线图可知，随着SO3 2-的加入，525nm和340nm处的吸收逐渐减弱，而在410nm处出现新的吸收并逐渐增强，当SO3 2-的加入量达到350当量，525nm和340nm处的吸收不再减弱，说明探针XDST2对SO3 2-的检测限度为0～350当量，即0～3500μmol/L。从探针XDST2的荧光滴定曲线图可知，随着SO3 2-的加入，375nm处的吸收逐渐减弱，而在465nm处出现新的吸收并逐渐增强，变化关系与紫外滴定曲线图一致。
1.2.2荧光探针XDST2检测时间的考察
分别取20μmol/L探针溶液2.5mL，以及由0，0.098，0.196，0.294，0.392，0.490，0.588，0.686，0.784，0.882Na2SO3分别配制质量浓度为0mg/L，10mg/L，20mg/L，30mg/L，40mg/L，50mg/L，60mg/L，70mg/L，80mg/L，90mg/L的二氧化硫标准对照溶液2.5mL(pH 7.40，0.04mol/L)，依次分别加入到10mL量瓶中，摇匀，室温静置。在可见光下观察反应后溶液的颜色，以2015版《中国药典》的常见硫熏药材限硫指标400mg/kg(对应质量浓度80mg/L，具体见式2)为考察对象，并在300s，600s，900s，1200s，1500s，1800s共6个时间点对显色后的溶液进行拍照，拍照结果见图3(由于探针溶液颜色在可见光下呈现的红、淡红及黄色分别对应365nm紫外光下的紫红、淡紫红和绿色，见1.4标准比色卡的制备部分，故选择在可见光下，考察10μmol/L探针溶液对0mg/L～90mg/L的10个二氧化硫对照溶液在1800s内显色变化，下同)。
根据图3可知，可见光下0mg/L～30mg/L SO2标准对照溶液在0～300s颜色变化不大，但40mg/L～90mg/L SO2标准对照溶液在0～300s颜色显著变为淡红色；300s～1800s时0mg/L～30mg/L SO2标准对照溶液颜色较稳定，随浓度增大逐渐由红变为淡红，而从300s起，40mg/L～90mg/L SO2标准对照溶液颜色发生明显变化，80mg/L、90mg/L的两个SO2标准对照溶液在1500s以后变为黄色，40mg/L～70mg/L SO2标准对照溶液在1500s以后随浓度增大逐渐由红变为淡红。以2015版《中国药典》的常见硫熏药材限硫指标400mg/kg对应浓度80mg/L的组为考察对象，初步确定荧光探针XDST2检测时间为1500s。
另外，按照“1.1二氧化硫标准溶液的制备”的方法配制质量浓度为0mg/L，10mg/L，30mg/L，80mg/L，90mg/L，100mg/L的6个二氧化硫对照溶液，转化为药典浓度分别为0mg/kg，50mg/kg，150mg/kg，400mg/kg，450mg/kg，500mg/kg。依次将配制好的6个二氧化硫对照溶液分别装入到6个对应的10ml比色瓶，用0.5mol/L NaOH调二氧化硫对照溶液pH至7.40，再依次加入2.5mL20μmol/L探针的N,N-二甲基甲酰胺溶液到相应比色瓶中，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其紫外动力学吸收曲线，测定结果如图4所示。
从检测结果图4来看，SO2质量浓度为0mg/L时，探针XDST2的(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)溶液吸光度值在0至1800s相对稳定；当SO2质量浓度不为0mg/L时，随着二氧化硫浓度的增大，初始吸光度值(0s处的吸光度值)逐渐减小，这是由于在转移样品至紫外-可见分光光度计期间，探针与不同浓度的SO3 2-发生迈克尔加成反应所致。另外，每一个质量浓度对应SO2对照溶液的紫外动力学吸收曲线不同，随着二氧化硫浓度的增大，在10μmol/L探针XDST2对SO3 2-的检测范围0-3500μmol/L(由1.2.1项探针XDST2对SO2标准溶液的紫外滴定结果算得)内，吸光度值减小得越多，减小的速度越快，随后趋于稳定，从1500s起，SO2质量浓度大于80mg/L(包括80mg/L)的二氧化硫对照溶液吸光度值较空白组均趋于稳定，且Abs小于0.04，说明相应SO3 2-反应完全，溶液呈现黄颜色，而SO2质量浓度在0～70mg/L(包括70mg/L)范围的二氧化硫对照溶液吸光度值仍然在持续减小，且Abs大于0.04，溶液呈现红色或淡红色。可见，0mg/L～90mg/LSO2标准对照溶液与探针溶液在0～1800s的紫外动力学吸收扫描结果和可见光下显色结果一致。
按照前述方法对质量浓度为75mg/L，76mg/L，77mg/L，78mg/L，79mg/L，80mg/L，81mg/L，82mg/L，83mg/L，84mg/L，85mg/L的11个二氧化硫对照溶液分别在室温下进行探针显色，在可见光下观察反应后溶液的颜色，以2015版《中国药典》的常见硫熏药材限硫指标400mg/kg对应浓度80mg/L的组为考察对象，并在300s，600s，900s，1200s，1500s，1800s共6个时间点对显色后的溶液进行拍照，记录结果如图5。
从质量浓度为75mg/L，76mg/L，77mg/L，78mg/L，79mg/L，80mg/L，81mg/L，82mg/L，83mg/L，84mg/L，85mg/L的11个二氧化硫对照溶液的探针显色结果可知，1500s为显著区分2015版《中国药典》规定常见硫熏中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)的最佳时间起始点。
综上考察结果，1500s～1800s是显著区分2015版《中国药典》规定常见中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)的最佳时间段，最终确定1500s(25min)为观察和比色时间点。
1.2.3荧光探针XDST2检测的pH条件考察
分别取3份20μmol/L探针溶液2.5mL，以及pH值依次为6.40，7.40，8.40，且质量浓度分别为80mg/L(400mg/kg)的3份二氧化硫标准对照溶液各2.5mL，依次加入到对应比色瓶中，摇匀，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其在0～300s的紫外动力学吸收曲线，扫描结果如图6所示。
图6的结果表明80mg/L(400mg/kg)二氧化硫标准对照溶液与探针溶液的显色反应影响较大，为了便于显色判别，pH为7.40较为合适。
1.2.4荧光探针XDST2的用量
分别取20μmol/L探针DMF溶液1mL、2.5mL、4mL各1份，以及质量浓度分别为80mg/L(400mg/kg)的二氧化硫标准对照溶液各3份，对应为4mL、2.5mL、1mL，依次分别加入到6个10ml比色瓶中，摇匀，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，放入UV-1800紫外-可见分光光度计测定其在0～300s的紫外动力学吸收曲线，扫描结果如图7所示。
图7表明探针用量对0mg/L(400mg/kg)二氧化硫标准对照溶液与探针溶液的显色反应有影响，为了便于显色判别，探针用量为2.5mL较为合适。
1.2.5荧光探针XDST2检测的溶剂考察
改良药典法采用的是N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(pH＝7.40,40mmol)溶液作为SO2提取液及样品检测液。为了确保SO2提取液对SO3 2-的提取程度及样品检测液的澄明度，采用50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲吸收液作为超声提取法的样品提取液。同时，照3.5.2荧光探针XDST2检测时间的考察部分方法在50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲吸收液中考察10μmol/L探针溶液对0mg/L～90mg/L的10个二氧化硫对照样品在1800s内显色变化，选取300s，600s，900s，1200s，1500s，1800s共6个时间点对应显色结果如图8所示。
从图8的显色结果可知，1500s为显著区分2015版《中国药典》规定常见硫熏中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)的最佳时间起始点，1500s～1800s是显著区分2015版《中国药典》规定常见硫熏中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)的最佳时间段，这与之前“1.2.2荧光探针XDST2检测时间的考察”部分的显色变化一致，说明50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液可以用来提取SO3 2-。
1.2.6荧光探针XDST2检测的温度条件考察
分别取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，400mg/kg(80mg/L)的标准二氧化硫对照液2.5mL，各8份于比色小瓶，调节pH至7.40，分别对应取一瓶置于BCD-226WTM(E)型美的电冰箱或HH-S6型电热恒温水浴锅，调节温度分别为0℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，保持10min。随后取出对应温度下的二氧化硫标准对照液和探针DMF溶液，将待测二氧化硫标准对照液加入相应温度的探针DMF溶液，计时，摇匀。观察各温度下的待测二氧化硫标准对照液在1800s内显色变化，结果如图9所示。
从图9的显色结果来看，在0℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃下2015版《中国药典》规定常见硫熏中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)对应的标准二氧化硫对照液的显色时间点是1500s，这与之前“1.2.2荧光探针XDST2检测时间的考察”部分的显色变化一致，表明0～50℃对400mg/kg(80mg/L)二氧化硫标准对照溶液与探针溶液的显色反应影响较小，因此，荧光探针XDST2检测的温度条件为0～50℃。
1.2.7荧光探针XDST2选择性的考察
取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，100当量的SO3 2-、F-、Cl-、Br-、I-、NO2 -、CH3COO-、HPO4 2-、CO3 2-、SO4 2-、S2O3 2-、SCN-、H2PO4 -、HCO3 -的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)盐溶液各2.5mL，依次加入到10ml比色瓶中，摇匀，室温静置25min，分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液颜色并拍照，记录结果(如图10)。
结果显示，在可见光下，只有SO3 2-与探针XDST2发生迈克尔加成反应，使得溶液颜色变黄，其他组均为红色；在紫外光下，只有SO3 2-与探针XDST2发生迈克尔加成反应，使得溶液颜色变绿，绿色荧光增强，其他组均为紫红色。综上所述，说明探针XDST2对SO3 2-具有良好的选择性。
1.2.8荧光探针XDST2检测的重复性考察
分别取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，400mg/kg(80mg/L)的标准二氧化硫对照液2.5mL，各6份于10mL比色小瓶，调节pH至7.40，依次将待测二氧化硫标准对照液加入相应温度的探针DMF溶液，计时，摇匀。室温下观察各组待测二氧化硫标准对照液在1800s内显色变化，结果如图11所示。
从显色结果来看，室温下2015版《中国药典》规定常见硫熏中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)对应的6组标准二氧化硫对照液的显色时间点均为1500s，表明室温下探针XDST2对400mg/kg(80mg/L)的二氧化硫标准对照溶液与溶液的显色重复性良好。
1.2.9荧光探针XDST2光谱性质研究
本部分取用20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，以及一系列浓度的标准二氧化硫对照液2.5mL，调节pH至7.40，依次分别加入到10mL比色瓶中，摇匀，立即将比色瓶中待测样品转移至比色皿，分别放入UV-1800紫外-可见分光光度计和F-7000荧光光谱仪，测定其紫外光谱及荧光光谱，扫描结果如图12～13所示。
从紫外光谱图可知，荧光探针XDST2的空白溶液中，其在525nm和340nm处有最大吸收，随着SO3 2-浓度的增大，525nm处的吸收逐渐减弱，而在410nm处出现新的吸收并逐渐增强；另外，在荧光谱图中，荧光探针XDST2的空白溶液中，其在375nm处有最大吸收，随着SO3 2-的加入，375nm处的吸收逐渐减弱，在465nm处出现新的吸收并逐渐增强。
探针XDST2检测二氧化硫衍生物SO3 2-的反应机理如下：
Figure BDA0002403142980000111
精密称取2.005mg探针XDST2试剂，装入核磁管，加入0.5mL溶液(DMSO-d6:D2O＝4:1)溶解，即得10mmol·L-1的空白探针XDST2待测样品；同时称取2.005mg探针XDST2试剂，以及3.15mgNa2SO3，装入核磁管，加入0.5mL溶液(DMSO-d6:D2O＝4:1)溶解，即得供试样品(探针XDST2+Na2SO3(5当量))。采用Bruker AVII-400核磁共振波谱仪测得探针XDST2与亚硫酸盐相互作用的1H-NMR谱图如图14所示。
从图14中1H-NMR谱图结果来看，随着5当量SO3 2-的加入，探针XDST2与SO3 2-发生了香豆素环3位侧链的双键迈克尔加成(1,4-加成)反应。如图16中b)部分所示，δ＝7.64ppm处的峰是探针XDST2结构中乙烯的质子信号(1a)，在加入5当量SO3 2-后，7.64ppm的信号消失，同时在4.60ppm处出现产物的质子信号(2a)。产物(2b、2c、2d、2e)的质子信号因探针XDST2的共轭桥的破坏而略有上升，这组氢归属于2-氰基-2-苯并噻唑乙烯基的迈克尔加成(1,4-加成)。由于2-氰基-2-苯并噻唑乙烯基部分苯环上的质子信号发生了改变，分别从7.51～8.18ppm变为7.46～8.08ppm，故我们认为这是探针XDST2上双键的1,4-加成形成新的双键，而不是香豆素环外双键的1,2-加成。
综上所述，通过紫外光谱、荧光光谱及1H-NMR谱测定，验证了探针XDST2与亚硫酸盐的相互作用机理。
1.3供试品溶液的制备
超声提取法：采用超声波辅助脱除中药材二氧化硫的方法对药材进行前处理。分别取药材或饮片细粉约5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，加50％乙醇的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液25mL，密塞，超声20min，振摇，滤过，即得供试品溶液。
改良药典法：采用N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,40mmol)溶液吸收改良药典法提取的SO2，即采用改良的酸蒸馏法对药材进行前处理，分别称取各药材约5g，精密称定，置两颈圆底烧瓶中，加水120mL和6mol/L盐酸溶液2mL，导入氮气至瓶底，连接回流冷凝管，在冷凝管上端连接导气管，将导气管插入到100mL锥形烧瓶底部，锥形瓶内加N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)(0.04mol/L)缓冲溶液25mL作为吸收液。加热两颈烧瓶内溶液至沸，保持20min，以确保SO2收集完全。所得SO2吸收溶液密封，避光保存。
分别对两种方法提取安徽葛根、河北山药、广西牛膝、河南白术、四川白芍的供试液探针显色反应，结果如表1：
表1
Figure BDA0002403142980000121
显色结果一致，说明采用超声提取法得到的二氧化硫提取液中药材成分对探针XDST2显色检测的干扰不大，没有干扰，考虑到操作的简便性，后续检测采用超声提取法制备。
1.4标准比色卡的制备
根据探针XDST2对SO3 2-的检测范围为0-3500μmol/L，即探针检测SO2的浓度范围为0～224mg/L，故以2015版《中国药典》的常用硫熏中药材限硫指标400mg/kg(80mg/L)及一般中药材限硫指标150mg/k(30mg/L)为考察对象，选择0～224mg/L的5个浓度对应SO2标准对照液进行标准比色卡建立(见SO3 2-浓度与SO2浓度的转换关系式)。
取浓度为20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，SO2药典浓度分别为0mg/kg(0mg/L)，50mg/kg(10mg/L)，150mg/kg(30mg/L)，400mg/kg(80mg/L),450mg/kg(90mg/L)的N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)盐溶液各2.5mL，依次加入到10ml比色瓶中，摇匀，室温静置25min，分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液颜色并拍照，记录结果(如图15)。
从图15中的可见光显色图片来看，随着SO2浓度的增大，10μmol/L探针XDST2的(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由红变淡红，最后变黄，在25min时可以明显区分出150mg/kg(30mg/L)及400mg/kg(80mg/L)以上浓度二氧化硫对照溶液。
从图15中的紫外光显色图片来看，随着SO2浓度的增大，10μmol/L探针XDST2的(N,N-二甲基甲酰胺)-(N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)缓冲溶液(pH＝7.40,20mmol)溶液颜色逐渐由紫红变淡紫红，最后变绿，在25min时可以明显区分出150mg/kg(30mg/L)及400mg/kg(80mg/L)以上浓度二氧化硫对照溶液。
综上所述，确定可见光及365nm紫外光下药典浓度为0mg/kg(0mg/L)，50
mg/kg(10mg/L)，150mg/kg(30mg/L)，400mg/kg(80mg/L),450mg/kg(90mg/L)的5个二氧化硫标准对照液的显色结果即为标准比色卡。
1.5空白试验
分别取未硫熏的安徽亳州牛膝、河南禹州白芍和四川成都葛根，用本发明探针进行药材中的SO2残留检测，检测结果见图16，表明本发明探针的专属性良好。
1.6中药材中二氧化硫残留量的测定
取20μmol/L探针DMF溶液2.5mL，样品吸收溶液2.5mL，依次加入到10mL比色瓶中，调节pH至7.40，摇匀，室温静置25min。分别在可见光和365nm紫外光下观察反应后溶液的颜色，记录结果。将其与荧光探针XDST2的标准比色卡比对得SO3 2-的浓度，即测得中药材样品中二氧化硫残留范围，并判断是否超出规定限量。同时按2015版《中国药典》四部通则2331项下收载的方法测定二氧化硫残留量，结果见表2、表3。
表2探针比色法和酸碱滴定法测得36批中药材中二氧化硫残留结果
Figure BDA0002403142980000131
Figure BDA0002403142980000141
Figure BDA0002403142980000151
表3探针比色法和酸碱滴定法测定36批中药材中二氧化硫残留量的结果对照
Figure BDA0002403142980000152
Figure BDA0002403142980000161
注：①“1”表示荧光探针法和酸碱滴定法的结果相符，“0”表示荧光探针法和酸碱滴定法的结果不符；②“*”表示中药材中二氧化硫残留量含量超过国家标准限量；③准确率＝(探针比色法测得结果得分/药材总数)×100％。
本发明探针XDST2对SO3 2-具有显著的显色反应性质，本发明通过建立比色法，测定了购自安徽亳州等五大药材市场的山药等8种共36批中药材含硫量，结果表明，在测定的36批中药材中，有24批药材含有二氧化硫，占比66.66％。其中，二氧化硫残留量超过2015版《中国药典》标准的有10批，占比27.77％。通过对测定结果进行比较分析，相较于酸碱滴定法的测定结果，探针显色法的测定结果一致，准确率为高达100％。
本发明制备了一种香豆素结构的荧光探针XDST2，根据探针与不同浓度SO3 2-的反应及显色不同，以2015版《中国药典》中规定的传统习用硫熏中药材和其他中药材中药材及饮片的二氧化硫残留量限制指标为基准，建立基于香豆素结构的探针显色法，并以酸碱滴定法的测定结果为验证，将本发明方法用于检测中药材二氧化硫残留量，可为中药材质量控制及合理使用提供依据。
本发明探针XDST2对SO3 2-具有高选择性和高灵敏度检测的特点，与酸碱滴定法相比较，有着易于携带、操作简便、检测快速和环境友好的特点，可作为有关部门和消费者快速筛选合格中药材的参考方法，对提高和控制中药材在流通和使用过程中的质量具有重要意义。此外，本发明方法还可以应用于检测食品中的二氧化硫残留量，如香菇，馒头等。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.香豆素衍生物作为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针的应用，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure FDA0002403142970000011
2.一种SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针组合物，其特征在于，包括结构式如下的香豆素衍生物：
Figure FDA0002403142970000012
3.一种二氧化硫残留检测方法，其特征在于，以香豆素衍生物为SO3 2-和/或HSO3 -荧光探针，对二氧化硫进行定量检测，所述香豆素衍生物化学结构式如下：
Figure FDA0002403142970000013
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，用于检测残留有二氧化硫产品中的二氧化硫残留，所述产品包括中药材、食品。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，对被检测的产品进行预处理，处理方法包括以下内容：
将产品与水、盐酸混合加热至沸腾，以羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液为吸收液收集SO2气体；
进一步地，将香豆素衍生物溶液与吸收了SO2的吸收液混合，通过混合后吸收液的颜色判断SO3 2-的浓度，得出产品中二氧化硫残留量；
进一步地，是观察混合后1500～1800s时溶液的颜色；
更进一步地，混合后将溶液pH值调至6～8，优选7.4。
6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，对被检测的产品进行预处理，处理方法包括以下内容：
将产品与50％乙醇的羟乙基哌嗪乙硫磺酸缓冲液混合超声处理得提取液；
进一步地，将香豆素衍生物溶液与提取液混合，通过混合后提取液的颜色判断SO3 2-的浓度，得出产品中二氧化硫残留量；
进一步地，是观察混合后1500～1800s时溶液的颜色；
更进一步地，混合后将溶液pH值调至6～8，优选7.4。
7.权利要求1所述的香豆素衍生物的制备方法，其特征在于，包括如下内容：
(1)将4-(二乙氨基)水杨醛与丙二酸二乙酯反应得到中间体1，哌啶做催化剂，其中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：(2～3)：(0.2～0.4)；
(2)将中间体1通过环化反应得到中间体2；
(3)将中间体2通过Vilsmeier-Haack反应得到中间体3；
(4)将中间体3与苯并噻唑-2-乙腈反应得到权利要求1所述的香豆素衍生物，哌啶做催化剂，其中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：(2～3)：(0.5～1.5)，反应温度为0～10℃。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，4-(二乙氨基)水杨醛：丙二酸二乙酯：哌啶的摩尔比为1：2.4：0.35，溶剂为乙醇。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)的反应条件为以乙酸：浓盐酸体积比为1：(0.8～1.2)的溶液为溶剂，在80～140℃下反应；其中，乙酸：浓盐酸体积比优选1：1，反应温度优选120℃；
进一步地，步骤(3)的反应条件为以DMF：POCl3体积比为(3～5):1的溶液为溶剂，在50～75℃下反应；其中，DMF：POCl3体积比优选4:1，反应温度优选65℃；
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，中间体3：苯并噻唑-2-乙腈：哌啶的摩尔比为1：2.4：1，反应温度为0～5℃，溶剂为乙醇。
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