CN112266366B - 基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光分子及其制备方法和应用 - Google Patents

基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光分子及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种识别用于检测甲醛的硝基呋咱衍生物荧光探针分子及其制备方法和应用，该制备方法合成路线短，提纯方法简单。本发明提供的荧光探针（FAP1）本身在CH3CN‑Tris‑HCl溶液体系中具有微弱的荧光，当与甲醛发生特异性反应后，生成具有强烈荧光的产物，从而实现对甲醛的专一选择和定量检测。通过紫外‑可见分光光度计和荧光光谱仪研究了探针FAP1在CH3CN‑Tris‑HCl溶液体系中与常见活性小分子的识别特性。结果表明：探针FAP1对甲醛的专一选择性好、抗干扰性强，具有较宽泛的pH值适用范围。该探针对甲醛的最低检出限为0.016μM，在环境检测和生物领域具有广阔的应用前景。

Description

基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光分子及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于化学检测领域，涉及甲醛检测试剂，特别是指基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光分子及其制备方法和应用。
背景技术
甲醛是一种有机化学物质，化学式是HCHO或CH2O，通常为无色水溶液或气体，有刺激性气味。甲醛可作为酚醛树脂、脲醛树脂、维纶、乌洛托品、季戊四醇、染料、农药和消毒剂等的原料。甲醛具有强烈的毒性，已于2017年被世界卫生组织国际癌症研究机构列入一类致癌物清单。长期接触甲醛会造成中枢神经的麻痹，进一步造成肺水肿、肝昏迷、肾衰竭等一系列危害。生物体内甲醛的重要来源之一是食物，而食品特别是农产品中甲醛的来源主要有：人为违规添加、环境中的甲醛污染、动植物体内“内生”甲醛。国家食药监总局要求，各级食药监管部门要加强对蔬菜、水果、肉制品、水产品、乳制品等食用农产品批发、零售市场及生产加工环节的监督检查，严禁经营者将甲醛作食用农产品防腐剂使用；严禁非法或超范围使用防腐剂、保鲜剂。由于我国农产品生产、销售等环节的复杂现状，对非法添加甲醛的检测仍需加强。
荧光探针是一种将分子间的相互作用转换为易识别的光学信号传递给外界的工具。荧光探针与特定目标分析物发生作用后，荧光信号会发生明显变化从而达到检测目的。荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简便快速、对检测物损伤少等优点已被广泛应用于检测环境和生物体系中的金属阳离子、阴离子、生物体内活性小分子等方面。荧光探针分子的开发与利用研究是化学与生物、医学、农业等科学的交叉领域。专利CN201710307526.8公开了一种基于7-硝基苯呋咱的谷胱甘肽和半胱氨酸荧光探针及其制备方法，该探针的检测机理为谷胱甘肽和半胱氨酸结构中的巯基与丙烯酸酯发生迈克尔加成，再进一步发生分子内环化释放出荧光从而实现对谷胱甘肽和半胱氨酸的特异性识别，检测机理与本发明的荧光探针识别甲醛明显不同，并且检测的对象也有显著的不同。
而甲醛是人们生活环境中常见且危害较大的有害物，及时准确用于非疾病的诊断检测生物体、环境和食品中甲醛的含量在生物健康、环境保护和食品安全领域具有重要的意义。
发明内容
本发明提出了一种基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针及其制备方法，合成的荧光探针能够灵敏快速的从多种活性小分子物质中高效专一识别甲醛。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针分子（FAP1），所述荧光探针分子的结构式如下：
Figure 472210DEST_PATH_IMAGE001
。
所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针分子的制备方法的合成路线为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
；
具体步骤为：
（1）将4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑、N-(2-氨基乙基)吗啉和无水三乙胺溶解于无水二氯甲烷中，室温搅拌反应，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到淡黄色固体即为中间体1；
（2）将中间体1和水合肼溶解于甲醇溶液中，加热回流条件下反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到橙色产品即为甲醛荧光探针FAP1。
所述步骤（1）中，4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑、N-(2-氨基乙基)吗啉和无水三乙胺的物质的量比为1:1:4。
所述步骤（1）中，室温搅拌反应时间为6小时，柱层析洗脱剂甲醇和二氯甲烷的体积比为1:45。
所述步骤（2）中，所用水合肼为质量分数为80%的水溶液，中间体1和水合肼的物质的量比为1：（6-20），加热回流反应时间为4-10小时。
所述步骤（2）中，硅胶柱层析所用洗脱剂体积比为，甲醇和二氯甲烷的体积比为1：（15-30），硝基呋咱衍生物荧光探针分子的产率为25-50%。
所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光分子，作为特异性识别环境和生物体系中甲醛的应用。
本发明具有以下有益效果：
（1）本申请所选用的荧光团硝基呋咱衍生物具有原料简单易得、发射波长在可见光区内、stocks位移大（132 nm）使得荧光探针FAP1具有背景干扰低、对生物样品的光损伤小、样品穿透性强、检测灵敏度高等诸多优点。
（2）本申请的探针FAP1识别甲醛的机理是探针FAP1分子结构中的氨基与甲醛发生缩合反应生成席夫碱，分子内电荷发生重排，释放出荧光实现了对甲醛的特异性识别。具体识别反应机理为：
Figure 61454DEST_PATH_IMAGE003
；通过高分辨质谱对探针FAP1识别甲醛后的最终产物进行了确证（附图10），实验结果表明，FAP1-FA正离子模式下理论计算值为355.1188, HR-MS结果显示为355.1194，高分辨质谱实验结果验证了识别机理。
（3）本申请选用“肼”作为甲醛的特异性反应基团，单独探针FAP1在溶液体系中具有微弱的荧光，只有与甲醛发生特异性反应后才能释放出强烈的荧光信号进而实现了对甲醛的专一性识别；探针FAP1对甲醛的最低检出限为0.016 μM，pH适用范围广，具有较好的实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明的荧光探针FAP1核磁共振氢谱图。
图2为本发明的荧光探针FAP1核磁共振碳谱图。
图3为本发明的荧光探针FAP1高分辨质谱图。
图4为本发明的荧光探针FAP1荧光选择性图，激发波长430 nm。
图5为本发明的荧光探针FAP1紫外选择性图。
图6为本发明的荧光探针FAP1识别甲醛的竞争性实验图，激发波长430 nm，发射波长560 nm。
图7为本发明的荧光探针FAP1识别甲醛的荧光滴定图，激发波长430 nm。图8为本发明的荧光探针FAP1识别甲醛的最低检测限图，激发波长430 nm，发射波长560 nm。
图9为本发明的荧光探针FAP1识别甲醛的pH适用范围图，激发波长430 nm，发射波长560 nm。
图10为本发明的荧光探针FAP1识别甲醛的高分辨质谱验证机理图，测试溶剂为甲醇。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体1的制备方法为：将4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑（253.1 mg， 1mmol）、N-(2-氨基乙基)吗啉（130.2 mg，1 mmol）和无水三乙胺（556 μL，4 mmol）混合溶解于10 mL的无水二氯甲烷中，室温条件下搅拌六小时。减压蒸馏除去溶剂。用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:45，体积比），柱层析分离，得到250.0 mg淡黄色产品即为中间体1，产率73%。
（2）将中间体1（346.8 mg，1 mmol）和80%水合肼（363 μL，6 mmol）溶解于甲醇溶液中，加热回流条件下反应4小时后，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:15），经硅胶柱层析分离得到85.5 mg橙色产品即为甲醛荧光探针FAP1，产率25%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.18 (s, 4 H), 2.27 (t, J= 6.4 Hz, 2 H), 2.93 (d, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.40 (s, 4 H), 4.79 (s, 2 H), 6.57(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H) 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 9.44 (s, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 40.0, 53.5, 57.4, 66.4,98.4, 109.7, 139.2, 143.2, 143.4, 146.0。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C12H18N6O4S: 342.1110, found343.1192 [M+H+]+, 365.1011 [M+Na+]+。
实施例2
一种基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体1的制备方法为：将4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑（253.1 mg， 1mmol）、N-(2-氨基乙基)吗啉（130.2 mg，1 mmol）和无水三乙胺（556 μL，4 mmol）混合溶解于10 mL的无水二氯甲烷中，室温条件下搅拌六小时。减压蒸馏除去溶剂。用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:45，体积比），柱层析分离，得到250.0 mg淡黄色产品即为中间体1，产率73%。
（2）将中间体1（346.8 mg，1 mmol）和80%水合肼（545 μL，9 mmol）溶解于甲醇溶液中，加热回流条件下反应6小时后，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:20），经硅胶柱层析分离得到102.6 mg橙色产品即为甲醛荧光探针FAP1，产率30%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.18 (s, 4 H), 2.27 (t, J= 6.4 Hz, 2 H), 2.93 (d, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.40 (s, 4 H), 4.79 (s, 2 H), 6.57(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H) 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 9.44 (s, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 40.0, 53.5, 57.4, 66.4,98.4, 109.7, 139.2, 143.2, 143.4, 146.0。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C12H18N6O4S: 342.1110, found343.1192 [M+H+]+, 365.1011 [M+Na+]+。
实施例3
一种基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体1的制备方法为：将4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑（253.1 mg， 1mmol）、N-(2-氨基乙基)吗啉（130.2 mg，1 mmol）和无水三乙胺（556 μL，4 mmol）混合溶解于10 mL的无水二氯甲烷中，室温条件下搅拌六小时。减压蒸馏除去溶剂。用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:45，体积比），柱层析分离，得到250.0 mg淡黄色产品即为中间体1，产率73%。
（2）将中间体1（346.8 mg，1 mmol）和80%水合肼（726 μL，12 mmol）溶解于甲醇溶液中，加热回流条件下反应10小时后，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:25），经硅胶柱层析分离得到136.8 mg橙色产品即为甲醛荧光探针FAP1，产率40%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.18 (s, 4 H), 2.27 (t, J= 6.4 Hz, 2 H), 2.93 (d, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.40 (s, 4 H), 4.79 (s, 2 H), 6.57(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H) 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 9.44 (s, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 40.0, 53.5, 57.4, 66.4,98.4, 109.7, 139.2, 143.2, 143.4, 146.0。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C12H18N6O4S: 342.1110, found343.1192 [M+H+]+, 365.1011 [M+Na+]+。
实施例4
一种基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测荧光探针的制备方法，具体步骤为：
（1）中间体1的制备方法为：将4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑（253.1 mg， 1mmol）、N-(2-氨基乙基)吗啉（130.2 mg，1 mmol）和无水三乙胺（556 μL，4 mmol）混合溶解于10 mL的无水二氯甲烷中，室温条件下搅拌六小时。减压蒸馏除去溶剂。用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:45，体积比），柱层析分离，得到250.0 mg淡黄色产品即为中间体1，产率73%。
（2）将中间体1（346.8 mg，1 mmol）和80%水合肼（1210 μL，20 mmol）溶解于甲醇溶液中，加热回流条件下反应10小时后，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂（1:30），经硅胶柱层析分离得到171.1 mg橙色产品即为甲醛荧光探针FAP1，产率50%。
核磁共振氢谱测定：1H NMR (DMSO-d 6 , 400 MHz) δ 2.18 (s, 4 H), 2.27 (t, J= 6.4 Hz, 2 H), 2.93 (d, J = 5.6 Hz, 2 H), 3.40 (s, 4 H), 4.79 (s, 2 H), 6.57(d, J = 8.4 Hz, 1 H), 7.25 (s, 1 H) 7.87 (d, J = 8.0 Hz, 1 H), 9.44 (s, 1 H)。
核磁共振碳谱测定：13C NMR (DMSO-d 6 , 100 MHz) δ 40.0, 53.5, 57.4, 66.4,98.4, 109.7, 139.2, 143.2, 143.4, 146.0。
高分辨质谱测定：HR-ESI-MS calcd for C12H18N6O4S: 342.1110, found343.1192 [M+H+]+, 365.1011 [M+Na+]+。
实施效果例
荧光和紫外选择性实验：
配制pH为7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，用上述缓冲溶液和乙腈（CH3CN）配置体积比为4:6的混合溶液A，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针FAP1溶液。用荧光光谱仪考察了探针FAP1对甲醛在混合溶液A中的选择性。如图4所示，在430 nm处激发条件下，单独的探针FAP1 (10 µM)在混合溶液A中并在37℃条件下保温2小时后在560 nm处具有微弱的荧光发射强度。同等条件下，当加入甲醛(200 µM)后，在560 nm处的荧光发射强度明显增强，但是加入其它活性小分子（各类醛类、氨基酸类、过氧化物等）(200 µM) 时，溶液体系的荧光发射强度与单独探针体系的荧光发射强度相比没有明显变化。运用紫外-可见分光光度计考察了探针FAP1对甲醛的紫外选择性，如图5所示，单独探针FAP1 (10 µM)和识别其他活性小分子(200 µM)后的紫外吸收均比探针识别甲醛后的紫外吸收要弱，紫外吸收光谱也能够实现对甲醛的专一识别。
以上实验结果表明，探针FAP1对甲醛在混合溶液A中具有较好的荧光和紫外专一选择性。
抗干扰性实验：
配制pH为7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，用上述缓冲溶液和乙腈（CH3CN）配置体积比为4:6的混合溶液A，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针FAP1溶液。用荧光光谱仪考察了探针FAP1在其他活性小分子存在的条件下对甲醛在混合溶液A中的竞争选择性实验。在20个干净的荧光比色皿中，分别加入3000 μL的混合溶液A和30 μL的探针FAP1的乙腈溶液，再分别加入20个摩尔当量的甲醛和20个摩尔当量的其他分析物（各类醛类、氨基酸类、过氧化物等），在荧光光谱仪上检测，绘制不同分析物对应的560 nm荧光强度的柱状图，得到荧光发射柱状图（附图6）。
经实验证明，探针FAP1对甲醛在混合溶液A中的识别不受上述其他分析物的干扰，具有较好的抗干扰性。
最低检出限实验：
良好的检出限是检验一个探针分子是否具有应用价值的标准之一。配制pH为7.4、浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，用上述缓冲溶液和乙腈（CH3CN）配置体积比为4:6的混合溶液A，并用乙腈配制浓度为1 mM的探针FAP1溶液。固定探针FAP1浓度为10 µM，测定其对不同浓度的甲醛的响应强度，随着甲醛浓度的增加，体系荧光发射强度在560 nm处不断增强（附图7），研究发现溶液荧光发射强度在甲醛浓度为0-1.5 µM间呈线性（R 2 = 0.998）（附图8），经计算(3σ/k)得出该探针分子对甲醛的检出限为0.016 μM。
酸碱度适用范围实验：
配制pH分别为3，4，5，6，7，8，9浓度为10 mM的Tris-HCl缓冲溶液，用上述缓冲溶液和乙腈配置体积比为4:6的混合溶液A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7 并用乙腈配制浓度为1mM的探针FAP1溶液。用荧光光谱仪考察了单独探针FAP1 (10 µM)和探针FAP1 (10 µM)与甲醛 (20 eq.)在混合溶液A1-A7中的荧光发射强度。如图9所示，在430 nm处激发条件下，单独的探针FAP1 (10 µM)在pH值分别为3，4，5，6，7，8，9的混合溶液A1-A7中在544 nm处具有微弱的荧光发射强度，并且荧光发射强度变化不大，当在上述溶液体系加入甲醛 (20 eq.)后，体系在pH值分别为3，4，5，6，7的混合溶液A1-A5中在560 nm处的荧光发射强度明显增强。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光探针，其特征在于，所述硝基呋咱衍生物荧光探针的结构式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
2.权利要求1所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光探针的制备方法，其特征在于，步骤为：
（1）将4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑、N-(2-氨基乙基)吗啉和无水三乙胺溶解于无水二氯甲烷中，室温搅拌反应，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到淡黄色固体即为中间体1；
（2）将中间体1和水合肼溶解于甲醇溶液中，加热回流条件下反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，用甲醇和二氯甲烷作为洗脱剂，经硅胶柱层析分离得到橙色产品即为用于甲醛检测的荧光探针FAP1。
3.根据权利要求2所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，4-氯-7-氯磺酰基-2,1,3-苯并恶二唑、N-(2-氨基乙基)吗啉和无水三乙胺的物质的量比为1:1:4。
4.根据权利要求2所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（1）中，室温搅拌反应时间为6小时，柱层析洗脱剂甲醇和二氯甲烷的体积比为1:45。
5.根据权利要求2所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，所用水合肼为质量分数为80%的水溶液，中间体1和水合肼的物质的量比为1：（6-20），加热回流反应的时间为4-10小时。
6.根据权利要求2所述的基于硝基呋咱衍生物的用于甲醛检测的荧光探针的制备方法，其特征在于：所述步骤（2）中，硅胶柱层析所用的洗脱剂为体积比为1：（15-30）的甲醇和二氯甲烷，硝基呋咱衍生物荧光探针分子的产率为25-50%。
7.权利要求1所述的荧光探针在非用于疾病的诊断和治疗中作为特异性识别环境和生物体系中甲醛的应用。
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