CN101090912A - Torc多核苷酸和多肽以及使用方法 - Google Patents

Torc多核苷酸和多肽以及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及利用CREB(TORC)相关多核苷酸、多肽或TORC特异性抗体的传感器的一系列方法。此外，本发明涉及TORC相关多核苷酸、多肽或TORC特异性抗体组合物，包括TORC野生型序列变体。示例性方法包括刺激细胞中TORC相关过程的方法以及抑制细胞中TORC相关过程的方法和抑制细胞中TORC相关过程的方法。本发明还公开了基本抑制患者疾病或病理病症发生、治疗或改善患者疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中TORC激活过程的水平异常相关，所述方法包括对受试者施用一种或多种治疗有效剂量的调节TORC多肽在细胞的亚细胞区域中累积的物质或抑制细胞中TORC表达的物质。在另一方面公开了调节细胞中TORC相关过程活性的物质。在另一方面，本发明涉及检测样品中TORC多肽的存在或对其定量的方法。在另一方面，公开了测定样品中TORC多肽的量是否与参照中TORC多肽的量不同的方法。本发明的另一方面涉及促进在第一患者中诊断或预后疾病或病理的方法或开发其治疗策略的方法，其中已知病理中TORC多肽的亚细胞定位与非病理状态下TORC多肽的亚细胞定位不同。

Description

TORC多核苷酸和多肽以及使用方法
发明领域
本发明一般性地涉及某些多核苷酸和多肽、含有它们的细胞以及使用它们的方法。具体地，本发明公开了TORC多核苷酸和TORC多肽、它们的变体、TORC特异性抗体和含TORC的细胞。本发明还公开了使用TORC组合物的药学研究方法、测定方法、诊断方法和治疗方法。
发明背景
环腺苷酸应答元件(CRE)结合蛋白(CREB)家族转录因子家族代表一小组蛋白质，包括CREB1和密切相关的CREM和ATF-1蛋白。CREB1蛋白通过与存在于影响许多生物学过程的大量基因的启动子中的cAMP应答元件(CRE)结合来控制基因表达。CREB调节一系列靶基因，所述靶基因参与细胞生长调节和分化、代谢、发育、神经元活性以及免疫调节(综述于Mayr和Montminy，2001；Shaywitz和Greenberg，1999)。特别地，据认为CREB是适应性行为的多个关键信号途径的终点(综述参阅West等，2001和Lonze等，2002)。
基因表达的长期变化(据认为是长期记忆的基础)很可能部分或大部分是通过CREB介导的(Bourtchuladze等，1994，Yin等，1994，参阅Tully等，2003)。人们已经提出激活CREB介导的基因表达是在多种临床环境(包括神经变性和精神疾病)中增强记忆的可行方法(Tully等，2003；Jackson等，2003)。激活cAMP应答或破坏CREB活性也已显示能影响成瘾行为(参阅Chao和Nestler 2004)和对乙醇的敏感性(Moore等，1998)。破坏小鼠CREB活性会破坏昼夜节律钟(Gau等，2002)、增加焦虑并影响吗啡撤除后的行为(Valverde等，2004)，这说明修饰CREB活性可能还可用于治疗睡眠障碍、焦虑或成瘾。
CREB调节多种促生长和抗调亡基因包括cfo、细胞周期蛋白A、细胞周期蛋白D1、PCNA、Bcl2以及神经营养因子如BDNF。多种研究还提示神经元的存活需要CREB活性。在小鼠中阻断CREB和CREM导致神经元细胞死亡和进展性神经变性(Mantamadiotis 2002；综述参阅Lonze等2002)。因此，激活CREB可能有神经保护作用，并在神经变性疾病或中风方面具有临床益处。除了其在中枢神经系统中的作用以外，大量代谢调节基因在其启动子中含有CRE位点，并且已经显示糖异生的限速酶PEPCK的基因受cAMP的调节。在小鼠中阻断CREB1功能导致低血糖(Herzig等，2001)。CREB1还在免疫应答中发挥作用，因为CREB1缺陷型小鼠表现出有缺陷的T细胞发育(Rudolf等，1998)，并且阻断通过CREB1的转录激活的CREB1异构体ICER阻断IL-2表达(Bodor等，2000)。已经提出激活CREB是在多种临床环境(包括神经变性和精神疾病)中增强记忆的可行方法，并且可能起神经保护作用(Tully等，2003)，CREB信号传导还与TNFα诱导的血管平滑肌细胞迁移有关，所述迁移可以促进粥样动脉硬化斑的形成(Ono等，2004)。
申请人先前已经公开，TORC1是磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)、双向调节因子和趋化因子如IL-8和Exodus-1/MIPα等蛋白的有效诱导物，并据信通过CREB激活发挥作用(PCT专利公开WO2004/085646和Iourgenko，等2003)。TORC1和其他TORC蛋白与增强CREB与TFIID的TAFII130组分之间的相互作用有关(Conkright，等2003)。由此，相信本发明的TORC蛋白可作为新药物靶标，用于治疗与启动子区含有CRE位点的基因异常激活相关的病理病症，以及用于治疗与PEPCK、双向调节因子和趋化因子特别是IL-8和Exodus-1/MIPα异常激活相关的病症。这些病症包括但不仅限于骨关节炎、牛皮癣、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、癌症、病理性血管发生、糖尿病、高血压、慢性痛和其他炎性和自身免疫疾病以及神经退化病症例如阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病。
因此仍然需要调节TORC活性。还仍然需要鉴定TORC活性候选调节剂。另外，仍然需要治疗与患病的细胞或组织中异常TORC活性相关的疾病或病理病症。本发明内容致力于解决这些及相关需求。
发明概述
本发明广泛涉及与调节的CREB(TORC)家族物质的传感器相关的多核苷酸、多肽和抗体组合物以及在研究、诊断应用和治疗应用中使用这些组合物的方法。
首先，本发明公开了确定样品中TORC多肽的生物活性是否异常的方法，其中所述方法包括：
a)确定TORC多肽在样品细胞的多种亚细胞级分中的第一分布；和
b)将a)的结果与TORC多肽在一种或多种参照细胞的亚细胞级分中的第二分布比较，所述参照细胞已确定具有正常的TORC分布；
由此，如果样品细胞中TORC多肽的分布与参照细胞中TORC多肽的分布不同，则样品细胞中TORC多肽的生物活性为异常。在该测定方法的重要实施方案中，首要亚细胞级分为细胞质，在其他实施方案中，其次的亚细胞级分为核。在其他实施方案中，细胞为上皮细胞或脑中天然存在的细胞。
另一方面，本发明包括鉴定细胞中CREB启动过程的调节剂的方法，包括将细胞与调节细胞的亚细胞区室中TORC多肽积累的物质相接触。在该方法的重要实施方案中，调节物质可以是离子载体、细胞内cAMP浓度的刺激剂、细胞内钙浓度的刺激剂或蛋白激酶A活性的刺激剂。在其他重要的实施方案中，亚细胞级分可以是细胞核，或抑制剂例如亲免素结合剂。在其他重要的实施方案中，细胞可以是哺乳动物细胞或上皮细胞或脑中天然存在的细胞。另外，在该方法中，细胞可以体外培养，或其可从受试者中离体培养或在受试者中体内培养。
另一方面，本发明公开了调节细胞中CREB启动的过程的方法，包括将细胞与调节细胞中TORC多肽表达的物质接触。在该方法的重要实施方案中，物质可包括反义寡核苷酸、干扰寡核苷酸、微小寡核苷酸(microoligonucleotide)、三螺旋核酸、核酶、RNA适体、双链或单链RNA、肽模拟物、含有肽模拟物编码序列的多核苷酸、或它们中任何两个或更多的混合物。在其他重要的实施方案中，细胞可以是哺乳动物细胞或上皮细胞，或脑中天然存在的细胞。另外在该方法的重要实施方案中，细胞可以体外培养，或其可从受试者中离体培养或在受试者中体内培养。
本发明的另一方面提供了用于在受试者中基本抑制疾病或病理病症的发展、治疗或改善疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中CREB启动过程的水平异常相关。该方法包括对受试者施用一种或多种治疗有效剂量的物质，所述物质调节细胞中亚细胞区的TORC多肽积累。在该疗法的有利实施方案中，亚细胞区可为细胞质，或其可以是细胞核。在其他有利的实施方案中，病理病症可以是神经变性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可选自阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、COPD、风湿性关节炎、癌症、糖尿病、高血压和慢性痛。在另一有利的实施方案中，CRE调节剂改变(例如抑制或增强)一种或多种TORC蛋白质的活性或积累，所述TORC蛋白质选自TORC1、TORC2或TORC3。在另一有利的实施方案中，TORC调节剂包括TORC蛋白质的一种或多种抗体或其片段，其中所述抗体或其片段改变TORC蛋白质的活性或积累。在另一有利的实施方案中，TORC调节剂包括TORC蛋白质的一种或多种肽模拟物，其中所述肽模拟物改变TORC蛋白质的活性或积累。
本发明的又一方面提供了用于在受试者中基本抑制疾病或病理病症的发展、治疗或改善疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中TORC相关过程的水平异常相关。该方法包括对受试者施用一种或多种治疗有效剂量的物质，所述物质调节细胞中亚细胞区的TORC多肽积累。在该疗法的有利实施方案中，亚细胞区可为细胞质，或其可以是细胞核。在其他有利的实施方案中，病理病症可以是神经变性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可选自阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、COPD、风湿性关节炎、癌症、糖尿病、高血压和慢性痛。在另一有利的实施方案中，CRE调节剂改变一种或多种TORC蛋白质的活性或积累，所述TORC蛋白质选自TORC1、TORC2或TORC3。在另一有利的实施方案中，TORC调节剂包括TORC蛋白质的一种或多种抗体或其片段，其中所述抗体或其片段改变TORC蛋白质的积累。在另一有利的实施方案中，TORC调节剂包括TORC蛋白质的一种或多种肽模拟物，其中所述肽模拟物改变TORC蛋白质的积累。
本发明的另一方面提供了用于在受试者中基本抑制疾病或病理病症的发展、治疗或改善疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中TORC激活的或CREB启动的过程的水平异常相关。该方法包括向受试者使用治疗有效剂量的调节细胞中TORC多肽表达的物质。在该疗法的重要实施方案中，抑制物质包括反义寡核苷酸、干扰寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA适体、双链或单链RNA、肽模拟物、含有肽模拟物编码序列的多核苷酸、或它们中任何两个或更多的混合物。在其他重要的实施方案中物质调节选自TORC1、TORC2或TORC3中任何一种或多种TORC蛋白质的表达。在其他重要的实施方案中，病理病症可以是神经变性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可选自阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、COPD、风湿性关节炎、癌症、糖尿病、高血压和慢性痛。
本发明另一方面提供鉴定调节细胞中TORC相关过程活性的物质的方法，包括：
a)将TORC多肽引入第一细胞和参照细胞；
b)将所述第一细胞与所述物质接触；和
c)确定与未接触所述物质的参照细胞中TORC多肽的生物功能相比，是否所述第一细胞中的TORC多肽生物功能受到调节；
从而如果出现功能差异，则调节物质得以鉴定。在该方法的重要实施方案中，生物功能包括调节多种亚细胞区室中TORC多肽的分布。在其他重要的实施方案中，首要亚细胞级分可以是细胞质，或其次的亚细胞级分可以是细胞核。在另一重要的实施方案中，该方法还包括在步骤b)中将第一细胞与参照细胞均与调节细胞核级分中TORC多肽积累的物质接触；而在另一重要的实施方案中，该方法还包括在步骤b)中将第一细胞与参照细胞均与调节细胞质级分中TORC多肽积累的物质接触。在另一重要的实施方案中，TORC多肽选自TORC1、TORC2或TORC3。在另一重要的实施方案中，第一细胞和参照细胞体外或离体观察，或得自体内模型。
本发明另一方面提供与TORC多肽免疫特异性结合的抗体。在有利的实施方案中，抗体与多肽免疫特异性结合，所述多肽的氨基酸序列如SEQID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6、或其片段所示。
本发明另一方面公开了用于测定用途、用于诊断用途以及用于研究目的的试剂盒--本发明的TORC相关组合物，其中该试剂盒在一个和多个容器中包含一种或多种选自以下的组分：
a)TORC多核苷酸；
b)TORC融合多核苷酸；
c)本文所述的TORC多肽；
d)TORC融合多肽；和
e)TORC抗体。
在包含多核苷酸的试剂盒的重要实施方案中，多核苷酸可包括反义寡核苷酸、干扰寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA适体、双链或单链RNA、肽模拟物、含有肽模拟物编码序列的多核苷酸、或它们中任何两个或更多的混合物。
本发明广泛涉及多种测定和诊断方法。一方面本发明公开了检测样品中TORC多核苷酸的存在或对其定量的方法，包括步骤：
a)提供含有样品核酸的样品；和
b)检测在样品TORC多核苷酸的存在或对其定量。
在该方法的重要实施方案中，样品来自细胞的亚细胞级分。在另一重要的实施方案中，扩增样品核酸中包含至少一部分TORC序列的靶核苷酸序列，并且步骤b)中的检测或定量在扩展的靶TORC序列上进行。在另一重要的实施方案中，扩增包括逆转录或聚合酶链式反应，或二者兼而有之。在另一重要的实施方案中，步骤b)中的检测或定量包括i)细胞或亚细胞级分的荧光原位杂交，或ii)实时聚合酶链式反应。在其他重要的实施方案中，步骤b)中的检测或定量包括在确保TORC多核苷酸与探针杂交的条件下，使样品核酸与探针核酸接触，并检测与探针核酸杂交的TORC多核苷酸的存在或将其定量，所述探针核酸包括与TORC多核苷酸杂交的TORC多核苷酸。在其他重要的实施方案中，TORC多核苷酸包含标记，且检测或定量包括检测或定量标记。在该方法的其他重要的实施方案中，探针核酸与固体表面结合。
本发明另一方面公开了鉴定调节剂的方法，所述调节剂可用于在第一受试者中诊断或预测病理或者开发其治疗策略，所述病理与CREB依赖性基因表达相关，该方法包括步骤：
a)提供来自第一受试者的包含样品核酸的样品，其中样品包括TORC核苷酸序列；和
b)确定是否来自第一受试者的样品中TORC序列的量与参照样品中TORC序列的量不同，其中参照样品包含来自已知没有该病状的第二受试者的参照核酸；
从而促成诊断、预测该病理或者开发其治疗策略。在该方法的重要实施方案中，样品来自细胞的亚细胞级分。另一方面，病理病症可以是神经变性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可选自阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、COPD、风湿性关节炎、癌症、糖尿病、高血压和慢性痛。另一方面该方法包括比较第一样品和参照样品的表达基因的基因表达谱。
另一方面本发明公开了检测样品中TORC多肽的存在或将其定量的方法，包括步骤：
a)提供怀疑含有TORC多肽的样品；
b)在确保TORC多肽与特异性结合剂结合的条件下，使多肽与结合TORC多肽的特异性结合剂接触；和
c)检测与TORC多肽结合的特异性结合剂的存在或将其定量。
在有利的实施方案中，样品来自细胞的亚细胞级分。在该方法的另一有利的实施方案中，特异性结合剂包含标记，或所述特异性结合剂与包含标记的第二结合剂结合，其中检测或定量包括检测或定量标记。在另一有利的实施方案中，特异性结合剂为抗体。
另一方面本发明公开了确定样品中TORC多肽的量与参照样品中TORC多肽的量是否不同的方法，其中该方法包括步骤：
a)提供怀疑含有TORC多肽的样品；
b)在确保TORC多肽与特异性结合剂结合的条件下，使多肽与结合TORC多肽的特异性结合剂接触；和
c)检测在步骤b)中使用的相同条件下，与样品结合的特异性结合剂的量和与参照结合的特异性结合剂的量是否不同，其中参照包括标准或参照量的TORC多肽。
在该方法的重要实施方案中，样品来自细胞的亚细胞级分。在其他重要的实施方案中，样品由人提供而参照样品由人提供，或样品由哺乳动物提供而参照由相同物种的哺乳动物提供。在该方法的另一重要的实施方案中，特异性结合剂包含标记，或特异性结合剂与包含标记的第二结合剂结合，其中检测或定量包括检测或定量标记。在另一重要的实施方案中，特异性结合剂为抗体。
另一方面本发明公开了在第一受试者中促成诊断或预后疾病或病理，或开发其治疗策略的方法，其中在该病理中TORC多肽的亚细胞定位已知与非病理状态下TORC多肽的亚细胞定位不同，该方法包括步骤：
a)提供来自第一受试者的怀疑包含TORC多肽的样品；
b)在确保TORC多肽与特异性结合剂结合的条件下，使样品与结合本文所述TORC多肽的特异性结合剂接触；和
c)检测在步骤b)中使用的相同条件下，与样品结合的特异性结合剂的量和与参照结合的特异性结合剂的量是否不同，其中参照由已知不具有该病理的第二受试者提供；
从而促成诊断、预后该病理或发展其治疗策略。在该方法的重要实施方案中，样品来自细胞的亚细胞级分。在其他重要的实施方案中，病理病症可以是神经变性疾病、自身免疫性疾病或炎性疾病，或其可选自阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿病、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、COPD、风湿性关节炎、癌症、糖尿病、高血压和慢性痛。在其他重要的实施方案中，样品由人提供而参照样品由人提供，或样品由哺乳动物提供而参照由相同物种的哺乳动物提供。在该方法的另一重要的实施方案中，特异性结合剂包含标记，或特异性结合剂与包含标记的第二结合剂结合，其中检测或定量包括检测或定量标记。在另一重要的实施方案中，特异性结合剂为抗体。
附图简述
图1.使用荧光显微术对瞬间转染荧光TORC蛋白质的亚细胞定位图。图A-D，HeLa细胞。图E-H，HEK293细胞。
图2.使用荧光显微术成像的转染的HeLa细胞中TORC2-eGFP(图A)和TORC3-eGFP(图B)的亚细胞定位图。
图3.HeLa细胞TORC1转运筛选的结果图。各MCG全长cDNA集合克隆(菱形点)均标绘了胞核-胞质荧光差异。细霉素B包含在每个平板中作为TORC转运(x点)的阳性对照。标示了含有TRPV6和PKA的阳性克隆。
图4.显微术成像用空表达载体pCMV-SPORT6(图A)或含有TRPV6(B图)或PKA(C图)的表达载体转染的细胞中TORC1-eGFP的定位图。最初递交的上面一组图A-C为彩色的。下面一组图A-C通过使用计算机将彩色图转化为灰度图像制作。
图5.通过荧光显微术获得的HeLa细胞中应答cAMP信号传导的荧光TORC融合蛋白质转运图。
图6.通过荧光免疫组织化学(IHC)获得的HEK293细胞中内源TORC转运图和通过显微摄影术获得的核染色(Hoechst)图。
图7.使用荧光显微术的HEK293细胞中应答GPCR激动剂异丙肾上腺素的荧光TORC融合蛋白质转运图。
图8.使用荧光显微术的HeLa细胞中TORC1-eGFP融合蛋白转运图，所述细胞应答钙信号传导通过神经钙蛋白激活稳定表达TORC1-eGFP。
图9.使用荧光和显微照相术的HeLa细胞中TORC1-eGFP转运图，所述细胞稳定表达由激活的神经钙蛋白诱导的TORC1-eGFP。上面一组图A和B最初递交时为彩色的。下面一组图A和B通过计算机将彩色图转化为灰度图像制作。
图10.TRPV6激活NF-AT依赖性的荧光素酶报告基因图。
图11.使用荧光显微术获得的，响应用几种外源因子处理的TORC融合蛋白质在HEK293中的转运图。
图12.使用荧光显微术获得的，响应紫外线照射和PMA施用的TORC1-eGFP在HeLa细胞中的转运图。
图13.HeLa细胞中TORC1过表达对刺激依赖性CRE指导的转录的影响图。
图14.HeLa细胞中钙诱导的CRE驱动的转录或NFKB驱动的转录对TORC蛋白质的需要图。
图15.处理HeLa细胞后获得的Western印迹图，所述细胞在引入多种物质前用抗GFP特异性siRNA转染或用TORC1和TORC2特异性siRNA二者共同转染。
图16.TORC1(1-44)-eGFP融合蛋白质对启动子驱动的基因表达的影响图。
图17.通过荧光显微术成像，果蝇涎细胞中应答cAMP和钙的荧光果蝇TORC蛋白质转运图。上面一组图A至E最初递交时为彩色。下面一组图A至E通过计算机将彩色图转化为灰度图像制作。
图18.TORC1激活CREB介导的PGC-1α基因转录。HeLa细胞用pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc，phRL-SV40(作为转染效率的对照)与所示的多种cDNA构建体一同转染。裂解细胞并在转染后48小时检测荧光素酶活性。计算萤火虫发光(ff)与海肾发光(RL)的比值(均值±SEM)，表达为标准化的荧光素酶，并用作PGC-1α基因转录的指数。
图19.TORC1异位表达促进PGC-1α和细胞色素C表达，提示其诱导线粒体发生。HeLa细胞用对照慢病毒(终止或GFP)或TORC1慢病毒转导。A、转导后72小时从细胞中提取总蛋白质并进行Western印迹分析，以确定PGC-1α蛋白质的表达。B、转导后24、48和72小时从细胞中提取总RNA并进行qPCR分析，以确定内源PGC-1α(B)和细胞色素c(C)mRNA的表达水平。
图20.TORC1的异位表达促进HeLa细胞的细胞呼吸。HeLa细胞用对照(终止)或TORC慢病毒转导。细胞呼吸在转导后72小时使用Clark电极测定。寡霉素和CCCP的浓度分别为2μg/ml和2μM。
图21.TORC1、2和3激活PGC-1α基因的转录。HeLa细胞用pGL3-basic-2kb-PGC1-Luc，phRL-SV40(作为转染效率的对照)与所示的多种cDNA构建体一同转染。裂解细胞并在转染后48小时检测荧光素酶活性。计算萤火虫发光与海肾发光的比值(均值±SEM)，表达为标准化的荧光素酶活性，并用作PGC-1α基因转录的指数。N＝6，*P＜0.05(TORC1、2、3相对于载体)。
图22.TORC2或TORC3的异位表达促进PGC-1α和线粒体标志物的表达。初级肌细胞用TORC2、TORC3或GFP腺病毒转导。A.转导后48小时从细胞中提取总蛋白质并进行Western印迹分析，以确定异位TORC2和TORC3蛋白质的表达。检测异位TORC2和TORC3蛋白质表达的一抗和二抗分别为V5和山羊抗兔IgG。B-C.转导后24和48小时从细胞中提取总RNA并进行qPCR分析，以确定内源PGC-1α(B)和PGC-1α靶基因(C)，包括ERRα和线粒体标志物、细胞色素c(CytC)、细胞色素氧化酶亚基II(CoxII)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)的表达水平。N＝3，*P＜0.05(TORC2或TORC3相对于GFP)。
图23.TORC2或TORC3的异位表达促进小鼠初级肌细胞中的脂肪酸氧化。初级肌细胞用TORC2、TORC3或GFP腺病毒转导。转导后48小时进行14C-软脂酸氧化。N＝3，*P＜0.05。
图24.TORC2或TORC3的异位表达促进小鼠初级肌细胞中细胞呼吸。初级肌细胞用TORC、TORC3或GFP腺病毒转导48小时。不加处理(本底)或用寡霉素或CCCP处理后测量细胞呼吸。N＝3，*p＜0.05(TORC相对于GFP)。
发明详述
认为本文所述发明不限制为所述的具体方法论、流程和试剂，因为其可变化。还应理解本文使用的命名法仅用于描述具体实施方案的目的，而不旨在以任何方式限制本发明的范围。
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。尽管任何与本文所述类似或等效的方法和材料可用于实践或检测本发明，现描述了优选的方法、设备和材料。所有本文提到的出版物引用作为参考，用于描述和公开可结合本发明使用的出版物中报道的材料和方法论。
实践本发明要使用许多分子生物学常规技术。这些技术众所周知并描述于例如《Current Protocols in Molecular Biology》，第I、II和III卷，1997(F.M.Ausubel编)；Sambrook等，1989，《Molecular Cloning：A LaboratoryManual》，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.；《DNA Cloning：A Practical Approach》，第I和II卷，1985(D.N.Glover编)；《Oligonucleotide Synthesis》，1984(M.L. Gait编)；《NucleicAcid Hybridization》，1985，(Hames和Higgins)；《Transcription andTranslation》，1984(Hames和Higgins编)；《Animal Cell Culture》，1986(R.I.Freshney编)；《Immobilized Cells and Enzymes》，1986(IRL Press)；Perbal，1984，《A Practical Guide to Molecular Cloning》；《Methods inEnzymology》系列(Academic Press，Inc.)；《Gene Transfer Vectors forMammalian Cells》，1987(J.H.Miller和M.P. Calos编，Cold SpringHarbor Laboratory)以及《Methods in Enzymology》第154卷和第155卷(分别由Wu和Grossman以及Wu编)。
缩写
ATF：激活转录因子
cAMP：环AMP
CBP：CREB结合蛋白
CCE：库容性钙内流
CNS：中枢神经系统
COPD：慢性阻塞性肺病
CPA：圆弧偶氮酸(cyclopiazonic acid)
CRE：cAMP应答元件
CREB：cAMP应答元件结合蛋白
CREM：cAMP应答元件调节剂
CsA：环孢素A
dTORC：调节的CREB的果蝇传感器
HTS：高通量筛选
ICER：可诱导的cAMP早期阻遏物
LMB：细霉素B
NF-AT：激活的T-细胞核因子
PKA：环AMP依赖性蛋白激酶A
SOCC：钙库控制的钙通道
TORC：调节的CREB传感器
TRPV6：瞬时受体电位阳离子通道，V亚家族，成员6
实施例证明TORC蛋白质是CREB依赖性基因表达的关键共调节蛋白。发现TORC蛋白质主要存在于细胞的细胞质内，但是通过多种已知协同调控CREB1磷酸化的可诱导通路快速转运至细胞核。这些包括提高细胞内cAMP水平的物质、诱导瞬时钙增加的物质、紫外光、蛋白激酶A(PKA)激活和GPCR配体。另外，对于诱导CRE介导的基因表达，TORC活性是必要的而TORC核转运是充分的。另外，TORC1以神经钙蛋白依赖性方式转运至核，从而代表示除了NF-AT之外的受该种方式调节的另一哺乳动物转录因子。响应钙信号传导的TORC1转运以及较小程度的TORC2转运对环孢素A(CSA)敏感，提示这是亲免素结合剂发生效力和毒力的一种新机制。还说明单个果蝇TORC蛋白质即dTORC也受神经钙蛋白依赖性的核转运调节，进一步说明TORC功能的重要保守作用。最后，TORC转运提供了cAMP和钙依赖性信号转导途径激活的简单生物传感器。
实施例中报道的实验显示TORC转运测定可用作鉴定TORC功能调节剂并最终鉴定CRE依赖的基因激活调节剂的高通量筛选方法。根据用已知修饰基因获得的结果，还相信TORC功能和转运的调节剂以及干扰TORC多肽表达的物质对调整CREB1介导的应答有效。另外，相信TORC功能和转运的调节剂以及干扰TORC多肽表达的物质会有效地在受试者中基本抑制疾病或病理病症发展、治疗或改善疾病或病理病症，所述疾病或病理病症与细胞中TORC相关过程或CREB启动过程的水平异常相关。
本文使用术语“样品”和类似的词语是指任何物质、组合物或物体，其包含与完整细胞中核酸、多核苷酸或寡核苷酸或蛋白质或多肽的形式相同或最低限度不同的核酸、多核苷酸或寡核苷酸或蛋白质或多肽。广义地，样品可以是由完整细胞组成的生物学样品。在该广义含义中，样品中的DNA为基因组DNA，样品中的RNA包括mRNA、tRNA、rRNA和类似的RNA。样品还可以包含从基因组DNA最小限度改变来的DNA，考虑到例如从细胞样品中分离细胞核或破坏细胞样品中包含的细胞核的步骤。就其他含义而言，样品可以是亚细胞级分或亚细胞区室或细胞器，或就完整细胞而言，可以是细胞本身或细胞的亚细胞区。在本文考虑的若干实施方案中，包含细胞、核酸、多核苷酸或寡核苷酸或蛋白质或多肽的样品从怀疑患有或诊断患有特定病理的受试者获得。
本文使用术语“参照”和类似的词语，是指如上“样品”定义的任何物质、组合物或物体，其中样品得自怀疑患有或诊断患有特定病理的受试者的方法实施例中的除外，此时相同方法中同类步骤中使用的参照来自已知不患有该病理的受试者。更广泛而言，参照来自能可靠地作为对照使用或表征为非实验状态或非病理学状态的来源。
本文使用术语“激动剂”是指直接或间接调节多肽(例如TORC多肽)和促进所述多肽生物活性的分子(即调节剂)。激动剂可包括蛋白质、核酸、糖类或其他分子。增强基因转录或蛋白质生物化学功能的调节剂分别是促进所述蛋白质转录或刺激其生物化学性质或活性的物质。
本文使用术语“拮抗剂”或“抑制剂”是指直接或间接调节多肽(例如TORC多肽)的分子(即调节剂)，其封闭或抑制所述多肽的生物学活性。拮抗剂和抑制剂可包括蛋白质、核酸、糖类或其他分子。抑制蛋白质表达或生物化学功能的调节剂分别是降低基因表达或所述蛋白质生物活性的物质。
检测和标记。可以用多种方法检测TORC多核苷酸或TORC多肽。检测可以包括任何一种或多种能够观察TORC多核苷酸或TORC多肽存在或数量的方法。在一个实施方案中，含有TORC的样品核酸可在扩增前检测。在可选实施方案中，样品中的TORC多核苷酸可扩增以产生扩增的TORC多核苷酸，并检测或定量扩增的多核苷酸。可使用物理、化学或生物学方法检测并定量TORC多核苷酸。非限制性实例的物理方法包括光学显影，包括多种显微镜技术如荧光显微术、共聚焦显微术、原位杂交的显微成像，表面等离子共振(SPR)检测，如将探针结合至表面并使用SPR检测TORC多核苷酸或TORC多肽对固定探针的结合，或将探针置于色谱介质中并检测色谱介质中结合的TORC多核苷酸。物理方法还包括凝胶电泳或毛细管电泳形式，其中将TORC多核苷酸或TORC多肽从其他多核苷酸或多肽中分离并检测分离的TORC多核苷酸或TORC多肽。物理方法还广义地包括任何检测或定量物质的分光镜方法。化学方法通常包括杂交方法，其中TORC多核苷酸与探针杂交。生物学方法包括引起TORC多核苷酸或TORC多肽对细胞产生生物效应，并检测该效应。本发明公开了可作为生物学测定的生物效应的实例。在许多实施方案中，多核苷酸可如下所述标记以便于检测和定量。例如，可以通过化学或酶促添加标记部分，例如标记的核苷酸或标记的寡核苷酸接头，以标记样品核酸。许多等效的检测TORC多核苷酸或多肽的方法为本发明领域相关领域的技术人员已知，并认为落入本发明范围之内。
本发明核酸可使用cDNA、mRNA或可选的基因组DNA作为模板，与适当的寡核苷酸引物一起根据任何广义的PCR扩增技术进行扩增。扩增的核酸可克隆进适合的载体并通过DNA序列分析进行征。另外，对应TORC核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准合成技术(例如使用自动DNA合成仪)制备。
扩增的多核苷酸可直接进行检测和/或定量。例如，扩增的多核苷酸可在根据大小分离的凝胶中进行电泳，并用显示其存在和数量的染料染色。可选地，扩增的TORC多核苷酸可通过在杂交条件下(如下)接触探针核酸并检测和/或定量杂交结合进行检测。检测以任何允许检测TORC多核苷酸已与探针结合的方法完成。这可通过检测因与片段杂交引起的探针物理性质改变完成。这类物理检测法的非限制性实例为SPR。
完成检测的另一方法是使用TORC多核苷酸或TORC多肽的标记形式并检测结合的标记。多核苷酸可在扩增核酸的操作中或通过其他方法被标记为另外的特征。可通过使用修饰的核苷酸将标记掺入进片段中，所述核苷酸包含在用于扩增片段群的组合物中。标记可以是例如能够通过其放射性检测的放射性标记如125I、35S、32p、14C或3H。另外，可选择能够使用例如分光镜方法检测的标记。在一个实例中，标记可以是吸收入射光的发色团。优选可以通过冷光检测的标记。冷光包括荧光、磷光和化学发光。因此可以使用发荧光、发磷光或引起化学发光反应的标记。合适的荧光标记或荧光色素的实例包括152Eu标记、荧光素标记、罗丹明标记、藻红蛋白标记、藻蓝蛋白标记、Cy-3、Cy-5、异藻蓝蛋白标记、o-邻苯二醛标记和荧光胺标记。发冷光标记提供高灵敏度的检测。标记还可以是磁共振标记，例如可通过电子顺磁共振检测的稳定自由基标记，或可通过核磁共振检测的核标记。标记还可以是特异配体-受体对中的配体；然后通过特异性受体的二次结合检测配体的存在，所述特异性受体通常自身标记用于检测。这类配体-受体对的非限制性实例包括生物素和链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白；半抗原如地高辛配基或抗原及其特异性抗体等。标记还可以是附着在TORC多核苷酸或TORC多肽上的融合序列。这类融合允许分离和/或检测并定量TORC多核苷酸或TORC多肽。作为非限制性的实例，融合序列可以是FLAG序列、多聚组氨酸序列、荧光蛋白质序列，如绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白，碱性磷酸酶，谷光甘肽转移酶等。总之，可以用本公开相关领域技术人员已知的多种方法完成标记。任何允许检测和/或定量TORC多核苷酸或TORC多肽的等效标记应理解落入本发明范围内。
检测、定量包括标记的方法对于本发明相关领域的技术人员通常是公知的，作为非限制性的实例，相关领域的技术人员包括：光谱学、核酸化学、生物化学、分子生物学和细胞生物学的技术人员。定量允许测定与探针结合的核酸或多核苷酸或其片段的数量、质量或浓度。定量包括确定如此处和下文所述的物理、化学或生物学性质的改变的量。例如来自标记的信号强度可用于评价与探针结合的核酸量。任何能够检测与探针核酸杂交的多核苷酸或其片段的存在和/或数量、质量或浓度的等效操作认为落入本发明的范围。
本文使用术语“基本抑制与细胞中TORC相关或CREB启动过程相关的疾病或病理病症的发展”，以及类似的术语和短语是指对受试者的处理，其预防性地起作用以最小化或基本消除疾病或病症的起始表现。作为非限制性的实例，这类起始表现包括检测的诊断值或该疾病或病症的系统症状。其疾病或病理病症被基本抑制的受试者显示与正常无病的受试者临床和诊断上无法区别。
本文在关于细胞中TORC相关或CREB促进进程使用术语“治疗”和类似的术语和短语时，是指对受试者的处理，其发挥作用以阻止疾病或病症的发展或在受试者中起始改善，作为非限制性的实例，这可以通过检测诊断值或疾病或病症的系统性症状评价。
本文使用术语“改善”和类似的术语和短语，当用于细胞中TORC相关或CREB促进进程相关的疾病或病理病症时，是指对受试者的处理，其发会作用以降低或基本消除受试者中疾病或病症的表现。这类表现包括的非限制性实例为检测的诊断值或疾病或病症的系统性症状。
本文使用术语“Torc相关的”或“Torc激活的”是指作为Torc活性的结果或状态表达的基因或蛋白质。例如Torc活性或分布之上游或下游途径中被抑制或诱导的Torc相关基因或蛋白质。
多核苷酸
本文使用术语“核酸”和“多核苷酸”和类似的术语和短语认为彼此同义，并按照例如生物化学、分子生物学、基因组学和本发明相关的类似领域技术人员常规理解使用。本发明使用的多核苷酸可以是单链或配对的双链结构，或甚至是三链碱基配对结构。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA链与RNA链的任意混合物，例如非限制性实例为DNA-RNA双链体结构。本文所用的多核苷酸和“寡核苷酸”除了链长度外，在本文定义的多核苷酸的任何和所有属性方面相同。本文使用的多核苷酸可以是长度约50个核苷酸或碱基对或更长，或长度为或长于约60，或约79，或约80，或约100，或约150，或约200，或约300，或约400，或约500，或约700，或约1000，或约1500，或约2000或约2500，或约3000个核苷酸或碱基对或甚至更长。寡核苷酸长度可以是至少3个核苷酸或碱基对，或长度可以短于约70，或约60，或约50，或约40，或约30，或约20，或约15，或约10个核苷酸或碱基对。多核苷酸和寡核苷酸均可化学合成。寡核苷酸可用作探针。
本文使用“分离的”核酸分子是与至少一种存在于所述核酸天然来源中的其他核酸分子分离开来的分子。分离的核酸分子的实例包括(但不仅限于)重组多核苷酸分子、载体中包含的重组多核苷酸序列、异源宿主细胞中存在的重组多核苷酸分子、部分或基本纯化的核酸分子以及合成的DNA或RNA分子。优选的，“分离的”核酸不含有此核酸来源的生物基因组DNA中天然位于核酸侧翼的序列(即位于核酸5’和3’末端的序列)。例如，在多种实施方案中，分离的TORC核酸分子可包含少于约50kb、25kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的核苷酸序列，所述核苷酸序列天然位于核酸来源的细胞基因组DNA核酸分子的侧翼。此外，“分离的”核酸分子如cDNA分子通过重组技术制备时可基本不含其他细胞材料或培养基，或通过化学合成时不含化学前体或其他化学物质。
本发明的核酸分子(例如具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5核苷酸序列的核酸分子)或任何该核苷酸序列的互补物可使用标准分子生物技术和本文提供的序列信息进行分离。使用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一核酸序列的全部或部分作为杂交探针，可使用标准杂交和克隆技术分离TORC核酸序列(例如如Sambrook等编，MOLECULAR CLONING：A Laboratory Manual，第三版，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001和Brent等，Current Protocols in Molecular Biology，Wiley Interscience Publishers，(2003)所述)。
本文使用术语“互补的”是指核酸分子的核苷酸单位间的Watson-Crick或Hoogsteen碱基配对。本文和权利要求中使用术语“互补的”和类似的词语，是指核酸、多核苷酸或寡核苷酸的一条链中的第一核酸碱基仅与核酸、多核苷酸或寡核苷酸的另一条链中的特定第二核酸碱基特异性地相互作用。作为非限制性的实例，如果考虑天然存在的碱基，A和T或U相互作用，而G和C相互作用。本发明和权利要求中使用“互补的”旨在表示区域内“完全互补”，即当两条多核苷酸链互相比对时，至少在该区域内一条链上的连续碱基序列中每个碱基都与相对链中相同长度的连续碱基序列中的相互作用碱基互补。
本文使用“杂交”和类似的词语是指通过引起链与互补序列互相作用形成核酸、多核苷酸或寡核苷酸双链体的过程。相互作用通过各链上的互补碱基特异性地相互作用成对产生。链彼此杂交的能力取决于如下所述的多种条件。当各链上足够数量对应位置被能够相互作用的核苷酸占据时，核酸链彼此杂交。本发明领域技术人员(包括非限制性的实例分子生物学家和细胞生物学家)能理解，形成双链体的链的序列不需要100％地彼此互补而能够特异性杂交。
在另一实施方案中，本发明的分离的核酸分子包含与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一所示核苷酸序列或该核苷酸序列的部分互补的核酸分子。与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一所示核苷酸序列互补的核酸分子是与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一所示核苷酸序列足够互补，而可与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一所示核苷酸序列很少或无错配地以氢键结合从而形成稳定的双链体。
核酸、多核苷酸或寡核苷酸的重要用途是在鉴定探针核酸与之杂交的靶序列的测定法中的用途。探针对靶标的选择性受到杂交条件严格度的影响。杂交反应的“严格度”容易由本领域普通技术人员确定，并通常根据探针长度、温度和缓冲液组成按经验评估。当互补的链存在于低于它们解链温度的环境中时，杂交通常取决于变性DNA再退火的能力。更高的相对温度旨在使反应条件更加严格，而更低的温度则更加不严格。对于杂交反应和鉴定多种严格度的杂交条件的更多细节和解释参见Brent等，《Current Protocols in Molecular Biology》，Wiley Interscience Publishers，(2003)和Sambrook等，《Molecular Cloning：A Laboratory Manual》，第三版，New York：Cold Spring Harbor Press，2001。另外，在高通量或多元测定系统中，探针性质和严格度均可优化，以允许在单组严格度条件下达到多元测定的目的。
本文定义的“严格条件”或“高严格条件”的非限制性实例包括：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如50℃0.015 M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠；(2)杂交中使用变性剂，如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺与0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液在pH6.5与750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠在42℃；(3)使用50％甲酰胺，5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt′s溶液，超声处理的鲑精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖在42℃，在42℃用0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和在55℃用50％甲酰胺洗涤，然后是在55℃用包括含有EDTA的0.1×SSC的高严格度洗涤，或(4)在50℃采用7％的十二烷基磺酸钠(SDS)，0.5M NaPO4，1mM EDTA，以及在50℃用2×SSC，0.1％SDS洗涤。
“中度严格条件”的非限制性实例包括使用比上述更不严格的洗涤溶液和杂交条件(例如温度、离子强度和％SDS)。中度严格条件的实例为在37℃溶液中孵育过夜，所述溶液包含：20％甲酰胺，5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt′s溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性的剪切鲑精DNA，然后在1×SSC中于大约37-50℃洗涤滤纸。熟练技术人员将明白如何调节温度、离子强度等，这是适应诸如探针长度等因素所必须的。
变体Torc多核苷酸
本发明还包括与公开的TORC核苷酸序列不同的核酸分子。例如序列可以因为遗传密码的简并性而不同。从而这些核酸编码与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5所示核苷酸序列编码的相同的TORC蛋白。在这类实施方案中，本发明的分离的核酸分子具有下述核苷酸序列：其编码具有SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一所示氨基酸序列的蛋白质。
除SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一所示人TORC核苷酸序列外，本领域技术人员会理解群体(例如人群)中可存在引起TORC蛋白质氨基酸序列改变的DNA等位序列多态性。这类天然等位变异通常引起TORC基因核苷酸序列中1-5％的改变。任何及所有这类核苷酸变异和引起的TORC蛋白中的氨基酸多态性，为天然等位变异的结果而且并不改变TORC蛋白的功能活性，旨在包含在本发明范围内。
此外，编码来自其他物种的TORC直向同源物的核酸分子，具有与SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一不同的核苷酸序列，旨在包含在本发明范围内。对应于本发明TORC cDNA的天然等位变体和直向同源物可基于它们与本文公开的人TORC核酸的同源性，使用人cDNA或其部分作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下进行分离。
保守突变
除了群体中可能存在的TORC序列天然存在的等位变体外，熟练技术人员还将理解SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5任一的核苷酸序列的变体可由熟练技术人员产生，从而引起编码的TORC蛋白氨基酸序列改变而不改变TORC蛋白的功能。例如，可在SEQ ID NO：1、SEQID NO：3或SEQ ID NO：5任一的序列中进行引起“非必需”氨基酸残基上氨基酸置换的核苷酸置换。“非必需”氨基酸残基是序列中可自TORC蛋白野生型序列改变但不改变产生的基因产物生物活性的位置上的残基，而“必需”氨基酸残基是生物活性必需的位置上的残基。例如，TORC蛋白家族(本发明的TORC蛋白是其成员)成员内不变的氨基酸残基预示着特别不适于进行改变。在进行了多肽的同源物、直系同源物和旁系同源物的多重序列比对之后，多肽氨基酸序列中的位置是否不变或可进行替换将是显而易见的。
因此本发明很重要的一个方面涉及编码TORC蛋白的核酸分子，其中在不是活性所必需的氨基酸残基中含有改变。这些TORC蛋白在氨基酸序列上与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一序列不同，但保留了生物活性。在一个实施方案中，分离的核酸分子包含编码蛋白质的核苷酸序列，其中蛋白质包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQID NO：6中任一序列至少约75％相似的氨基酸序列。优选地，核酸分子编码的蛋白质与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一序列至少约80％相同，更优选与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约97％、至少约98％并且最优选至少约99％相同。可以通过以下方法产生编码与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一序列相似的蛋白质的分离核酸分子：在相应的核苷酸序列中引入一个或多个核苷酸置换、添加或缺失，从而在编码的蛋白质中引入一个或多个氨基酸置换、添加或缺失。
优选在一个或多个推测的非必需氨基酸残基上进行保守性氨基酸取代。“保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基取代。本领域已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基家族。某些氨基酸具有带有多于一种分类特征的侧链，如带有长脂肪侧链的极性氨基酸。氨基酸家族包括具有以下侧链的氨基酸：碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)、芳香侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)和金属络合侧链(如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸和组氨酸)。可以通过标准技术，如定点诱变和PCR介导的诱变，在SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5中引入突变。或者，在另一实施方案中，可以通过如饱和诱变在TORC编码序列的全部或部分中随机引入突变，可以筛选所得突变体的TORC蛋白生物活性，以鉴定保留活性的突变体。对SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQID NO：5进行诱变之后，可以通过本领域已知的任何重组技术表达编码的蛋白质并测定蛋白质的活性。
测定两种或更多序列之间的相似性
为了测定两种氨基酸序列或两种核酸之间的百分比相似性，出于最佳比较的目的比对序列(如可以在被比较的任一序列中引入缺口，以实现序列间的最佳比对)。本文使用的氨基酸或核苷酸“同一性”与氨基酸或核苷酸“同源性”同义。
术语“序列同一性”指在特定的比较区域中，两种多核苷酸或多肽序列在逐个碱基基础上相同的程度。通过以下步骤计算术语“序列同一性百分比”：在比较区域中比较最佳比对的两种序列；确定在两种序列中出现相同核酸碱基(如核酸情况下的A、T或U、C、G或I)的位置数，以获得匹配位置数；用匹配位置数除以比较区域中的位置总数(即窗口大小)；结果乘以100以获得序列同一性百分比。本文使用的术语“基本同一”表示多核苷酸序列的特征，其中在比较区中与参照序列相比，多核苷酸包含具有至少80％序列同一性、优选至少85％序列同一性、通常为90％至95％序列同一性、更通常为至少99％序列同一性的序列。在多肽中，通过以下步骤计算“阳性残基百分比”：在比较区域中比较最佳比对的两种序列；测定在两种序列中出现相同和上文定义的保守性氨基酸取代的位置数，以获得匹配位置数；用匹配位置数除以比较区域中的位置总数(即窗口大小)；用结果乘以100获得阳性残基百分比。
本领域已知的“同一性”是通过序列比较测定的两种或更多多肽序列或两种或更多多核苷酸序列之间的关系。在本领域中，“同一性”的情况还可以指多肽或核苷酸序列之间的序列相关性程度，通过这些序列串间的匹配测定。可以使用已知方法便利地测定“同一性”和“相似性”，包括但不仅限于《Computational Molecular Biology》，Lesk.A.M.编辑，OxfordUniversity Press，New York，1988；《Biocomputing：Informatics andGenome Projects》，Smith，D.W.编辑，Academic Press，New York，1993；《Computer Analysis of Sequence Data》，Part I.Griffin，A.M.和Griffin，H.G.编辑Humana Press，New Jersey，1994；《Sequence Analysis inMolecular Biology》，von Heinj e，G.，Academic Press，1987和《SequenceAnalysis Primer》，Gribskov，M.和Devereux，J.编辑，M Stockton Press.New York，1991以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.(1988)48：1073中所述的方法。确定同一性的优选方法设计用以给出测试序列间的最大匹配。公共可用的计算机程序中编程了确定同一性和相似性的方法。确定两种序列之间同一性和相似性的优选计算机程序方法包括但不仅限于GCG程序包(Devercux，J.，等(1984)Nucleic Acids Research 12(1)：387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等(1990)J.Molec.Biol.215：403-410。BLAST X程序可从NCBI和其他来源公开得到(BLASTManual，Altschul，S.，等，NCBI NLM NIH Bethesda，Md.20894；Altschul，S.，等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410)。还可以使用熟知的SmithWaterman算法确定同一性。
此外，BLAST算法可用于检测两种序列之间的相似性和百分比同一性。BLAST可自万维网上国家生物技术信息中心网址获得。描述BLAST分析的参考文献包括Madden，T.L.，Tatusov，R.L.&Zhang，J.(1996)Meth.Enzymol.266：131-141；Altschul，S.F.，Madden，T.L.，Schffer，A.A.，Zhang，J.，Zhang，Z.，Miller，W.&Lipman，D.J.(1 997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402和Zhang，J.&Madden，T.L.(1997)Genome Res.7：649-656。
反义核酸
本发明的另一方面涉及分离的反义核酸分子或其变体、片段、类似物或衍生物，所述反义核酸分子与包含核苷酸序列SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3或SEQ ID NO：5的核酸分子杂交或互补。“反义”核酸包含与编码蛋白质的“有义”核酸互补(例如与双链cDNA分子的编码链互补或与mRNA序列互补)的核苷酸序列。在具体方面提供了反义核酸分子，所述反义核酸分子包含与至少约10、25、50、100、250或500个核苷酸的部分或整个TORC编码链互补的序列。
在一个实施方案中，反义核酸分子与编码TORC蛋白的核苷酸序列编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指包含翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列区域(如人TORC蛋白的蛋白编码区，对应于SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一)。在另一实施方案中，反义核酸分子与编码TORC蛋白的核苷酸序列编码链的“非编码区”反义。术语“非编码区”指编码区侧翼的5’和3’序列，它们不翻译成氨基酸(即也称为5’和3’非翻译区)，但它们可能含有调节表达的序列。
给定编码本文公开的TORC蛋白的编码链序列(如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5)，可以按照Watson和Crick或Hoogsteen碱基配对原则设计本发明的反义核酸。反义核酸分子可以与TORC mRNA的完整编码区互补，但更优选仅与TORC mRNA的部分编码区或非编码区反义的寡核苷酸。
本发明的反义核酸分子一般对受试者施用或原位产生，从而它们与编码TORC蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合，从而抑制蛋白质的表达，例如通过抑制转录和/或翻译。可以通过常规核苷酸互补性进行杂交以形成稳定的双链体，或者例如在反义核酸分子与DNA双链体结合的情况下，通过双螺旋大沟中的特异性相互作用进行杂交。
干扰RNA
在本发明的一个方面，可以通过RNA干扰减弱TORC基因的表达。本领域熟知的一种方法是短干扰RNA(siRNA)或小RNA(文中也称为干扰多核苷酸或小多核苷酸)介导的基因沉默，其中特异性双链TORC产生的siRNA核苷酸序列靶向TORC基因的表达产物，所述siRNA核苷酸序列与TORC基因转录物(包括5’非翻译(UT)区、ORF或3’UT区)的至少19-25 nt长区段互补。参阅如PCT申请WO 00/44895、WO 99/32619、WO 01/75164、WO 01/92513、WO 01/29058、WO 01/89304、WO 02/16620和WO 02/29858，所述文献各以其整体引入本文为参考，还参阅Jia等(2003)J.Vir0l.77(5)：3301-3306和Morris等(2004)Science305：1289-1292。靶向的基因可以是TORC基因或TORC基因的上游或下游调节剂。TORC基因上游或下游调节剂的非限制性实例包括例如与TORC基因启动子结合的转录因子、与TORC多肽相互作用的激酶或磷酸酶以及参与TORC调节途径的多肽。
本发明的TORC多核苷酸包括siRNA多核苷酸。可以使用TORC多核苷酸序列获得这样的TORC siRNA，例如通过在无细胞系统中加工TORC核糖多核苷酸序列、通过转录重组双链TORC RNA或通过化学合成与TORC序列类似的多核苷酸序列。参阅如Tuschl，Zamore，Lehmann，Bartel和Sharp(1999)，Genes&Dev.13：3191-3197，所述文献以其整体引入本文为参考。
一般使用这样的siRNA双链体可以观察到最有效的沉默：由21-nt有义链和21-nt反义链组成，以具有2-nt 3’突出的方式配对。2-nt 3’突出的序列对siRNA靶标识别的特异性也稍有贡献。对特异性的贡献局限于与第一个配对碱基毗邻的未配对核苷酸。在一个实施方案中，3’突出中的核苷酸为核糖核苷酸。在备选实施方案中，3’突出中的核苷酸为脱氧核糖核苷酸。
为了产生siRNA，本发明的预期重组表达载体包含克隆进表达载体的TORC DNA分子，所述载体在TORC序列两侧以允许两条链均表达的方式包含有效连接的调节序列。可以体内杂交有义和反义RNA链，以通过切割RNA而形成siRNA来产生用于沉默TORC基因的siRNA构建体。或者，可以使用两种构建体产生siRNA构建体的有义和反义链。最后，克隆的DNA可以编码具有二级结构的构建体，其中单个转录物同时具有来自一个或多个靶基因的有义和互补反义序列。在该实施方案的实施例中，发夹RNAi产物与靶基因的全部或部分相似。在另一实施例中，发夹RNAi的产物为siRNA。TORC序列侧翼的调节序列可以相同，或者可以不同，从而可以独立调节或者以时间或空间方式调节其表达。
在具体的实施方案中，通过将TORC基因模板克隆进载体来胞外转录siRNA，所述载体含有例如来自小核RNA(snRNA)U6的RNA pol III转录单位或人Rnase P RNA H1。载体系统的一个实例为GeneSuppressorTMRNA干扰试剂盒(可购自Imgenex)。U6和H1启动子为III型Pol III启动子的成员。
siRNA载体具有提供长效mRNA抑制的优点。相反，用外源合成siRNA转染的细胞一般在7天或10轮细胞分裂后从mRNA抑制中恢复。siRNA表达载体的长效基因沉默能力可以提供在基因治疗中的应用。
一般而言，通过称为DICER的ATP依赖性核糖核酸酶从较长的dsRNA消化出siRNA。DICER是双链RNA特异性内切核酸酶RNase III家族成员。siRNA与细胞蛋白质装配成内切核酸酶复合物。果蝇的体外研究提示siRNA/蛋白质复合物(siRNP)其后转移至称为RNA诱导的沉默复合物(RISC)的第二种酶复合物，它含有与DICER不同的内切核核糖酸酶。RISC使用反义siRNA链编码的序列寻找并破坏互补序列的mRNA。因此siRNA发挥向导作用，限制核糖核酸酶仅切割与一条或两条siRNA链互补的mRNA。
siRNA靶向的TORC mRNA区一般选自从起始密码子下游50至100nt开始的期望TORC序列。或者，可以使用5’或3’UTR和起始密码子附近的区域，但一般应该避免，因为它们可能有更多调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或转录起始复合物可以干扰siRNP或RISC内切核酸酶复合物的结合。参阅Elbashir等2001 EMBO J.20(23)：6877-88。因此在靶向所需基因时，应该仔细斟酌以适应SNP、多态性、等位变体或物种特异性变异。
涉及TORC siRNA的实验包括正确的阴性对照。一般应该混排(scramble)TORC siRNA的核苷酸序列并进行同源性搜索以确保它与任何其他基因均缺乏同源性。
本发明的发明性治疗方法将施用TORC siRNA构建体作为疗法，以补偿异常的TORC表达或活性。获得TORC核糖多核苷酸并加工成siRNA片段，或者如上文所述合成TORC siRNA。如上文所述使用已知的核酸转染技术对细胞或组织施用TORC siRNA。对TORC基因具有特异性的TORC siRNA会降低或敲低TORC转录产物，这将引起TORC多肽产量下降，导致细胞或组织中TORC多肽活性降低。
本发明还包括基本抑制患者疾病或病理病症的发生、治疗或改善疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中TORC相关的或CREB启动的过程的水平异常相关，所述方法包括对个体施用靶向蛋白mRNA(编码该蛋白的mRNA)以进行降解的RNAi构建体。特异性RNAi构建体包括siRNA或加工成siRNA的双链基因转录物。经治疗靶TORC蛋白的表达受到抑制。
核酶
本文考虑的多核苷酸还可以是核酶，即酶RNA分子，可用于通过特异性切割RNA来抑制基因表达。核酶的作用机制涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，其后是内切核酸酶切割。可以使用的实例包括改造的“锤头状”或“发夹”基序核酶分子，它们可以设计成特异并高效地催化基因序列(如TORC1、TORC2或TORC3基因)的内切核酸酶切割。可以合成核酶以识别目的蛋白质的特异性核苷酸序列并切割(Cech.J.Amer.Med Assn.260：3030(1988))。设计用于基因表达的靶向性抑制的这些分子的技术为本发明相关领域技术人员所熟知。
核酶方法包括使细胞接触核酶或诱导细胞中这些小RNA酶分子的表达(Grassi和Marini，1996，Annals of Medicine 28：499-510；Gibson，1996，Cancer and Metastasis Reviews 15：287-299)。可以利用锤头状和发夹核酶的胞内表达抑制基因编码的蛋白，所述核酶靶向与至少一种本文所述基因对应的mRNA。
核酶可以以掺入了核酶序列的RNA寡核苷酸的形式直接递送至细胞，或者作为编码所需核酶RNA的表达载体引入细胞。可以在体内以足以高效催化切割mRNA的数目常规表达核酶，从而修饰细胞中的mRNA丰度(Cotten等，1989 EMBO J.8：3861-3866)。
适体
还可以将RNA适体引入细胞或在细胞中表达，以修饰RNA丰度或活性。RNA适体是蛋白质的特异性RNA配体，如能够特异性抑制其翻译的Tat和Rev RNA(Good等，1997，Gene Therapy 4：45-54)。
三螺旋多核苷酸
可以使用“三螺旋”碱基配对法实现对基因表达的抑制。三螺旋配对之所以有用是因为它导致抑制双螺旋打开至足以结合聚合酶、转录因子或调节分子的能力。文献中已经描述了使用三链DNA的最近的治疗进展(Gee，J.E.等(1994)In：Huber，B.E.and B.I.Carr，Molecular andImmunologic Approaches，Futura Publishing Co.，Mt.Kisco，N.Y.)。这些分子还可以设计为通过阻止由结合核糖体引起的转录来阻断mRNA的翻译。
可以使用本领域合成核酸分子的任何已知技术来制备本发明的所有多核苷酸，包括反义分子、三螺旋DNA、RNA适体和核酶。它们包括化学合成寡核苷酸的技术，如固相亚磷酰胺化学合成。或者，可以通过体外和体内转录编码本文所述多肽基因的DNA序列来制备RNA分子。这样的DNA序列可以掺入到具有适当的RNA聚合酶启动子(如T7或SP6)的多种载体中。或者可以将组成型或诱导型合成反义RNA的cDNA构建体引入细胞系、细胞或组织。
RNA的产生
使用已知方法产生TORC的有义RNA(ssRNA)和反义RNA(asRNA)，如在RNA表达载体中进行转录。参阅如Sambrook等《Molecular Cloning》，第三版，Cold Spring Harbor Laboratory Press， Plainview，N.Y.(2001)。使用Expedite RNA亚磷酰胺和胸苷亚磷酰胺(Proligo，Germany)化学合成siRNA，如21 nt RNA。使合成的寡核苷酸去保护并凝胶纯化(Elbashir等(2001)Genes&Dev.15，188-200)，其后通过Sep-Pak C18盒(Waters，Milford，Mass.，USA)纯化(Tuschl等(1993)Biochemistry，32：11658-11668)。通过在退火缓冲液(100mM乙酸钾、30mM pH 7.4的HEPES-KOH、2mM乙酸镁)中于90℃孵育1分钟，之后37℃孵育1小时，使RNA单链退火。
PNA部分
在多个实施方案中，可以修饰TORC核酸以产生肽核酸(参阅Hyrup等(1996)Bioorg Med Chem 4：5-23)。本文使用的术语“肽核酸”或“PNA”指核酸模拟物，如DNA模拟物，其中脱氧核糖核酸骨架被替换为假肽骨架，仅保留四种天然核碱基。已经显示在低离子强度条件下PNA的中性骨架能与DNA和RNA特异性杂交。可以使用标准固相肽合成方案实现PNA寡聚物的合成，如上文Hyrup等(1996)；Perry-O′Keefe等(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：14670-675所述。
TORC的PNA可用于治疗和诊断应用。例如，PNA可以作为反义或抗基因剂，用于通过如诱导转录或翻译停止或抑制复制来序列特异性地调节基因表达。TORC蛋白的PNA还可用于例如通过PNA指导的PCR箝位(clamping)进行的基因中单碱基对突变分析；与其他酶(如S1核酸酶(Hyrup B.(1996)见上文))组合时作为人工限制性酶；或作为探针或引物用于DNA测序和杂交(Hyrup等(1996)，上文；Perry-O′Keefe(1996)，上文)。
多肽
本文使用的术语“蛋白质”、“多肽”或“寡肽”和基于它们的类似词语指由肽键连接的α氨基酸聚合物。α氨基酸包括核酸、多核苷酸和寡核苷酸的三联密码子编码的氨基酸。它们还可以包括具有与遗传密码编码的氨基酸不同的侧链的氨基酸。
本文使用的本发明多肽或蛋白质的“成熟”形式为天然存在的多肽或前体形式或前蛋白的产物。天然存在的多肽、前体或前蛋白的非限制性实例包括由相应基因编码的全长基因产物。或者，它可以定义为本文公开的开放读码框编码的多肽、前体或前蛋白。还是作为非限制性实例，产物的“成熟”形式作为细胞或宿主细胞中可能发生的一种或多种天然存在加工步骤的结果而产生，基因产物在所述细胞或宿主细胞中产生。这些导致多肽或蛋白质“成熟”形式的加工步骤的实例包括切割开放读码框起始密码子编码的N端甲硫氨酸残基或蛋白水解切割信号肽或前导肽。因此在去除N端甲硫氨酸后，来自具有残基1至N(其中残基1为N端甲硫氨酸)的前体多肽或蛋白质的成熟形式将保留残基2至N。或者，来自具有残基1至N(其中切去从残基1至残基M的N端信号序列)将保留残基M+1至残基N。本文使用的多肽或蛋白质的“成熟”形式还可以来自翻译后修饰步骤，而不是蛋白水解切割事件。作为非限制性实例，这些其他过程包括糖基化、肉豆蔻酰化或磷酸化。通常，成熟的多肽或蛋白质可以仅来自这些过程之一，或者来自其任何组合。
本文使用的“氨基酸”代表可见于蛋白质的任何一种天然存在的α氨基酸。此外，术语“氨基酸”代表蛋白质化学、生物化学和其他本发明相关领域的技术人员已知的任何非天然存在氨基酸。它们的非限制性实例包括肌氨酸、羟脯氨酸、正亮氨酸、别异亮氨酸、环己基丙氨酸、苯基甘氨酸、高半胱氨酸、二羟苯丙氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、天然存在L-氨基酸的D-氨基酸异构体等等。此外氨基酸还可以是经修饰或衍生的，例如通过用标记偶联侧链。可以在本文公开的多肽中掺入任何本领域技术人员已知的氨基酸。
本文使用的术语“表位标记”指嵌合多肽，它包含与“标记多肽”融合的TORC多肽。标记多肽具有足以提供表位的残基，可以针对所述表位产生抗体，但是又足够短，从而不干扰与其融合的多肽的活性。标记多肽还优选十分独特，从而抗体基本不与其他表位交叉反应。合适的标记多肽通常具有至少6个氨基酸残基，一般约8至50个氨基酸残基(优选约10至20个氨基酸残基)。
本文使用的术语“活性的”或“活性”和类似术语指多肽的形式，所述形式保留自然或天然存在的TORC的生物活性和/或免疫活性，其中“生物”活性指与诱导产生针对自然或天然存在的TORC所具有的抗原表位的抗体的能力不同的、由自然或天然存在的TORC引起的生物功能(抑制或刺激)，而“免疫”活性指诱导产生针对自然或天然存在的TORC所具有的抗原表位的抗体的能力。
TORC蛋白和多肽
本发明的TORC蛋白包括分离的TORC蛋白，其序列在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中提供。本发明还包括突变体或变体蛋白，其残基可以由SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的相应残基发生改变，但仍编码保持TORC蛋白样活性和生理功能的蛋白质或其功能性片段。例如，本发明包括上述变体TORC核酸编码的多肽。在突变体或变体蛋白质中，可以这样改变多达20％或以上的残基。
一般而言，保留TORC蛋白样功能的TORC蛋白样变体包括任何变体，其中特定位置的残基被其他氨基酸取代，还包括在亲本蛋白质的两个残基之间插入额外的残基的可能性，以及缺失亲本序列中一个或多个残基的可能性。本发明包括任何氨基酸取代、插入或缺失。在有利的情况下，取代为上文定义的非必需或保守性取代。此外，不限制本发明范围地，可以取代SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中的任何位置，从而突变体或变体蛋白质可以包括一个或多个取代。
本发明还包括分离的TORC蛋白及其生物活性部分或其衍生物、片段、类似物或同源物。还提供了适于作为产生抗TORC蛋白抗体的免疫原的多肽片段。蛋白质或多肽的片段如肽或寡肽的长度可以为5个氨基酸残基或更多，或者长度为6个或更多，7个或更多，8个或更多，9个或更多，10个或更多，15个或更多，20个或更多，25个或更多，30个或更多，50个或更多，100个或更多残基，上至比全长序列短一个氨基酸的长度。在一个实施方案中，可以使用标准蛋白质纯化技术通过适当的纯化方案从细胞或组织来源中分离天然TORC蛋白。在另一实施方案中，通过重组DNA技术产生TORC蛋白。作为重组表达的备选方案，可以使用标准肽合成技术化学合成TORC蛋白或多肽。蛋白质和多肽的纯化描述于教科书例如“Protein Purification，第三版”，R.K.Scopes，Springer-Verlag，New York，1994；“Protein Methods，第二版，”D.M.Bollag，M.D.Rozycki和S.J.Edelsterin，Wiley-Liss，New York，1996以及“Guide to ProteinPurification”，M.Deutscher，Academic Press，New York，2001中。
TORC蛋白的生物活性部分包括这样的肽：它含有与TORC蛋白氨基酸序列充分相似或来自TORC蛋白的氨基酸序列(如SEQ ID NO：2、SEQID NO：4或SEQ ID NO：6)的氨基酸序列，包含少于全长TORC蛋白的氨基酸，并显示至少一种TORC蛋白活性。生物活性部分一般包含具有至少一种TORC蛋白活性的结构域或基序。TORC蛋白的生物活性部分可以是例如长度为10、25、50、100或更多氨基酸的多肽。
本发明TORC蛋白的生物活性部分可以含有至少一种上文鉴定的在TORC蛋白质家族中保守的结构域。此外，可以通过重组技术制备缺失了其他蛋白区域的生物活性部分，并评估一种或多种天然TORC蛋白的功能活性。
在一个实施方案中，TORC蛋白具有SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，TORC蛋白与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一基本相似，并保留SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一的功能活性，但由于天然等位基因变异或诱变而在氨基酸序列上存在差异，这在下文有详细描述。因此，在另一实施方案中，TORC蛋白是这样的蛋白质：它包含与SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6中任一氨基酸序列具有至少约45％的相似性，更优选约55％或更高，65％或更高，70％或更高，75％或更高，80％或更高，85％或更高，90％或更高，95％或更高，98％或更高，或甚至99％或更高的相似性，并保留具有序列SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的相应多肽的TORC蛋白功能活性。作为TORCX多肽与同源或旁系同源多肽比对的结果鉴定了可以在变体多肽分子中改变的特定氨基酸残基的非限制性实例。
嵌合及融合蛋白
本发明还提供TORC蛋白嵌合或融合蛋白。本文使用的TORC蛋白“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包括与非TORC多肽有效连接的TORC多肽。“TORC多肽”指具有对应于TORC蛋白的氨基酸序列的多肽，而“非TORC多肽”指具有对应于与TORC蛋白不基本相似的蛋白质(例如来自相同或不同生物的与TORC蛋白不同的蛋白质)的氨基酸序列的多肽。在含有TORC蛋白的融合蛋白中，TORC多肽可以对应于TORC蛋白的全部或部分。在一个实施方案中，TORC蛋白融合蛋白包含全长TORC蛋白或TORC蛋白的至少一个生物活性片段。在另一实施方案中，TORC蛋白融合蛋白包含TORC蛋白的至少两个片段，所述片段各自保留其生物活性。在融合蛋白中，术语“有效连接”旨在表示TORC多肽和非TORC多肽彼此框内融合。非TORC多肽可以与TORC多肽的N端或C端融合。
在另一实施方案中，融合蛋白为GST-TORC蛋白融合蛋白，其中TORC蛋白序列与GST(即谷胱甘肽S转移酶)序列的C端融合。这样的融合蛋白可以便于纯化重组TORC蛋白。其他融合实施方案包括用于纯化和检测融合构建体的FLAG标记融合和荧光蛋白融合。
在另一实施方案中，融合蛋白为在其N端含有异源信号序列的TORC蛋白。例如，可以除去天然TORC蛋白信号序列并替换为来自另一蛋白质的信号序列。在某些宿主细胞(如哺乳动物宿主细胞)中，可以通过使用异源信号序列提高TORC蛋白的表达和/或分泌。
在另一实施方案中，融合蛋白为TORC蛋白-免疫球蛋白融合蛋白，其中包含一个或多个结构域的TORC蛋白序列与来自免疫球蛋白家族成员的序列融合。本发明的TORC蛋白-免疫球蛋白融合蛋白可以掺入到药物组合物中并对受试者施用，以抑制TORC蛋白配体与细胞表面TORC蛋白之间的相互作用，从而抑制TORC蛋白介导的体内信号转导。
可以通过标准重组DNA技术产生本发明的TORC蛋白嵌合或融合蛋白。例如，按照常规技术将编码不同多肽序列的DNA片段框内连接在一起，例如使用平末端或粘末端连接、限制性酶消化以提供适当的末端、适当时补平粘末端、碱性磷酸酶处理以避免不期望的连接以及酶促连接。在另一实施方案中，可以通过常规技术(包括自动化DNA合成仪)合成融合基因。或者可以使用锚定引物进行基因片段的PCR扩增，所述锚定引物产生两个连续基因片段之间的互补突出，所述突出可以退火并再扩增以产生嵌合基因序列(参阅如Brent等，《Current Protocols in MolecularBiology》，Wiley Interscience Publishers，(2003))。此外，许多已经编码融合部分(如GST多肽)的表达载体是市售的。可以将TORC蛋白编码核酸克隆进这些表达载体，从而融和部分与TORC蛋白框内连接。
TORC多肽或TORC寡肽的“特异性结合剂”是与TORC多肽或寡肽特异性结合但与其他多肽和寡肽结合很弱或不结合的任何物质。特异性结合剂的非限制性实例包括抗体、TORC多肽的特异性受体、这些抗体和受体的结合结构域、适体、印痕聚合物等。
TORC激动剂和拮抗剂
本发明还涉及发挥TORC蛋白激动剂(模拟物)或TORC蛋白拮抗剂功能的TORC蛋白片段或变体。TORC蛋白激动剂可以保留天然存在形式TORC蛋白的基本相同的生物活性或其子集。TORC蛋白的拮抗剂可以抑制天然存在形式TORC蛋白的一种或多种活性，例如通过与包括TORC蛋白的细胞信号级联的下游或上游成员竞争性结合。
可以通过筛选TORC蛋白突变体(如截短突变体)组合文库的TORC蛋白激动剂或拮抗剂活性来鉴定发挥激动剂(模拟物)或拮抗剂功能的TORC蛋白变体或片段。在一个实施方案中，通过核酸水平的组合诱变产生TORC变体杂色文库(variegated library)，并由杂色基因文库编码。可以通过例如以下方法产生TORC变体杂色文库：将合成寡核苷酸混合物酶促连接进基因序列，从而潜在TORC序列的简并集合可作为单个多肽表达，或者作为其中含有TORC序列集的较大的融合蛋白集合(如用于噬菌体展示)表达。可以在自动化DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，接着将合成基因连接进适当的表达载体。合成简并寡核苷酸的方法为本领域已知(参阅如Narang(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等(1984)Annu Rev Biochem 53：323；Itakura等(1984)Science 198：1056；Ike等(1983)Nucl Acid Res 11：477)。
由于TORC基因家族含有高度保守的关键区，因此预计TORC蛋白的肽模拟物也发挥TORC调节剂的作用。实施例中公开了模拟物的实施方案。这些肽来自或设计自阻断TORC功能的TORC家族蛋白。预计这些模拟物阻断所有高度相关TORC蛋白的功能。可以按照常规方法基于对多肽中TORC蛋白活性所必需区域的了解来产生合适的TORC蛋白的合适的肽模拟物。简言之，通过常规结构-功能研究(如野生型蛋白的缺失或突变分析)和多序列比对鉴定蛋白质中的短氨基酸序列。肽模拟物的氨基酸序列可以由完全或部分与该区域匹配的氨基酸组成。可以用与原始氨基酸相似但赋予更好的药理学特性如较高的抑制活性、稳定性、半衰期或生物利用率的化学结构替代这些氨基酸。
多肽文库
此外，TORC蛋白编码序列片段的文库可用于产生用于筛选和其后选择TORC蛋白变体的功能性片段杂色群。
本领域已知的若干技术可用于筛选通过点突变或截短产生的组合文库的基因产物以及用于在cDNA文库中筛选具有选定特性的基因产物。这些技术适用于快速筛选通过TORC蛋白组合诱变产生的基因文库。递归总体诱变(REM)，一种增强文库中功能性突变体频率的新技术，可以与筛选测定组合使用，以鉴定TORC变体(Arkin和Yourvan(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：7811-7815；Delgrave等(1993)Protein Engineering6：327-331)。
抗TORC抗体
本文使用的术语“抗体”指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(与之免疫反应)的抗原结合位点的分子。这些抗体包括但不仅限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab、Fab，和F(ab′)2片段以及Fab表达文库。一般而言，得自1 人的抗体分子是指IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类中的任一种，这些类因分子中存在的重链的性质而彼此有别。某些类还有亚类，如IgG1、IgG2等。此外，在人中，轻链可以是κ链或λ链。本文提到的抗体包括所有这些人抗体种类的类、亚类和型。本文公开的任何抗体都与其同源抗原“免疫特异性”结合。免疫特异性结合指通过用特定免疫原攻击宿主而产生的抗体与包含免疫原部分的分子(如抗原)以高亲和力结合，并且与不含有免疫原的分子仅以弱亲和力结合或根本不结合。在该定义中使用的高亲和力指具有低于约1×10-6M的解离常数，弱亲和力指具有高于约1×10-6M的解离常数。
旨在用作抗原的本发明分离的蛋白质或其部分或片段可以作为免疫原，使用多克隆和单克隆抗体制备的标准技术产生与抗原免疫特异性结合的抗体。全长蛋白可以用作免疫原，或者本发明提供用作免疫原的抗原的抗原肽片段。抗原肽片段包含全长蛋白质(如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6)氨基酸序列的至少6个氨基酸残基，并包括其表位，从而针对该肽产生的抗体与全长蛋白或含有该表位的任何片段形成特异性免疫复合物。优选地，抗原肽包含至少10个氨基酸残基，或至少15个氨基酸残基，或至少20个氨基酸残基，或至少30个氨基酸残基。抗原肽优选包含的表位为位于其表面的蛋白质区域，一般是亲水性区域。
多种本领域已知的方法可用于产生针对本发明蛋白质或针对其衍生物、片段、类似物、同源物或直向同源物的多克隆或单克隆抗体(参阅例如《Antibodies：A Laboratory Manual》，Harlow E和Lane D，1988，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，此处引用作为参考)。下文讨论了一些这类抗体。
1. 多克隆抗体
为了产生多克隆抗体，可以通过一次或多次注射天然蛋白质、其合成变体或上述物质的衍生物来免疫多种合适的宿主动物(如兔、山羊、小鼠或其他哺乳动物)。合适的免疫原性制品可以含有例如天然存在的免疫原性蛋白质、代表该免疫原性蛋白质的化学合成多肽或重组表达的免疫原性蛋白质。此外，蛋白质可以与已知在免疫动物中为免疫原性的另一种蛋白质缀合。这些免疫原性蛋白质的实例包括但不仅限于匙孔械血蓝蛋白、血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。
可以从哺乳动物(如从血中)分离针对免疫原性蛋白质的多克隆抗体分子并使用熟知的技术进一步纯化，如使用A蛋白或G蛋白的亲和层析，其主要提供免疫血清的IgG级分。免疫球蛋白的纯化讨论于例如D.Wilkinson(The Scientist，The Scientist，Inc.，Philadelphia PA出版，14卷，8期(2000年4月17日)，25-28页)。
2. 单克隆抗体
本文使用的术语“单克隆抗体”(MAb)或“单克隆抗体组合物”指仅含有一种抗体分子的抗体分子群，其由单一的轻链基因产物和单一的重链基因产物组成。特别地，单克隆抗体的互补性决定区(CDR)在该群的所有分子中都相同。因此MAb含有能与抗原特定表位发生免疫反应的抗原结合位点，特征在于对其独特的结合亲和力。
可以使用杂交瘤方法制备单克隆抗体，如Kohler和Milstein， Nature，256：495(1975)所述。在杂交瘤方法中，一般用免疫剂免疫小鼠、仓鼠或其他适当的宿主动物，以诱发产生或能够产生与免疫剂特异性结合的抗体的淋巴细胞。或者，可以体外免疫淋巴细胞。接着使用适当的融合剂(如聚乙二醇)使淋巴细胞与永生化细胞系融合，以形成杂交瘤细胞[Goding，《 Monoclonal Antibodies：Principles and Practice》，Academic Press，(1986)59-103页]。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人来源的骨髓瘤细胞。优选的永生化细胞系是高效融合、支持选择的抗体产生细胞进行抗体的稳定高水平表达并且对培养基如HAT培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是小鼠骨髓瘤细胞，它可得自如SalkInstitute Cell Distribution Center，San Diego，California以及美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Manassas，Virginia。还描述了利用人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系生产人单克隆抗体(Kozbor： J.Immunol.， 133：3001(1984)；Brodeur等： Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，(1987)51-63页)。
接着可以测定培养杂交瘤细胞的培养基中针对该抗原的单克隆抗体的存在。鉴定了所需杂交瘤细胞之后，可以通过有限稀释操作对克隆进行亚克隆，并通过标准方法培养(Goding，1986)。用于该目的的合适培养基包括如Dulbecco改良Eagle培养基和RPMI-1640培养基。或者可以体内(如作为哺乳动物的腹水)培养杂交瘤细胞。
可以通过常规免疫球蛋白纯化操作从培养基或腹水中分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体，例如A蛋白-琼脂糖、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
还可以通过重组DNA方法产生单克隆抗体，如美国专利No.4,816,567所述。
3. 人源化抗体
针对本发明蛋白质抗原的抗体还可以包括人源化抗体或人抗体。这些抗体适用于对人施用而不引起人对所施用免疫球蛋白的免疫应答。抗体的人源化形式为嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他抗原结合亚序列)，其原则上由人免疫球蛋白序列组成，并含有最少的来自非人免疫球蛋白的序列。可以遵循Winter及同事的方法(Jones等， Nature， 321：522-525(1986)；Riechmann等， Nature，332：323-327(1988)；Verhoeyen等， Science， 239：1534-1536(1988))，通过将啮齿类CDR或CDR序列替换为人抗体的相应序列来进行人源化(还可参阅美国专利No.5,225,539)人源化抗体最好还包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，一般是人免疫球蛋白的恒定区(Jones等，1986；Riechmann等，1988以及Presta(1992)Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596)。
4. 人抗体
全人抗体基本指其中轻链和重链(包括CDR)的全部序列都来自人基因的抗体分子。本文中这样的抗体被称为“人抗体”或“全人抗体”。可以通过三源杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术(参阅Kozbor，等(1983)Immunol Today 4：72)和EBV杂交瘤技术产生人单克隆抗体来制备人单克隆抗体(参阅Cole，等(1985)，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。可以在本发明的实践中使用人单克隆抗体，并且可以使用人杂交瘤(参阅Cote，等(1983)Proc Natl Acad SciUSA 80：2026-2030)或通过用EB(Epstein Barr)病毒体外转化人B细胞来生产(参阅参阅Cole，等(1985)，MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCERTHERAPY，Alan R.Liss，Inc.，77-96页)。
此外，还可以使用其他技术产生人抗体，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter(1991)J.Mol.Biol.，227：381；Marks等(1991)J.Mol.Biol.，222：581)。类似的，可以通过将人免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全失活的转基因动物(如小鼠)来产生人抗体。在攻击后观察到了人抗体产生，其在所有方面(包括基因重排、装配和抗体谱)都与人中观察到的高度相似。该方法描述于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016和Marks等(1992)(Bio/Technology 10，779-783)；Lonberg等((1994)Nature 368856-859)；Morrison((1994)Nature 368，812-13)；Fishwild等，((1996)Nature Biotechnology 14，845-51)；Neuberger((1996)Nature Biotechnology14，826)；以及Lonberg和Huszar((1995)Intern.Rev.Immunol.13 65-93)。产生目的抗体如人抗体的方法还公开于美国专利No.5,916,771。
还可以使用转基因非人动物生人抗体，所述动物经修饰从而应答于抗原攻击而产生全人抗体而不是动物的内源抗体(参阅出版物WO94/02602)。使非人动物中编码免疫球蛋白重链和轻链的内源基因失能，并将编码人重链和轻链免疫球蛋白的活性基因座插入宿主基因组。使用例如含有必需人DNA区段的酵母人工染色体来整合人基因。通过含有少于全部修饰补体(complement)的中间转基因动物的杂交育种来以后代获得提供所有所需修饰的动物。
5.Fab片段和单链抗体
根据本发明，可适用技术产生对本发明抗原蛋白具有特异性的单链抗体(参阅如美国专利No.4,946,778)。此外，可适用方法构建Fab表达文库(参阅如Huse，等，1989 Science 246：1275-1281)，以允许迅速并高效地鉴定对蛋白质或其衍生物、片段、类似物或同源物具有所需特异性的单克隆Fab抗体片段。可以通过本领域已知的技术产生含有针对蛋白质抗原的独特型的抗体片段，包括但不仅限于(i)通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生的F(ab′)2片段；(ii)通过还原F(ab′)2片段的二硫键而产生的Fab片段；(iii)通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段和(iv)Fv片段。
6. 双特异性抗体
双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆(优选人或人源化)抗体。在本案中，结合特异性之一是针对本发明抗原蛋白质的。第二结合靶标是任何其他抗原，有利地是细胞表面蛋白或受体或受体亚基。
产生双特异性抗体的方法为本领域已知。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于共表达两种免疫球蛋白重链/轻链对，其中两种重链具有不同的特异性(Milstein和Cuello， Nature， 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤)产生10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有1种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤实现正确分子的纯化。类似的操作公开于1993年5月13日出版的WO 93/08829和Traunecker等(1991)EMBO J.，10：3655-3659。产生双特异性抗体的其他细节参阅如Suresh等(1986)Methods in Enzymology，121：210。
7. 免疫缀合物
本发明还涉及包含与细胞毒性剂缀合的抗体的免疫缀合物，所述细胞毒性剂为例如化学治疗剂、毒素(如细菌、真菌、植物或动物来源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射性缀合物)。
上文已经描述了用于产生这类免疫缀合物的化学治疗剂。可以使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、莫迪素A链、α-帚曲霉素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin)、美洲商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、sapaonaria officinalis抑制剂、多花白树毒蛋白、丝林毒素(mitogellin)、局限曲霉素、酚霉素、伊诺霉素(enomycin)和单端孢霉烯族化合物(tricothecenes)。多种放射性核素可用于产生放射性缀合抗体。实例包括212Bi、131I、131In、90Y和186Re。
使用多种双功能蛋白偶联剂产生抗体与细胞毒性剂的缀合物，所述蛋白偶联剂为例如N-琥珀酰亚胺基-3-2-吡啶二硫代基-丙酸酯(SPDP)、亚胺基硫醇(IT)、亚氨酸酯的双功能衍生物(如己二亚氨酸二甲酯盐酸盐(dimethyl adipimidate HCL))、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双叠氮化合物(如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(如甲苯基2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(如1，5-二氟代-2，4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等， Science， 238：1098(1987)所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。14C标记的1-异硫氰酰基苄基-3-甲基二乙烯三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸缀合到抗体上的示例性螯合剂，参阅WO94/11026。
8. 针对TORC蛋白的抗体的诊断应用
针对本发明蛋白质的抗体可用于本领域已知的与蛋白质定位和/或定量有关的方法中(如用于测量适当的生理样品中的蛋白质水平、用于诊断方法、用于蛋白质造影等)。抗TORC抗体可用于检测或定量样品中的TORC蛋白抗原。在许多这样的实施方案中，抗体用于免疫吸附测定。
对本发明蛋白具有特异性的抗体可用于通过标准技术如免疫亲和层析或免疫沉淀来分离该蛋白质。这样的抗体可便于从细胞中纯化天然蛋白质抗原以及纯化宿主细胞中表达的重组产生的抗原。可以通过将抗体与可检测物质偶联(即物理连接)来使检测更为便利。可检测物质的实例包括多种酶、辅基、荧光物质、发光物质、生物发光物质和放射性物质。合适的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光物质的实例包括伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明、二氯三嗪基氨基荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光物质的实例包括鲁米诺；生物发光物质的实例包括荧光素酶、萤光素和水母发光蛋白；合适的放射性物质的实例包括125I、131I、35S或3H。
9. 抗体的药物组合物
可以以药物组合物的形式施用特异性结合本发明蛋白的抗体以及通过本文公开的筛选测定鉴定的其他分子，以用于治疗多种疾病。涉及制备这类组合物的原则和注意事项以及组分选择的指南提供于例如Remington：《The Science And Practice Of Pharmacy》第19版(Alfonso R.Gennaro，等，editors)Mack Pub.Co.，Easton，Pa.：1995；《Drug AbsorptionEnhancement：Concepts，Possibilities，Limitations，And Trends》，HarwoodAcademic Publishers，Langhorne，Pa.，1994以及《Peptide And ProteinDrug Delivery》(Advances In Parenteral Sciences，卷4)，1991，M.Dekker，New York。
还可以在胶体药物递送系统(如脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米囊)或巨乳中将活性成分包进(例如分别通过凝聚技术或通过界面聚合)制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊以及聚甲基丙烯酸甲酯微胶囊。
10. 抗体疗法
本发明的抗体(包括多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体和全人抗体)可以用作治疗剂。这样的物质一般用于治疗或预防受试者的疾病或病状。对受试者施用抗体制品(优选对其靶抗原具有高特异性和高亲和力的抗体制品)，所述抗体制品一般由于其与靶标的结合而具有效应。这样的效应可以是两种之一，取决于给定抗体分子与所述靶抗原之间相互作用的具体性质。在第一种情况下，施用抗体消除或抑制靶标与其天然结合的内源配体之间的结合。在这种情况下，抗体与靶标结合并掩盖天然存在配体的结合位点，其中该配体作为效应分子。从而受体介导配体负责的信号转导途径。
或者，效应可以是由于与靶分子上的效应物结合位点结合而引发生理结果。在这种情况下，靶标，即其内源配体在疾病或病理下缺乏或受损的受体，与作为代用效应物配体的抗体结合，起始基于受体的受体信号转导事件。
需要施用的量还取决于抗体对其特异性抗原的结合亲和力，还取决于其在所施用受试者的自由体积中清除的速率。作为非限制性实例，本发明抗体或抗体片段的治疗有效剂量的一般范围约0.1mg/kg体重至约50mg/kg体重。一般给药频率范围可以从例如每天两次至每周一次。
TORC重组载体和宿主细胞
本发明的另一方面涉及含有编码TORC蛋白核酸的载体(优选表达载体)或其衍生物、片段、类似物或同源物。本文使用的术语“载体”指能够运输与其连接的另一核酸的核酸分子。一类载体为“质粒”，指可以在其中插入待连接的额外DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体为病毒载体，其中额外的DNA区段可以连接进病毒基因组中。某些载体能够在其引入的宿主细胞中自主复制(例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加体哺乳动物载体)。其他载体(如非附加体哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合进宿主细胞的基因组，从而与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能指导与其有效连接的基因的表达。这些载体在本文中称为“表达载体”。用于重组DNA技术的表达载体通常为质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒是最普遍使用的载体形式。然而，本发明旨在包括这些发挥等效功能的其他形式的表达载体，如病毒载体(如复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
本发明的重组表达载体包含适于核酸在宿主细胞中表达的形式的本发明核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节序列，所述调节序列基于用于表达的宿主细胞来选择，并与待表达的核酸序列有效连接。在重组表达载体中，“有效连接”指目的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式与调节序列连接(如在体外转录/翻译系统或当载体引入宿主细胞时的宿主细胞中)。术语“调节序列”旨在包括启动子、增强子和其他表达控制元件(如多腺苷酸化信号)。这些调节序列描述于例如Goeddel(1990)《GENEEXPRESSION TECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY》185，AcademicPress，San Diego，Calif。调节序列包括指导核酸序列在许多类型的宿主细胞中组成型表达的调节序列和指导核苷酸序列仅在某些宿主细胞中表达的调节序列(如组织特异性调节序列)。本领域技术人员应该理解，表达载体的设计可以取决于例如以下这些因素，如待转化的宿主细胞的选择、所需的蛋白质表达水平等。可以将本发明的表达载体引入宿主细胞，从而产生由本文公开的核酸编码的蛋白质或肽，包括融合蛋白或肽(如TORC蛋白、TORC蛋白的突变形式、融合蛋白等)。
本发明的重组表达载体可以设计用于在原核和真核细胞中表达TORC蛋白。例如，TORC蛋白可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或哺乳动物细胞中表达。合适的宿主细胞在Goeddel(1990)中有进一步的讨论。或者可以体外转录并翻译重组表达载体，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
可以使用载体从任何所需基因中选择启动子区，所述载体在限制性位点或用于引入候选启动子片段(即可能含有启动子的片段)的位点下游含有缺乏启动子区的报告基因转录单位(如氯霉素乙酰转移酶(“CAT”)或荧光素酶(LUC)转录单位)。例如，在CAT或LUC基因限制性位点上游将含启动子的片段引入载体分别引起CAT或LUC活性的产生，所述活性可以通过标准CAT或LUC测定进行检测。适用于该目的的载体为本领域所熟知并且易于获得。两种这样的载体为pKK232-8和pCM7。因此，用于表达本发明多核苷酸的启动子不仅包括熟知并且易于获得的启动子，还包括可使用报告基因通过上述技术便利地获得的启动子。
蛋白质在原核生物中的表达最常使用含有组成型或诱导型启动子的载体在大肠杆菌中进行，所述启动子指导融合或非融合蛋白的表达。在已知细菌启动子中，适用于表达多核苷酸和多肽的为大肠杆菌lacI和lacZ启动子、T3和T7启动子、T5 tac启动子、λPR、PL启动子和trp启动子。融合载体在其编码的蛋白质中(通常在重组蛋白的氨基端)添加若干氨基酸。这些融合载体一般用于三个目的：(1)提高重组蛋白的表达；(2)提高重组蛋白的溶解度和(3)通过在亲和纯化中作为配体而辅助纯化重组蛋白。在融合表达载体中，常在融合部分与重组蛋白接合处引入蛋白水解切割位点，以使在纯化蛋白后可以将重组蛋白与融合部分分离。这样的酶及其同源识别序列包括Xa因子、凝血酶和肠激酶。典型的融合表达载体包括pGEX(Pharmacia Biotech Inc；Smith和Johnson(1988)Gene 67：31-40)、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，它们分别将靶重组蛋白与谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A融合。
合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的实例包括pTrc(Amrann等，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等(1990)《GENE EXPRESSIONTECHNOLOGY：METHODS IN ENZYMOLOGY》185，Academic Press，SanDiego，Calif.60-89)。
在另一实施方案中，TORC表达载体为酵母表达载体。用于在酿酒酵母(S.cerivisae)中表达的载体实例包括pYepSec1(Baldari，等，(1987)EMBO J 6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz，(1982)Cell30：933-943)、pJRY88(Schultz等，(1987)Gene 54：113-123)、pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)和picZ(InVitrogen Corp，SanDiego，Calif.)。
或者，可以使用杆状病毒表达载体在昆虫细胞中表达TORC蛋白。可用于在培养的昆虫细胞(如SF9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol Cell Biol 3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。
在另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。哺乳动物表达载体的实例包括pCDM8(Seed(1987)Nature329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J 6：187-195)。当在哺乳动物细胞中使用时，经常通过病毒调节元件提供表达载体的控制功能。例如，普遍使用的启动子来自多瘤病毒、腺病毒2、巨细胞病毒和猿猴病毒40。其他真核启动子包括CMV即早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、逆转录病毒LTR启动子如劳氏肉瘤病毒(“RSV”)启动子，以及金属硫蛋白启动子如小鼠金属硫蛋白-I启动子。
对于原核及真核细胞的其他合适的表达系统，参阅如Sambrook等，《MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL》第三版，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，2001。
在另一实施方案中，重组哺乳动物表达载体能够指导核酸在特定细胞类型中优先表达。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括白蛋白启动子(肝特异性，Pinkert等(1987)Genes Dev 1：268-277)、淋巴特异性启动子(Calame和Eaton(1988)Adv Immunol 43：235-275)特别是T细胞受体启动子(Winoto和Baltimore(1989)EMBO J 8：729-733)和免疫球蛋白启动子(Banerji等(1983)Cell 33：729-740；Queen和Baltimore(1983)Cell33：741-748)、神经特异性启动子(如神经丝启动子；Byrne和Ruddle(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86：5473-5477)、胰特异性启动子(Edlund等(1985)Science 230：912-916)和乳腺特异性启动子(如乳清启动子；美国专利No.4,873,316和欧洲申请出版物No.264,166)。还包括发育调节的启动子，如鼠源hox启动子(Kessel和Gruss(1990)Science 249：374-379)和甲胎球蛋白启动子(Campes和Tilghman(1989)Genes Dev 3：537-546)。
本发明还提供包含以反义取向克隆进表达载体的本发明DNA分子的重组表述载体。即DNA分子以允许(通过DNA分子的转录)表达与TORCmRNA反义的RNA分子的方式与调节序列有效连接。与反义取向克隆的核酸有效连接的调节序列可以选择指导反义RNA分子在多种细胞类型中持续表达的调节序列(如病毒启动子和/或增强子)，或者可以选择指导反义RNA的组成型、组织特异性或细胞类型特异性表达的调节序列。关于使用反义基因的基因表达的调节的讨论参阅Weintraub等，“AntisenseRNA as a molecular tool for genetic analysis，”Reviews--Trends in Genetics，Vol.1(1)1986。
宿主细胞
本发明另一方面涉及引入了本发明重组表达载体的宿主细胞。本文中术语“宿主细胞”和“重组宿主细胞”可互换使用。应该理解，这些术语不仅指特定的受试细胞，还指这些细胞的后代或可能的后代。因为在其后的世代中可能由于突变或环境影响而出现某些修饰，因此这些后代可能事实上不与亲本细胞相同，但仍包括在本文使用的术语范围内。
宿主细胞可以是原核或真核细胞。例如，可以在细菌细胞如大肠杆菌、昆虫细胞、酵母或哺乳动物细胞(如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或COS细胞)中表达TORC蛋白。其他合适的宿主细胞是本领域技术人员已知的。
此外，可以选择以所需的特定方式调节插入序列的表达或修饰并加工基因产物的宿主细胞株。蛋白质产物的这些修饰(如糖基化)和加工(如切割)对蛋白质的功能可能是很重要的。不同的宿主细胞对蛋白质的翻译后加工和修饰具有不同的特征性和特定的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白质的正确修饰和加工。为此，可以使用具有用于正确加工原始转录物、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。这些哺乳动物宿主细胞包括但不仅限于CHO、VERO、BHK、HeLa、COS、MDCK、293、3T3和WI38细胞。
可以通过常规转化或转染技术将载体DNA引入原核或真核细胞。本文使用的术语“转化”和“转染”旨在指多种用于将外源核酸(如DNA)引入宿主细胞的本领域已知技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂转染或电穿孔。用于转化或转染宿主细胞的合适方法可见于Sambrook，等(2001)、Brent等(2003)以及其他实验室手册。
就哺乳动物细胞的稳定转染而言，为了鉴定和选择稳定整合体，一般将编码可选择标记(如对抗生素的抗性)的基因与目的基因一起引入宿主细胞中。多种可选择标记包括赋予对药物(如G418、潮霉素和氨甲喋呤)的抗性的标记。
细胞培养
使用标准培养条件繁殖用于表达TORC的细胞培养物。转染前24小时(约80％汇合)，用胰蛋白酶处理细胞并用无抗生素的新鲜培养基以1∶5稀释(1-3×105细胞/ml)，转移至24孔板(500ml/孔)。使用市售的脂转染试剂盒或通过FuGENE6或通过电穿孔、磷酸钙颗粒掺入或生物射弹进行转染，使用带有阳性和阴性对照的标准技术监测TORC的表达。阳性对照是天然表达TORC的细胞，而阴性对照是不表达TORC的细胞。
本发明的宿主细胞如培养的原核或真核宿主细胞可用于生产(即表达)TORC蛋白。因此，本发明还提供使用本发明的宿主细胞生产TORC蛋白的方法。在一个实施方案中，该方法包括在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞(其中引入了编码TORC蛋白的重组表达载体)，从而生产TORC蛋白。在另一实施方案中，该方法还包括从培养基或宿主细胞中分离TORC蛋白。
转基因动物
本发明的宿主细胞还可用于产生非人转基因动物。例如，在一个实施方案中，本发明的宿主细胞为受精的卵母细胞或胚胎干细胞，其中引入了TORC蛋白编码序列。接着可以使用这些宿主细胞产生在其基因组中引入了外源TORC蛋白序列的非人转基因动物或改变了内源TORC蛋白序列的同源重组动物。这样的动物可用于研究TORC蛋白的功能和/或活性以及用于鉴定和/或评估TORC蛋白活性的调节剂。本文使用的“转基因动物”指非人动物，优选哺乳动物，更优选啮齿类如大鼠或小鼠，其中动物的一种或多种细胞包含转基因。转基因动物的其他实例包括非人灵长类、绵羊、狗、牛、山羊、鸡、两栖动物等。转基因是整合进发育成转基因动物的细胞基因组的外源DNA，并且所述外源DNA在成熟动物的基因组中保留，从而指导所编码的基因产物在转基因动物的一种或多种细胞类型或组织中表达。本文使用的“同源重组动物”是非人动物，优选哺乳动物，更优选小鼠，其中在发育成动物之前，通过内源基因与引入动物细胞(如动物的胚胎细胞)的外源DNA分子之间的同源重组改变了内源TORC基因。
可以通过(如通过显微注射、逆转录病毒感染)将TORC蛋白编码核酸引入受精卵母细胞的雄原核，并使卵母细胞在假孕的雌性代孕动物中发育来产生本发明的转基因动物。通过胚胎操作和显微注射产生转基因动物特别是诸如小鼠等动物的方法已成为本领域的常规技术，并描述于例如美国专利No.4,736,866、4,870,009和4,873,191以及Hogan 1986，《MANIPULATING THE MOUSE EMBRYO》，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y中。接着可以使用转基因初建(founder)动物繁育带有转基因的其他动物。此外，带有编码TORC蛋白的转基因的转基因动物还可以与带有其他转基因的其他转基因动物杂交。同源重组载体的描述参阅如Thomas等(1987)Cell 51：503。将载体引入胚胎干细胞系(例如通过电穿孔)并选择引入的TORC蛋白基因与内源TORC蛋白基因同源重组的细胞(参阅如Li等(1992)Cell 69：915)。参阅如Bradley 1987，《TERATOCARCINOMAS AND EMBRYONIC STEM CELLS：A PRACTICALAPPROACH》，Robertson编辑IRL，Oxford，113-152页和Bradley(1991)Curr Opin Biotechnol 2：823-829；PCT国际公开WO 90/1184；WO91/01140；WO 92/0968和WO 93/04169。
药物组合物
以治疗有效剂量对患者施用本文公开的药物组合物，所述药物组合物用于预防、治疗或改善与异常CRE依赖性基因表达或趋化因子异常活化相关的病理疾病。治疗有效剂量指化合物的量足以引起对所述疾病发生的基本抑制、治疗或改善。
与一种或多种其他治疗剂“组合”给药包括同时(共存)和任何顺序的连续给药。
本文使用的“载体”包括在使用剂量和浓度下对接触的哺乳动物无毒的可药用载体、赋形剂或稳定剂。生理可用载体经常是水性pH缓冲溶液。生理可用载体的实例包括缓冲液如磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和其他有机酸缓冲液；抗氧化剂包括抗坏血酸；小分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖醇如甘露醇或山梨醇；形成盐的抗衡离子如钠；和/或非离子表面活性剂如TWEENTM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICSTM。
本发明的TORC核酸分子、TORC蛋白和抗TORC蛋白抗体及其衍生物、片段、类似物和同源物在本文中称为“活性化合物”或“治疗剂”。这些治疗剂可以掺入适于对患者施用的药物组合物中。这样的组合物一般包含核酸分子、蛋白质或抗体和可药用载体。
本文使用的“可药用载体”旨在包括与药物施用相容的任一或所有溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等等。合适的载体在教科书有所描述，如《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，Gennaro AR编辑第20版(2000)Williams&Wilkins PA，USA和《Wilsonand Gisvold’s Textbook of Organic Medicinal and PharmaceuticalChemistry》，Delgado和Remers，Lippincott-Raven，所述教科书均引入本文为参考。可在这些载体或稀释剂中使用的组分的优选实例包括但不仅限于水、盐水、磷酸盐、羧酸盐、氨基酸溶液、Ringer溶液、葡萄糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水性载体如不挥发油。
将本发明的药物组合物配制为与其预期给药途径相容。给药途径的实例包括胃肠外如静脉内、皮内、皮下、经口(如吸入)、经皮(局部)、经粘膜和直肠给药。用于胃肠外、皮内或皮下应用的溶液或混悬液可以包括以下组分：无菌稀释剂如注射用水、盐水溶液、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂如乙二胺四乙酸；缓冲液如乙酸、柠檬酸或磷酸以及用于调整张力的物质如氯化钠或葡萄糖。可以用酸或碱调整pH，如盐酸或氢氧化钠。胃肠外制品可以包装在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多剂量管中。
就吸入给药而言，化合物以气溶胶喷雾的形式由加压容器或含有适当的推进剂(如气体如二氧化碳)的分配器或喷雾器中递送。
还可以通过经粘膜或经皮方式全身给药。对于经粘膜或经皮给药，在制剂中使用适用于待渗透屏蔽的渗透剂。这类渗透剂为本领域所共知，包括如用于经粘膜给药的去污剂、胆盐和夫西地酸衍生物。可以通过使用鼻腔喷雾或栓剂实现经粘膜给药。对于经皮给药，将活性化合物配制为软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂中，如本领域所共知。
还可以以用于直肠递药的栓剂(如用常规栓剂基质如可可脂及其他甘油酯)或保留灌肠剂的形式制备化合物。
可以制备缓释制剂。合适的缓释制剂的实例包括含有抗体的固体疏水聚合物的半透性基质，所述基质为有形物品如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括多元酯、水凝胶(例如聚甲基丙烯酸-2-羟乙酯或聚乙烯醇)、聚乳酸(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRCN DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的注射用微球)以及聚-D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乙酸-乙醇酸使分子释放超过100天，而某些水凝胶在较短的时间段中释放药物活性成分。
已经使用人生长激素(rhGH)、干扰素-(rhIFN-)、白细胞介素-2和MN rgpl20成功实现了用于缓释的重组蛋白微囊化。Johnson等，Nat Med.2：795-799(1996)；Yasuda，Biomed.Ther.，27：1221-1223(1993)；Hora等，Bio/Technology，8：755-758(1990)；Cleland，“Design and Production ofSingle Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide MicrosphereSystems”，Vaccine Design：The Subunit and Adjuvant Approach，Powell和Newman编辑，(Plenum Press：New York.1995)，439-462页；WO 97/03692，WO 96/40072，WO 96/7399和美国专利No.5,654,010。
本发明的核酸分子可以插入载体并作为基因治疗载体使用。基因治疗载体可以包括反义多核苷酸和抑制性多核苷酸，包括microRNA(miRNA)、修饰的miRNA、小抑制性RNA(siRNA)和修饰的siRNA，其中如本发明所述引入修饰以至少赋予分子稳定性。在基因治疗的一个实施方案中，TORC核酸是在受试者中表达TORC蛋白或其片段或嵌合蛋白的表达载体的一部分。具体地，这样的核酸具有与TORC编码区有效连接的启动子，所述启动子为诱导型或组成型以及任选地为组织特异性。在另一具体实施方案中，使用这样的核酸分子：其中TORC编码序列和任何其他目的序列的侧翼为促进在基因组期望位点同源重组的区域，从而提供TORC核酸的染色体内表述(Koller和Smithies，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：8932-8935；Zijlstra等，1989，Nature 342：435-438)。
可以通过大量途径中的任一种将基因治疗载体递送至受试者，如美国专利No.5,703,055所述，将其构建为适当的核酸表达载体的一部分并施用，从而使其进入胞内，如通过施用缺陷型或减毒逆转录病毒或其他表达载体进行感染(参阅如美国专利No.4,980,286和下文提到的其他专利)或通过裸DNA直接注射或通过使用微粒轰击(如基因枪；生物射弹，Dupont)或用脂质或细胞表面受体或转染剂包衣、包裹在脂质体、微粒或微胶囊中或通过与已知入核的肽结合施用、通过与经受受体介导的胞吞作用的配体结合施用(参阅如美国专利No.5,166,320；5,728,399；5,874,297和6,030,954，均以其整体引入本文为参考)(可用于靶向特异性表达受体的细胞类型)等。因此递送可包括例如静脉内注射、局部给药(参阅美国专利No.5,328,470)或立体定位注射(参阅Chen等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：3054-3057)。基因治疗载体的药物制品可以包括处于可用稀释剂中的基因治疗载体，或者可以包含包埋基因递送载体的缓释基质。或者，当重组细胞可以产生完整的基因递送载体(如逆转录病毒载体)时，药物制品可以包含一种或多种产生基因递送系统的细胞。
在替代实施方案中，可以使用逆转录病毒载体(参阅如美国专利No.5,219,740、5,604,090和5,834,182)。这些逆转录病毒载体已经被修饰以缺失包装病毒基因组和整合进宿主细胞DNA中不必要的逆转录病毒序列。将待用于基因治疗的TORC核酸克隆进便于将基因递送给患者的载体。
腺病毒是基因治疗中可以使用的另一种病毒载体。在将基因递送至呼吸上皮时腺病毒是特别有利的载体。腺病毒天然感染呼吸上皮，引起轻微的疾病。基于腺病毒的递送系统的其他靶标为肝、中枢神经系统、内皮细胞和肌肉。腺病毒具有能够感染不分裂细胞的优势。进行基于腺病毒的基因治疗的方法描述于例如美国专利No.5,824,544、5,868,040、5,871,722、5,880,102、5,882,877、5,885,808、5,932,210、5,981,225、5,994,106、5,994,132、5,994,134、6,001,557和6,033,8843，所述文献均以其整体引入本文为参考。
还已提出将腺相关病毒(AAV)用于基因治疗。生产和使用AAV的方法描述于例如美国专利No.5,173,414、5,252,479、5,552,311、5,658,785、5,763,416、5,773,289、5,843,742、5,869,040、5,942,496和5,948,675，所述文献均以其整体引入本文为参考。
基因治疗的另一方法涉及通过诸如电穿孔、脂转染、磷酸钙介导的转染或病毒感染的方法将基因转移至组织培养物中的细胞。转移方法通常包括将可选择标记转移进细胞。接着将细胞置于选择压力下，以分离摄取并表达转移基因的细胞。接着将这些细胞递送给患者。在优选的实施方案中，用于基因治疗的细胞是患者自体的细胞。
本发明的药物组合物的剂量和期望的药物浓度可以取决于具体的用途而变化。确定适当的剂量或给药途径在普通医师的能力之内。动物实验为确定人治疗的有效剂量提供了可靠的指导。可以按照Mordenti，J.和Chappell，W.“The use of interspecies scaling in toxicokinetics”，Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等编辑，PergamonPress，New York 1989，42-96页规定的原则进行有效剂量的物种间缩放。
在体内施用TORC多肽或其激动剂或拮抗剂时，取决于给药途径，正常剂量可以在每天约10ng/kg至100mg/kg哺乳动物体重之间变化，优选约1.mu.g/kg/天至10mg/kg/天。文献中提供了关于具体剂量和递送方法的指导，参阅如美国专利No.4,657,760、5,206,344或5,225,212。应该理解，不同的制剂对不同的治疗化合物和不同的紊乱有效，例如，靶向一种器官或组织的给药可能需要以与靶向其他器官或组织不同的方式递送。可以配制化合物及其生理可用盐和溶剂化物用于通过吸入或吹入(通过口或鼻)或局部、经口、口腔、胃肠外或直肠给药。
就经口给药而言，药物组合物可以是例如片剂或胶囊剂的形式，所述片剂或胶囊剂使用可药用赋形剂如粘合剂(如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)、填充剂(如乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)、润滑剂(如硬脂酸镁、滑石或硅)、崩解剂(如马铃薯淀粉或羟乙酸淀粉钠)或湿润剂(如十二烷基硫酸钠)通过常规方法制备。可以通过本领域已知的方法包衣片剂。用于经口给药的液体制品可以是例如溶液、糖浆剂或混悬剂的形式，或者它们可以以干产品的形式出现，在使用前与水或其他合适的载体重构。可以使用可药用添加剂如悬浮剂(如山梨糖醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)、乳化剂(如卵磷脂或阿拉伯胶)、非水性载体(如杏仁油、油酯类、乙醇或分级植物油)和防腐剂(如对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸甲酯或山梨酸)通过常规方法制备这样的液体制品。制品还可以适当地含有缓冲盐、调味剂、着色剂和甜味剂。
可以适当地配制用于经口给药的制剂，以提供活性化合物的控释。
对于口腔给药，组合物可以是以常规方式制备的片剂或锭剂形式。
对于吸入给药，以来自增压包或喷雾器的气溶胶喷雾的形式便利地递送根据本发明使用的化合物，其中使用合适的推进剂，如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合适的气体。在增压气雾剂的情况下，可以通过提供递送计定量的阀门来确定剂量单位。用于吸入器或吹入器的胶囊或药筒(如明胶的)可以制备为含有化合物的粉剂混合物和合适的粉剂基质如乳糖或淀粉。
可以将化合物配制为用于通过注射(如推注或连续输注)进行胃肠外给药。注射用制剂可以以单位剂量形式(如安瓿)或带有防腐剂的多剂量容器出现。组合物可以为以下形式，如油性或水性载体中的混悬剂、溶液或乳剂，并且可以含有配制剂如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。或者，活性成分可以是在使用前与合适的载体(如无菌无热原水)重构的粉剂形式。
化合物还可以配制成直肠组合物如栓剂或保留灌肠剂，例如含有常规栓剂基质如可可脂或其他甘油酯。
除了上述剂型以外，化合物还可以配制为贮藏制品。这些长效制剂可以通过植入(如皮下或肌内)或通过肌内注射给药。因此，化合物可以与合适的聚合物或疏水材料(例如作为可用油中的乳剂)或者离子交换树脂一起配制或配制为微溶衍生物(如作为微溶盐)。
需要时，组合物可以以含有一个或多个单位剂量形式活性成分的包装或分配装置的形式出现。包装可以包含例如金属或塑料箔，例如水泡眼包装。包装或分配装置可以含有给药说明书。
适用于本发明的药物组合物包括这样的组合物：其中包含有效剂量的活性成分，以实现预期目的。有效剂量的确定在本领域技术人员的能力之内。
对于任何化合物，首先可以在细胞培养测定(如癌细胞)或动物模型(通常为小鼠、兔、狗或猪)中估计治疗有效剂量。动物模型还可用于确定适当的浓度范围和给药途径。可以在动物模型中配制剂量，以获得包括IC50(即测试化合物对症状实现半数最大抑制的浓度)的循环血浆浓度范围。接着可以使用这些信息确定用于人给药的剂量和给药途径。
治疗有效剂量指用于预防、治疗或改善特定的目的病理疾病的有效成分的量。可以在细胞培养物或实验动物中通过标准操作确定有效剂量和毒性，如ED50(在50％群体中具有疗效的剂量)和LD50(对50％群体致死的剂量)。毒效应与疗效之间的剂量比为治疗指数，可以表示为比例LD50/ED50。优选显示高治疗指数的药物组合物。使用得自细胞培养物测定和动物研究的数据配制用于人的剂量范围。这些组合物中含有的剂量优选在包括ED50而没有或几乎没有毒性的循环浓度范围内。取决于使用的剂型、患者的敏感性和给药途径，剂量可以在该范围内变化。
具体的剂量可以由从业医师考虑需要治疗的受试者的相关因素来确定。调整剂量和给药以提供足够水平的活性部分或维持所需的效应。可能考虑的因素包括疾病状态的严重程度、受试者的总体健康程度、受试者的年龄、体重和性别、饮食、给药时间和频率、药物组合、反应敏感性和对疗法的耐受性/反应性。可以每3至4天、每周或每两周一次施用长效药物组合物，取决于具体制剂的半衰期和清除率。
取决于给药途径，正常剂量可以在0.1至100,000微克、上至约1g之间变化。文献中提供了关于具体剂量和递送方法的指导，并且是本领域的从业医师普遍可获得的。对于核苷酸，本领域技术人员将使用与蛋白质或其抑制剂不同的剂型。类似的，多核苷酸或多肽的递送对于具体的细胞、条件、位置等要具体对待。适用于蛋白质经口给药的药物剂型描述于例如美国专利5,008,114、5,505,962、5,641,515、5,681,811、5,700,486、5,766,633、5,792,451、5,853,748、5,972,387、5,976,569和6,051,561。
本发明的其他用途和方法
本文描述的核酸分子、蛋白质、蛋白质同源物和抗体可用于一种或多种以下方法：(a)筛选测定；(b)预测医学(如诊断测定、预后测定、监测临床试验和药物基因组学)以及(c)治疗方法(如治疗和预防)。
筛选测定
本发明提供用于鉴定调节剂的“筛选测定”，所述调节剂即与TORC蛋白结合或者对例如TORC蛋白表达或TORC蛋白活性具有刺激或抑制效应的候选或测试化合物或物质(如蛋白质、多肽、核酸或多核苷酸、肽、肽模拟物、小分子包括激动剂或拮抗剂、或其他药物)。可以利用任一所述测定以及药理学、血液学、内科学、肿瘤学等领域从业医师已知的其他测定，以筛选候选物质作为治疗剂的特性。已经指出，本发明的治疗剂包括蛋白质、多肽、核酸或多核苷酸、肽、肽模拟物、小分子包括激动剂或拮抗剂、或本文所述其他药物。
在一个实施方案中，本发明提供用于筛选结合或调控TORC蛋白或多肽或其生物活性部分的筛选或测试化合物的方法。可以使用本领域已知的组合文库法多种方法中的任一种获得本发明的测试化合物，包括生物文库、空间可寻址的平行固相或液相文库、需要去褶合的合成文库法、“一珠一化合物”文库法和使用亲和层析选择的合成文库法。生物文库法限于肽文库，而其他四种方法可用于肽、非肽寡聚物或小分子化合物文库(Lam(1997)Anticancer Drug Des 12：145)。
用于合成分子文库的方法实例可见于本领域，例如DeWitt等(1993)Proc Natl Acad Sci U.S.A.90：6909；Erb等(1994)Proc Natl Acad Sci U.S.A.91：11422；Zuckermann等(1994)J Med Chem 37：2678；Cho等(1993)Science 261：1303；Carrell等(1994)Angew Chem Int Ed Engl 33：2059；Carell等(1994)Angew Chem Int Ed Engl 33：2061和Gallop等(1994)JMed Chem 37：1233。
化合物文库可以呈现于溶液(如Houghten(1992)Biotechniques13：412-421)或珠子(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片(Fodor(1993)Nature 364：555-556)、细菌(Ladner美国专利No.5,223,409)、孢子(LadnerUSP′409)、质粒(Cull等(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)或噬菌体(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390；Devlin(1990)Science249：404-406；Cwirla等(1990)Proc Natl Acad Sci U.S.A.87：6378-6382；Felici(1991)JMolBiol 222：301-310；Ladner，见上文)上。
在重要的实施方案中，基于细胞的测定包括使用转染细胞，所述转染细胞产生标记的来自异源TORC多核苷酸的TORC蛋白。通过检查标记TORC的亚细胞分布来评估可以测试效率的候选活性物质应用(见实施例)。
在另一个实施方案中，测定为基于细胞的测定，其中使在细胞表面表达膜结合形式TORC蛋白或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物与TORC蛋白结合的能力。细胞可以是例如哺乳动物来源或是酵母细胞。可以通过如以下方法测定测试化合物与TORC蛋白的结合：将测试化合物与放射性同位素或酶标记偶联，从而可以通过检测复合物中标记的化合物来测定测试化合物与TORC蛋白或其生物活性部分的结合。例如，可以用125I、35S、14C或3H直接或间接标记测试化合物，并通过直接计数放射性发射或通过闪烁计数检测放射性同位素。或者，可以用例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶或荧光素酶来酶标记测试化合物，并通过测定适当底物至产物的转化来检测酶标记。
在另一实施方案中，测定为基于细胞的测定，包括使在细胞表面表达膜结合形式TORC蛋白或其生物活性部分的细胞与测试化合物接触，并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)TORC蛋白或其生物活性部分的活性的能力。可以通过例如测定TORC蛋白与TORC蛋白靶分子结合或相互作用的能力来测定测试化合物调节TORC蛋白或其生物活性部分的活性的能力。在一个实施方案中，TORC蛋白靶分子是信号转导途径的组分，所述信号转导途径促进胞外信号(如通过化合物与膜结合TORC蛋白分子的结合产生的信号)转导通过细胞膜并进入细胞。靶标可以是例如具有催化活性的第二胞内蛋白或促进信号传导分子与TORC蛋白结合的蛋白。
可以通过用于测定直接结合的上述方法之一实现对TORC蛋白与TORC蛋白靶分子结合或相互作用的能力的测定。在一个实施方案中，可以通过测定靶分子的活性实现对TORC蛋白与TORC蛋白靶分子结合或相互作用的能力的测定。例如，可以通过以下方法测定靶分子的活性：检测靶标对胞内第二信使的诱导(即胞内Ca2+、二酰基甘油、IP3等)、检测靶标对适当底物的催化/酶促活性、检测对报道基因的诱导(包括与编码可检测标记(如荧光素酶)的核酸有效连接的TORC应答调节元件)、或检测细胞应答，例如细胞存活、细胞分化或细胞增殖。
又在另一个实施方案中，本发明的测定是无细胞测定，包括使TORC蛋白或其生物活性部分与测试化合物接触，并测定测试化合物与TORC蛋白或其生物活性部分结合的能力。可以如上述直接或间接测定测试化合物与TORC蛋白的结合。在一个实施方案中，测定包括使TORC蛋白或其生物活性部分与已知结合TORC蛋白的化合物接触以形成测定混合物、使测定混合物与测试化合物接触，并测定测试化合物与TORC蛋白相互作用的能力，其中测定测试化合物与TORC蛋白相互作用的能力包括测定测试化合物与已知化合物相比优先与TORC蛋白或其生物活性部分结合的能力。
在另一实施方案中，测定为无细胞测定，包括使TORC蛋白或其生物活性部分与与测试化合物接触，并测定测试化合物调节(如刺激或抑制)TORC蛋白或其生物活性部分的活性的能力。可以通过上述测定直接结合的方法之一测定TORC蛋白与TORC蛋白靶分子结合的能力来测定测试化合物调节TORC蛋白活性的能力。在备选实施方案中，可以通过测定TORC蛋白进一步调节TORC蛋白靶分子的能力来实现测定测试化合物调节TORC蛋白活性的能力。例如，可以如上述测定靶分子对适当底物的催化/酶促活性。
又在另一实施方案中，无细胞测定包括使TORC蛋白或其生物活性部分与已知结合TORC蛋白的化合物接触以形成测定混合物、使测定混合物与测试化合物接触，并测定测试化合物与TORC蛋白相互作用的能力，其中测定测试化合物与TORC蛋白相互作用的能力包括测定TORC蛋白与TORC蛋白靶分子优先结合或调节TORC蛋白靶分子活性的能力。
在上述本发明测定方法的多于一个实施方案中，可能需要固定TORC蛋白或其靶分子，以便于从一种或两种蛋白质的非复合形式中分离复合形式以及实现测定的自动化。可以在适于容纳反应物的任何容器中实现存在或不存在候选化合物情况下测试化合物与TORC蛋白的结合或TORC蛋白与靶分子的相互作用。这些容器的实例包括微孔板、试管和微量离心管。在一个实施方案中，可以提供添加了允许一种或两种蛋白与基质结合的结构域的融合蛋白。
用于将蛋白质固定在基质上的其他技术也可以用于本发明的筛选测定。例如，可以使用缀合生物素和链霉抗生物素蛋白来固定TORC蛋白或其靶分子。可以使用本领域熟知的技术(如生物素化试剂盒，PierceChemicals，Rockford，Ill.)由生物素-NHS(N-羟基-琥珀酰亚胺)制备生物素化的TORC蛋白或靶分子，并固定在用链霉抗生物素蛋白包被的96孔板(Pierce Chemical)中。或者，可以在平板的孔中衍生与TORC蛋白或靶分子反应但不干扰TORC蛋白与其靶分子结合的抗体，未结合的靶标或TORC通过抗体缀合而留在孔中。除了上文所述用于GST固定复合物的方法以外，用于检测这类复合物的方法包括使用与TORC蛋白或靶分子反应的抗体进行复合物的免疫检测，以及依赖于检测与TORC蛋白或靶分子相关的酶活性的酶联试验。
在另一方面，在这样的方法中鉴定CREB促进过程的调节剂：使细胞与候选化合物接触并测定细胞中TORC mRNA或蛋白的表达。将存在候选化合物时TORC mRNA或蛋白的表达水平与不存在候选化合物时TORC mRNA或蛋白的表达水平相比较。接着可以将候选化合物鉴定为TORC表达的调节剂和/或CREB促进过程的调节剂。例如，若存在候选化合物时TORC mRNA或蛋白的表达高于(统计学意义地高于)不存在候选化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为TORC mRNA或蛋白表达的刺激剂。或者，若存在候选化合物时TORC mRNA或蛋白的表达低于(统计学意义地低于)不存在候选化合物时的表达，则候选化合物被鉴定为TORC mRNA或蛋白表达的抑制剂。可以通过本文所述检测CREB促进过程或TORC mRNA或蛋白的调节剂的方法来测定细胞中TORCmRNA或蛋白的表达水平。
又在本发明的另一实施方案中，TORC蛋白可以在双杂交测定或三杂交测定中用作“诱饵蛋白”(参阅如美国专利No.5,283,317；Zervos等(1993)Cell 72：223-232；Madura等(1993)J Biol Chem 268：12046-12054；Bartel等(1993)Biotechniques 14：920-924；Iwabuchi等(1993)Oncogene8：1693-1696和Brent WO 94/10300)，以鉴定与TORC蛋白结合或相互作用(“TORC蛋白结合蛋白”或“TORC蛋白-bp”)并调节TORC蛋白活性的其他蛋白质。这些TORC蛋白结合蛋白也可能作为如TORC蛋白途径的上游或下游元件参与TORC蛋白信号的传播。
双杂交系统基于大多数转录因子的组件性质，其由分开的DNA结合结构域和激活结构域组成。简言之，该测定使用两种不同的DNA构建体。在一个构建体中，编码TORC蛋白的基因与编码已知转录因子(如GAL-4)的DNA结合结构域的基因融合。在另一构建体中，将来自DNA序列文库的编码未鉴定蛋白(“猎物”或“样品”)的DNA序列与编码已知转录因子激活结构域的基因融合。如果“诱饵”与“猎物”蛋白能够在体内相互作用，形成TORC蛋白依赖性复合物，则转录因子的DNA结合和激活结构域互相接近。这种接近使与应答于该转录因子的转录调节位点有效连接的报道基因(如LacZ)转录。可以检测报道基因的表达，并分离含有功能性转录因子的细胞集落，并用于获得编码与TORC蛋白相互作用的蛋白质的克隆基因。
还可以体内进行筛选。例如，在一个实施方案中，本发明包括通过施用测试化合物筛选调节剂的方法，所述调节剂在TORC蛋白相关疾病中具有活性或为其潜在因素或对其易感，或者在患TORC相关疾病风险增高的测试动物中具有活性或为其潜在因素或对其易感。在一些实施方案中，测试动物重组表达TORC多肽。测量施用化合物后测试动物中多肽的活性，并将测试动物中蛋白质的活性与未施用所述多肽的对照动物中该多肽的活性比较。所述测试动物中所述多肽活性相对于对照动物的改变表示测试化合物是TORC相关疾病的潜在因素或对其易感的调节剂。
在一些实施方案中，测试动物是重组测试动物，所述重组测试动物以相对于野生型测试动物提高的水平表达测试蛋白转基因或表达启动子控制下的转基因。优选地，启动子不是转基因的天然基因启动子。
本发明还涉及通过上述筛选测定鉴定的新物质及其用于本文所述治疗的用途。
预测医学
本发明还涉及预测医学领域，其中将诊断测定、预后测定、药物基因组学和监测临床试验用于预后(预测)目的，从而预防性地治疗个体。因此，本发明的一个方面涉及诊断测定，以测定生物样品(如血、血清、细胞、组织)中CREB启动过程或TORC蛋白和/或核酸表达以及TORC蛋白活性的调节剂，从而确定个体是否患有与异常TORC表达或活性相关的疾病或病症或有患病风险。本发明还提供用于确定个体是否有发生TORC蛋白、核酸表达或活性相关病症的诊断(或预测)测定。例如，可以测定生物样品中TORC基因的突变。这样的测定可用于诊断或预测目的，从而在病症发生前预防性治疗个体，所述病症以TORC蛋白、核酸表达或活性为特征或与之相关。
诊断测定
对应于SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5的TORC核酸中任一部分的多核苷酸或寡核苷酸可用于检测含有相应ORF基因的DNA，或者检测相应TORC基因或TORC蛋白样基因的表达。例如，可以使用在特定细胞或组织中表达的TORC核酸来鉴定该特定细胞类型的存在。
用于检测CREB启动过程决定性调节剂或生物样品中TORC的存在或不存在的示例方法包括从测试受试者中获得生物学样品并将该生物学样品与化合物或物质接触，从而检测生物样品中TORC蛋白的存在，所述化合物或物质能够检测TORC蛋白或编码TORC蛋白的核酸(例如mRNA、基因组DNA)。用于检测TORC mRNA或基因组DNA的物质为能够与TORC mRNA或基因组DNA杂交的标记的核酸探针。核酸探针可以是例如全长TORC核酸(例如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5核酸)或其部分(如至少15、30、50、100、250或500个核苷酸长度并足够与如上所述的TORC mRNA或基因组DNA在严格条件下特异性杂交的寡核苷酸)。用于本发明诊断测定的其他合适探针在本文中描述。
用于检测TORC蛋白的物质为能够结合TORC蛋白的抗体，优选为带有可检测标记的抗体。抗体可以是多克隆抗体，或更优选单克隆抗体。可使用完整抗体或其片段(例如Fab或F(ab′)2)。术语“标记的”涉及探针或抗体时旨在包括通过将可检测物质偶联(即物理连接)至探针或抗体上的直接标记探针或抗体，以及通过与另一直接标记的试剂反应而间接标记探针或抗体。间接标记的实例包括使用荧光标记的二抗和用生物素末端标记的DNA探针检测一抗，从而其可用荧光标记的链霉抗生物素蛋白进行检测。术语“生物样品”旨在包括从受试者中分离的组织、细胞和生物学流体，以及存在于受试者中的组织、细胞和流体。即可使用本发明的方法检测体外和体内生物学样品TORC mRNA、蛋白质或基因组DNA。例如，用于检测TORC mRNA的体外技术包括Northern杂交和原位杂交。用于检测TORC蛋白的体外技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、Western印迹、免疫沉淀和免疫荧光法。用于检测TORC基因组DNA的体外技术包括Southern杂交。另外，用于检测TORC蛋白的体内技术包括向受试者中引入标记的抗TORC蛋白抗体。例如，可用放射性标记物标记抗体，所述放射性标记物的存在和定位可通过标准成像技术检测。
本发明还包括用于检测生物样品中CREB启动过程的决定性调节剂或TORC存在的试剂盒。例如，所述试剂盒可包含：能够检测生物样品中CREB启动过程的决定性调节剂或TORC蛋白或mRNA存在的标记的化合物或物质；用于确定样品中TORC量的部件(means)和用于将样品中TORC量与标准比较的部件。所述化合物或物质可包装在合适的容器中。试剂盒还可包含使用该试剂盒检测TORC蛋白或核酸的说明书。
预后测定
本文描述的诊断方法还可用于鉴定患有或有发生与异常TORC表达或活性相关疾病或紊乱风险的受试者。例如，本文描述的测定法，如先前的诊断测定或随后的测定，可用于鉴定患有或具有发生与异常TORC蛋白、核酸表达或活性相关疾病风险的受试者。
此外，本文描述的预后测定可用于确定是否受试者可以用药(例如激动剂、拮抗剂、肽模拟物、蛋白质、肽、核酸、小分子或其他候选药物)治疗与异常TORC表达或活性相关的疾病或紊乱。例如，这类方法可用于确定是否患者能够用针对疾病(例如增生性紊乱、分化障碍、神经胶质相关紊乱等)的物质有效治疗。因此，本发明提供用于确定是否受试者能够用物质有效治疗的方法，所述物质针对与异常TORC表达或活性相关的疾病，在所述方法中获得测试样品并检测TORC蛋白或核酸(例如其中TORC蛋白或核酸的存在可诊断受试者能够施用治疗与异常TORC表达或活性相关疾病的物质)。
本发明的方法还可用于检测调节TORC表达和活性的TORC基因中的遗传损伤，从而确定是否带有损伤基因的受试者具有风险或患有增生性紊乱、分化障碍、神经胶质相关紊乱等。在多个实施方案中，所述方法包括在来自受试者的样品中检测遗传损伤的存在或不存在，所述损伤表征为至少一个影响编码TORC蛋白的基因的完整性的改变，或TORC基因的错误表达。
监测临床效力
监测物质(例如药物、化合物)对TORC表达或活性的影响可应用于临床试验。例如，通过本文所述筛选测定确定的物质提高TORC基因表达、蛋白质水平，或促进TORC生物功能的效力可在显示降低的TORC基因表达、蛋白质水平或下调的TORC活性的受试者临床试验中监测。另外，通过筛选测定确定的物质降低TORC基因表达、蛋白质水平或抑制TORC生物功能的效力可在显示提高的TORC基因表达、蛋白质水平或上调的TORC活性的受试者的临床试验中监测。在这类临床试验中，TORC和优选的其他基因(涉及例如增生或神经紊乱)的表达或活性可用作特定细胞应答性的“读出”或标记物。这类方法包括评价TORC亚细胞定位，或测定TORC的CREB共激活活性。
治疗方法
本发明提供治疗有患病风险(或易患病的)或患有与异常TORC表达或活性相关疾病的受试者的预防和治疗方法。
表征为提高(相对于未患有疾病或病症的受试者)水平或生物活性的疾病和病症可用拮抗(即降低或抑制)活性的疗法治疗。拮抗活性的疗法可以以治疗或预防的方式进行。可使用的疗法包括(但不仅限于)(i)TORC多肽，或其衍生物、片段或同源物；(ii)TORC多肽抗体；(iii)编码TORC肽的核酸；(iv)施用反义或siRNA TORC核酸；或(v)改变TORC肽及其结合配偶体之间相互作用的调节剂(即抑制剂、激动剂和拮抗剂，包括其他本发明的肽模拟物或对本发明肽特异的抗体)。
表征为降低(相对于未患有疾病或病症的受试者)水平或生物活性的疾病或病症可用提高(即促进)活性的疗法治疗。上调活性的疗法可以以治疗或预防方式进行。可以使用的疗法包括(但不仅限于)TORC肽或其类似物、衍生物片段或同源物；或提高生物利用率的激动剂。
本发明一方面提供通过向受试者施用调节TORC表达或至少一种TORC活性的物质预防受试者与TORC表达或活性相关的疾病或病症。有风险患有异常TORC表达或活性引起或促成的疾病的受试者可通过例如如本文所述的诊断或预后测定的任何组合鉴定。预防药的施用可在TORC异常的特征症状出现之前进行，从而预防疾病或病症，或可选地延迟其进展。根据TORC异常的类型，可使用例如TORC激动剂或TORC拮抗剂用于治疗受试者。适当的物质可根据本文所述筛选测定确定。
本发明另一方面涉及调节TORC表达或活性用于治疗目的的方法。本发明的调节方法涉及将细胞与物质接触，所述物质调节一种或多种与该细胞相关的TORC蛋白活性的活性。调节TORC蛋白活性的物质可以是本文所述的物质，例如核酸或蛋白质、TORC蛋白天然存在的同源配体、肽、TORC肽模拟物或其他小分子。
TORC多核苷酸和多肽
本发明公开了TORC多核苷酸及其编码的多肽。可如Iourgenko等(2003)和(年，月，日)提交的美国临时申请No.xx/xxx，xxx所述，分离、表征并制备TORC多核苷酸。编码人TORC1(GenBank登录号AY360171)的多核苷酸见表1。
表1
  1  aggaggagga ggtggcggcg agaagatggc gacttcgaac aatccgcgga aattcagcga
  61 gaagatcgcg ctgcacaatc agaagcaggc ggaggagacg gcggccttcg aggaggtcat
 121 gaaggacctg agcctgacgc gggccgcgcg gctccagctc cagaaatccc agtacctgca
 181 actgggcccc agccgaggcc agtactatgg cgggtccctg cccaacgtga accagatcgg
 241 gagtggcacc atggacctgc ccttccagcc cagcggattt ctgggggagg ccctggcagc
 301 ggctcctgtc tctctgaccc ccttccaatc ctcgggcctg gacaccagcc ggaccacccg
 361 gcaccatggg ctggtggaca gggtgtaccg ggagcgtggc cggctcggct ccccacaccg
 421 ccggcccctg tcagtggaca aacacggacg gcaggccgac agctgcccct atggcaccat
 481 gtacctctca ccacccgcgg acaccagctg gagaaggacc aattctgact ccgccctgca
 541 ccagagcaca atgacgccca cgcagccaga atcctttagc agtgggtccc aggacgtgca
 601 ccagaaaaga gtcttactgt taacagtccc aggaatggaa gagaccacat cagaggcaga
 661 caaaaacctt tccaagcaag catgggacac caagaagacg gggtccaggc ccaagtcctg
 721 tgaggtcccc ggaatcaaca tcttcccgtc tgccgaccag gaaaacacta cagccctgat
 781 ccccgccacc cacaacacag gggggtccct gcccgacctg accaacatcc acttcccctc
 841 cccgctcccg accccgctgg accccgagga gcccaccttc cctgcactga gcagctccag
 901 cagcaccggc aacctcgcgg ccaacctgac gcacctgggc atcggtggcg ccggccaggg
 961 aatgagcaca cctggctcct ctccacagca ccgcccagct ggcgtcagcc ccctgtccct
1021 gagcacagag gcaaggcgtc agcaggcatc gcccaccctg tccccgctgt cacccatcac
1081 tcaggctgta gccatggacg ccctgtctct ggagcagcag ctgccctacg ccttcttcac
1141 ccaggcgggc tcccagcagc caccgccgca gccccagccc ccgccgcctc ctccacccgc
1201 gtcccagcag ccaccacccc cgccaccccc acaggcgccc gtccgcctgc cccctggtgg
1261 ccccctgttg cccagcgcca gcctgactcg tgggccacag ccgcccccgc ttgcagtcac
1321 ggtaccgtcc tctctccccc agtccccccc agagaaccct ggccagccat cgatggggat
1381 cgacatcgcc tcggcgccgg ctctgcagca gtaccgcact agcgccggct ccccggccaa
1441 ccagtctccc acctcgccag tctccaatca aggcttctcc ccagggagct ccccgcaaca
1501 cacttccacc ctgggcagcg tgtttgggga cgcgtactat gagcagcaga tggcggccag
1561 gcaggccaat gctctgtccc accagctgga gcagttcaac atgatggaga acgccatcag
1621 ctccagcagc ctgtacagcc cgggctccac actcaactac tcgcaggcgg ccatgatggg
1681 cctcacgggc agccacggga gcctgccgga ctcgcagcaa ctgggatacg ccagccacag
1741 tggcatcccc aacatcatcc tcacagtgac aggagagtcc ccccccagcc tctctaaaga
1801 actgaccagc tctctggccg gggtcggcga cgtcagcttc gactccgaca gccagtttcc
1861 cctggacgaa ctcaagatcg accccctgac cctcgacgga ctgcacatgc tcaacgaccc
1921 cgacatggtt ctggccgacc cagccaccga ggacaccttc cggatggacc gcctgtgagc
1981 gggcacgccg gcaccctgcc gctcagccgt cccgacggcg cctccccagc ccggggacgg
2041 ccgtgctccg tccctcgcca acggccgagc ttgtgattct gagcttgcaa tgccgccaag
2101 cgccccccgc cagcccgccc ccggttgtcc acctcccgcg aagcccaatc gcgaggccgc
2161 gagccgggcc gtccacccac ccgcccgccc agggctgggc tgggatcgga ggccgtgagc
2221 ctcccgcccc tgcagaccct ccctgcactg gctccctcgc ccccagcccc ggggcctgag
2281 ccgtcccctg taagatgcgg gaagtgtcag ctcccggcgt ggcgggcagg ctcaggggag
2341 gggcgcgcat ggtccgccag ggctgtgggc cgtggcgcat tttccgactg tttgtccagc
2401 tctcactgcc ttccttggtt cccggtcccc cagcccatcc gccatcccca gcccgtggtc
2461 aggtagagag tgagccccac gccgccccag ggaggaggcg ccagagcgcg gggcagacgc
2521 aaagtgaaat aaacactatt ttgacggcaa aaaaaaaaaa aaa
(SEQ ID NO：1)
在表1显示的序列中，编码序列从位置26延伸至位置1978。
根据表1核苷酸序列预测的TORC1蛋白多肽序列见表2(GenBank登录号AAQ98856.1)。
表2
  1 matsnnprkf sekialhnqk qaeetaafee vmkdlsltra arlqlqksqy lqlgpsrgqy
 61 yggslpnvnq igsgtmdlpf qpsgflgeal aaapvsltpf qssgldtsrt trhhglvdrv
121 yrergrlgsp hrrplsvdkh grqadscpyg tmylsppadt swrrtnsdsa lhqstmtptq
181 pesfssgsqd vhqkrvlllt vpgmeettse adknlskqaw dtkktgsrpk scevpginif
241 psadqentta lipathntgg slpdltnihf psplptpldp eeptfpalss ssstgnlaan
301 lthlgiggag qgmstpgssp qhrpagvspl slstearrqq asptlsplsp itqavamdal
361 sleqqlpyaf ftqagsqqpp pqpqpppppp pasqqppppp ppqapvrlpp ggpllpsasl
421 trgpqpppla vtvpsslpqs ppenpgqpsm gidiasapal qqyrtsagsp anqsptspvs
481 nqgfspgssp qhtstlgsvf gdayyeqqma arqanalshq leqfnmmena isssslyspg
541 stlnysqaam mgltgshgsl pdsqqlgyas hsgipniilt vtgesppsls keltsslagv
601 gdvsfdsdsq fpldelkidp ltldglhmln dpdmvladpa tedtfrmdrl
(SEQ ID NO：2)
编码人TORC2(GenBank登录号AY360172)的多核苷酸见表3。
表3
   1 atctaggctg gggccgggtt cgcggtgctc gctgaggcgg cggtggctac ggctggagga
  61 gccgggccga ggccgcggcg gaggccgcgg ctggtactgg gagggtggca gggagggacg
 121 gggaaggaag atggcgacgt cgggggcgaa cgggcctggt tcggccacgg cctcggcttc
 181 caatccgcgc aaatttagtg agaagattgc gctgcagaag cagcgtcagg ccgaggagac
 241 ggcggccttc gaggaggtga tgatggacat cggctccacc cggttacagg cccaaaaact
 301 gcgactggca tacacaagga gctctcatta tggtgggtct ctgcccaatg ttaaccagat
 361 tggctctggc ctggccgagt tccagagccc cctccactca cctttggatt catctcggag
 421 cactcggcac catgggctgg tggaacgggt gcagcgagat cctcgaagaa tggtgtcccc
 481 acttcgccga tacacccgcc acattgacag ctctccctat agtcctgcct acttatctcc
 541 tcccccagag tctagctggc gaaggacgat ggcctggggc aatttccctg cagagaaggg
 601 gcagttgttt cgactaccat ctgcacttaa caggacaagc tctgactctg cccttcatac
 661 aagtgtgatg aaccccagtc cccaggatac ctacccaggc cccacacctc ccagcatcct
 721 gcccagccga cgtgggggta ttctggatgg tgaaatggac cccaaagtac ctgctattga
 781 ggagaacttg ctagatgaca agcatttgct gaagccatgg gatgctaaga agctatcctc
 841 atcctcttcc cgacctcggt cctgtgaagt ccctggaatt aacatctttc catctcctga
 901 ccagcctgcc aatgtgcctg tcctcccacc tgccatgaac acggggggct ccctacctga
 961 cctcaccaac ctgcactttc ccccaccact gcccaccccc ctggaccctg aagagacagc
1021 ctaccctagc ctgagtgggg gcaacagtac ctccaatttg acccacacca tgactcacct
1081 gggcatcagc agggggcatg ggcctgggcc cggctatgat gcaccaggac ttcattcacc
1141 tctcagccac ccatccctgc agtcctccct aagcaatccc aacctccagg cttccctgag
1201 cagtcctcag ccccagcttc agggctccca cagccacccc tctctgcctg cctcctcctt
1261 ggcctgccat gtactgccca ccacctccct gggccacccc tcactcagtg ctccggctct
1321 ctcctcctcc tcttcctcct cctccacttc atctcctgtt ttgggcgccc cctcttaccc
1381 tgcttctacc cctggggcct ccccccacca ccgccgtgtg cccctcagcc ccctgagttt
1441 gctcgcgggc ccagccgacg ccagaaggtc ccaacagcag ctgcccaaac agttttcgcc
1501 aacaatgtca cccaccttgt cttccatcac tcagggcgtc cccctggata ccagtaaact
1561 gtccactgac cagcggttac ccccctaccc atacagctcc ccaagtctgg ttctgcctac
1621 ccagccccac accccaaagt ctctacagca gccagggctg ccctctcagt cttgttcagt
1681 gcagtcctca ggtgggcagc ccccaggcag gcagtctcat tatgggacac cgtacccacc
1741 tgggcccagt gggcatgggc aacagtctta ccaccggcca atgagtgact tcaacctggg
1801 gaatctggag cagttcagca tggagagccc atcagccagc ctggtgctgg atccccctgg
1861 cttttctgaa gggcctggat ttttaggggg tgaggggcca atgggtggcc cccaggatcc
1921 ccacaccttc aaccaccaga acttgaccca ctgttcccgc catggctcag ggcctaacat
1981 catcctcaca ggggactcct ctccaggttt ctctaaggag attgcagcag ccctggccgg
2041 agtgcctggc tttgaggtgt cagcagctgg attggagcta gggcttgggc tagaagatga
2101 gctgcgcatg gagccactgg gcctggaagg gctaaacatg ctgagtgacc cctgtgccct
2161 gctgcctgat cctgctgtgg aggagtcatt ccgcagtgac cggctccaat gagggcacct
2221 catcaccatc cctcttcttg gccccatccc ccaccaccat tcctttcctc ccttccccct
2281 ggcaggtaga gactctactc tctgtcccca gatcctcttt ctagcatgaa tgaaggatgc
2341 caagaatgag aaaaagcaa
(SEQ ID NO：3)
在表3所示序列中，编码序列从位置131延伸至位置2212。
基于表2的核苷酸序列预测的TORC2蛋白的多肽序列显示在表4中(GenBank登录号AAQ98857.1)
表4
  1 matsgangpg satasasnpr kfsekialqk qrqaeetaaf eevmmdigst rlqaqklrla
 61 ytrsshyggs lpnvnqigsg laefqsplhs pldssrstrh hglvervqrd prrmvsplrr
121 ytrhidsspy spaylspppe sswrrtmawg nfpaekgqlf rlpsalnrts sdsalhtsvm
181 npspqdtypg ptppsilpsr rggildgemd pkvpaieenl lddkhllkpw dakklsssss
241 rprscevpgi nifpspdqpa nvpvlppamn tggslpdltn lhfppplptp ldpeetayps
301 lsggnstsnl thtmthlgis rghgpgpgyd apglhsplsh pslqsslsnp nlqaslsspq
361 pqlqgshshp slpasslach vlpttslghp slsapalsss ssssstsspv lgapsypast
421 pgasphhrrv plsplsllag padarrsqqq lpkqfsptms ptlssitqgv pldtsklstd
481 qrlppypyss pslvlptqph tpkslqqpgl psqscsvqss ggqppgrqsh ygtpyppgps
541 ghgqqsyhrp msdfnlgnle qfsmespsas lvldppgfse gpgflggegp mggpqdphtf
601 nhqnlthcsr hgsgpniilt gdsspgfske iaaalagvpg fevsaaglel glgledelrm
661 eplgleglnm lsdpcallpd paveesfrsd rlq
(SEQ ID NO：4)
编码人TORC3的多核苷酸(GenBank登录号AY360173)见表5。
表5
  1 attcgccatg gccgcctcgc cgggctcggg cagcgccaac ccgcggaagt tcagtgagaa
 61 gatcgcgctg cacacgcaga gacaggccga ggagacgcgg gccttcgagc agctcatgac
121 cgacctcacc ctgtcgcggg ttcaatttca gaagcttcag caactgcgcc ttacacagta
181 ccatggagga tccttaccaa atgtgagcca gctgcggagc aatgcgtcag agtttcagcc
241 gtcatttcac caagctgata atgttcgggg aacccgccat cacgggctgg tggagaggcc
301 atccaggaac cgcttccacc ccctccaccg aaggtctggg gacaagccag ggcgacaatt
361 tgatggtagt gcttttggag ccaattattc ctcacagcct ctggatgaga gttggccaag
421 gcagcagcct ccttggaaag acgaaaagca tcctgggttc aggctgacat ctgcacttaa
481 caggaccaat tctgattctg ctcttcacac gagtgctctg agtaccaagc cccaggaccc
541 ctatggagga gggggccagt cggcctggcc tgccccatac atggggtttt gtgatggtga
 601 gaataatgga catggggaag tagcatcttt ccctggccca ttgaaagaag agaatctgtt
 661 aaatgttcct aagccactgc caaaacaact gtgggagacc aaggagattc agtccctgtc
 721 aggacgccct cgatcctgtg atgttggagg tggcaatgct tttccacata atggtcaaaa
 781 cctaggcctc tcacccttct tggggacttt gaacactgga gggtcattgc cagatctaac
 841 caacctccac tactcgacac ccctgccagc ctccctggac accaccgacc accactttgg
 901 cagtatgagt gtggggaata gtgtgaacaa catcccagct gctatgaccc acctgggtat
 961 aagaagctcc tctggtctcc agagttctcg gagtaacccc tccatccaag ccacgctcaa
1021 taagactgtg ctttcctctt ccttaaataa ccacccacag acatctgttc ccaacgcatc
1081 tgctcttcac ccttcgctcc gtctgttttc ccttagcaac ccatctcttt ccaccacaaa
1141 cctgagcggc ccgtctcgcc gtcggcagcc tcccgtcagc cctctcacgc tttctcctgg
1201 ccctgaagca catcaaggtt tcagcagaca gctgtcttca accagcccac tggccccata
1261 tcctacctcc cagatggtgt cctcagaccg aagccaactt tcctttctgc ccacagaagc
1321 tcaagcccag gtgtcgccgc caccccctta ccctgcaccc caggagctca cccagcccct
1381 cctgcagcag ccccgcgccc ctgaggcccc tgcccagcag ccccaggcag cctcctcact
1441 gccacagtca gactttcagc ttctcccggc ccagggctca tctttgacca acttcttccc
1501 agatgtgggt tttgaccagc agtccatgag gccaggccct gcctttcctc aacaggtgcc
1561 tctggtgcaa caaggttccc gagaactgca ggactctttt catttgagac caagcccgta
1621 ttccaactgc gggagtctcc cgaacaccat cctgccagaa gactccagca ccagcctgtt
1681 caaagacctc aacagtgcgc tggcaggcct gcctgaggtc agcctgaacg tggacactcc
1741 atttccactg gaagaggagc tgcagattga acccctgagc ctggatggac tcaacatgtt
1801 aagtgactcc agcatgggcc tgctggaccc ctctgttgaa gagacgtttc gagctgacag
1861 actgtgaaca gaaggcagtg gaacagaaga atgtttttct gcaacagcca aaatagaatg
1921 gaatagaatg aagccagctg ataccacggg ctttcgttat cttgacatag aaggaagcag
1981 tgccacggct ccagggtttc agatgagatc ccatctcaga cactgtggct tcctccagat
2041 cacacagctt tgtactgcct ctcccgcctg tggccaaagt cgtgttgcag caggcaggct
2101 gcttggagct tcccatgaac tggaaagctc acctccactg catcttttta ctggccatcc
2161 agtcagccga tgtgtaagag taggaaatac tgtgtcactg gaggccctcc gtagcattgg
2221 g
(SEQ ID NO：5)
在表5所示的序列中，编码序列从位置8延伸至位置1867。
根据表3的核苷酸序列推测的TORC3蛋白的多肽序列显示在表6中(GenBank登录号AAQ98858.1)。
表6
  1 maaspgsgsa nprkfsekia lhtqrqaeet rafeqlmtdl tlsrvqfqkl qqlrltqyhg
 61 gslpnvsqlr snasefqpsf hqadnvrgtr hhglverpsr nrfhplhrrs gdkpgrqfdg
121 safganyssq pldeswprqq ppwkdekhpg frltsalnrt nsdsalhtsa lstkpqdpyg
181 gggqsawpap ymgfcdgenn ghgevasfpg plkeenllnv pkplpkqlwe tkeiqslsgr
241 prscdvgggn afphngqnlg lspflgtlnt ggslpdltnl hystplpasl dttdhhfgsm
301 svgnsvnnip aamthlgirs ssglqssrsn psiqatlnkt vlssslnnhp qtsvpnasal
361 hpslrlfsls npslsttnls gpsrrrqppv spltlspgpe ahqgfsrqls stsplapypt
421 sqmvssdrsq lsflpteaqa qvsppppypa pqeltqpllq qprapeapaq qpqaasslpq
481 sdfqllpaqg ssltnffpdv gfdqqsmrpg pafpqqvplv qqgsrelqds fhlrpspysn
541 cgslpntilp edsstslfkd lnsalaglpe vslnvdtpfp leeelqiepl sldglnmlsd
601 ssmglldpsv eetfradrl
(SEQ ID NO：6)
本文和权利要求中使用术语“TORC”多核苷酸、“TORCX多核苷酸”(其中“X”值为1，2或3)和类似的术语和短语通常是指表1、3和5中所示核苷酸序列或其互补物，以及编码多肽的多核苷酸，所述多肽的氨基酸序列与表2、4或6中给出的氨基酸序列至少80％相同，或至少85％相同，或至少90％相同，或至少95％相同，或至少97％相同，或至少98％相同，或至少99％相同；或指本段描述的任何核苷酸序列的片段；或指与本段所述任何核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外，TORC多核苷酸指本段上述多核苷酸，其中上述片段编码多肽的成熟形式。TORC多核苷酸还指该段上述多核苷酸或其互补物，其中编码多肽中的变体氨基酸残基是非关键性的或是保守取代。TORC多核苷酸还指编码融合蛋白的多核苷酸，其中多核苷酸包括本段上述第一TORC多核苷酸和融合至该第一多核苷酸5’或3’末端的编码第二种多肽的第二多核苷酸。
本文和权利要求中使用术语“TORC”多肽、“TORCX多肽”(其中“X”值为1，2或3)和类似的术语和短语通常是指表2、4和6中所示氨基酸序列以及多肽，所述多肽的氨基酸序列与表2、4或6中给出的氨基酸序列或与多肽至少80％相同，或至少85％相同，或至少90％相同，或至少95％相同，或至少97％相同，或至少98％相同，或至少99％相同；或指其氨基序列断为本段描述的任何氨基酸序列的片段的多肽。此外，TORC多肽指本段上述多肽，其中上述片段编码多肽的成熟形式。TORC多肽还指该段上述多肽，其中编码多肽中的变体氨基酸残基是非关键性的或是保守取代。TORC多肽还指编码融合蛋白的多肽，其中多肽包括本段上述第一TORC多肽和融合至第一多肽5’和3’末端的第二多肽的第二多肽。
实施例
材料和方法
下列材料和方法用在下文所述实施例中。
试剂、仪器和培养条件。所有的细胞系在37℃含5％CO2的潮湿培养箱中补充有10％胎牛血清、青霉素/链霉素(Invitrogen#15140-122)和MEM非必需氨基酸(Invitrogen#11140-050)的Dulbecco′s改良的Eagle培养基(Invitrogen，Carisbad，CA#11995-065)上培养。细霉素B、洛诺霉素(ionomycin)、雷帕霉素和环孢素A得自EMD Biosciences Inc.，San DiegoCA。佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸(PMA；Sigma#P3766))、圆弧偶氮酸(Sigma#C1530)、弗司扣林(forskolin)(Sigma#F3917)、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(IBMX)、二丁酰环-AMP(db-cAMP)得自Sigma，St.Louis，MO。异丙肾上腺素(cat#195263)得自MP Biomedicals，Inc.，Irvine，CA。FK506得自Novartis(CGP048123-NX1，Novartis-Basel 81402076)。DNA转染使用Fugene6转染试剂(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)，siRNA转染使用Oligofectamine(Invitrogen#12252-011)按照各自制造商方案进行。细胞暴露于紫外Stratalinker 2400(Stratagene，La Jolla，CA)中1焦耳/cm2的254nm紫外光中。荧光素酶报告基因pCRE-Luc、pNFAT-TA-Luc和pNFKB-Luc得自BD Biosciences，Inc.，San Jose，CA。转运筛选中使用的cDNA集合含有得自诺华研究基金会基因组研究所(Genomics Institute ofthe Novartis Research Foundation)哺乳动物基因组集合(MammalianGenome Collection)(MGC)(可得自美国典型培养物保藏中心，Manassas，VA)的约7,000个全长人和鼠cDNA。
TORC cDNA的核苷酸序列。编码TORC蛋白的核苷酸序列可得自GenBank登录号AY360171(hTORC1)、AY360172(hTORC2)和AY360173(hTORC3)。
质粒构建和病毒生产。FLAG-TORC1表达质粒pCMV-FLAG-TORC1使用下列引物通过PCR扩增人TORC1编码区并将该产物克隆进pFlag-CMV4(Sigma)的HinDIII和BamHI位点产生：
5’-GTA AAG CTT ATG GCG ACT TCG AAC AAT CCG-3’(SEQ IDNO：7)，和
5’-CGT GGA TCC TCA GTC CAT CCG GAA GGT GTC CTC-3’(SEQ ID NO：8)。
TORC1-eGFP表达质粒pCMV-TORC1-eGFP使用下列引物通过PCR扩增人TORC1编码区并克隆进pEGFP-N1(BD Biosciences)的BglII和BamHI位点中产生：
5’-CGC GAG ATC TAT GGC GAC TTC GAA CAA TCCG-3’(SEQID NO：9)，和
5’-ATA GGA TCC GTC CAT CCG GAA GGT GTC CTC-3’(SEQ IDNO：10)。
TORC2-eGFP表达质粒pCMV-TORC2-eGFP使用下列引物PCR扩增人TORC2编码区并将所得产物克隆进pEGFP-N1(U-4153 p35-55)的NheI和EcoRI位点中产生：
5’TTC TTT CGC TAG CGA GGC GAC GTC GGG GGC GAA CGGGCCT 3’(SEQ ID NO：11)
和
5’GAA CTG CAG AAT TCG TTG GAG CCG GTC ACT GCG GAATGA3’(SEQ ID NO：12)。
TORC3-eGFP表达质粒pCMV-TORC3-eGFP使用下列引物通过PCR扩增TORC3编码区并将所得PCR产物克隆进pEGFP-N1(U-4153p35-55)的NheI和EcoRI位点内产生：
5’TTC TTT CGC TAG CGA TGG CCG CCT CGC CGG GCT CGGGCA3’(SEQ ID NO：13)和
5’GAA CTG CAG AAT TCG CAG TCT GTC AGC TCG AAA CGTCTC 3’(SEQ ID NO：14)。
显性失活TORC1表达载体pTORC1(1-44)-eGFP使用下列引物通过PCR扩增TORC1编码头44个氨基酸的编码区并将所得产物克隆进pEGFP-N1(U-4153 p116-117)的NheI和EcoRI位点产生：
5’TCC CTT GCT AGC GCC ACC ATG GCG ACT TCG AAC AATCCG CGGAAA 3’(SEQ ID NO：15)
和
5’CTT TCT CAG AAT TCG CTG GAG CCG CGC GGC CCG CGTCAG GCT 3’(SEQ ID NO：16)。
组成型活性神经钙蛋白表达构建体pCI-neo-CnA*-HA(Molkentin等，1998)得自Eric Olson，University of Texas Southwestern Medical Center，Dallas TX。
cDNA筛选。转染前24小时将HeLa细胞以1,200细胞/孔铺在384-孔平板上30ul培养基中。对每批384孔平板，将35ugpCMV-TORC1-eGFP稀释进10ml OPTI-MEM中，然后加入562ulFugene6。向含有4ul约7.5ng/ul cDNA表达质粒的OPTI-MEM的cDNA印模(stamp)中加入3ul该混合物，并最终将整个混合物添加入HeLa细胞。48小时后，从平板中取出培养基并将平板浸入-20℃的100％甲醇中20分钟，去除甲醇并在室温干燥平板。核以每孔25ul PBS中的5ug/ml Hoechst染料染色15分钟，然后用PBS洗涤3次。使用Cellomics ArrayScan II获得每孔的细胞图像，并使用胞质至胞核转运(Cytoplasm to NuclearTranslocation)算法确定细胞质和核中TORC1-GFP的量。
稳定TORC-eGFP细胞系的建立。用pCMV-TORC1-eGFP转染HeLa细胞并用700ug/ml遗传霉素选择稳定的整合体。分离并扩增表达TORC1-eGFP的单个菌落(HhTORC1eGFP细胞)。
用AseI限制性内切酶线性化的pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP转染HEK293细胞，并用700ug/ml遗传霉素选择产生表达TORC-eGFP细胞群的稳定整合体。这些分别称为293hTORC1、293hTORC2或293hTORC3细胞。所有稳定的TORC-eGFP细胞系进行荧光激活的细胞分选，以去除不发荧光的细胞。
共聚焦显微术。涂有HhTORC1eGFP的四孔玻璃载片分别用0.38ugpCMV-SPORT6或相应cDNA质粒与0.13ug p3x-FLAG-CMV-7-BAP(Sigma#C-7472)共转染作为转染对照。24小时后置换培养基，48小时后用PBS中的4％甲醛在室温固定细胞10分钟，并用PBS中的0.2％TritonX-100透化2分钟。用PBS中3％的BSA封闭细胞1小时，并与抗FLAG单克隆抗体(Sigma#F-3165)孵育，然后用抗小鼠AlexaFluor 647抗体(Molecular Probes，Eugene OR，Cat.#A-21463)和Hoechst 33342染料(Molecular Probes#H3570)染色。
TORC抗体。制造肽抗原并用于免疫兔以产生多克隆抗体，然后将所述多克隆抗体从原始肽中亲和纯化。用于各抗体的抗原为：
抗TORC1-PAS2769-2770：CSPHRRPLSVDKHGR(SEQ ID NO：17)；
抗TORC1-1B：ENPGQPSMGIDIASC(SEQ ID NO：18)；
抗TORC1-2A：CPATEDTFRMDRL(SEQ ID NO：19)；
抗TORC1-EPO31350：KQAWDTKKTGSRPKSC(SEQ ID NO：20)；和
抗TORC2-1cKSCN：CDPAVEESFRSDRLQ(SEQ ID NO：21)。
抗TORC1-EPO31350由Eurogentec North America Inc.，San Diego，CA制造；抗TORC1-PAS2769-2770由ProSciInc.，Poway CA制造；其余的抗体由Zymed Laboratories，Inc.，San Francisco CA制造。
免疫组织化学。用DMSO或50uM弗司扣林处理来自HEK93的细胞90分钟，在-20℃用100％甲醇固定20分钟，然后干燥并用PBS中的5％BSA/10％山羊血清/0.1％Tween-20在室温封闭3小时。细胞与1∶4000稀释的抗TORC2抗体1cKSCN孵育。然后用抗兔AlexaFluor 488(MolecularProbes#A21441)和Hoechst染料染色细胞，之后显微镜检。
siRNA转染。6000HeLa细胞同时涂布，并用90ng pCRE-luc或pNFKB-luc和10ng海肾荧光素酶质粒与每孔0.3μl Fugene6在96孔板中转染。24小时后使用Oligofectamine转染试剂(Invitrogen)进行siRNA转染，缺乏抗生素的培养基中siRNA终浓度为20nM，siRNA转染后24小时将培养基换为含有抗生素的培养基。siRNA转染后48小时换为含有多种化合物的培养基，并在与化合物过夜孵育后确定荧光素酶活性。使用的siRNA为：
非特异性对照：5′-UAG CGA CUA AAC ACA UCA AUU-3′(SEQ IDNO：22；Dharmacon，Dallas TX，#D-001210-01-05)；
GL3荧光素酶5′-CTT ACG CTG AGT ACT TCG A-3′(SEQ ID NO：23；Dharmacon #D-001400-01-05)；
TORC1 5′-CCG GCA ACC UCG CGG CCA AUU-3′(SEQ ID NO：24；Dharmacon#D-014026-03)；
TORC2 5′-CGA CUA CCA UCU GCA CUU AUU-3′(SEQ ID NO：25；Dharmacon#D-018947-02)；和
TORC3 5′-CAA CGC AUC UGC UCU UCA CUU-3′(SEQ ID NO：26；Dharmacon#D-014210-04)。
果蝇方法。Gal4应答构建体UAS-GFP-TORC通过从pEGFP-N1载体(Clontech#6085-1)中PCR克隆eGFP基因，并将来自果蝇基因组DNA的dTORC基因PCR克隆进pUAST载体(Brand和Perrimon，1993)产生。通过P元件种系转化将该构建体注入果蝇胚胎中产生转基因系(Rubin和Spradling，1982)。为了诱导融合蛋白的表达，将含有UAS-GFP-TORC的果蝇与含有来自Bloomington Stock Center，University of Indiana，Bloomington，IN的HS-Gal4构建体的果蝇杂交。将幼虫在25℃热激，并将来自晚期三龄幼虫的唾液腺在PBS中进行解剖，置于含有多种化学物质处理的96孔板中的Sang M3培养基(Sigma#S3652)中。使用Nikon EclipseTE2000-E荧光显微镜将腺体成像。拍摄100×放大率的图像。
实施例1.TORC蛋白质的亚细胞定位。
用FLAG-TORC1(图1，图A和B)或TORC1-eGFP(图C和D)转染HeLa细胞。细胞不处理(图A和C)或用10nM细霉素B(LMB)，一种CRM1介导的蛋白质核输出真菌抑制剂，处理90分钟(图B和D)。FLAG标记的蛋白质通过免疫荧光成像，而eGFP标记的蛋白质直接通过荧光成像。尽管TORC蛋白质显示为CREB1-共激活剂(Iourgenko等，2003)，使用FLAG表位的蛋白质免疫荧光发现主要存在于HeLa细胞质中(图1，图A)。使用TORC1eGFP融合蛋白来自eGFP的直接荧光也得到了类似的结果(TORC1-eGFP；图1，图C)。由于大量的信号转导蛋白质受核输出或刺激介导的输入的调节，在用LMB处理后研究TORC1的定位。接触LMB后90分钟发现TORC1融合蛋白主要存在于核内(图1，分别为图B和D)。各标记的构建体看来保留了类似于未标记TORC构建体的激活CRE依赖性转录的能力(数据未显示)。
实施例2.TORC2和TORC3蛋白质的亚细胞定位。
还研究了人TORC2和TORC3的定位。HeLa细胞和HEK293细胞都用pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP转染。作为eGFP融合物表达时，TORC2和TORC3组成型存在于HeLa细胞核内(图2)。然而，在HEK293细胞中表达时，TORC2-eGFP和TORC3-eGFP融合蛋白均大量(尽管非唯一的)存在于细胞质中(图1，分别为图E和G，其显示荧光主要在核外)。
如HeLa细胞中的TORC1(实施例1)一样，LMB处理引起蛋白质在细胞核中的聚集，其显示发荧光(图1，分别为图F和H)。可得出结论，即三种人TORC的亚细胞定位受核输出调节(实施例1和2中TORC蛋白的定位看来并非转染或标记的矫作物)。首先，无论TORC1表达为带有N端FLAG表位标签或C端eGFP标记，转运和输出是类似的。其次，用eGFP单独转染后未观察到转运(数据未显示)。最后如下文所述，未发现处理引起细胞质碱性磷酸酶基因转运的出现(实施例4和7)。
实施例3.鉴定诱导TORC1核聚集的cDNA。
为了鉴定调节TORC转运的细胞信号，开发了高复杂性筛选以鉴定引起核内TORC1-eGFP聚集的基因。HeLa细胞用TORC1-eGFP与来自MGC全长集合的约7,000个独立的cDNA表达构建体共转染(Strausberg等，2002)。转染48小时后固定细胞，并使用Cellomics ArrayScan II自动显微镜确定细胞质和核中eGFP荧光的相对量。为了提供TORC1-eGFP转运的阳性对照，固定前用LMB处理每个384孔细胞培养物平板中的一个孔。通过绘制胞核-胞质荧光差异监测转运。经由LMB的转运事实上在所有的对照孔中检测到(图3，“X”)。
从具有高胞核-胞质荧光差异的克隆中回收可能的活性cDNA并在后续测定中再检测。来自该筛选的最高得分可再现样品为编码鼠瞬时型受体电势阳离子通道亚家族V成员6(TRPV6：cDNA克隆MGC：27673IMAGE：4911355)和鼠cAMP依赖性蛋白激酶催化性α亚单位(PKA：cDNA克隆MGC：6169 IMAGE：3497908)的质粒。应该注意一些其他的cDNA也证实它们诱导标记的TORC1蛋白转运的能力。
实施例 4.验证TRPV6和PKA的作用。
为了验证TRPV6和PKA诱导TORC1-eGFP转运至核(实施例3)，用空表达载体pCMV-SPORT6(图4，图A)或包含TRPV6(图B)或PKA(图C)的表达载体转染稳定表达TORC1-eGFP的HeLa细胞。进行共聚焦显微术；在原始彩色的显微照片中，碱性磷酸酶染色(粉色)标记转染的细胞、核DNA染色为蓝色，而TORC1-eGFP荧光为绿色。在图4中，使用空载体的对照(图A)显示一个细胞(下边右侧)具有粉色的细胞质，指示转染成功。该细胞具有蓝色的核染色，核中和核附近为浅绿(下边右侧部分)。在图B中(TRPV6)右侧的三个细胞有细胞质粉色染色，其中上边两个具有清晰的绿色核；下边的细胞具有蓝绿色核。图C(PKA)中中央的大细胞具有粉色的细胞质和绿色的核。这些结果显示这些cDNA克隆的基因产物诱导核中TORC1-eGFP的聚集。TRPV6引起事实上所有TORC1-eGFP移至核内，而PKA只引起部分TORC1-eGFP在核内聚集。这些观察结果说明TORC1转运至核内是受调节的事件，并提示TORC活性可被cAMP和钙信号转导途径诱导。
TRPV6和PKA还诱导TORC2和TORC3在HEK293细胞中的转运，然而仅仅PKA的活性就足以诱导TORC2和TORC3的核内聚集，而无需同时以LMB封闭核输出(实施例5)。
实施例5.TORC蛋白转运对cAMP的依赖性。
PKA诱导TORC 1转运提示cAMP可能些同地通过磷酸化激活CREB和通过核转运激活TORC。为了评估该可能性，将稳定表达TORC1-eGFP的HeLa细胞暴露于未处理(图5，图A)、50μM弗司扣林和100uM IBMX(图B)或1mM db-cAMP(图C)2小时。发现通过这些处理提高细胞内cAMP浓度，引起eGFP荧光在核内显著出现(图B和C)，说明与仅显示细胞质荧光的未处理对照相比，TORC1-eGFP在HeLa细胞中的部分转运(图5，图A)。类似的，稳定表达TORC2-eGFP(图5，图D和E)或TORC3-eGFP(图F和G)的HEK293细胞未处理(图D和F)或用25μM弗司扣林处理1小时(图E和G)。从图E和G中荧光显微术结果可以看出，仅通过弗司扣林处理，在稳定转染的HEK293细胞中TORC2-eGFP和TORC3-eGFP就转运至细胞核。
另外，TORC2-eGFP(数据未显示)和TORC3-eGFP(图5，图H)在用PKA共转染的稳定转染的HEK293细胞中聚集。
内源TORC2的定位在野生型HEK293细胞中通过弗司扣林接触后免疫组织化学染色进行研究。HEK293细胞未处理(图6，图A和B)，或用50μM弗司扣林处理90分钟(图C和D)。抗TORC2染色显示在图A和C中，相应的Hoechst染色见图B和D。未处理的细胞显示细胞各处的弥散染色，而接触弗司扣林的细胞主要显示核免疫组织化学染色，与Hoechst染色核观察到的不同。因此，所有TORC的亚细胞定位显示受细胞内cAMP水平调节。
应该注意因为TORC蛋白的低水平表达和可利用抗体试剂的性质，评估的其内源转运是困难的。尽管目前产生的抗体容易识别过表达的蛋白质，但TORC1抗体可以低敏感度识别内源蛋白而TORC3抗血清不能检测内源蛋白。
实施例6.通过G蛋白偶联受体刺激TORC转运
为了评估内源G蛋白偶联受体(GPCR)刺激是否诱导TORC转运，用异丙肾上腺素(β2肾上腺素受体激动剂)处理稳定表达多种TORC-eGFP融合物的HEK293细胞1小时。如图7所示，未处理的稳定表达TORC1-eGFP的HEK293细胞(图A)以及单独用10nM LMB(图B)或单独用160nM异丙肾上腺素(图C)处理的细胞显示来源于胞质的eGFP荧光。仅有用异丙肾上腺素加LMB(图D)处理引起主要从核中发出荧光。
在稳定表达TORC2-eGFP或TORC3-eGFP的HEK293细胞的情况下，与未处理细胞的胞质荧光(分别为图E和G)相比，仅用160nM异丙肾上腺素处理时从核中发出荧光(图7，分别为图F和H)。因此仅在存在LMB时TORC1-eGFP应答于异丙肾上腺素处理而转运至核中，而仅有异丙肾上腺素对于TORC2-eGFP和TORC3-eGFP的核转运就已经足够。
与HeLa细胞相反，在稳定转染的HEK293细胞中，TORC1-eGFP的输入很缓慢，并且同时需要LMB和弗司扣林以及IBMX或异丙肾上腺素处理(数据未显示)，提示同时需要输入信号和阻断输出。
实施例7.TORC以神经钙蛋白依赖性方式应答于钙而转运。
TRPV6是怀疑(但未证实)为与库容性钙内流(CCE)和钙信号传导(Cui等，2002)相关的钙库控制的钙通道。这特别有意义，因为CCE是活化和诱导另一转录因子——活化T细胞核因子——的核转运所必需的(NF-AT：综述参阅Hogan等，2003)。NF-AT含有由磷酸化失活的核定位信号；NF-AT的核输入需要由钙依赖性磷酸酶神经钙蛋白进行去磷酸化。NF-AT还含有神经钙蛋白调节的核输出序列(NES)(Zhu和Mekeon 1999)。神经钙蛋白是免疫抑制药物环孢素A(CsA)和FK506的靶标，有效阻断NF-AT刺激依赖性地转运至核。
为了确定TORC的转运是否还受到胞内钙水平的调节，研究了TORC蛋白应答于钙离子载体洛诺霉素或肌质-内质网钙ATPase圆弧偶氮酸(CPA)的定位(图8)。使稳定表达TORC-eGFP的HeLa细胞接触DMSO载体(图A)、1μM洛诺霉素(图B)或10μM CPA(图C)1小时。如eGFP荧光所示，与单独用DMSO观察到的胞质荧光相比，洛诺霉素和CPA都可诱导TORC1-eGFP在核中的累积。
图D、E和F也显示使用1μM洛诺霉素进行的处理。预接触6.4nMFK506(图D)或5μM CsA(图E)1小时之后，eGFP荧光仍然保留在胞质中，表明应答于洛诺霉素的转运完全被这些物质阻断。用2μM雷帕霉素(不抑制神经钙蛋白的亲免素结合化合物)进行的处理(图F)不阻断转运，这可以从强核荧光看出来。应答于洛诺霉素的转运被CsA和FK506完全阻断，但不被雷帕霉素阻断的事实提示神经钙蛋白与钙诱导的转运有关。
还通过研究转染活化形式的神经钙蛋白之后TORC1-eGFP的定位来进一步测试了神经钙蛋白在TORC转运中的作用(图9)。用空表达载体(图A)或表达组成型活性形式神经钙蛋白的质粒(图B)瞬时转染稳定表达TORC1-eGFP的HeLa细胞。在图A中，四个下方细胞显示蓝色核和微带粉色(碱性磷酸酶转染对照的染色)的绿色胞质。图B中的所有细胞都在胞质中显示浅粉色胞质染色和强绿色荧光，在所有细胞中都胜过了蓝色核染色。因此表达活性神经钙蛋白诱导TORC1-eGFP在核中的累积，模拟了TRPV6或洛诺霉素的效果。还发现在HEK293细胞中共转染活化的神经钙蛋白诱导TORC2和TORC3的转运(数据未显示)。
实施例8.TRPV6调节TORC的转运。
为了确定TRPV6表达是否也足以激活NF-AT信号传导，用空载体或与NF-AT依赖性荧光素酶报道基因组合的TRPV6表达载体瞬时转染HEK293细胞。在报道基因测定之前18个小时加入3μM CsA。发现荧光素酶显示TRPV6激活NF-AT(图10)。这种激活被CsA抑制，与TRPV6通过活化神经钙蛋白激活NF-AT的假说一致。因此，TORC转运以与NF-AT相似的方式受到调节，并显示代表了神经钙蛋白和亲免素结合免疫抑制剂的新靶标。相信这是首次证明TRPV6表达足以活化神经钙蛋白，因此它可以在T细胞活化中发挥作用。
实施例9.TORC转运的钙依赖性活化。
在稳定表达的HEK293细胞中研究了钙信号传导对三种人TORC-eGFP融合蛋白核转运的影响。TORC2-eGFP和TORC3-eGFP确实应答于LMB接触而在核中累积，但速率远低于HeLa细胞。TORC3-eGFP在接触LMB约90分钟后变成主要在核中，TORC2-eGFP在接触LMB 120分钟后变成主要在核中。另一方面，在HeLa细胞中，TORC1在少于30分钟内接近转运完全(数据未显示)。
使稳定表达TORC1-eGFP、TORC2-eGFP或TORC3-eGFP的HEK293细胞接触10nM LMB、10μM洛诺霉素、10nM LMB和10uM洛诺霉素或者10nM LMB、10μM洛诺霉素和5μM CsA(图11)。处理进行45分钟，CsA处理包括15分钟1μM CsA的预接触。如eGFP荧光显微术所示，当细胞仅接触洛诺霉素或LMB 45分钟时，三种TORC中的每一种在HEK293细胞中均显示微弱的转运至核或不转运至核。但洛诺霉素和LMB两者的组合引起所有三种TORC-eGFP融合蛋白高效转运至核(图11)。因此，HEK293细胞中钙诱导的核转运似乎同时需要正信号以及对核输出的抑制。有意思的是，三种TORC对CsA的敏感性不同。TORC1-eGFP的核累积被CsA完全阻断，而TORC2-eGFP和TORC3-eGFP蛋白分别被CsA部分影响或无影响(图11)。因此，尽管所有的三种TORC转运都应答于钙信号传导，但调节TORC2和TORC3转运的机制可能与TORC1不同，至少在HEK293细胞中如此。还应该指出，核输入和输出的动力学可以解释在核中累积不同的TORC对诱导剂和LMB组合的不同需要。
实施例10.TORC转运对其他刺激的依赖性。
引起CREB磷酸化和CRE依赖性转录的若干其他刺激的效应也引起TORC转运的协同诱导。稳定表达TORC1-eGFP的HeLa细胞为未处理(图12，图A和D)或仅接触紫外光(1焦耳/cm2)(图B)或在存在10μMCsA(图C)、10μM PMA(图E)或10μM PMA和5μM CsA(图F)的情况下接触紫外光。接触紫外光10分钟或接触PMA 1小时后获得图像。紫外光辐照细胞(图12，图B，与图A相比)和蛋白激酶C(PKC)激动剂佛波醇-12-肉豆蔻酸-113-乙酸(PMA)均诱导TORC1-eGFP在核中累积(图E，与图D相比)。UV和PMA引起的转运都被CsA处理阻断(分别为图C和F)，证明这些应答都需要神经钙蛋白。TORC应答于cAMP的转运对CsA不敏感(数据未显示)，显示至少两种独立的途径调节TORC蛋白的亚细胞定位。
实施例11.TORC核转运足以诱导CRE介导的基因表达。
为了确定TORC1过表达和定位对基因表达的影响，使用含有CRE依赖性启动子的荧光素酶报道基因在未转染HeLa细胞和稳定表达TORC1-eGFP的HeLa细胞中比较CRE依赖性转录。用10nM LMB、10μM CsA、5μM洛诺霉素、10μM PMA或所示组合刺激HeLa细胞和稳定表达TORC1-eGFP的HeLa细胞18小时(图13)。Western分析和实时PCR分析都表明HeLa细胞表达TORC1，但水平极低，而TORC1-eGFP稳定细胞系产生显著更多的TORC1蛋白(数据未显示)。如图13所示，未处理的幼稚HeLa细胞和转染的HeLa：：TORC1-eGFP显示相似水平的CRE驱动的荧光素酶，LMB处理仅在HeLa：：TORC1-eGFP细胞中引起显著降低。这提示TORC1-eGFP移动至核足以活化CRE驱动的基因表达。此外，洛诺霉素和PMA在幼稚HeLa细胞中引起中等水平的活化，这些物质在HeLa：：TORC1-eGFP中显示高于10倍提高的CRE荧光素酶诱导。此外，洛诺霉素的诱导被CsA完全阻断。PMA活化被CsA部分阻断(数据未显示)，提示PMA可能同时以神经钙蛋白依赖性和非依赖性的机制诱导TORC活性。因此，过表达TORC1有效增强CRE驱动基因表达的活化，LMB使外源TORC1移动至核不足以诱导CRE驱动的基因表达。因此，过表达TORC1以神经钙蛋白依赖性方式有效增强CRE驱动基因表达的活化。相信这些观察结果提供了解释CsA和FK506抑制部分CREB应答基因表达这一前期发现的机制(Siemann等1999)。
实施例12.使用siRNA敲低TORC。
为了确定TORC功能是否是通过钙信号传导进行活化所必需的，用siRNA抑制TORC1和TORC2表达。使用TORC1和TORC2特异性抗体通过western印迹分析鉴定显著阻断人TORC1和TORC2蛋白表达的siRNA(数据未显示)。用CRE-荧光素酶质粒或NFKB-荧光素酶质粒瞬时转染HeLa细胞，其后用20nM特异于荧光素酶(GL3)、TORC1(T1)、TORC2(T2)或者TORC1和TORC2(T1/T2)的siRNA以及对照非特异性siRNA转染。siRNA转染48小时后，用DMSO、50μM弗司扣林和100μM IBMX、10μM洛诺霉素或含10uM PMA的10μM洛诺霉素处理每种共转染细胞制备物(图14)。使用抗pGL3 siRNA作为siRNA转染和效率的阳性对照。
单独敲低TORC1或TORC2足以通过洛诺霉素降低CRE活化。单独的TORC1 siRNA抑制PMA和洛诺霉素的诱导，而TORC2 siRNA的影响很小。同时转染TORC1和TORC2 siRNA时，针对所有刺激均观察到最大抑制。这些影响是特异性的，因为TORC siRNA对洛诺霉素和PMA诱导的NF-κB依赖性荧光素酶报道基因根本没有影响(图14)，对SV40驱动的海肾荧光素酶报道基因的本底表达也没有任何影响。
用抗GFP特异性siRNA或者TORC1和TORC2特异性siRNA转染HeLa细胞，接着用DMSO、洛诺霉素或者弗司扣林和IBMX诱导20分钟，其后裂解。通过western印迹分析显示siRNA阻断TORC1和TORC2蛋白产生(图15)。应该指出，弗司扣林/IBMX对CRE表达的诱导仅被TORC1和TORC2 siRNA中度阻断。对弗司扣林/IBMX诱导的弱抑制可能是因为siRNA的阻断不足或者是因为在HeLa细胞中表达所有三种人TORC蛋白。在还包括TORC3 siRNA时，观察到了对CRE活化的更彻底的抑制(数据未显示)。在这些实验中，由于缺乏质量足够高的抗体，因此不可能确认对TORC3蛋白表达的抑制。阻断TORC1和TORC2表达对通过洛诺霉素或弗司扣林/IBMX的CREB1磷酸化没有影响(图15)，这与TORC不依赖于CREB磷酸化而活化CRE驱动的表达的先期数据一致。
该实施例中报道的实验显示TORC对于钙诱导的CRE驱动的表达是必要的。
实施例13.TORC的显性失活突变构建体
使用多种siRNA和阻断多种TORC的需要使siRNA的结果(实施例12)变得复杂。为了更便利地高效阻断所有的TORC蛋白，设计了显性干扰TORC蛋白，它将高度保守的TORC1 44个氨基酸CREB结合结构域与eGFP融合(T1-44eGFP)。为了高效阻断全部TORC蛋白的活性，设计了将特异性阻断全部TORC与CREB1的相互作用的显性干扰蛋白。TORC蛋白的CREB1相互作用结构域存在于TORC1的前44个氨基酸中。代表TORC1基因第一外显子的N端44个氨基酸在所有哺乳动物、线虫和果蝇TORC蛋白中几乎100％保守，而与任何其他蛋白几乎没有同源性或相似性(Iourgenko等，2003)。当这44个氨基酸与eGFP作为融合蛋白表达(T1(1-44)eGFP)时，HhTORC1细胞中增强的CRE应答被高效阻断，全部三种TORC对CRE激活的活性都被抑制(数据未显示)。用eGFP对照或者TORC1(1-44)eGFP与CRE-荧光素酶(图16，图A)或NFKB-荧光素酶(图B)转染HeLa细胞，之后用50μM弗司扣林/100μM IBMX或5μM洛诺霉素进行刺激。在图C中，用CRE-荧光素酶和β2-肾上腺素受体(β2AR)与空CMV载体、eGFP或TORC1(1-44)-eGFP融和物的组合转染HEK293细胞，并接触异丙肾上腺素18小时.显性失活T1(1-44)eGFP也高效阻断CRE通过弗司扣林/BIMX或洛诺霉素和PMA的活化(图16，图A)。这种活性是特异性的，因为对单独的eGFP的表达没有影响，而且T1(1-44)eGFP对通过洛诺霉素和PMA实现的NF-κB报道基因活化没有影响(图16，图B)。如图16的图C所示，T1(1-44)eGFP强烈抑制β2-肾上腺素受体(β2AR)和异丙肾上腺素对CRE-荧光素酶的诱导，而eGFP则不然。因此阻断TORC功能也阻止通过Gs相关GPCR使用异丙肾上腺素实现的CRE活化。可以得出结论，这证明TORC功能对CRE应答的活化是充分且必要的。
实施例14.TORC转运是进化上保守的调节机制。
产生了eGFP与果蝇TORC(dTORC)蛋白的融合物。对表达dTORC-eGFP转基因的果蝇幼虫唾液腺进行以下处理：未处理1小时(图17，图A)；接触5μM洛诺霉素1小时(图B)；5μM洛诺霉素与10μM CsA1小时(图C)；未处理4小时(图D)；100μM db-cAMP 4小时(图E)。通过显微术研究自表达dTORC融和蛋白的转基因幼虫解剖的唾液腺。在唾液腺的所有细胞中dTORC-eGFP都定位于胞质中(图17，图A和D)。使转基因唾液腺接触洛诺霉素或db-cAMP诱导dTORC-eGFP转运入核(分别为图B和E)。洛诺霉素诱导的转运被CsA阻断(图C)。因此，与人细胞一样，果蝇中TORC的定位受cAMP和钙的调节。因此，这种TORC在细胞内亚细胞定位的调节是高度保守的修饰CREB信号传导的机制。
实施例15.神经元细胞中TORC蛋白的亚细胞定位。
建立了通过神经生长因子诱导显示神经元表型的选自HCN-1A(皮质神经元)、HCN-2(皮质神经元)、DBTRG-05MG(神经胶质细胞；成胶质细胞瘤)的人脑细胞系(均可得自ATCC)或鼠原代背根神经节外植体神经元(Araki等(2004)Science 305：1010-1013)培养物。用pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP转染细胞。24-48小时后使用荧光显微术研究eGFP定位。在LMB存在下复查结果。这些结果表征了神经元细胞中TORC蛋白的亚细胞定位。
实施例16.鉴定调节脑细胞中TORC相关过程活性的物质。
建立培养中的神经元细胞或神经元表型细胞(实施例15)，并用pCMV-TORC1-eGFP、pCMV-TORC2-eGFP或pCMV-TORC3-eGFP进行转染。将培养物分成两部分，其中仅有一部分用候选TORC效应剂处理。通常存在候选物的文库，如组合文库。在多孔板中用文库的多个成员处理转染的神经元细胞培养物。为了选择具有最强的调节活性的物质，可以用已知促进TORC蛋白在胞质中累积的物质预处理培养物，或者用已知促进TORC蛋白在核中累积的物质预处理培养物。可以调整这些物质的浓度，从而使其处于促进其效应的效率中点或附近。使用荧光显微术检查TORC蛋白-eGFP融合物的亚细胞定位，并与来源培养物中用该物质处理但不用候选物质处理的部分进行比较。将与培养物未处理部分相比诱导显著效应的候选物质鉴定为该测定的生物效应物质。
通用方法：在实施例17至23公开的实验中使用以下方法和物质。
细胞培养：从2至3周龄FVB雄性小鼠中分离初级肌细胞。在含有20％热灭活FBS(Hyclone，cat# 30070.03)、100U/ml青霉素-100μg/ml链霉素(Gibco，cat# 15140-122)、1×Normocin(Invivogen，cat# ant-nr-1)和2.5ng/ml bFGF(Invitrogen，cat# 13256-029)的Ham’s F10(Gibco，cat#11550-043)中培养成肌细胞。当达到80％汇合时，转换成含有5％马血清(Hyclone，cat# SH30074)的DMEM(Gibco，cat# 11965-092)诱导分化。
转染和荧光素酶活性测量：在含10％FBS的DMEM中培养HeLa细胞。以7000个细胞/孔将其铺在96孔板中，6小时后使用Fugene 6转染试剂(Roche，cat# NC916732)进行转染。用于转染的DNA和Fungene 6的量分别为163 ng和0.325μl。转染后48或72小时裂解细胞，按照提供商的说明书使用Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega，cat# PRE2943-0)测量荧光素酶活性。
用慢病毒或腺病毒进行转导：以1.3×105细胞/孔将HeLa细胞铺在6孔板中。在每个孔中加入2ml含有0.5ml TORC1或STOP(对照)慢病毒、8mg/ml聚凝胺(Polybrene)(Sigma，cat# H9268)和10mM Hepes的培养基，将平板以1000g离心30分钟以提高转导效率。24小时后移去培养基并换成含10％FBS的DMEM。在转导后24、48或72小时收获细胞。用TORC2、TORC3或GFP(对照)腺病毒(4×108颗粒/孔于6孔板中)感染初级肌细胞(分化后1天)。每天更换培养基。转导后24或48小时收获细胞。
RNA提取和基因表达的实时PCR分析：使用Trizol(Invitrogen，cat#15596-026)从细胞中提取总RNA。使用Superscript II RNase H逆转录酶(Invitrogen，cat# 18064-022)以1mg总RNA进行cDNA合成。使用合成的cDNA和对靶基因具有特异性的引物/探针集合通过实时PCR测定靶基因的相对表达。通过比较靶基因/18S rRNA计算相对mRNA表达水平。细胞色素氧化酶亚基II(CoxII)的Taqman探针序列为5’-TCAAGCAACAGTAACATCAAACCGACCA-3’(SEQ ID NO：XX)。CoxII的Taqman引物序列为5’-CCATCCCAGGCCGACTAA-3’(SEQ IDNO：XX)(正向)和5’-CAGAGCATTGGCCATAGAATAACC-3’(SEQ IDNO：XX)(反向)。CoxII的探针和引物分别得自Sigma Genosys和AppliedBiosystems。其他基因的Taqman引物/探针集合得自Applied Biosystems(下文列出)：
人和小鼠细胞色素c(Hs01588973_m1；Mm01621048_s1)
人和小鼠PGC-1α(Hs00173304_m1；Mm00447183_m1)
小鼠ERRα(Mm00433143_m1)
小鼠异柠檬酸脱氢酶(Mm00499674_m1)
18S(cat#4310893E)。
蛋白质提取和Western印记：使用补充了Complete Mini蛋白酶抑制剂混合物(Roche，cat#DCTC0)的细胞抽提缓冲液(Biosurce，cat# FNN0011)裂解细胞。将50μg细胞裂解液用于Western印记分析。TORC1抗体得自Mark Labow(FGA)，以1∶2000的稀释度使用。抗微管蛋白(Abcam，cat#ab3194)和V5(Invitrogen，cat#960-25)的抗体分别以1∶3000和1∶5000使用。二抗山羊抗兔IgG(cat#31460)和山羊抗小鼠IgG(cat#31430)购自Pierce，以1∶10000的稀释度使用。
脂肪酸氧化：在含有114mM NaCl、4.7mM KCl、1.2mM KH2PO4、1.2mM MgSO4和0.5％无脂肪酸BSA的非碳酸缓冲液中用36μM14C-软脂酸(ARC，cat#ARC-172A)标记细胞2小时。定量由细胞产生的14CO2，并用作脂肪酸氧化速率的指标。
细胞呼吸：用胰蛋白酶处理细胞并重悬于含有25mM葡萄糖和1mM丙酮酸以及2％无脂肪酸BSA的PBS中。使用Clark电极测量未处理和用寡霉素和CCCP处理的细胞呼吸。各测量使用300,000,000 Hela细胞或50,000,000初级肌细胞。寡霉素的浓度为2μg/ml，而Hela细胞及初级肌细胞的CCCP浓度分别为2μM和2-5μM。
实施例17
TORCl的异位表达提高HeLa细胞中线粒体基因表达和线粒体氧化能力。图18图解说明了用pGL3-basic-2kb-PGC1α-Luc、phRL-SV40(作为转染效率的对照)与标示的多种cDNA构建体一起转染HeLa细胞的结果。在转染后48小时裂解细胞并测定荧光素酶活性。计算萤火虫发光(ff)与海肾发光(RL)的比值(均值±SEM)，表达为标准化的荧光素酶，并用作PGC-1α基因转录的指标。TORC1诱导PGC-1α启动子转录，如报道蛋白的表达所示。CREB显性失活抑制剂ACREB的存在降低TORC1的影响，从而说明TORC1通过CREB机制发挥功用。
实施例18
图19证明TORC1的异位表达提高PGC-1α和细胞色素c的表达，提示其诱导线粒体发生。细胞色素c是公认的线粒体水平生物标志。用对照慢病毒(Stop或GFP)或TORC1慢病毒转导HeLa细胞。A.转导后72小时从细胞提取总蛋白，并进行Western印记分析，以测定PGC-1α蛋白的表达。B.在转导后24、48和72小时从细胞提取总RNA，进行qPCR分析，以测定内源PGC-1α(B)和细胞色素c(C)mRNA的表达水平。
实施例19
图20证明TORC1的异位表达提高HeLa细胞中的细胞呼吸。用对照(Stop)或TORC1慢病毒转导HeLa细胞。在转导后72小时使用Clark电极测定细胞呼吸。寡霉素(MP Biomedicals；ATP合酶抑制剂)和CCCP(Sigma；电子传递链解偶联剂)的浓度分别为2μg/ml和2μM。在TORC1表达后观察到提高的细胞呼吸。
实施例20
在小鼠初级肌细胞中TORC2和TORC3的异位表达提高线粒体基因表达和线粒体氧化能力。图21图解说明了TORC1、TORC2和TORC3中的每一种都活化PGC-1α基因的转录。用pGL3-basic-2kb-PGC1-Luc、phRL-SV40(作为转染效率的对照)与标示的多种cDNA构建体一起转染HeLa细胞。在转染后48小时裂解细胞并测定荧光素酶活性。计算萤火虫发光(ff)与海肾发光(RL)的比值(均值±SEM)，表达为标准化的荧光素酶，并用作PGC-1α基因转录的指标。N＝6，*P＜0.05(TORC1、2、3相对于载体)。
实施例21
在图22中显示TORC2或TORC3的异位表达在初级肌细胞中提高PGC-1α和线粒体标志物的表达。用TORC2、TORC3或GFP腺病毒转导初级肌细胞。A.转导后48小时从细胞提取总蛋白并进行Western印记分析，以测定异位TORC2和TORC3蛋白的表达。用于检测异位TORC2和TORC3蛋白的一抗和二抗分别为V5和山羊抗兔IgG。B-C.转导后24和48小时从细胞提取总RNA并进行qPCR分析，以测定内源PGC-1α(B)和PGC-1α靶基因(C)的表达水平，所述靶基因包括ERRα和线粒体标志物、细胞色素C(CytC)、线粒体氧化酶亚基II(CoxII)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)。N＝3，*P＜o.05(TORC2或TORC3相对于GFP)。
实施例22
图23显示TORC2或TORC3的异位表达在小鼠初级肌细胞中提高脂肪酸氧化。用TORC2、TORC3或GFP腺病毒转导初级肌细胞。在转导后48小时进行14C-软脂酸氧化。N＝3，*P＜0.05。该功能测定还证实了TORC蛋白在线粒体生物发生中的作用。
实施例23
在图24中显示TORC2或TORC3的异位表达提高小鼠初级肌细胞的细胞呼吸。用TORC2、TORC3或GFP腺病毒转导初级肌细胞48小时。对未处理(本底)或者寡霉素或CCCP处理测量细胞呼吸。N＝3，*p＜0.05(TORC相对于GFP)。
实施例1-14展示的数据提示在神经元中TORC活性、表达或核转运的激动剂本身可诱导或增强CREB介导的过程。由于已知cAMP和CREB介导的应答与大量病理和生理过程关联，因此TORC活性的修饰剂可能具有多种应用。TORC激动剂可用于增强记忆，治疗抑郁、情绪紊乱或精神分裂症。已知CREB功能的丧失与神经退化关联，阻断CREB功能引起神经元细胞死亡和凋亡。此外，在亨廷顿病中，认为沉淀的核包涵体使CBP隔离，从而也会阻断CREB活性(Sugars等，2003；Kazantsev 1999)。在这种情况下，通过TORC激动剂恢复CREB可诱导的基因表达同样也具有临床实用性。
该实施例还鉴定了TRPV6高效诱导神经钙蛋白依赖性诱导NF-AT驱动基因表达的能力。如上文所述，怀疑TRPV6组成钙库控制的钙通道，或者为其一部分，所述钙通道是应道是应答胞内钙浓度瞬时提高而活化神经钙蛋白所必需的。TRPV6可以以CsA敏感性方式诱导TORC转运以及NF-AT驱动的基因表达这一观察结果强烈支持了TRPV6在NF-AT驱动过程(如心脏肥大和T细胞活化)中的作用。
TORC移动至核提供了鉴定cAMP或钙介导的信号转导事件的高效经济的通用方法。有多种测定可用于研究细胞培养物中的cAMP水平或钙介导信号传导的活化。然而，多数使用报道基因或ELISA型测定的这些方法都很昂贵、费时并且难于以高通量方式应用于个体细胞。TORC转运的显像允许以高通量形式鉴定个体细胞cAMP和钙信号传导的修饰剂。
最后，由于已经证明TORC1转运足以诱导和增强CREB介导的表达，因此诱导TORC核转运的化合物可有益于作为记忆增强剂或作为神经保护剂，而阻断TORC核转运的化合物可用于治疗动脉硬化。
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Claims (28)

1.鉴定细胞中CREB启动过程的调节剂的方法，所述方法包括使细胞接触调节TORC多肽在细胞的亚细胞区室中累积的物质。
2.权利要求1所述的方法，其中所述物质为离子载体、胞内cAMP浓度刺激剂、胞内钙浓度刺激剂或蛋白激酶活性刺激剂。
3.修饰细胞中TORC相关过程的方法，包括使细胞接触促进TORC多肽在细胞的亚细胞级分中累积的物质。
4.权利要求3所述的方法，其中所述物质为亲免素结合剂。
5.调节细胞中CREB启动过程的方法，包括使细胞接触调节细胞中TORC多肽表达的物质。
6.权利要求5所述方法，其中所述物质包括反义寡核苷酸、干扰寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA适体、双链或单链RNA、肽模拟物、含有肽模拟物编码序列的多核苷酸、或其中任意两种或多种的混合物。
7.在受试者中基本抑制疾病或病理病症的发展、治疗或改善疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中CREB启动过程的水平异常相关，包括对受试者施用一种或多种治疗有效剂量调节TORC多肽在细胞亚细胞区域累积的物质。
8.权利要求7所述方法，其中所述物质为亲免素结合剂。
9.权利要求7所述方法，其中所述物质为离子载体、胞内cAMP浓度刺激剂、胞内钙浓度刺激剂或蛋白激酶活性刺激剂。
10.权利要求7的方法，其中所述TORC调节剂包括一种或多种针对TORC蛋白的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段抑制所述TORC蛋白的活性。
11.权利要求7的方法，其中所述TORC调节剂包括一种或多种TORC蛋白的肽模拟物，其中所述肽模拟物抑制所述TORC蛋白的活性。
12.在受试者中基本抑制疾病或病理病症的发展、治疗或改善疾病或病理病症的方法，所述疾病或病理病症与细胞中TORC激活及CREB启动过程的水平异常相关，包括对受试者施用一种或多种治疗有效剂量调节TORC多肽在细胞中表达的物质。
13.权利要求12的方法，其中所述调节物质包括反义寡核苷酸、干扰寡核苷酸、微小寡核苷酸、三螺旋核酸、核酶、RNA适体、双链或单链RNA、肽模拟物、包含肽模拟物编码序列的多核苷酸、或其中任意两种或多种的混合物。
14.鉴定调节细胞中CREB启动过程活性的物质的方法，包括：
a)将TORC多肽引入第一细胞和参照细胞；
b)使第一细胞接触物质；和
c)测定与未接触该物质的参照细胞中TORC多肽的生物功能相比，第一细胞中TORC多肽的生物功能是否受到调节；
其中如果发生这样的功能调节，则鉴定到调节剂。
15.权利要求14的方法，其中生物功能包括调节TORC多肽在多种亚细胞区室中的分布。
16.检测样品中TORC多肽的存在或对其进行定量的方法，包括步骤：
a)提供怀疑含有TORC多肽的样品；
b)在确保TORC多肽与特异性结合剂结合的条件下，使多肽接触结合TORC多肽的特异性结合剂；和
c)检测与TORC多肽结合的特异性结合剂的存在或对其进行定量。
17.权利要求16所述方法，其中样品来自细胞的亚细胞级分。
18.测定样品中TORC多肽的量与参照中TORC多肽的量是否不同的方法，其中所述方法包括步骤：
a)提供怀疑包含TORC多肽的样品；
b)在确保TORC多肽与特异性结合剂结合的条件下，使样品接触结合TORC多肽的特异性结合剂；和
c)测定在与步骤b)中相同的条件下，与样品结合的特异性结合剂的量和与参照结合的特异性结合剂的量是否不同，其中参照包括标准或参照量的TORC多肽。
19.权利要求18所述方法，其中样品来自细胞的亚细胞级分。
20.在第一受试者中促成诊断或预后疾病或病理的方法，其中在该病理中TORC多肽的亚细胞定位已知与非病理状态下TORC多肽的亚细胞定位不同，该方法包括步骤：
a)提供怀疑包含TORC多肽的来自第一受试者的样品；
b)在确保TORC多肽与特异性结合剂结合的条件下，使样品接触与权利要求16所述结合多肽的特异性结合剂；和
c)测定在与步骤b)中相同的条件下，与样品结合的特异性结合剂的量和与参照结合的特异性结合剂的量是否不同，其中参照由已知不患有该病理的第二受试者提供；
从而促成诊断或预后病理，或促成开发其治疗策略。
21.权利要求20所述的方法，其中样品来自细胞的亚细胞级分。
22.鉴定调节细胞中TORC多肽活性的物质的方法，包括：
a.使第一细胞接触物质；
b.使参照细胞接触对照物质；和
c.测定与参照细胞相比，第一细胞中TORC多肽的亚细胞区室化是否发生改变；
其中诱导第一细胞中TORC多肽亚细胞区室化相对于所述参照细胞改变的物质为调节细胞中TORC多肽活性的物质。
23.权利要求22的方法，其中所述TORC多肽选自TORC1、TORC2和TORC3。
24.权利要求22的方法，其中所述亚细胞区室化的改变为核转运。
25.权利要求22的方法，其中所述第一细胞和所述参照细胞各自包含重组TORC多肽。
26.在权利要求22的方法中最初鉴定的化合物的用途，所述化合物作为调节TORC多肽活性的物质用于治疗选自抑郁、心境障碍、精神分裂症、神经变性疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病的疾病，或者作为神经保护剂，或者用于增强记忆。
27.在权利要求22的方法中最初鉴定的化合物的用途，所述化合物作为调节TORC多肽活性的物质用于治疗选自动脉硬化、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、癌症、病理性血管发生、糖尿病、高血压、慢性痛、炎性疾病和自身免疫性疾病的疾病。
28.在权利要求22的方法中最初鉴定的作为调节TORC多肽活性的物质的化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗选自抑郁、心境障碍、精神分裂症、神经变性疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病和亨廷顿病、动脉硬化、骨关节炎、牛皮癣、哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)、类风湿性关节炎、癌症、病理性血管发生、糖尿病、高血压、慢性痛、炎性疾病和自身免疫性疾病的疾病，或者用作神经保护剂，或用于增强记忆。
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