CN113121552A - 一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种选择性检测半胱氨酸（Cysteine,Cys）的荧光分子探针，该分子探针的化学结构式如下：

Description

一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成与应用
技术领域
本发明属于分析化学技术领域，具体涉及一种可选择性检测Cys荧光探针的合成，以及该探针在环境中定量检测Cys，在细胞内荧光成像Cys的应用。
背景技术
半胱氨酸（Cysteine，Cys）是二十种天然氨基酸中唯一含有还原性巯基的氨基酸，是细胞中硫代谢的中心物质。细胞内的Cys主要由三条途径获得，胱氨酸还原、蛋氨酸代谢和体内蛋白质分解。由于血浆中较高的氧化环境，Cys在血液系统中主要以二硫键的氧化态（Cyss）形式存在，Cys和Cyss的动态平衡是血液系统中氧化还原稳态的主要调节因素。血浆中总Cys的含量约为250 μM，且其随年龄、胆固醇、性别等因素的不同略有变化。血浆中的Cyss经细胞膜上Xc-通道进入细胞后在细胞内被还原为Cys，Cys在细胞内进一步参与蛋白质、GSH的合成以及分解代谢（细胞中总Cys的浓度为30-200 μM）。在动物细胞中，Cys参与了肽链的合成和折叠、氧化还原平衡调控、细胞信号传导、解毒、凋亡等大量生命过程，在生命系统中有着不可或缺的重要地位。其在肌体内的浓度异常与心脑血管疾病、神经退行性疾病、癌症等重大疾病的发病密切相关。因此，通过实时监测细胞内Cys含量对深入了解其生物学作用机制与功能、指导药物开发具有重要意义。
近年来，荧光探针因其能够监测和可视化活细胞中的分析物而受到广泛的关注，因其提供了一种非破坏性、高选择性与灵敏度、可视化、操作简便的分析方法。截至目前已报道了很多基于丙烯酸酯/醛基为识别基团的荧光探针用于检测Cys，但这些分子探针存在选择性差（同型半胱氨酸和谷胱甘肽有一定的干扰）、灵敏度低的缺点。因此，发展高特异性的识别位点/基团用于高选择性检测Cys，对深入了解Cys的生物学功能与相关机制具有非常重要的意义。
发明内容
鉴于上述情况，克服一些现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种高选择性检测Cys的荧光探针，利用Cys与探针发生取代-重排-环化级联反应机理，实现高选择性检测Cys的目的，为环境中定量Cys和活细胞中成像分析Cys提供可靠的分析工具与方法。
本发明的目的还在于提供一种选择性检测Cys的荧光分子探针的合成与应用方法。
本发明解决问题采取的具体技术方案为：一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成与应用，探针的化学结构式如下：
Figure 670574DEST_PATH_IMAGE001
。
一种选择性检测Cys荧光探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的合成方法包括以下步骤：
步骤1.合成(氰基甲基)三苯基溴化膦
将适量溴乙氰与三苯基膦加入乙酸乙酯中，回流反应2小时，过滤干燥得白色固体(氰基甲基)三苯基溴化膦；
步骤2.合成(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈
a. 将适量9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-甲醛与(氰基甲基)三苯基溴化膦加入二氯甲烷中，室温搅拌反应30分钟，
b. 将适量NaOH溶于H2O中，缓慢滴加入步骤a的反应液中，继续室温搅拌反应5小时，
c. 反应完毕后柱层析纯化得黄色固体(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈。
本发明的荧光分子探针选择性检测Cys使用方法：无特殊说明，通常在室温下将探针分子溶解在有机相和水相体积比为5:5的环境下用于分析检测，有机相为二甲基亚砜(DMSO)，水相为pH = 7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)和分析物的水溶液。
本发明的荧光探针选择性检测Cys的具体特征如下：该分子探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针溶解在有机相和水相(5:5,v/v)溶液中，与Cys室温反应30分钟后，在380nm激发波长下发射472 nm的强蓝色荧光，探针本身无明显荧光，对Hcy, GSH, NAC, Gly,Ala, His, Met, Thr, Lys, Asp, Glu, Pro和Ser等氨基酸均无明显响应，可高灵敏度检测Cys（检测限为0.5 nM）。因此，本发明公开的荧光探针能够实现对Cys高灵敏定量检测。
附图说明
图1为本发明的荧光探针的核磁共振氢谱图。
图2为本发明的荧光探针成像HepG2细胞内源性Cys的荧光成像图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的说明。
本发明所述的荧光分子探针的合成方法如下式所示：
Figure 525398DEST_PATH_IMAGE002
实施例1.合成(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈
将0.5g(1.65 mmol)9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-甲醛与572mg（1.5 mmol）(氰基甲基)三苯基溴化膦加入30 mL二氯甲烷中，室温搅拌反应30分钟；然后将65.84mg(1.65 mmol)NaOH溶于8mL的H2O中，缓慢滴加入上述反应液中，继续室温搅拌反应5小时；反应完毕后柱层析纯化得黄色固体(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈286 mg，产率为58.4%。
实施例2.本发明的荧光分子探针在体外环境中检测Cys的应用
本发明所述的荧光分子探针光谱性质实验：将探针溶解在二甲基亚砜(DMSO)中配置成浓度为1 mM的探针溶液，配置浓度为10 mM的Cys水溶液。具体测试方式为：取20 μL 1mM的探针溶液，980 μL的分析纯DMSO，所需量的10 mM的Cys水溶液和所需量的PBS缓冲水溶液于2 mL的样品管中，所有测试均保持有机相和水相的体积比为5:5 (每一个测试样品总体积为2 mL)。例如当要求测试Cys浓度为20 μM时探针与Cys反应后的荧光强度，配制样品情况为：取20 μL的1 mM的探针溶液，980 μL的分析纯DMSO，40 μL的1 mM的Cys水溶液和960μL的PBS缓冲溶液于2 mL的样品管中，室温下震荡摇匀30分钟后即可用380 nm的激发波长测量472 nm处的荧光强度，其他测试操作与上述步骤类似，根据标准曲线即可定量环境中的Cys。该探针分子实现了高选择性高灵敏度检测Cys，非常适合活细胞中内源性Cys的成像及环境中Cys的定量分析。
实施例3.HepG2（肝癌细胞）细胞中内源性Cys的荧光成像分析
将HepG2传代至共聚焦皿细胞培养基中，在标准生长条件下培养，待细胞融合率达70-80%时，加入适量探针（5μM）继续在标准生长条件下培养30分钟，然后在共聚焦荧光显微镜下照相，用蓝色荧光通道进行荧光成像HepG2细胞中内源性的Cys，从图2可以看出探针能够成像细胞中内源性的Cys。
本发明的一种选择性检测半胱氨酸的荧光分子探针，利用Cys与探针发生取代-重排-环化级联反应机理，实现了高选择性检测Cys的目的，为环境中定量Cys和活细胞中成像分析Cys提供可靠的分析工具与方法。尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细的介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，具有本文所述技术特征的一种选择性检测半胱氨酸荧光探针的合成与应用，均落入本专利的保护范围。

Claims (4)

1.一种选择性检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述的荧光分子探针的化学结构式如(1)所示：
Figure 691581DEST_PATH_IMAGE001
（1）。
2.如权利要求1所述的荧光分子探针的合成，其特征在于，所述荧光分子探针的合成方法包括以下步骤：
步骤1.合成(氰基甲基)三苯基溴化膦
将适量溴乙氰与三苯基膦加入乙酸乙酯中，回流反应2小时，过滤干燥得白色固体(氰基甲基)三苯基溴化膦；
步骤2.合成(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈
a. 将适量9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-甲醛与(氰基甲基)三苯基溴化膦加入二氯甲烷中，室温搅拌反应30分钟，
b. 将适量NaOH溶于H2O中，缓慢滴加入步骤a的反应液中，继续室温搅拌反应5小时，
c. 反应完毕后柱层析纯化得黄色固体(E)-3-（9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-基）丙烯腈。
3.如权利要求2所述的荧光分子探针的合成，其特征在于，所述步骤a的9-氯-11-氧代-2,3,6,7-四氢-1H,5H,11H-吡喃并[2,3-f]吡啶并[3,2,1-ij]喹啉-10-甲醛与(氰基甲基)三苯基溴化膦的摩尔比为1:1-1.2。
4.如权利要求1所述的荧光分子探针的应用，其特征在于，所述的荧光分子探针能够制备在环境中定量检测Cys，在细胞内荧光成像Cys的器件的应用。
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