KR20230009326A - 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 동물 모델 및 상기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 동물 모델 및 상기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사회적 우세성이 결여된 동물 모델 및 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 동물 모델은 CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제함으로써 사회적 우세성이 결여되도록 하였으며, 이러한 동물 모델은 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 모델로서 이용될 수 있다. 또한, 본 발명은 뇌의 EGF(Epidermal growth factor) 수용체에 대한 작용제(agonist)를 포함하는 조성물을 이용하여 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환을 예방하거나 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 동물 모델 및 상기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{AN ANIMAL MODEL OF DISEASES ASSOCIATED WITH LACK OR REDUCTION OF SOCIAL DOMINANCE AND A PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING SAID DISEASES}
본 발명은 사회적 우세성(social dominance)이 결여된 동물 모델 및 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환 또는 상태를 예방하거나 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 사회적 우세성 결여 동물 모델 및 뇌의 EGF(Epidermal growth factor) 수용체에 대한 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
cAMP 반응 요소 결합 단백질(cAMP-responsive element binding protein, CREB)은 다양한 세포에서 발현되며 몇몇 진핵생물의 전사 인자를 활성화시키는 것으로 잘 알려져 있다. 특히, CREB은 다양한 종류의 뇌 세포에서 사회적 우세(social dominance)와 관련된 신경전달물질 및 호르몬의 유전자 발현을 조절하는 중요한 세포 내 단백질이며, 우울증 치료에 대한 표적으로 연구된 바 있다. CREB이 인산화 될 때, CREB에 결합하는 CBP/P300 보조활성자(coactivator)가 cAMP 반응 요소 매개 유전자 전사(cAMP response element(CRE)-mediated gene transcription)를 활성화하기 위해 동원된다. 최근 새로운 CREB 보조활성자인 CREB-조절 전사 보조활성자(CREB-regulated transcription coactivator, CRTC; 조절된 CREB 활성 트랜스듀서, TORC)가 연구되고 있다. 기저 상태에서 CRTC는 14-3-3 단백질에 결합하고 세포질에서 인산화 상태로 존재한다. cAMP 및 칼슘의 증가는 CRTC의 탈인산화 및 14-3-3 단백질의 방출을 유도한다. 탈인산화된 CRTC는 핵으로 이동하고 CREB의 bZIP DNA 도메인에 결합하여 CRE-매개 유전자 전사를 활성화시킨다.
포유 동물 조직에서 발현되는 CRTC는 3 개의 아이소형(CRTC1, CRTC2 및 CRTC3)으로 구성된다. CRTC1은 주로 기억, 행동, 일주기 시계 및 에너지 소비와 관련되어 뇌에서 생성된다. 또한, CRTC2는 호르몬 항상성을 조절하는 뇌 및 이자섬(pancreatic islet)에서 발현된다. CRTC2와 CRTC3는 말초 조직, 간, 지방, 골수 유래 면역 세포에서 발견된다. CRTC2는 간에서 포도당 항상성을 유지하지만, CRTC3는 지방 조직의 에너지 균형 및 대식세포의 염증 조절 기능과 관련이 있다. 그러나 CRTC3가 뇌에서 어떻게 작동하는지에 대한 연구는 전무하다. 따라서 CRTC3가 뇌에서 발현되는지 여부와 그 역할에 대한 연구가 매우 필요한 실정이다. 특히, CRTC3가 CREB 활성화 이외의 유전자 발현에도 영향을 미치는지 밝혀낼 필요가 있다.
한편, 동물과 인간 사회는 사회적 계급과 밀접한 관련이 있다. 인간과 다른 많은 사회는 사회적 계급을 유지하고 의사 소통을 달성하기 위해 사회적 상호 작용이 필요한 기술이 요구된다. 이러한 사회적 관계에서 사회적 우세(social dominance)는 모든 동물 시스템 중 다수의 사회적 종에서 종종 관찰되는 행동이다. 대부분의 동물 사회에서 개체는 다른 개체를 상대적으로 지배적이거나 종속적인 상태로 만든다. 이렇게 형성된 사회적 계층화(social stratification)는 건강과 복지에 중요한 영향을 미친다. 즉, 사회적 지위와 우세는 생존, 건강 및 생식 성공의 정도를 결정하는 중요한 요소로 알려져 있다. 특히, 이러한 사회적 우세는 사람의 심리 상태와 연결되어 다양한 정신 질환 상태와 연관될 수 있음이 보고되고 있다. 구체적으로, 사회적 우세는 약물 중독(drug intoxication; 비특허문헌 1), 조현병(schizophrenia; 비특허문헌 2 및 3), 우울증(depressive disorder; 비특허문헌 4), 취약X증후군(fragile X syndrome; 비특허문헌 5), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 및 자폐증(autism; 비특허문헌 2 및 6)의 상태와 연관될 수 있음이 보고되었다.
사회신경과학 분야의 신경 이미징 및 분자적 기술의 발전으로 다양한 동물 모델과 인간 두뇌 이미징 방법을 통해 사회 계층을 형성하는 신경 기질을 조사할 수 있게 되었다. 인지 사회적 우세(perception social dominance)에서, 해마(hippocampus), 편도체(amygdala), 선조체(striatum), 전전두엽 피질(prefrontal cortex, PFC) 및 두정엽내구(intraparietal sulcus)를 포함하여 뇌의 다양한 위치에서 관찰되는 신경 활성화 패턴이 발견되었다.
해마에서의 글루코코르티코이드 수용체 동원은 사회적 우세 또는 복종에 의해 조절된다. 흥미롭게도 편도체는 사회적 순위, 사회적 보상 및 정서적 반응을 배우는 동안 중요한 역할을 수행하는 뇌 영역이다. 편도체는 해마, 선조체 및 PFC와 관련이 있다. 그러나 최근의 연구는 사회적 우세와 PFC의 연관성을 보여 주었다. PFC는 스트레스, 우울증 및 사회적 우세와 관련이 있는데, 다수 연구는 설치류 뇌에서 PFC 및 편도체와 관련된 사회적 행동 관련 신경 회로, 특히 공격적인 행동 및 사회적 부착에 대해 보고하였다. 이 두 가지 행동에 대한 뉴런 회로에 대한 연구는 광범위하게 특성화되었지만 사회적 우세 행동에 대한 연구는 여전히 알려져 있지 않았다.
이와 관련하여, 최근의 연구는 스트레스에 의한 사회적 우세의 변화가 PFC에서 편도체로의 신경 투영을 활성화시키는 것으로 나타났다. 또한, PFC에서 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid)-타입 글루타메이트 수용체(AMPA-R)의 인산화는 사회적 우세에서 매개된다. 실제로 편도체와 PFC는 사회적 우세와 관련이 있을 수 있다. AMPA-R의 서브유닛, GluA1(Glutamate receptor 1) 및 GluA2(Glutamate receptor 2)의 인산화는 사회적 우세의 조절을 위한 주요 분자에 관여한다. GluA1의 pS818 및 pS831은 만성 구속 스트레스에 의해 유의하게 감소되며, 장기 강화(long-term potentiation, LTP) 동안 시냅스 통합에 필요하다. 사회적 우세에서 AMPA-R의 역할에 대한 몇몇 증거에도 불구하고, CRTC3에 의한 CREB 조절에 관여하는 기저 분자 메커니즘은 거의 알려지지 않았다.
한편, 암피레귤린(Amphiregulin, AREG)은 제1형 막관통 당단백질 합성 단백질로서 다양한 세포에서 성장인자로 발견되었다(비특허문헌 7). AREG는 원래 암종 세포주의 성장을 억제하지만 섬유모세포(fibroblast) 및 난모세포(oocyte), 각질세포(keratinocyte) 및 신경줄기세포(neural stem cell)와 같은 정상 세포에서는 증식을 촉진하는 인자로 알려져 있다. 이와 같이, AREG는 증식, 생존, 운동성 및 혈관 형성에서 양방향 기능을 갖는다(비특허문헌 8 내지 10).
AREG 발현 부위에서 이들의 역할에 대한 연구는 활발히 진행되고 있지만, 뇌에서 AREG를 발현하는 세포와 이들이 뇌에서 어떤 역할을 하는가에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았다.
Anacker AM, Smith ML, Ryabinin AE. Establishment of stable dominance interactions in prairie vole peers: relationships with alcohol drinking and activation of the paraventricular nucleus of the hypothalamus. Soc Neurosci. 2014;9(5):484-94. Zhou Y, Kaiser T, Monteiro P, Zhang X, Van der Goes MS, Wang D, Barak B, Zeng M, Li C, Lu C, Wells M, Amaya A, Nguyen S, Lewis M, Sanjana N, Zhou Y, Zhang M, Zhang F, Fu Z, Feng G. Mice with Shank3 Mutations Associated with ASD and Schizophrenia Display Both Shared and Distinct Defects. Neuron. 2016 Jan 6;89(1):147-62. Wallen-Mackenzie A, Nordenankar K, Fejgin K, Lagerstrφm MC, Emilsson L, Fredriksson R, Wass C, Andersson D, Egecioglu E, Andersson M, Strandberg J, Lindhe O, Schiφth HB, Chergui K, Hanse E, Lεngstrφm B, Fredriksson A, Svensson L, Roman E, Kullander K. Restricted cortical and amygdaloid removal of vesicular glutamate transporter 2 in preadolescent mice impacts dopaminergic activity and neuronal circuitry of higher brain function. J Neurosci. 2009 Feb 18;29(7):2238-51. Yang CR, Bai YY, Ruan CS, Zhou HF, Liu D, Wang XF, Shen LJ, Zheng HY, Zhou XF. Enhanced aggressive behaviour in a mouse model of depression. Neurotox Res. 2015 Feb;27(2):129-42. Saxena K, Webster J, Hallas-Potts A, Mackenzie R, Spooner PA, Thomson D, Kind P, Chattarji S, Morris RGM. Experiential contributions to social dominance in a rat model of fragile-X syndrome. Proc Biol Sci. 2018 Jun 13;285(1880):20180294. Huang WH, Wang DC, Allen WE, Klope M, Hu H, Shamloo M, Luo L. Early adolescent Rai1 reactivation reverses transcriptional and social interaction deficits in a mouse model of Smith-Magenis syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Oct 16;115(42):10744-10749. Fukuda S, Nishida-Fukuda H, Nakayama H, Inoue H, Higashiyama S. Monoubiquitination of pro-amphiregulin regulates its endocytosis and ectodomain shedding. Biochem Biophys Res Commun. 2012 Apr 6;420(2):315-20. Shoyab M, Plowman GD, McDonald VL, Bradley JG, Todaro GJ. Structure and function of human amphiregulin: a member of the epidermal growth factor family. Science. 1989 Feb 24;243(4894 Pt 1):1074-6. Kato M, Inazu T, Kawai Y, Masamura K, Yoshida M, Tanaka N, Miyamoto K, Miyamori I. Amphiregulin is a potent mitogen for the vascular smooth muscle cell line, A7r5. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Feb 21;301(4):1109-15. Falk A, Frisιn J. Amphiregulin is a mitogen for adult neural stem cells. J Neurosci Res. 2002 Sep 15;69(6):757-62.
본 발명은 상술한 문제점을 모두 해결하는 것을 그 목적으로 한다.
본 발명은 사회적 우세성이 결여된 동물 모델 및 이의 제조 방법을 제공하는 것을 일 목적으로 한다.
본 발명은 사회적 우세성이 결여된 동물 모델을 이용하여 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환 또는 정신 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
본 발명은 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명은 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 목적으로 제한되지 않는다. 본 발명의 목적은 이하의 설명으로 보다 분명해질 것이며, 청구범위에 기재된 수단 및 그 조합으로 실현될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 대표적인 구성은 다음과 같다.
본 발명의 일 태양에 따르면, CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 사회적 우세성 결여 동물 모델 및 이의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 태양에 따르면, 상기 사회적 우세성 결여 동물 모델을 이용하여 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환 또는 정신 질환의 치료제를 스크리닝하는 방법이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 뇌의 EGF(Epidermal growth factor) 수용체에 대한 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
본 발명에 따른 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 사회적 우세성 결여 동물 모델은 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환, 특히 사회적 패배 스트레스(social defeat stress)를 동반하거나 이에 의해 유발되는 질환에 대한 동물 모델로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 개체의 사회적 우세 순위를 상승시키는 효과가 있으므로, 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환을 효과적으로 예방하고 치료할 수 있다. 따라서 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환인 만성 염증(chronic inflammation), 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation), 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder), 공격적 성격(aggressive personality), 만성 스트레스(chronic stress), 불안신경증(anxiety neurosis), 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애, 조현병(schizophrenia), 기분 장애, 조증(mania), 우울증(depressive disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 취약X증후군(fragile X syndrome), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder), 자폐증(autism) 등의 예방 및 치료에 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1a 내지 도 1c는 뇌의 각 부위별로 CRTC3의 발현 여부를 확인한 결과를 나타낸다:
도 1a는 WT 마우스 뇌의 동결절편을 면역조직화학법에 의해 CRTC3에 대한 염색을 수행하여 얻은 이미지로서, 각각 변연전 피질(Prelimbic cortex, PrL)을 포함하는 전두엽 피질(Prefrontal cortex, PFC), 대상피질(Cingulate cortex, Cg), 치상회(Dentate gyrus, DG), CA(Cornu Ammonis)3 영역, 해마(Hippocampus), 시상하부(Hypothalamus, Hy), 편도체(Amygdala, Amy), 복측피개영역(Ventral tegmental area, VTA) 및 내측등쪽핵(Medial dorsal nucleus, MD)을 포함하여 뇌의 전체적인 영역에 대한 CRTC3의 발현 정도를 확인하였다.
도 1b는 뇌에서 발현된 CRTC3 및 특정 세포의 마커를 이중 염색한 결과를 나타낸 것으로서, 각각 성상교세포 마커(GFAP, s100β), 뉴런 마커(NeuN) 및 미세아교세포 마커(Iba1)을 사용하여 공동 위치화를 확인한 현미경 이미지이다.
도 1c는 일차 성상교세포, 뉴런 및 미세아교세포에서 발현되는 CRTC3 mRNA 수준을 확인하기 위해 qRT-PCR을 수행한 결과를 그래프로 나타낸다(one-way ANOVA, *** p < 0.001).
도 2a 내지 도 2m은 CRTR3가 넉아웃(knockout, KO)된 마우스에서 사회적 우세성이 감소됨을 확인한 행동 실험 결과를 나타낸다(모든 그래프에서 데이터는 평균±평균의 표준 오차(Mean±SEM)로 표시):
도 2a는 튜브 우세 시험(tube dominance test)에서 승리/패배 확정 방법과 관련된 사진을 나타낸다.
도 2b는 튜브 우세 시험에서 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스의 승점을 나타낸다(WT, n = 33; CRTC3 KO, n = 20; Mann-Whitney U test, p = 0.0003).
도 2c 및 도 2d는 튜브 우세 시험에서 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스의 밀거나(Push-initiated; 도 2c) 밀리는(Push-back; 도 2d) 횟수 및 평균 시간을 그래프로 나타낸다(Mann-Whitney U test, 모두 p < 0.0001).
도 2e는 튜브 우세 시험에서 마우스가 밀리는 동안 저항한 시간의 백분율을 그래프로 나타낸다(Mann-Whitney U test, p = 0.1524).
도 2f는 튜브 우세 시험에서 마우스가 밀리고 있는 동안 후퇴한 시간의 백분율을 그래프로 나타낸다(Mann-Whitney U test, p = 0.1524).
도 2g는 동일한 케이지에서 사육되거나(좌측 그래프, Familiar group; WT, n = 51; CRTC3 KO, n = 28; 튜브 시험, n = 56; Chi-square, *** p < 0.001) 서로 직면하지 않은 상이한 케이지에서 사육된(우측 그래프, Unfamiliar group; WT, n = 12; CRTC3 KO, n = 11; 튜브 시험, n = 55; Chi-square, *** p < 0.001) WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스에 대한 튜브 우세 시험 결과로서, 승리한 마우스는 1점, 패배한 마우스는 0점으로 설정하여 계산되었다.
도 2h 동일한 무게의 WT 마우스와 CRTC3 마우스를 매칭하여 튜브 우세 시험을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2i는 동일한 케이지에서 사육된 암컷 WT 마우스 및 암컷 CRTC3 KO 마우스에 대한 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 2j는 상이한 케이지에서 사육된 암컷 WT 마우스 및 암컷 CRTC3 KO 마우스에 대한 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 2k는 웜 스팟 시험에서 마우스가 웜 스팟에 머문 시간(좌측 그래프) 및 이를 통해 측정한 사회적 순위(우측 그래프)를 그래프로 나타낸다(Mann-Whitney U test, p < 0.0001).
도 2l은 소변 표시 시험에서 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 소변 스팟 면적을 그래프로 나타낸다.
도 2m은 소변 표시 시험에서 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 소변 스팟을 닌하이드린 반응을 이용하여 격자무늬가 그려진 OHP 필름 상에 각각 표시한 그림을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3d는 CRTC3 KO 마우스에 대한 다양한 행동 실험 결과를 나타낸다:
도 3a는 Y-미로 시험에서 새로운 팔을 탐색하는 시간(좌측 그래프) 및 진입 횟수(우측 그래프)를 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 각각에 대해 측정한 그래프를 나타낸다(WT, n = 17; CRTC3 KO, n = 16; t-test).
도 3b는 모리스 수중 미로 시험에서 탈출 플랫폼에 도달하기 위한 수영 시간(s), 수영 거리(cm) 및 프로브 시험 동안 플랫폼이 설치되었던 영역에 머문 시간(s)을 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스에서 각각 측정한 결과를 나타낸다(WT, n = 21; CRTC3 KO, n = 18; t-test).
도 3c는 후각 선호 시험에서 땅콩 버터와 2-MBA(2-methylbutyric acid)에 대해 관심을 보이는 시간을 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 각각에 대해 측정한 결과를 나타낸다.
도 3d는 새로운 물체 인식 시험에서 새로운 모형에 다가가 탐색하는 시간을 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 각각에 대해 측정한 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 CRTC3와 관련된 유전자의 발현 확인을 위해 마우스 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 전체 전사체 프로파일 분석을 수행한 결과를 나타낸다:
도 4a는 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스의 성상교세포에 25 μM의 포스콜린(FSK)을 2시간 동안 처리한 후 유전자의 발현 배수 변화 값을 나타낸 히트맵이다.
도 4b는 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스의 성상교세포에서 유전자 발현의 상대적 비율을 마이크로어레이로 분석한 결과로서, 포스콜린 처리 후 각 마우스에서 유전자의 전사 수준 차이를 비교하여 그 값이 큰 유전자부터 낮은 유전자 순으로 나열한 그래프이다.
도 5a 내지 도 5f는 성상교세포에서 AREG와 CRTC3의 연관성 및 AREG의 세포 형태 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸다:
도 5a는 AREG를 발현하는 세포를 확인하기 위해 일차 성상교세포, 뉴런 및 미세아교세포로부터 cDNA를 합성하여 qRT-PCR을 수행한 결과를 나탄낸다(One-way ANOVA, *** p < 0.001).
도 5b는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 일차 성상교세포 샘플에서 qRT-PCR을 수행하여 AREG의 발현을 확인한 결과를 나타낸다(Unpaired t-test, ** p = 0.0041).
도 5c는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 일차 성상교세포에 25μM 포스콜린(FSK)을 처리하여 AREG의 발현 수준을 확인한 결과를 나타낸다(Two-way ANOVA, * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001).
도 5d는 루시퍼레이즈 분석 결과를 나타낸 것으로서, AREG 프로모터에 루시퍼레이즈 발현 유전자를 삽입한 후 루시퍼레이즈의 활성을 측정함으로써 CRTC3의 발현 또는 포스콜린(FSK)의 처리 여부에 따른 AREG의 발현양을 측정한 결과를 나타낸다.
도 5e는 CRTC3 KO 일차 성상교세포에 AREG(200 ng/ml)를 처리한 후 면역세포화학법에 의해 GFAP으로 염색하여 WT 및 AREG 미처리 CRTC3 KO 성상교세포와 그 형태를 비교한 이미지를 나타낸다.
도 5f는 AREG 처리 여부에 따른 CRTC3 KO 성상교세포의 세포 형태 지수(CIS)를 평가한 결과를 나타낸다(One-way ANOVA, * p < 0.05, ** p < 0.01).
도 6a 및 도 6b는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 대뇌피질(CTX) 및 편도체(AMY)에서 p-STAT3, STAT3, p-GluA1 및 GluA1의 발현 수준을 웨스턴 블롯팅으로 측정한 결과를 나타낸다. 모든 밴드는 β-액틴으로 정규화되었으며, 그래프에서 데이터는 평균±평균의 표준 오차(Mean±SEM)로 표시되었다:
도 6a는 CRTC3 KO 마우스의 대뇌피질(CTX)에서, p-STAT3의 발현은 STAT3과 비교하여 감소되고(** p = 0.0031), p-GluA1 및 GluA1의 발현 수준이 약간 감소됨을 보여준다(p-GluA1, p = 0.0973; GluA1, p = 0,0578)(Unpaired t-test, Mann-Whitney test).
도 6b는 CRTC3 KO 마우스의 편도(AMY)에서, p-STAT3의 발현이 현저히 감소하고(Mann Whitney test, * p = 0.0379), STAT3, p-GluA1 및 GluA1의 발현 수준은 증가하였음을 보여준다(STAT3, ** p = 0.0079; p-GluA1, ** p = 0.0021; GluA1, *** p = 0.0006)(Unpaired t-test, Mann-Whitney test).
도 7a 내지 도 7f는 CRTC3 KO 마우스와 낮은 순위를 가진 C57BL/6 마우스에 AREG, AREG-EGF, AREG-HB 또는 EGF를 주입하고 튜브 우세 시험 또는 웜 스팟 시험을 통해 사회적 순위의 변화를 측정한 결과를 나타낸다. 약물 주입 전후의 모든 튜브 시험 승점 그래프에서 회색 그래프는 각 개별 마우스의 승점을 나타내고 빨간색 그래프는 평균 승점의 변화를 나타낸다:
도 7a는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 그룹에서 AREG 주입 전후의 튜브 시험 결과를 나타낸다.
도 7b는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 그룹에서 AREG 주입 전후로 웜 스팟 시험에 의해 평가된 순위(좌측 그래프) 및 웜 스팟에 머무른 시간(우측 그래프)의 변화를 나타낸다(Wilcoxon signed rank test, p = 0.0313(좌측 그래프), p = 0.0129(우측 그래프)).
도 7c는 C57BL/6 마우스 그룹에서 가장 낮은 순위의 마우스에 AREG를 주입한 전후의 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 7d는 C57BL/6 마우스 그룹에서 가장 낮은 순위의 마우스에 AREG-EGF를 주입한 전후의 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 7e는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 그룹에서 AREG-EGF를 주입한 전후의 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 7f는 C57BL/6 마우스 그룹에서 가장 낮은 순위의 마우스에 AREG-HB 또는 마우스 EGF(mEGF)를 주입한 전후의 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 8a 및 도 8b는 CRTC3 KO 마우스에서 성상교세포 특이적으로 암피레귤린을 발현시킨 경우 사회적 우세 순위가 회복되는 것을 확인한 결과이다:
도 8a는 CRTC3 KO 마우스에 AAV5-GFAP-mAREG 94-191 바이러스를 투여하여 성상교세포 특이적으로 AREG를 발현시킨 전후의 튜브 우세 시험 결과를 나타낸다.
도 8b는 CRTC3 KO 마우스에 AAV5-GFAP-mAREG 94-191 바이러스를 투여하여 성상교세포 특이적으로 AREG를 발현시킨 전후의 웜 스팟 시험 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9b는 랫트에서 AREG-EGF의 처리에 따른 PFC와 PC 사이의 rsFC를 확인한 결과를 나타낸다:
도 9a의 좌측 그래프는 설치류의 사회적 우세-관련 뇌 ROI의 rsFC 매트릭스 나타내며, PBS(좌측 하단) 및 AREG-EGF(우측 상단) 그룹으로 표시된다. 색상 바는 Fisher z-변환 상관 계수(z-CorrCoef)를 나타낸다. 도 9a의 우측 그래프는 rsFC(AREG-EGF - PBS)와 동일한 ROI로 표시된 그룹 차별성 맵을 나타낸다(# P < 0.05, @ P < 0.01, Student's t-test). 색상 막대는 그룹 차이를 나타낸다.
도 9b는 PFC와 PC 중심의 ROI 간의 평균 rsFC 매트릭스를 나타낸다(* p < 0.05, Student's t-test; L, 왼쪽 반구;R, 오른쪽 반구).
도 9c의 좌측 이미지는 fMRI 측정 위치로서 Ca1/2(24b'/24a') 영역을 중심으로 지정하여 촬영한 것을 나타낸다(시상(coronal) 단면(위) 및 관상(saggital) 단면(아래)에서의 촬영 위치를 나타냄). 도 9c의 우측 이미지는PBS(상단) 및 AREG-EGF(중단) 투여 그룹에서 rsFC 차이를 뇌 단면에서의 신호 변화로 나타낸 것이며, 하단 이미지는 PBS와 AREG-EGF 투여 그룹 간의 차이를 보여준다.
도 10a 내지 도 10e는 마우스에서 AREG의 투여에 따른 PFC와 PC 사이의 rsFC를 확인한 결과를 나타낸다:
도 10a는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스에서 AREG의 투여 전 설치류의 사회적 우세-관련 뇌 ROI의 rsFC 매트릭스(우측) 및 rsFC(WT - KO)와 동일한 ROI로 표시된 그룹 차별성 맵을 나타낸다.
도 10b는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스에서 AREG의 투여 전 PFC와 PC 중심의 ROI 간의 평균 rsFC 매트릭스를 나타낸다.
도 10c는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스에서 AREG의 투여 후 설치류의 사회적 우세-관련 뇌 ROI의 rsFC 매트릭스(우측) 및 rsFC(WT - KO)와 동일한 ROI로 표시된 그룹 차별성 맵을 나타낸다.
도 10d는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스에서 AREG의 투여 후 PFC와 PC 중심의 ROI 간의 평균 rsFC 매트릭스를 나타낸다.
도 10e의 좌측 이미지는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스에서 각각 AREG 투여 전후의 rsFC 차이를 뇌 단면에서의 신호 변화로 나타낸 것이며, 하단 이미지는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 사이의 차이를 보여준다.
도 10e의 우측 이미지는 fMRI 측정 위치로서 Ca1/2 영역을 중심으로 지정하여 촬영한 것을 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 AREG의 EGF 및 HB 도메인이 다양한 종에서 보존된 결과를 보여준다:
도 11a는 다양한 종에서 AREG 단백질의 아미노산 서열을 보여준다(Homo sapiens, 인간; Bos Taurus, 소; Sus scrofa, 돼지; Mus musculus, 마우스; Rattus norvegicus, 갈색쥐).
도 11b는 마우스에 투여된 AREG-EGF 및 AREG-HB 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 구현예에 관하여 특정 도면을 참조하여 기술될 것이지만, 본 발명은 이에 한정되지 않고, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 본 발명의 다양한 구현예/실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 본 명세서에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 본 발명의 기술적 사상과 범위를 벗어나지 않으면서 일 구현예/실시예에서 다른 구현예/실시예로 변경되거나 구현예/실시예들이 조합되어 구현될 수 있다. 본 명세서에 사용된 기술 및 학술 용어들은, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 분야에서 일반적으로 사용되는 것과 같은 의미를 갖는다. 본 명세서를 해석할 목적으로 하기 정의들이 적용될 것이고, 단수로 사용된 용어는 적절한 경우에는 복수형을 포함할 것이며 그 반대도 마찬가지이다.
정의
본 명세서에서 사용되는 용어 "동물 모델"은 인간의 질병과 유사한 상태의 질병에 걸리거나 선천적으로 그 질병에 걸리도록 만들어낸 동물을 의미한다.
용어 "사회적 우세(성)(social dominance)"는 집단 또는 군집을 이루어 생활하는 사회적 동물 사이에 나타나는 사회성 행동의 한 부류로서, 상하 관계를 포함하는 타인과의 사회적 상호 관계 일체를 의미한다. 본 용어 "사회적 우세(성)"는 용어 "사회적 우위(성)" 또는 "사회적 지배(성)"과 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 용어 "사회적 우월(성)(social superiority)" 또는 "사회적 계급(social hierarchy)"이 가지는 의미를 포괄한다.
용어 "사회적 패배 스트레스(social defeat stress)"는 사회적 상호 관계 또는 사회적 대치(social confrontation) 중 사회적 패배로 인한 종속 동물 또는 사회적 우세 순위가 상대적으로 낮은 동물에게 나타나는 스트레스 반응을 의미한다. 본 발명에서, 사회적 우세성이 결여 또는 감소된 동물은 사회적 패배 스트레스 반응이 나타날 수 있다.
용어 "유전자"는 생물학적 기능과 연관된 임의의 핵산을 나타내는 데에 광범위하게 사용된다. 유전자는 코딩 서열 및/또는 이러한 코딩 서열의 발현을 위해 요구되는 조절 서열을 포함할 수 있다.
용어 "유전자의 발현 억제"는 유전자의 발현을 감소시키는 모든 행위를 의미하며, 구체적으로 유전자 넉아웃(knockout), 넉다운(knockdown), 유전자 DNA 서열에 결실, 중복, 역위, 또는 교체 등의 변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다.
용어 "단백질의 활성 억제"는 표적 단백질의 활성을 억제 또는 저해하는 모든 행위를 의미한다. 상기 단백질의 활성 억제는 표적 단백질의 활성을 직접적으로 억제하거나 다른 단백질과의 상호작용을 방해하여 이의 기능을 억제하는 것을 의미할 수 있다. 상기 단백질의 활성을 억제할 수 있는 물질로는 예를 들어, 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 항체 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 상기 표적 단백질은 CRTC3 단백질을 의미한다.
용어 "성상교세포(astrocyte)"는 "성상세포"라고도 하는데, 신경계에 가장 많은 수를 차지하는 세포로서 뉴런이 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌 내의 이온 농도를 조절하면서 뉴런 활성을 보조하는 역할을 수행한다고 알려져 있다.
용어 "야생형(wildtype) 동물"은 당업자에 의해 이해되는 해당 분야의 용어이며 돌연변이 또는 변이체 형태와 구별되는, 자연에서 발생하는 전형적인 형태의 동물을 의미한다.
용어 "기능적 연결성(functional connectivity)"은 해부학적으로 구분된 뇌의 영역들에서 동기화(synchronized)된 활동을 보이는 것을 의미한다. 즉, 공간적으로 떨어져 있지만 시간적으로 유사한 활동 패턴을 나타내는 두뇌 영역들은 기능적으로 연결되어 있는 것으로 본다.
용어 "작용제(agonist)"는 수용체와 결합되어 수용체를 활성화시킴으로써 신호전달경로와 같은 생물학적 반응을 활성화시키는 모든 화합물을 의미한다. 본 발명에서, EGF 수용체 작용제는 EGF수용체에 결합하여 EGF로 유도되는 신호전달경로를 활성화시키는 모든 화합물을 의미할 수 있다.
용어 "개체"는 "환자"와 상호교환적으로 사용되고, 사회적 우세성 결여 또는 저하의 예방 또는 치료를 필요로 하는 포유동물, 예를 들어, 영장류(예: 인간), 반려 동물(예: 개, 고양이 등), 가축 동물(예: 소, 돼지, 말, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예: 랫트, 마우스, 기니피그 등)일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 개체는 인간이다.
용어 "치료"는 일반적으로 목적하는 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득하는 것을 의미한다. 이러한 효과는 질병 및/또는 이러한 질병으로 인한 유해 효과를 부분적으로 또는 완전히 치유하는 점에서 치료적 효과를 가진다. 바람직한 치료적 효과는 질환의 발생 또는 재발 방지, 증상의 호전, 질환의 임의의 직접 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이의 방지, 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 차도 또는 개선된 예후를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 "치료"는 이미 나타난 질환 또는 장애의 의료적 개입을 의미할 수 있다.
용어 "예방"은 질병 또는 이의 증상을 부분적으로 또는 완전히 예방한다는 관점에서 목적하는 예방적인 약리학적 효과 및/또는 생리학적 효과를 수득함을 의미한다.
용어 "투여"는 개체에 예방적 또는 치료적 목적(예컨대, 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료)을 달성하기 위한 물질(예컨대, 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제)을 제공하는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 약자(약어)의 전체 이름(full name)은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
약자(abbreviation) 전체 이름(full name)
PFC Prefrontal cortex
PrL Prelimbic cortex
IL Infralimbic cortex
Cg1(24b) Primary cingulate cortex anterior part
Cg2(24a) Secondary cingulate cortex anterior part
Cg1(24b') Primary cingulate cortex posterior part
Cg2(24a') Secondary cingulate cortex posterior part
PC Parietal cortex
PtA Parietal associative cortex
PPC Posterior parietal cortex
NAc Nucleus accumbens
STR Striatum
CPu Caudate putamen
HPC Hippocampus
Amyg Amygdala
TH Thalamus
Hb Habenular
MD Medial dorsal nucleus
VTA Ventral tegmental area
Hypo Hypothalamus
DRN Dorsal raphe nucleus
M1 Primary motor cortex
S1DZ Primary somatosensory cortex dysgranular zone
S1BF Primary somatosensory cortex barrel field
S1Tr Primary somatosensory cortex trunk
LPtA Lateral parietal associative cortex
MPtA medial parietal associative cortex
V1B primary visual cortex binocular area
L/R Left and right bilateral ROIs
IH Interhemispheric ROI
동물 모델 및 이의 제조 방법
본 발명은 부분적으로 CRTC3이 사회적 우세성과 유의미한 관련성이 있으며, 동물에서 CRTC3의 기능 저해에 의해 사회적 우세성이 결핍되거나 현저하게 감소될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, CRTC3이 뇌의 여러 영역에서 발현되며 뇌에 존재하는 다양한 종류의 세포들 중 주로 성상교세포(astrocyte)에서 발현됨을 확인하고, 상기 CRTC3 유전자의 기능을 규명하기 위해 CRTC3 유전자가 넉아웃된 수컷 및 암컷 CRTC3 KO 마우스에서 튜브 우세 시험, 웜 스팟 시험 및 소변 표시 시험을 통해 사회적 우세성을 평가한 결과, 야생형(wildtype, WT) 마우스와 비교하여 CRTC3 마우스의 사회적 우세 순위(또는 사회적 서열)가 현저하게 낮다는 것을 발견하였다(실시예 1 및 실시예 3 참조). 특히, CRTC3 KO 마우스를 WT 마우스와 함께 사육한 경우와 분리하여 사육한 경우 모두에서 CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스보다 사회적 우세 순위가 가장 낮은 것으로 나타났다. 이와 같이, 동물(특히, 사회적 동물)에서 CRTC3 유전자의 기능이 결핍되거나 감소하면 사회적 우세성이 결여되거나 감소될 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, CRTC3 KO 마우스는 상기 사회적 우세성의 결여나 감소 외에, 단기 기억이나 장기 기억의 손상, 시각, 후각 등과 같은 감각과 관련된 행동의 변화는 나타나지 않는 것으로 확인되었다(실시예 4 참조).
이처럼, 본 발명자들은 CRTC3 유전자 또는 단백질은 동물의 다른 정신 활동이나 행동에는 거의 영향을 미치지 않으면서도 사회적 우세와 관련된 행동에 중대한 영향을 미친다는 사실을 발견하였다. 따라서 본 발명에 따른 동물 모델은 사회적 우세성이 결여된 동물 모델로서 이용될 수 있으며, 나아가 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환(예컨대, 정신 질환) 모델로서 활용될 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 사회적 우세성(social dominance) 결여 동물 모델이 제공된다. 또한, CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함하는 사회적 우세성 결여 동물 모델의 제조 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 동물 모델은 뇌 특이적으로 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 것일 수 있다. 또한, 상기 동물 모델은 뇌에 존재하는 세포 중 성상교세포 특이적으로 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 것일 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 제조 방법은 동물에서 뇌 특이적으로 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함할 수 있다. 또한, 상기 제조 방법은 동물에서 뇌의 성상교세포 특이적으로 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 "CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된"은 CRTC3 유전자 또는 CRTC3 단백질의 기능이 저해 또는 방해되는 것을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 CRTC3 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 CRTC3 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는, CRTC3 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, CRTC3 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 동물 모델은 CRTC3 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)하여 제조된 것일 수 있다. 전술한 바와 같이, CRTC3 유전자의 발현 억제는 유전자의 넉아웃, 넉다운 외에도 유전자 DNA 서열에 결실, 중복, 역위, 또는 교체 등의 변이를 도입함으로써 이루어질 수 있다.
여기에서, 용어 "넉아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, 용어 "넉다운"은 예를 들어, RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 저하(degradation)시켜 유전자의 발현량을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들면, CRTC3 넉아웃 동물은 이의 CRTC3 유전자가 불활성화되거나, 파괴되거나, 결실되거나, 또는 "넉아웃"된다.
또 다른 구현예에서, 상기 동물 모델은 CRTC3 단백질의 활성이 억제된 것일 수 있다. 전술한 바와 같이, CRTC3 단백질의 활성 억제는 CRTC3 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 모방체, 기질 유사체, 앱타머, 항체 등에 의해 수행될 수 있으며, 공지된 기술을 제한 없이 이용할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 동물 모델은 야생형(wildtype, WT) 동물과 비교하여 암피레귤린(Amphiregulin, AREG) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 감소되어 있는 것을 특징으로 할 수 있다. 후술한 바와 같이, CRTC3는 CREB의 표적 유전자인 AREG의 발현을 직접 조절하며, 따라서 상기 동물 모델은 특히 뇌에서 AREG의 발현 또는 활성이 현저하게 감소된다. 이러한 AREG의 결여 또는 감소에 의해 사회적 우세성의 손상이 발현되는 것으로 생각된다.
또한, 상기 동물 모델은 WT 동물과 비교하여 기억과 관련된 행동, 감각과 관련된 행동, 또는 이들 모두에 대한 변화가 나타나지 않을 수 있다. 이러한 특질로 인해 본 발명의 동물 모델은 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 다양한 질환이나 상태에 대한 모델로 활용될 수 있다.
게다가, 상기 동물 모델은 야생형 동물과 비교하여 뇌의 전전두엽 피질(prefrontal cortex, PFC)과 두정엽 피질(parietal cortex, PC)의 기능적 연결성이 저하된 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스에 비해 PFC와 PC 사이의 rsFC(휴식상태 기능적 연결성)이 현저하게 떨어져 있는 것이 확인되었으며, 이는 CRTC3가 뇌에서PFC와 PC 영역 간의 연결성에 중요한 기능을 수행함을 보여준다(실시예 11 참조).
또 다른 구현예에서, 상기 동물 모델은 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환에 대한 동물 모델로 사용될 수 있다.
상기 질환은 사회적 패배 스트레스(social defeat stress)를 동반하거나 이에 의해 유발되는 질환일 수 있으며, 상세한 내용은 하기 "약학 조성물 및 이를 이용한 질환의 예방 또는 치료 방법" 부분에서 기술된 내용과 동일하다.
일 구현예에서, 상기 사회적 패배 스트레스를 동반하거나 이에 의해 유발되는 질환은 만성 염증(chronic inflammation), 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation), 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder), 공격적 성격(aggressive personality), 만성 스트레스(chronic stress), 불안신경증(anxiety neurosis), 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애, 조현병(schizophrenia), 기분 장애, 조증(mania), 우울증(depressive disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 취약X증후군(fragile X syndrome), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 및 자폐증(autism)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다. 각 질환과 관련된 상세한 내용은 하기 "약학 조성물 및 이를 이용한 질환의 예방 또는 치료 방법" 부분에서 기술된 내용과 동일하다.
상기 동물 모델에서 사용될 수 있는 동물은 인간에게 나타나는 각종 질환을 지닌 동물로서 몇 세대를 요하는 장기간의 유전 연구나 직접 인간을 대상으로 실험이 어려운 장기이식 실험 등 인체 질환 규명과 치료법 개발에 사용되는 동물 모델에 해당할 수 있는 인간을 제외한 동물을 제한 없이 포함한다. 구체적으로, 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 동물 중 마우스 또는 랫트는 번식능력, 발육능력, 및 환경 적응능력이 좋고 자손의 수가 많아 실험군에 속하는 개체 수를 많이 확보할 수 있어 신뢰할 수 있는 결과를 얻을 수 있으며, 조작이 간편한 장점이 있기 때문에, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 마우스 및 랫트를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구현예에서, 사회적 우세성 결여 동물 모델의 제조를 위해 억제되는 CRTC3 유전자 또는 CRTC3 단백질은 공지된 CRTC3의 유전자 또는 단백질 정보에 기초하여 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다.
하기 표 2에 마우스(Mus musculus), 랫트(Rattus norvegicus) 및 원숭이(Macaca mulatta)의 예시적인 CRTC3 유전자(CRTC3 mRNA의 ORF) 및 단백질의 정보가 제공된다. 다른 구현예에서, 마우스를 이용하여 본 발명의 동물 모델을 제조하는 경우, 당업자는 하기 서열번호 1의 염기 서열을 갖는 CRTC3 DNA(또는 mRNA)를 넉아웃 또는 넉다운할 수 있다. 또는, 대안적으로 하기 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 CRTC3 단백질에 특이적인 물질을 사용하여 CRTC3의 활성을 저해할 수도 있다.
랫트, 원숭이 등을 모델 동물로 사용하는 경우에도 상기와 동일하다. 한편, 하기 표 2에 기재된 특정 동물의 CRTC3 서열은 예시적인 것이며, 다른 동물에 대한 CRTC3의 DNA 또는 단백질 서열은 미국 국립생물정보센터(www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 제공하는 데이터베이스에서 용이하게 찾을 수 있다.
구분 종류 서열 서열 목록
마우스 CRTC3 DNA ATGGCCGCCTCGCCCGGTTCGGGCAGCGCCAACCCGCGGAAGTTCAGTGAGAAGATCGCCCTGCACACGCAGCGGCAGGCCGAGGAGACGCGGGCCTTCGAGCAGCTCATGACCGACCTCACCCTGTCCCGGGTTCAGTTTCAGAAGCTTCAGCAGCTGCGCCTTACCCAGTACCACGGGGGATCCTTACCCAACGTGAGCCAGCTGCGGAACAGCGCGCCAGAGTTCCAGCCATCACTTCATCAAGCCGATAATGTTCGTGGAACCCGCCACCATGGGCTGGTGGAGAGGCCAGCCCGGAACCGCTTCCACCCCCTTCACCGAAGGTCTGGGGACAAGCCAGGGAGACAGTTTGATGGGAATGCTTTCGCAGCCAGTTATTCTTCACAGCACCTGGATGAGAGCTGGCCACGGCAACAGCCTCCTTGGAAAGAAGAGAAGCATCCTGGATTCAGGCTAACATCTGCACTTAACAGGACCAATTCTGATTCTGCTCTTCACACGAGTGCTCTGAGCACCAAACCCCAGGACCCCTATGGAGGAGGAGGCCAGTCAGCCTGGCCTGCCCCATACATGGGTTTCTGTGATGGTGAAAACGATGGCCATGCGGAAGTAGCCGCCTTCCCGGGTCCGCTGAAAGAAGAGAATCTGTTAAATGTCCCGAAGCCACTGCCTAAACACCTGTGGGAGAGCAAGGAGATCCAGTCCCTGTCTGGGCGCCCTCGATCCTGTGATGTTGGGGGCGGCAATGCTTTCCCACATAATGGCCAGAACACAGGCCTCTCACCGTTCCTGGGCACCCTGAACACCGGAGGGTCGTTACCAGATCTAACCAACCTCCACTACTCAGCACCCCTGCCAGCCTCCCTGGACACCAGCGACCACCTCTTTGGTAGCATGAGTGTGGGGAACAGCGTGGGCAACCTTCCAGCTGCCATGACTCACCTGGGGATAAGAACCTCCTCTGGTCTCCAAAGTTCTCGAAGTAACCCTTCCATCCAAGCCACACTCAGTAAGATGGCACTCTCCTCGTCCCTCAAGTGCCACCCGCAGCCGTCTGTGGCCAACGCCTCTGCTCTGCACCCCTCCCTCCGGCTCTTCTCCCTTAGCAACCCGTCTCTTTCCACCACAAACCTGAGTGGCCCCTCTCGGCGCAGGCAGCCTCCAGTCAGCCCTCTCACGCTCTCTCCTGGCCCTGAAGCACATCAAGGCTTCAGCAGACAGCTCTCTGCGACCAGCCCACTGAACCCGTATCCTGCCTCCCAGATGGTGACCTCAGAGCAGAGCCCACTTTCCTTCCTGCCCACAGACGCTCAAGCCCAAGTGTCCCCACCACCCCCTTACCCCACACCCCAGGAGCTGCCTCAGCCACTCCTACAGCAGCCCCATGCCCAGGAGCCCCCAACTCAGCAGCCCCAGGCAGCCCCCTCCCTGCCACAGTCAGACTTCCAGCTCCTCACTGCCCAGGGCTCAGCTTTGACCAGCTTCTTCCCGGATGTGCGCTTTGACCAACAGCCCATGAGGCCCAGCCCTGCCTTTCCTCAGCAGGTGCCTTTGGTACAGCAGAGCCACCGAGAACCACAGGACTCATTCCACTTGAGACCAAACCCATATTCCAGCTGTGGCAGCTTCCCAGGCACCATCCTGACAGAAGATACAAACAGCAACCTGTTCAAAGGCCTTAGCGGGGGGCTGTCGGGCATGCCAGAGGTCAGCCTGGACATGGACACCCCGTTCCCTCTGGAAGAGGAGCTGCAGATCGAACCCTTGAGCCTCGATGGACTCAACATGCTAAGTGACTCCAGCATGGGCCTGCTGGACCCCTCTGTGGAGGAGACGTTTCGAGCTGACCGGCTATGA 서열번호 1
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랫트 CRTC3 DNA ATGGCCGCCTCGCCCGGCTCGGGCAGCGCCAACCCGCGGAAGTTCAGTGAGAAGATCGCGCTGCACACGCAGCGGCAGGCCGAGGAGACGCGGGCCTTCGAGCAGCTCATGACCGACCTCACCCTGTCCCGGGTTCAGTTTCAGAGGCTTCAGCAACTGCGCCTTACACAGCACCACGGGGGATCCTTACCTAATGTGAGCCAGCTGCGGGGCAGCGCACCAGAGCTTCAGCCGTCACTCCATCACGCTGATAATGTCCGTGGGACCCGCCACCATGGGCTGGTGGAGAGGCCAGCCCGGAACCGCTTCCACCCTCTTCACCGCAGGTCTGGGGACAAGCCAGGGAGACAGTTTGATGGAAATGCTTTTGCAGCCAGTTATTCTTCGCAGCCCCTGGATGAGAGCTGGCCAAGGCAACAGCCTCCATGGAAAGAGGAAAAGCATCCTGGATTCAGGCTGACATCTGCACTTAACAGGACCAATTCTGATTCTGCTCTTCACACGAGTGCTCTGAGCACCAAACCCCAGGACCCCTATGGAGGAGGAGGCCAGTCAGCCTGGCCTGCCCCATACATGGGTTTCTGTGATGGTGAAAATGATGGCCGTGGGGAAGCCGCCTTCCCCGGTCTGCTGAAGGAAGAGAATCTGTTAAACGTCCCGAAGCCACTGCCCAAACAACTGTGGGAGACCAAGGAGATCCAGTCCCTGTCTGGACGCCCTCGGTCCTGTGATGTTGGGGGCGGCAGTGCCTTCCCACATAATGGCCAAAACACAGGCCTCTCGCCATTTCTGGGGACCCTGAACACTGGAGGGTCATTACCAGATCTAACCAACCTTCACTACTCAGCACCCCTGCCAGCCTCCCTGGACACCAGTGACCACCTCTTTGGTAGCATGAGCGTGGGGAACAGTGTGGGCAACCTTCCAGCTGCTATGACTCACCTGGGGATAAGAAACTCCTCTGGTCTCCAGAGTTCTCGAAGTAACCCTTCCATCCAAGCCACGCTCAATAAGATTGCGCTGTCCTCATCCCTCAATAGCCACCCACAGCCGTCCGTGGCCAATGCCTCTGCTCTCCACCCCTCGCTCCGTCTCTTCTCCCTTAGCAACCCATCTCTTTCTACCACAAACCTGAGTGGCCCCTCTCGGCGCAGGCAGCCTCCAGTCAGCCCTCTCACGCTCTCTCCTGGCCCTGAAGCACATCAAGGTTTCAACAGACAGCTATCTGCAACCAGCCCACTGAACCCGTACCCTGCCTCCCAGATGGTGACCTCAGAGCAGAGTCCACTTTCCTTCCTGCCCACAGACGCTCAAGCCCAAGTGTCCCCACCACCCCCTTACCCCACACCCCAGGAGCTGCCTCAACCACTCCTACAGCAGCCCCATGCCCATGAGCCCCCAGCTCAGCAGCCCCAGGCAGCCCCCTCCCTGTCACAGTCAGACTTCCAGCTCCTCACTGCCCAGGGCTCGTCTCTGACCAACTTCTTCCGCGATGTGGGCTTTGACCAGCAGCCCATGAGGCCCAGCCCCGCCTTTCCTCAGCAGGTGCCTTTGGTACAGCAGAGCCACCGAGAACCACAGGACTCGTTCCACTTGAGACCAAACCCATATTCCAACTGTGGGAGCTTCCCGAACACCATCCTGACAGAAGATACCAACACCAGCCTGTTCAAAGGCCTTAGTGGGGGGCTGTCGGGCATGCCTGAGGTCAGCCTGGACATGGACACTCCGTTCCCGCTGGAAGAGGAGCTACAGATCGAACCCTTGAGCCTGGACGGACTCAACATGTTAAGTGACTCCAGCATGGGCCTGCTGGACCCCTCTGTGGAGGAGACATTTCGAGCTGACCGGCTGTGA 서열번호 3
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원숭이 CRTC3 DNA ATGGCCGCCTCGCCGGGCTCGGGCAGCGCCAACCCGCGGAAGTTCAGTGAGAAGATCGCGCTGCACACGCAGCGACAGGCCGAGGAGACGCGGGCCTTCGAGCAGCTCATGACCGACCTCACCCTGTCGCGGGTTCAATTTCAGAAGCTTCAGCAACTGCGCCTTACACAGTACCATGGAGGATCCTTACCAAATGTGAGCCAGCTGCGGAGCAGTGCGTCAGAGTTTCAGCCGTCATTTCACCAAGCTGATAATGTTCGGGGAACCCGCCATCACGGGCTGGTGGAGAGGCCATCCAGGAACCGCTTCCACCCCCTGCACCGAAGGTCTGGGGACAAGCCAGGGCGGCAATTTGATGGTAGTGCTTTTGGAGCCAATTATTCCTCACAGCCTCTGGATGAGAGTTGGCCAAGGCAGCAGCCTCCTTGGAAAGACGAAAAGCATCCTGGGTTCAGGCTGACATCTGCACTTAACAGGACCAATTCTGATTCTGCTCTTCACACGAGTGCTCTGAGCACCAAGCCCCAGGACCCCTATGGAGGAGGGGGCCAGTCGGCCTGGCCTGCCCCATACATGGGTTTCTGTGATGGTGAGAATAATGGACATGGGGAAGTAGCATCTTTCCCTGGCCCATTGAAAGAAGAGAATCTGTTAAATGTTCCGAAGCCAGTGCCAAAACAACTGTGGGAGACCAAGGAGATTCAATCCCTGTCAGGACGCCCTCGATCCTGTGATGTTGGAGGTGGCAATGCTTTTCCACATAATGGTCAAAACCTAGGCCTTTCACCCTTTTTGGGGACCCTGAATACTGGAGGGTCATTGCCAGATCTAACCAACCTCCACTACTCCACGCCCCTGCCAGCCTCCCTGAACACCACCGACCACCTCTTCGGGAGTATGAGTGTGGGGAATAGTGTGAACAACATCCCAGCTGCTGTGACCCACCTGGGTATAAGAAGCTCCTCTGGTCTCCAGAGTTCTCGGAGTAACCCCTCCATCCAAGCCACGCTCAATAAGACTGTGCTTTCCTCTTCCCTAAATAACCACCCGCAGACATCTGTTCCCAATGCATCTGCTCTTCACCCTTCACTCCGTCTATTTTCCCTTAGCAACCCATCTCTTTCCACCACAAACCTGAGTGGCCCATCTCGGCGTCGGCAGCCTCCCGTCAGTCCTCTCACCCTTTCTCCTGGCCCCGAAGCACATCAAGGTTTCAGCAGACAGCTGTCTTCAACCAGCCCACTGGCCCCATATCCTACCTCCCAGATGGTGTCCTCAGACCGAAGCCAACTTTCCTTCCTGCCCACAGAAGCTCAAGCCCAGGTGTCCCCGCCACCCCCTTACCCTGCGCCCCAGGAGCTCACCCAGCCCCTCCTGCAGCAGCCCCGCACCCCTGAGGCCCCTGCCCAGCAGCCCCAGGCAGCCTCCTCACTGCCACAGTCGGACTTTCAGCTTCTCCCAGCCCAGGGCTCATCTTTGACCAACTTCTTCCCAGATGTGGGTTTTGACCAGCAGTCCATGAGGCCAGGCCCTGCCTTTCCTCAACAGGTGCCTCTAGTGCAACAAGGTTCCCGAGAACTGCAGGACTCTTTTCATTTGAGACCAAGCCCATATTCCAACTGCGGGAGTTTCCCAAACACCATCCTGACAGAAGACTCCAGCACCAGCCTGTTCAAAGACCTCAACAGTGCGCTCGCAGGCCTGCCCGAGGTCAGCCTGAACGTGGACACTCCATTTCCACTGGAAGAGGAGCTGCAGATTGAACCCCTGAGCCTGGACGGACTCAACATGTTAAGTGACTCCAGCATGGGCCTGCTGGACCCCTCTGTTGAAGAGACGTTTCGAGCTGACAGACTGTGA 서열번호 5
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치료제 스크리닝 방법
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 상기 사회적 우세성 결여 동물 모델을 이용하여 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환 또는 정신 질환의 치료제 스크리닝 방법이 제공된다.
일 구현예에서, 상기 스크리닝 방법은 (a) 상기 사회적 우세성 결여 동물 모델에 후보 약물을 투여하는 단계 및 (b) 상기 동물 모델의 사회적 우세성이 개선되는지 여부를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.
다른 구현예에서, 상기 동물 모델의 사회적 우세성이 개선되는지 여부를 확인하는 단계는 (b-1) 동물 모델에서 후보 약물의 처리 전과 후의 사회적 우세 순위를 측정하여 서로 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서 사회적 우세 순위는 공지된 행동 시험 방법 또는 본 명세서에 상세히 기술된 튜브 우세 시험, 웜 스팟 시험 또는 소변 표시 시험 등에 의해 측정, 평가 및 비교될 수 있다.
본 스크리닝 방법이 상기 단계 (b-1)을 포함하는 경우, 상기 스크리닝 방법은 (c-1) 동물 모델에서 후보 약물을 처리하기 전과 비교하여 후보 약물을 처리한 후의 사회적 우세 순위가 상승한 경우 후보 약물을 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 치료제로 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 동물 모델에서 사회적 우세성이 개선되는지 여부를 확인하는 단계는 (b-2) 동물 모델 또는 그의 생물학적 시료에서 후보 약물의 처리 전과 후의 암피레귤린의 발현 또는 활성 수준을 측정하여 서로 비교하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서 암피레귤린의 발현 또는 활성 수준의 측정은 암피레귤린 mRNA의 전사량 수준을 측정하거나 암피레귤린 단백질의 발현 또는 활성 수준을 측정하여 이루어질 수 있다. 상기 mRNA의 전사량 수준의 측정은 중합효소연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay, RPA), 마이크로어레이(microarray) 및 노던 블롯팅(northern blotting)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 mRNA의 전사량 수준 측정법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 단백질의 발현 또는 활성 수준의 측정은 웨스턴 블롯팅(western blotting), 면역염색법(immunostaining), 방사선면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence), 오우크테로니(ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 보체 고정 분석법(complement fixation assay) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 단백질 발현 또는 활성 수준을 측정하는 방법으로 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 스크리닝 방법이 상기 단계 (b-2)를 포함하는 경우, 상기 스크리닝 방법은 (c-2) 후보 약물을 처리하기 전과 비교하여 후보 약물을 처리한 후 동물 모델 또는 그의 생물학적 시료에서 암피레귤린의 발현 또는 활성 수준이 증가한 경우 후보 약물을 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 치료제로 선택하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 확인 단계(단계 (b))는 상기 사회적 우세성 평가를 위한 행동 시험 및 암피레귤린의 발현 또는 활성 수준 측정 외에 뇌파(Electroencephalogram, EEG) 분석 또는 뇌 MRI 분석, 또는 이들의 임의 조합을 통해 수행될 수 있다.
약학 조성물 및 이를 이용한 질환의 예방 또는 치료 방법
본 발명은 또한 사회적 우세성이 결여되거나 감소된 동물에 EGF 수용체를 활성화시킬 수 있는 물질(예를 들어, 암피레귤린 또는 이의 단편)을 투여하는 경우 사회적 우세 순위(또는 사회적 서열)가 바뀔 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 본 발명자들은 CRTC3과 암피레귤린(Amphiregulin, AREG) 사이의 연관성을 발견하고, AREG 특히, AREG의 EGF 도메인이 동물의 손상된 사회적 우세성을 회복하는 데 핵심적인 역할을 함을 실험을 통하여 확인하였다. 따라서, 이러한 사회적 우세성의 회복을 통해 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환을 예방하고 치료할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, AREG는 포스콜린(FSK)에 의한 CRTC3의 활성화에 의해 그 발현 수준이 증가하지만, CRTC3 KO 마우스에서는 발현 증가가 나타나지 않았으며, AREG 프로모터에 루시퍼레이즈 발현 유전자를 삽입하여 그 활성 측정을 통해 AREG가 CRTC3의 하류 신호 단백질임을 확인하였다(실시예 5 및 6 참조).
다른 실시예에 따르면, CRTC3의 결핍은 성상교세포의 복잡성을 감소시켰으며, 이러한 비정상적인 형태는 AREG의 투여에 의해 회복됨을 확인하였다(실시예 7 참조). 또한, CTCR3 KO 마우스는 WT 마우스와 비교하여 대뇌 피질 및 편도체에서 AREG 신호전달경로에 관여하는 p-STAT3이 감소되고, 사회적 우세성과 관련된 단백질 중 하나로 알려진 GluA1이 대뇌 피질에서 현저하게 감소됨을 확인하였다(실시예 8 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 사회적 우세성이 결여되거나 감소된 CRTC3 KO 마우스에 AREG 또는 AREG의 EGF 도메인(AREG-EGF)을 투여한 경우 사회적 우세 순위가 상승하는 것을 확인하였다. 또한, 놀랍게도 WT 마우스 그룹에서 상대적으로 사회적 우세 순위가 낮은 WT 마우스에 AREG 또는 AREG-EGF를 투여한 경우에도 상기 WT 마우스의 사회적 우세 순위가 상승하였다(실시예 9 참조). 이러한 결과는 CRTC3 KO 마우스에서 성상교세포 특이적으로 AREG를 발현시킨 경우에도 동일하게 나타났다(실시예 10 참조). 따라서 AREG, 특히 AREG의 EGF 도메인을 이용하여 EGF 수용체를 활성화시키면 손상된 사회적 우세성을 회복시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 사회적 우세성이 결여된 CRTC3 KO 랫트 또는 마우스에서 전전두엽 피질(PFC)과 두정엽 피질(PC)의 기능적 연결성이 현저하게 저하됨을 확인하였다(실시예 11 참조). 이는, CRTC3의 결핍에 따른 사회적 우세성의 손상이 PFC와 PC의 기능적 연결성 저하에 의해서도 발생됨을 보여주는 것이며, AREG의 투여에 의해 상기 기능적 연결성 또한 회복될 수 있다.
본 발명의 일 태양에 따르면, 뇌의 EGF(Epidermal growth factor) 수용체에 대한 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환(예컨대, 정신 질환)의 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공된다. 또한, 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법이 제공된다.
상술한 실시예에 따르면, 동물에서 사회적 우세성의 결여는 암피레귤린(Amphiregulin, AREG), 특히 AREG의 EGF 도메인에 의해 회복될 수 있다. 따라서 상기 AREG의 EGF 도메인에 의해 활성화되는 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제는 사회적 우세와 관련된 암피레귤린의 기능과 동등한 기능을 발휘할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 EGF 수용체에 대한 작용제는 암피레귤린, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 또한, 상기 암피레귤린 또는 이의 단편은 암피레귤린의 EGF 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서의 용어 "암피레귤린(Amphiregulin, AREG)"은 제1형 막관통 당단백질 합성 단백질로, pro-AREG라고도 한다(비특허문헌 7). AREG는 N-말단 pro-영역, 헤파린-결합 도메인(Heparin-binding domain, HB), 표피성장인자(Epidermal growth factor, EGF)-유사 도메인, 막횡단 도메인(transmembrane domain, TM) 및 C-말단으로 구성된다. Pro-AREG의 N-말단 부분은 핵과 연관된 것으로 알려진 2 개의 연속적인 Lys-Arg-Arg-Arg 모티프를 함유하는데 이는 핵 타겟 신호로 알려져 있다. AREG 또는 AREG 엑토도메인 셰딩의 가용성 형태는 막 관통 단백질 분해 효소인 ADAM-17/TACE의 단백질 분해 활성에 의해 생성된다. pro-AREG 또는 쪼개진 AREG는 다른 방식으로 신호를 전송할 수 있다. 인접분비(juxtacrine), 자가분비(autocrine) 및 주변분비(paracrine)의 방식으로 세포 내 핵 전좌 또는 엑소좀에 포함시켜 신호를 전송할 수 있다. AREG는 EGF 수용체(EGFR)의 리간드 중 하나로 잘 알려져 있다. AREG에 의한 EGFR의 활성은 Ras/MAPK, PI3K/AKT, mTOR, STAT, PLCγ, 다중 세포 내 신호 경로와 같은 하류(downstream) 수용체의 활성을 조절한다.
다른 구현예에서, 상기 암피레귤린은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 서열번호 8의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열이 포함된다.
또 다른 구현예에서, 상기 암피레귤린의 EGF 도메인은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 상기 서열번호 10의 서열과 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 서열이 포함된다.
하기 표 3에 상기 서열번호 8 및 서열번호 10을 포함한 예시적인 인간 암피레귤린의 DNA(또는 mRNA의 ORF) 서열 및 단백질 서열, 인간 암피레귤린 EGF 도메인의 DNA 서열 및 단백질 서열이 제공된다.
구분 종류 서열 서열 목록
인간 AREG DNA ATGAGAGCCCCGCTGCTACCGCCGGCGCCGGTGGTGCTGTCGCTCTTGATACTCGGCTCAGGCCATTATGCTGCTGGATTGGACCTCAATGACACCTACTCTGGGAAGCGTGAACCATTTTCTGGGGACCACAGTGCTGATGGATTTGAGGTTACCTCAAGAAGTGAGATGTCTTCAGGGAGTGAGATTTCCCCTGTGAGTGAAATGCCTTCTAGTAGTGAACCGTCCTCGGGAGCCGACTATGACTACTCAGAAGAGTATGATAACGAACCACAAATACCTGGCTATATTGTCGATGATTCAGTCAGAGTTGAACAGGTAGTTAAGCCCCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGAAAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAAATAGAAGAAACAGAAAGAAGAAAAATCCATGTAATGCAGAATTTCAAAATTTCTGCATTCACGGAGAATGCAAATATATAGAGCACCTGGAAGCAGTAACATGCAAATGTCAGCAAGAATATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTCCATGAAAACTCACAGCATGATTGACAGTAGTTTATCAAAAATTGCATTAGCAGCCATAGCTGCCTTTATGTCTGCTGTGATCCTCACAGCTGTTGCTGTTATTACAGTCCAGCTTAGAAGACAATACGTCAGGAAATATGAAGGAGAAGCTGAGGAACGAAAGAAACTTCGACAAGAGAATGGAAATGTACATGCTATAGCA 서열번호 7
단백질 SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGKNGKNRRNRKKKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEKSMKTHSMIDSSLSK 서열번호 8
인간 AREG-EGF DNA AAGAAAAATCCATGTAATGCAGAATTTCAAAATTTCTGCATTCACGGAGAATGCAAATATATAGAGCACCTGGAAGCAGTAACATGCAAATGTCAGCAAGAATATTTCGGTGAACGGTGTGGG 서열번호 9
단백질 KKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCG 서열번호 10
또 다른 구현예에서, 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환은 CRTC3의 발현 장애 또는 활성 저하에 의해 유발되는 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "사회적 우세성의 결여 또는 감소"는 사회적 계층을 형성하고 표현하는 능력의 결여 또는 감소를 의미하는 것으로서, "사회적 위축(social withdrawal)"을 포함하는 개념으로 사용된다. 구체적으로, 상기 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환은 사회적 우세성의 결여 또는 감소가 나타나는 질환 및 사회적 우세성의 결여 또는 감소에 의해 유발되는 질환을 모두 포함한다.
또 다른 구현예에서, 상기 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환은 CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3)의 발현 장애 또는 활성 저하에 의해 유발되는 것일 수 있다. 또한, 사회적 우세성이 결여되거나 감소된 동물은 사회적 패배 스트레스(social defeat stress)에 노출되거나, 사회적 우세성의 결여 또는 감소에 의해 사회적 패배 스트레스가 유발될 수 있다. 따라서 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 질환은 사회적 패배 스트레스와 관련된 질환일 수 있다. 구체적으로, 상기 사회적 패배 스트레스와 관련된 질환은 사회적 패배 스트레스가 나타나는 질환 및 사회적 패배 스트레스에 의해 유발되는 질환을 모두 포함한다.
상기 사회적 우세성의 결여 또는 감소가 나타나는 질환 또는 사회적 우세성의 결여 또는 감소에 의해 유발되는 질환은 사회적 패배 스트레스를 동반하거나 사회적 패배 스트레스에 의해 유발되는 질환일 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 만성 염증(chronic inflammation)일 수 있다. 사회적 우세 순위는 면역 유전자의 발현에 영향을 미치며, 특히 낮은 사회적 서열은 선천성 면역 방어 및 염증에 관여하는 유전자의 상향 조절로 이어진다고 알려져 있다(문헌[Lea AJ, Akinyi MY, Nyakundi R, Mareri P, Nyundo F, Kariuki T, Alberts SC, Archie EA, Tung J. Dominance rank-associated gene expression is widespread, sex-specific, and a precursor to high social status in wild male baboons. Proc Natl Acad Sci U S A. 2018 Dec 26;115(52):E12163-E12171.] 참조). 따라서 낮은 사회적 우세 순위에 따른 사회적 패배 스트레스는 만성 염증을 유발하며, 이러한 만성 염증은 노화 및 질병의 위험 인자이기 때문에 수명 단축 및 각종 질환의 발병과도 연관되어 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation)을 포함하는 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder)일 수 있다. 특히, 사회적 패배 스트레스는 자해, 자살 충동과 같은 정신적 상태를 야기할 수 있으며, 반사회적 인격장애와 같은 질환이 발생할 수 있다(문헌[Wolke D, Lereya ST. Long-term effects of bullying. Arch Dis Child. 2015 Sep;100(9):879-85. doi: 10.1136/archdischild-2014-306667. Epub 2015 Feb 10.], 문헌[Mueller AS, Abrutyn S, Pescosolido B, Diefendorf S. The Social Roots of Suicide: Theorizing How the External Social World Matters to Suicide and Suicide Prevention. Front Psychol. 2021 Mar 31;12:621569.] 및 문헌[Halpern J, Jutte D, Colby J, Boyce WT. Social dominance, school bullying, and child health: what are our ethical obligations to the very young? Pediatrics. 2015 Mar;135 Suppl 2(Suppl 2):S24-30.] 등 참조).
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 만성 스트레스(chronic stress)일 수 있다. 기존 연구에서 사회적 우세성과 만성 스트레스에 대한 반응은 유의한 연관성이 있으며, 특히 사회적 우세 순위가 낮은 수컷 동물은 높은 스트레스 상황에서 더 불안한 행동을 보인다고 보고된 바 있다(문헌[Karamihalev S, Brivio E, Flachskamm C, Stoffel R, Schmidt MV, Chen A. Social dominance mediates behavioral adaptation to chronic stress in a sex-specific manner. Elife. 2020 Oct 9;9:e58723.] 참조).
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 공격적 성격(aggressive personality), 불안신경증(anxiety neurosis), 조현병(schizophrenia), 기분 장애(mood disorder), 조증(mania), 우울증(depressive disorder) 또는 양극성 장애(bipolar disorder)일 수 있다. 특히, 사회적 우세 순위가 높은 상위 계층에 의해 하위 계층의 사회적 패배 스트레스가 과도해지는 경우, 하위 계층에서 공격적 성격, 불안신경증, 조현병, 조증, 우울증 또는 양극성 장애와 같은 정신 질환이 나타날 수 있음이 알려져 있다(문헌[J Price. The dominance hierarchy and the evolution of mental illness. The Lancet. Vol 290, Issue 7509, 243-246] 참조). 또한, 조현병 및 우울증과 관련된 동물 모델에서도 사회적 지배 행동에 심각한 결함이 나타남이 보고된 바 있다(비특허문헌 2 및 4 참조).
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애일 수 있다. 사회적 패배 스트레스는 약물에 대한 감수성을 더 민감하게 변화시키며, 따라서 사회적 우세성이 결여되거나 감소된 동물은 약물에 보다 쉽게 중독될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 취약X증후군(fragile X syndrome)일 수 있다. 상기 취약X증후군의 표현형 특징은 사회적 우세성의 결여 또는 사회적 위축으로 알려져 있다(비특허문헌 5 참조).
또 다른 구현예에서, 상기 질환은 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 또는 자폐증(autism)일 수 있다. 기존 연구에 따르면 자폐증 및 자폐 스펙트럼 장애 동물 모델은 사회적 지배 행동에 심각한 결함이 나타나며, 사회적 상호 작용의 결여 또한 나타난다(비특허문헌 2 및 6 참조).
따라서 본 발명의 약학 조성물은 상기와 같이 사회적 우세성이 결여되거나 감소됨으로써 발생하는 사회적 패배 스트레스와 관련된 (즉, 사회적 패배 스트레스가 유발되는 또는 사회적 패배 스트레스에 의해 유발되는) 다양한 질환 및 상태를 예방하거나 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의하면, 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제를 예방적 또는 치료적 유효량으로 개체에 투여하여 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환을 예방하거나 치료할 수 있다.
한편, 본 발명의 약학 조성물을 제조하기 위해, 상기 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제, 암피레귤린, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산은 제약상 허용되는 담체 및/또는 부형제와 혼합될 수 있다. 약학 조성물은 동결건조 제제 또는 수성 용액의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences and U.S. Pharmacopeia: National Formulary, Mack Publishing Company, Easton, PA (1984)]을 참조한다.
허용되는 담체 및/또는 부형제(안정화제 포함)는 사용되는 용량 및 농도에서 개체에게 무독성이고, 버퍼(예를 들어 포스페이트, 시트레이트 또는 다른 유기산); 항산화제(예를 들어 아스코르브산 또는 메티오닌); 방부제(예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤잘코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질알콜; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헤사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10 이하의 잔기) 폴리펩티드; 단백질(예를 들어 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린); 친수성 중합체(예를 들어 폴리비닐피롤리돈); 아미노산(예를 들어 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신); 단당류, 이당류, 및 다른 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이팅제(예를 들어 EDTA); 당(예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨); 염 형성 반대 이온(예를 들어 나트륨); 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및(또는) 비이온계 계면활성제(예를 들어 TWEEN(등록상표), PLURONICS(등록상표) 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG))을 포함할 수 있고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 그 투여 경로에 따라 당업계에 공지된 적합한 형태로 제제화될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "예방적 또는 치료적 유효량" 또는 "유효량"은 개체에서 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환을 예방 또는 치료하는 데 유효한 조성물의 유효 성분의 양으로서, 의학적 처치에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 상기 질환을 예방 또는 치료하기에 충분하며 부작용을 일으키지 않을 정도의 양을 의미한다. 상기 유효량의 수준은 환자의 건강 상태, 질환의 종류 및 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 방법, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 이때, 상기한 요소들을 모두 고려하여 최소한의 부작용 또는 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 약학 조성물에서 유효 성분의 유효량은 개체(환자)의 나이, 성별, 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물의 형태, 투여 경로 및 기간 등에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 일반적으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니지만, 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 주입용 펌프 등을 이식하여 장시간 또는 장기간에 걸쳐 투여할 수도 있다.
본 발명에 따른 조성물은 대상에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데 예를 들면, 비경구 투여일 수 있으며, 비경구 투여는 주사(예컨대, 볼러스 주사) 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여(subcutaneous injection), 정맥내 투여(intravenous injection), 근육내 투여(intramuscular injection), 동맥내 투여(intraarterial injection), 복강내 투여(intraperitoneal injection), 뇌내 투여(Intracerebral injection), 척추강내 투여(intrathecal injection) 또는 뇌실내 투여(intracerebroventricular injection)가 포함된다. 본 발명에 따른 조성물은 뇌내 투여 또는 뇌실내 투여가 바람직하다.
식품 조성물 및 건강기능식품 조성물
본 발명의 또 다른 태양에 따르면, 뇌의 EGF(Epidermal growth factor) 수용체에 대한 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는, 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 식품 조성물은 또한 건강기능식품일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "건강기능식품"은 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, 본 발명에 있어서는 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 및 개선에 그 유익한 효과가 있다.
본 발명의 상기 뇌의 EGF 수용체에 대한 작용제 또는 암피레귤린 또는 이의 단편을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 작용제 또는 암피레귤린 또는 이의 단편을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 상기 작용제 또는 암피레귤린 또는 이의 단편은 원료에 대하여 15 중량% 이하, 또는 10 중량% 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당 및 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스 및 수크로오스와 같은 디사카라이드, 덱스트린 및 시클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨 및 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출 등을 사용할 수 있다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01-0.20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
상술한 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물과 관련된 사항 이외에, 나머지 구성에 대한 구체적인 설명은 상기 "약학 조성물" 부분을 참조한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예
I. 사회적 우세성이 결여 또는 저하된 동물 모델: CRTC3 KO 마우스
실시예 1. 뇌에서 CRTC3의 발현 확인
실시예 1.1. 뇌에서 CRTC3의 발현 영역 확인
뇌에서는 주로 CRTC1 및 CRTC2가 발현되는 것으로 잘 알려져 있다. 그러나 뇌에서 CRTC3의 발현에 대한 연구는 전무한 실정이다. 이에 본 발명자들은 뇌에서 CRTC3이 발현되는지 여부를 조사하였다. 하기 실험예 1.5에 기술된 바와 같은 방법으로 야생형(WT) 마우스의 뇌를 동결절편하고 CRTC3을 특이적으로 인식하는 항체를 사용하여 염색하고, 뇌의 여러 영역을 조사하여 CRTC3이 발현되는 위치를 확인하였다.
그 결과, CRTC3은 전두엽 피질(PFC), 대상피질(Cg), 해마, 치상회(dentate gyrus, DG), CA(Cornu Ammonis)3 영역, 시상하부(Hy), 편도체(Amy), 복측피개영역(VTA) 및 내측등쪽핵(MD)에서 발현되는 것으로 확인되었다(도 1a). 도 1a에 도시된 뇌 영역 외에도, CRTC3은 후각신경구(olfactory bulb), 소뇌(cerebellum) 등에서도 발현되는 것이 확인되었다(데이터 생략). 이러한 실험 결과는 뇌의 여러 영역에서 CRTC3가 발현되는 것임을 입증하는 것이다.
실시예 1.2. CRTC3를 발현하는 세포의 확인
다음으로, CRTC3을 발현하는 세포의 종류를 식별하기 위해 이중 염색을 수행하였다. 뇌의 주요 세포들을 식별할 수 있는 마커로서 NeuN(뉴런), GFAP(성상교세포), s100β(성상교세포) 및 Iba1(미세아교세포)를 염색에 사용하였다.
실험 결과, CRTC3는 GFAP과 함께 위치하는 것으로 나타났다(도 1b). 이러한 결과는 CRTC3가 아교세포, 뉴런이 아닌 성상교세포에서만 독점적으로 발현되는 것을 의미한다(DIV 14).
상기 결과를 교차 검증하기 위해, 각 종류의 세포를 일차 배양하여 qRT-PCR에 의해 CRTC3 mRNA의 수준을 확인하였다.
상기 결과와 일치되게, CRTC3 mRNA의 발현 수준은 일차 성상교세포에서 가장 높은 것으로 나타났으며, 미세아교세포에서는 거의 발현되지 않음을 확인하였다(도 1c).
본 실시예 1의 실험 결과는 CRTC3이 뇌의 여러 영역에서 발현되며, 특히 뇌의 다양한 세포들 중 주로 성상교세포에서 발현된다는 것을 보여준다.
실시예 2. CRTC3 KO 마우스의 제조
실시예 2.1. 실험 동물
CRTC3 KO(knockout) 마우스는 울산대학교로부터 입수하였다. 상기 CRTC3 KO 마우스는 문헌[Song Y, Altarejos J, Goodarzi MO, Inoue H, Guo X, Berdeaux R, Kim JH, Goode J, Igata M, Paz JC, Hogan MF, Singh PK, Goebel N, Vera L, Miller N, Cui J, Jones MR; CHARGE Consortium; GIANT Consortium, Chen YD, Taylor KD, Hsueh WA, Rotter JI, Montminy M. CRTC3 links catecholamine signalling to energy balance. Nature. 2010 Dec 16;468(7326):933-9.]에 기술된 바에 따라 제조되었다. 구체적으로, CREB-결합 도메인(CREB-biding domain, CBD)를 인코딩하는 엑손 1 대신 Neo 선택 마커를 포함하는 CRTC3 표적화 벡터를 사용하여 상동 재조합에 의해 돌연변이 CRTC3 대립 유전자를 갖는(즉, CBD를 인코딩하는 엑손 1이 결실된) CRTC3-/- 마우스를 생성하였다. 표적화 벡터는 CBD를 코딩하는 CRTC3 유전자의 엑손 1을 포스포글리세롤 카이네이스(phosphoglycerol kinase, pgk)-네오마이신 선택 카세트로 대체하여 구축하였다. 또한, 표적화 벡터는 음성 선택을 위한 pgk-디프테리아 독소 A 카세트를 포함한다. 상기와 같이 구축된 벡터를 선형화한 후 전기천공법(electroporation)에 의해 R1 배아 줄기 세포로 도입하였다. G418 내성 클론은 상동 재조합에 대해 서던 블롯팅을 이용하여 스크리닝하였다. CRTC3-/- 마우스는 본 연구를 위해 최대 3세대 동안 C57/BL6 마우스로 역교배 하였다.
CRTC3 KO 마우스 및 야생형(wildtype, WT) 마우스를 비교하기 위해, 출생 이후 두 쌍 내지 세 쌍의 형제(sibling)를 분리하여 케이지에 함께 수용하였다. 형제 그룹의 각 마우스는 무작위로 선택되었다. 12주령의 수컷 C57BL/6 마우스는 코아테크 테크놀로지(서울, 대한민국)에서 구입하였다. 상기 C57BL/6 마우스는 세 쌍의 형제가 출생 이래로 케이지에 함께 수용되었다. 상기 마우스의 각 형제 그룹은 서로 다른 케이지에 수용되었고, 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있도록 하였으며, 주변 환경은 12:12 시간의 명암주기 및 일정한 온도(22±1℃)로 유지되었다.
모든 동물 실험 절차는 아산생명과학연구원의 동물실험윤리위원회(서울, 대한민국)의 승인을 받아 수행되었다.
실시예 2.2. 실험 동물의 유전자형 분석(Genotyping)
꼬리 생검에 의해 유전체(genomic) DNA를 수득한 후, 하기 표 4에 기재된 프라이머 세트를 사용하여 유전자형을 분석하여, WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스의 유전자형을 최종 확인하였다.
대립 유전자 프라이머 방향 서열 서열 목록
CRTC3 WT 정방향 5'-CCTGAGTTATTGGCGGATGT-3' 서열번호 15
역방향 5'-CACTCAGGCTGTAGCAAGCA-3' 서열번호 16
CRTC3 KO 정방향 5'-ATGGAAGGATTGGAGCTACG-3' 서열번호 17
역방향 5'-CACTCAGGCTGTAGCAAGCA-3' 서열번호 18
실시예 3. CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세성 감소 확인
CRTC3이 뇌에서 어떤 역할을 하는지 결정하기 위해, WT 및 CRTC3 KO 마우스를 사용하여 일련의 행동 실험을 수행하였다. 우선, 실험 동물의 사회적 우세(또는 사회적 우위, 사회적 계급)를 평가하기 위한 튜브 우세 시험(Tube dominance test), 웜 스팟 시험(Warm spot test) 및 소변 표시 시험(Urine marking test)을 수행하였다(도 2a 내지 도 2m).
실시예 3.1. 튜브 우세 시험(Tube dominance test)을 통한 CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세성 감소 확인
실시예 3.1.1. 튜브 우세 시험 방법
튜브 우세 시험은 설치류의 사회적 계층에 따른 우세 순위를 결정할 수 있는 표준 시험으로, 이외에도 다양한 종류의 행동 시험이 사회적 우세를 확인할 수 있는 것으로 알려져 있다. 튜브 시험의 장점은 마우스를 격렬한 상태에 노출시키지 않고서도 비교적 안전하게 진행될 수 있다는 것이다. 또한, 다양한 변형이 가능하며, 동일 케이지 또는 서로 다른 케이지에서 시험을 안전하게 수행할 수 있으므로, 다양한 시험 데이터를 얻을 수 있다. 기본적으로 요구되는 필수 장비는 마우스가 통과할 수 있는 좁은 원통형 튜브로서 매우 간단한 시험이라는 점 또한 본 튜브 시험의 장점이다.
튜브 우세 시험을 위한 장치는 길이 30 cm, 내경 2.5 cm의 투명한 플라스틱 튜브로 만들어졌다. 마우스가 튜브의 내부를 통과하는 것에 적응하도록 하기 위해, 각 마우스를 연속 2일 또는 3일 동안 튜브의 양쪽에서 교대로 튜브를 가로질러 통과하는 훈련을 수행하였다. 훈련 기간 동안, 마우스의 스트레스를 유발하지 않으면서 가능한 한 자연스럽게 튜브를 통과시키려고 하였다. 모든 마우스가 스트레스 없이 튜브를 자유롭게 통과할 수 있음이 확인된 후에 본 실험을 수행하였다.
우세 시험 기간 동안, 튜브의 양쪽 끝 부분에 각각 1마리의 마우스, 총 2마리의 마우스를 위치시켜 튜브의 중간에서 만나도록 하였다. 한 마우스가 상대 마우스를 튜브 밖으로 밀어낸 경우 승점 1점을 얻으며, 시험은 3회 반복 수행되었다. 예를 들어, 한 마우스가 승점 2~3점을 얻으면 승리하고 상대 마우스는 패배한 것으로 간주되었다. 동일한 케이지에 수용된 마우스의 경우, 사회적 우세 순위를 정할 때 3마리의 마우스에 대해 교대로 튜브 시험을 수행하였다. 예를 들어, 1번 마우스는 2번 마우스 및 3번 마우스와 튜브 시험을 수행하고, 두 상대 마우스에게 모두 승리하면 순위는 1위가 된다. 한편, 2번 마우스가 1번 마우스에게 패배하고 3번 마우스에게는 승리하면 순위는 2위가 된다. 이 두 시험에서, 3번 마우스는 두 상대 마우스에게 모두 패배하였으므로 3위를 차지한다. 각 시험마다 승리는 승점으로 결정되었다.
본 실시예에서는 다음과 같이 튜브 우세 시험을 수행하였다. 먼저, 마우스를 습관화한 후 동일한 케이지에서 WT 및 CRTC3 KO 마우스를 각각 튜브의 양쪽 끝에 놓고 튜브의 중앙에서 만나도록 하였다. 두 마우스가 튜브의 중앙에서 서로 만나지 않으면 실험을 반복하였다. 두 마우스가 튜브 내에서 마주치고 한 마우스가 다른 마우스를 튜브 밖으로 밀어내면 튜브 시험은 종료되었다(도 2a). 시험 시간은 2분을 초과하지 않았으며, 2분을 초과하면 시험을 다시 수행하였다. 상대 마우스를 튜브 밖으로 밀어낸 마우스가 승리하고 승점 1점을 얻는다. 반대로 튜브에서 밀려 나온 마우스는 패배한다. 이 두 마리의 마우스는 총 3회의 튜브 시험을 거쳤으며, 이 과정에서 2점 이상의 승점을 얻은 마우스가 최종 승리한 것으로 간주되었다. CRTC3 KO 마우스의 케이지 내에서의 사회적 우세 순위(사회적 서열)를 확인하기 위해 튜브 우세 시험을 5일 동안 수행하였다.
한편, 각 시험 시작 전에 튜브를 70% 에탄올로 멸균하였다.
실시예 3.1.2. 튜브 우세 시험 결과
튜브 우세 시험에서, 수컷 CRTC3 KO 마우스는 그 행동에 상당한 변화를 보였다(도 2b 내지 도 2f).
WT 마우스와 비교하여 CRTC3 KO 마우스의 승점은 현저하게 낮았다(도 2b). WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 밀거나(Push-initiated) 밀리는(Push-back) 횟수 및 지속 시간을 비교한 결과에서도, CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세성이 더 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 2c 내지 도 2f).
또한, WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세를 비교하기 위해 시험을 두 가지 방식으로 수행하였다.
첫 번째 방법으로, 동일한 케이지에 수용된 형제 마우스를 이용하여 실험하였다(도 2g의 좌측 그래프, Familiar group). 구체적으로, 마우스를 각 케이지로 분리할 때 WT 및 CRTC3 KO 마우스를 함께 수용하여 사육하였다. 동일한 케이지에서 사육된 WT 및 CRTC3 KO 마우스의 튜브 시험이 모든 경우에 수행되었다. WT 및 CRTC3 KO 마우스 시험은 25개 케이지에서 수행되었으며, WT 마우스는 84%, CRTC3 KO 마우스는 16%가 승리를 차지하였다. 즉, CRTC3 KO 마우스의 승리 횟수는 WT 마우스와 비교하여 현저하게 낮았다(WT, n = 50; CRTC KO, n = 28; 튜브 시험, n = 56; ***p < 0.0001).
두 번째 방법으로, 서로 다른 케이지에 분리되어 수용된 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 사이에서 사회적 서열이 비교되었다(도 2g의 우측 그래프, Unfamiliar group). 서로 다른 케이지에서 사육된 경우에도 WT 마우스는 69%, CRTC3 KO는 31%가 승리하여, CRTC3 KO 마우스의 승리 횟수는 WT 마우스와 비교하여 현저하게 감소되는 것으로 나타났다(WT, n = 12; CRTC3 KO, n = 11; 튜브 시험, n = 55). 결과적으로, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스와 비교하여 가장 낮은 순위가 낮은 것으로 나타났다.
한편, 사회적 우세의 차이가 마우스의 몸집 차이에 의한 것일 가능성을 배제하기 위해 동일한 무게의 수컷 마우스에서 튜브 시험을 진행하였다. 동일한 무게로 매칭된 마우스 실험에서도 CRTC3 KO 마우스는 낮은 사회적 서열을 보였다(도 2h).
추가적으로, 암컷 마우스에서도 수컷 마우스와 동일하게 CRTC3가 사회적 우세 순위에 영향을 미치는지 여부를 확인하였다. 암컷 마우스의 경우도 상기 수컷 마우스의 경우와 동일하게 두 가지 방식으로 튜브 우세 테스트를 진행하였다.
그 결과, 암컷 WT 마우스와 암컷 CRTC3 KO 마우스를 동일한 케이지에서 사육한 그룹(도 2i)과 서로 다른 케이지에 사육한 그룹(도 2j) 모두 암컷 WT 마우스에 비해 암컷 CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세 순위가 현저하게 낮은 것을 확인하였다(도 2i 및 도 2j). 이러한 결과는 수컷 마우스뿐만 아니라 암컷 마우스에서도 CRTC3가 우세한 사회적 서열 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 입증한다.
실시예 3.2. 웜 스팟 시험(Warm spot test)을 통한 CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세성 감소 확인
실시예 3.2.1. 웜 스팟 시험 방법
웜 스팟 시험은 다음과 같은 장치 및 방법으로 수행하였다. 시험 장치는 가로와 세로가 각각 30 cm인 박스로서 바닥면은 얼음에 의해 차갑게 유지되었다. 바닥의 한쪽 모서리 부분에 3 cm 정도의 부채꼴 모양으로 히팅 매트를 깔아 해당 바닥 부분만 따뜻하게 만들어 주었다. 첫 번째 시험에서는 모든 바닥 면이 차가운 상태의 박스에 마우스를 넣고 30분 동안 유지하여 환경에 익숙해지도록 하였다. 30분이 경과한 후 마우스를 바닥의 한쪽 모서리 부분에 히팅 매트가 깔려 있는 박스로 옮겨 20분 동안 각각의 마우스가 히팅 매트가 깔린 바닥면을 차지한 시간을 측정하고, 이에 기반하여 각 마우스의 그룹 내 순위를 결정하였다.
실시예 3.2.2. 웜 스팟 시험 결과
WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스에서 웜 스팟 시험을 수행한 결과, CRTC3 KO 마우스의 웜 스팟에서의 시간은 WT 마우스의 웜 스팟에서의 시간과 비교하여 현저하게 낮은 것으로 나타났다. 이에 따라, 상기 튜브 우세 시험 결과와 일치되게 웜 스팟 시험에서도 CRTC3 KO 마우스의 우세 순위 또한 낮은 것으로 평가되었다(도 2k).
실시예 3.3. 소변 표시 시험(Urine marking test)을 통한 CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세성 감소 확인
실시예 3.3.1. 소변 표시 시험 방법
소변 표시 시험에서 사회적 순위가 우세한 마우스는 소변 표시(urine marking)를 더 자주, 더 많이 하는 것으로 알려져 있으며, 상기 튜브 우세 시험 및 웜 스팟 시험과 같이 마우스의 사회적 서열을 알아볼 수 있다.
소변 표시 시험은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 먼저, 28 cm × 6.5 cm 면적의 케이지에 여과지를 깔고 케이지의 가운데에 철망을 설치하여 구역을 분리해 주었다. 이때, 각 구역에 배치된 마우스는 접촉하거나 냄새를 맡을 수 있도록 해 주었다. 동일한 케이지에서 사육된 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스를 나누어진 구역에 각각 배치한 후 2시간 동안 관찰하였다. 2시간이 경과한 후 여과지에 닌하이드린(ninhydrin) 용액을 분사하여 UV로 확인하였다. 0.4 mm × 0.4 mm 크기의 격자무늬가 그려진 OHP 필름 상에 닌하이드린 반응이 일어난 영역을 표시하였다. 소변 스팟(Urine spot)의 격자무늬 면적을 계산하여 데이터화 하였으며, 하루에 한 쌍의 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스를 짝지어 실험을 진행하였다. 예를 들어, WT 마우스 1마리, CRTC3 KO 마우스 2마리가 함께 사육된 경우, WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스를 각 1마리씩 하루에 한 번 실험을 진행하여 총 2일에 걸쳐 실험을 진행하였다.
실시예 3.3.2. 소변 표시 시험 결과
WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스에서 소변 표시 시험을 수행한 결과, CRTC3 KO 마우스는 마우스는 WT 마우스에 비해 소변 표시 스팟의 면적이 현저히 낮은 것을 확인할 수 있었다(도 2l 및 도 2m). 즉, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스에 비해 낮은 사회적 서열을 나타냄을 소변 표시 스팟으로 확인하였다.
본 실시예 3.1 내지 실시예 3.3의 실험 결과는 뇌에서 CRTC3가 결여된 동물은 사회적 우세성이 낮음을 보여준다.
실시예 4. CRTC3 KO 마우스에서 사회적 우세 이외의 다른 행동 변화 확인
CRTC3 KO 마우스에서 나타나는 다른 행동 변화를 확인하기 위해, 다양한 행동 실험을 수행하였다(도 3a 내지 도 3d). 구체적으로, 실험 동물의 장기 및 단기 기억을 평가하기 위한 Y-미로 시험(Y-maze test) 및 모리스 수중 미로 시험(Morris water maze test)을 수행하였다. 또한, 실험 동물의 후각, 시각 등 감각과 관련된 행동 변화를 평가하기 위한 후각 선호 시험(Olfactory preference test) 및 새로운 물체 인식 시험(Novel object recognition test)을 수행하였다.
실시예 4.1. CRTC3 KO 마우스의 단기 기억 손상 여부의 확인
실시예 4.1.1. Y-미로 시험 방법(Y-maze test)
Y-미로 시험은 미로의 팔이 각각 120° 각도로 대칭적으로 분리되어 있는 세 개의 팔(3-arm)이 구비된 수평 미로(10 cm Х 50 cm Х 20 cm)에서 수행되는 단기 기억에 관한 시험이다. 단기 기억력을 시험하기 위해, 첫 번째 세션에서 미로의 팔 하나를 숨기고 나머지 두 팔을 열었다. 마우스를 미로의 중심에 위치시킨 후 10분 동안 열려 있는 2개의 팔을 자유롭게 탐색할 수 있게 하였다. 3시간 후, 시험 세션에서는 새로운 팔을 탐색하게 하기 위해 닫혀 있던 팔을 열었다. 마우스를 미로의 중심에 위치시킨 후 열린 3개의 팔을 5분 동안 자유롭게 탐색할 수 있게 하였다. 시험은 스마트 비디오 추적 시스템(소프트웨어 버전 3.0, Panlab, Harvard Apparatus, 미국)에 의해 측정 및 기록되었다. 새로 열린 팔에 진입한 시간 및 진입 횟수에 대한 데이터를 수집하고 분석하였다. 각 시험의 시작 전에 미로를 70% 에탄올을 이용하여 세척하고 잔류 냄새를 제거하였다.
실시예 4.1.2. Y-미로 시험 결과
상기 실시예 4.1.1에서 기술한 바와 같이, 초기에는 3개의 팔 중 하나의 팔을 막고, 나머지 2개의 팔만 마우스가 자유롭게 이동할 수 있도록 하였다. 2시간 후에 막힌 하나의 팔을 열고, 마우스가 새로운 팔에 진입한 횟수와 새로운 팔에 머무는 시간을 측정하였다. Y-미로 시험 결과는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 간에 유의한 차이를 나타내지 않았다(도 3a).
실시예 4.2. CRTC3 KO 마우스의 장기 기억 손상 여부의 확인
실시예 4.2.1. 모리스 수중 미로 시험 방법(Morris water maze test)
장기 기억력 시험을 위한 모리스 수중 미로 시험은 원형 수영장(높이 50 cm Х 직경 120 cm, 온도 24±1℃의 물)을 사용하여 수행되었다. 시험을 위해, 직경 10 cm의 원형 탈출 플랫폼을 NW 사분면 중앙의 수면 아래 1.5 cm 지점에 위치시켰다. 수영장은 물에 탈지유를 용해하여 만든 액체를 40 cm의 깊이로 채웠으며, 매일 새로운 액체로 교체하였다. 추가적인 미로 단서(cue)는 수영장이 위치한 방의 벽, 포스터 및 가구의 기하학적 모양으로 구성되었다. 탈출 플랫폼 근처의 수중 미로 수영장 벽에 하나의 단서가 부착되었다.
실험 절차는 4일 동안의 훈련 시험일 및 1일 동안의 프로브(probe) 시험일로 구성된 총 5일 간의 시험으로 수행되었다. 훈련 시험 기간 동안, 마우스를 벽을 향한 3 사분면에 놓고 1분 동안 탈출 플랫폼을 찾도록 하였다. 지정된 시간 내에 탈출 플랫폼을 찾은 경우에는 1분 동안 그대로 있었으며, 그렇지 않은 경우에는 탈출 플랫폼으로 안내되어 1분 동안 그대로 있었다. 각 마우스에게는 3회의 훈련 세션 및 각 훈련 세션 간에 1분의 휴식이 주어졌다. 3회의 훈련 세션에서 마우스는 탈출 플랫폼이 위치하지 않은 다른 사분면(NE, SE 및 SW)에 배치하였다. 훈련 세션 후, 마우스는 탈출 플랫폼 없이 프로브 시험을 수행하였다. 마우스를 SE 사분면에 벽을 향하도록 놓고, 플랫폼을 미세 조정하였다. 모든 실험은 스마트 비디오 추적 시스템(소프트웨어 버전 3.0, Panlab)에 의해 측정 및 기록되었다. 데이터는 탈출 플랫폼에 도달하기 위한 수영 시간(s) 및 수영 거리(cm)로 수집되어 분석되었다.
실시예 4.2.2. 모리스 수중 미로 시험 결과
상기 실시예 4.2.1에서 기술된 바와 같이, 훈련 시험일 동안에는 마우스를 수영장에 놓고 탈출 플랫폼을 찾도록 하기 위한 훈련을 시켰다. 훈련 시험을 4일 동안 수행한 후 다음 날에는 탈출 플랫폼을 제거하고, 마우스가 제거된 플랫폼이 위치하였던 곳에 머무르는 시간을 측정하였다.
그 결과, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스와 비교하여 장기 기억력 측면에서 차이가 나타나지 않았다(도 3b, Time in platform). 또한, 훈련 시험 4일 동안에도 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스는 플랫폼을 찾기 위해 이동한 거리가 서로 유사하였다(도 3b, Distance to target). 한편, 훈련 시험 1일차에는 CRTC3 KO 마우스가 WT 마우스보다 더 짧은 시간 내에 플랫폼을 찾는 것처럼 보였으나, 나머지 3일 동안의 훈련 시험에서는 CRTC3 KO 마우스와 WT 마우스 간의 차이가 나타나지 않았다(도 3b, Latency to target). 프로브 시험에서, 제거된 탈출 플랫폼을 찾는 데 걸린 시간을 비교하면 CRTC3 KO 마우스와 WT 마우스 모두 비슷한 시간이 소요되었으며, 플랫폼이 설치되었던 영역에 머무르는 시간 또한 차이가 없음을 확인하였다(도 3b).
실시예 4.3. CRTC3 KO 마우스의 감각 관련 행동 변화의 확인
실시예 4.3.1. 후각 선호 시험(Olfactory preference test) 방법
후각 선호 시험을 위해, 4개의 빈 케이지와 10% 2-MBA(2-methylbutyric acid), 10% 땅콩 버터 용액을 준비하였다. 마우스를 4개의 케이지에 순서대로 각각 15분 동안 습관화(habituation) 시켰다. 4번째 케이지에서 15분이 경과한 후, 희석한 향기(scent) 용액이 묻은 필터지를 마우스의 반대편에 두고 3분 동안 비디오 촬영을 하였다. 3분 후 필터지를 제거하고 다른 향기를 묻힌 필터지를 위와 동일한 방법으로 촬영하여, 필터지에 다가가 관심을 보이는 시간을 측정하였다.
실시예 4.3.2. 새로운 물체 인식 시험(Novel object recognition test) 방법
새로운 물체 인식 시험은 다음과 같은 절차에 의해 수행되었다. 먼저, 40 × 40 cm 크기의 상자 양 끝에 동일한 모양의 모형을 두고 15분 동안 마우스가 탐색하도록 하였다. 15분 후 하나의 모형을 색깔과 모양이 다른 모형으로 교체한 뒤 15분 동안 관찰하면서, 새로운 모형에 다가가 탐색하는 시간을 측정하였다.
실시예 4.3.3. 후각 선호 시험 및 새로운 물체 인식 시험 결과
상기 실시예 4.3.1 및 실시예 4.3.2에 기술된 방법에 따라 후각 선호 시험 및 새로운 물체 인식 시험을 진행하여, CRTC3 KO 마우스에서 감각과 관련된 행동의 변화가 나타나는지 여부를 확인하였다.
후각 선호 시험에서, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스와 비교하여 차이를 보이지 않았다(도 3c). CRTC3 KO 마우스 그룹과 WT 마우스 그룹 모두 땅콩 버터에 대한 선호도가 높았으며, 2-MBA(2-methylbutiric acid)는 기피하는 경향을 보였다.
새로운 물체 인식 시험을 통해 마우스가 새로운 물체에 반응하는 시간을 측정하였을 때, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스와 비슷한 관심도를 나타내는 것으로 확인되었다(도 3d).
본 실시예 4.1 내지 4.3의 실험 결과는 뇌에서 CRTC3의 결여가 단기 기억 또는 장기 기억의 손상이나 감각 관련 행동 등의 변화를 초래하지는 않음을 보여준다.
상기 실시예의 결과를 종합하면, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스에 비해 사회적 우세성이 현저하게 저하되는데 반해, 장기 기억, 단기 기억 또는 감각 등과 관련된 행동에는 변화가 없는 것으로 나타났다. 따라서 CRTC3는 동물에서 사회적 우세를 인식하는 데 중요한 역할을 하며, 이 CRTC3 유전자의 발현이 억제 또는 감소되거나 CRTC3 단백질의 활성이 억제 또는 감소된 동물은 사회적 우세성 결여 동물 모델로서 이용될 수 있으며, 나아가 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 다양한 질환 또는 상태 예를 들어, 만성 염증(chronic inflammation), 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation), 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder), 공격적 성격(aggressive personality), 만성 스트레스(chronic stress), 불안신경증(anxiety neurosis), 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애, 조현병(schizophrenia), 기분 장애, 조증(mania), 우울증(depressive disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 취약X증후군(fragile X syndrome), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 및 자폐증(autism) 등과 같은 정신 질환의 동물 모델로서도 이용될 수 있다.
Ⅱ. 암피레귤린(Amphiregulin, AREG) 또는 이의 EGF 도메인의 질환 치료 용도
실시예 5. CRTC3에 의해 직접 조절되는 표적 유전자로서 AREG의 확인
CRTC3 결핍과 관련된 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해, 하기 실험예 1.3에 기술된 바와 같이 마우스 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 전체 전사체 프로파일 분석을 수행하였다(도 4). CRTC3을 발현하는 세포에서 CRTC3와 관련된 유전자의 발현 변화를 확인하기 위해, 성상교세포에 포스콜린(forskolin, FSK)을 처리하여 CRTC3을 활성화시켰다. FSK는 시그마-알드리치(세인트 루이스, 미국)에서 구입하였으며, DMSO를 사용하여 25 μM의 농도로 제조하여 사용하였다. FSK는 CRTC를 탈인산화시켜 핵 전이를 유도함으로써 유전자의 발현을 조절한다. 2시간 동안 FSK를 처리한 샘플을 비처리 샘플과 비교하여 얻은 배수 변화 값을 WT 마우스 및 CRTC3 KO 마우스 사이에서 비교하였다. 구체적으로, WT 마우스에 FSK를 처리한 후 발현이 증가한 유전자를 나열하고, 발현 수준이 높은 상위 29개의 유전자를 선별하여 CRTC3 KO 마우스와 비교하였다. CRTC3의 표적 유전자로 확인된 상기 29개의 유전자는 하기 표 5에 기재하였다.
Procr AREG Il6 Penk Vdr Thbd
Cytip Prg4 Gprc5a Has1 Rasd1 Gzme
Il1b Dgat1 Olfr130 Nefl Cxcl1 Zfp273
Trmt61b Apold1 Tac1 Svs3b Olfr584 Hist1h4n
Olfr1428 Cyp3a57 Vmn1r122 Hist1h4 Foxq1 -
WT 마우스에서는 FSK의 처리에 의해 대부분의 유전자의 발현이 증가하였지만, CRTC3 KO 마우스에서는 그렇지 않았다(도 4a). WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스에서 각 유전자의 발현 수준 차이를 비교하여, 차이 값이 큰 유전자부터 낮은 유전자 순으로 15개의 유전자를 분류하였다(도 4b). 이들 중 Procr 및 AREG 유전자의 경우, WT 마우스에서는 FSK의 처리에 따라 발현 수준이 증가하였지만, CRTC3 KO 마우스에서는 증가하지 않았고(도 4a), WT과 CRTC3 KO 마우스의 유전자 발현 수준 비교에서 그 차이 값이 가장 높은 것으로 나타났다(도 4b).
특히, AREG는 세포에서 분비되어 EGF(Epidermal growth factor) 수용체나 다른 세포 표면 수용체와 결합하여 신호전달을 발생시키는 단백질로 알려져 있었기 때문에, AREG 가 뇌에서 사회적 우세성(또는 사회적 지배성)을 조절하는데 관여하는 단백질일 것이라고 예상되었다.
본 실시예의 실험 결과는 CRTC3 KO 마우스의 성상교세포에서 암피레귤린(AREG)은 FSK에 의한 발현 촉진이 억제되며, AREG는 CRTC3에 의해 직접 조절되는 CREB 표적 유전자임을 보여준다.
실시예 6. AREG의 발현 양상 및 CRTC3와의 연관성 확인
CRTC3의 표적 유전자와 AREG의 연관성을 조사하기 위해, WT 마우스의 뇌에 존재하는 여러 종류의 세포를 일차 배양하여 하기 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 qRT-PCR 분석을 수행하였다.
그 결과, 실시예 1에서 확인한 CRTC3의 발현 양상과 유사하게, AREG는 주로 성상교세포에서 발현되며, 뉴런과 미세아교세포에서는 발현되지 않음을 확인하였다(도 5a).
또한, 상기 실시예 5의 마이크로어레이 분석 결과와 같이 CRTC3 KO 성상교세포에서 AREG의 발현 또한 감소되는지 여부를 확인하기 위해, 하기 실험예 1.2에 기술된 방법에 따라 qRT-PCR을 수행하였다.
그 결과, WT 마우스의 일차 성상교세포에 비해 CRTC3 KO 마우스의 성상교세포에서 AREG의 발현 수준이 현저하게 낮음을 확인하였다(도 5b). 또한, FSK를 처리하여 CRTC3를 활성화시킨 경우에도, WT 마우스의 일차 성상교세포에서는 FSK 처리에 의해 AREG의 발현 수준이 증가하는 반면, CRTC3 KO 마우스의 일차 성상교세포에서는 FSK 처리에도 불구하고 AREG의 발현 증가는 나타나지 않았다(도 5c).
이와 같은 AREG의 발현이 CRTC3에 의해 영향을 받는지 확인하기 위해, 루시퍼레이즈 분석(luciferase assay)를 수행하였다. AREG 프로모터에 루시퍼레이즈 발현 유전자를 삽입한 후 루시퍼레이즈의 활성을 측정하였다.
그 결과, CRTC3가 발현되는 세포에서는 AREG 프로모터가 작동하여 루시퍼레이즈가 활성화되었으며, FSK를 처리하는 경우에는 더 많이 활성화되었다(도 5d). 이에 반해, AREG-CRE 돌연변이에서는 CRTC3의 발현이나 FSK의 처리에도 불구하고 루시퍼레이즈의 활성이 현저하게 낮음을 확인하였다. 이러한 결과는 AREG가 CRTC3의 하류(downstream) 신호 단백질임을 뒷받침한다.
실시예 7. AREG의 성상교세포 형태 회복 효과의 확인
다음으로, 성상교세포에서 유도되는 세포 변화에서 CRTC3의 국소화 여부를 확인하기 위해, CRTC3 KO 마우스 및 WT 마우스에서의 성상교세포 형태를 비교 확인하였다. 성상교세포 마커로서 GFAP을 사용하여 세포의 형상을 하기 실험예 1.4에 기술된 방법에 따라 형광 염색을 통해 관찰하였다.
그 결과, CRTC3 KO 마우스의 성상교세포는 WT 마우스의 성상교세포와 비교하여 세포의 크기가 더 크고 형태가 덜 복잡하다는 것이 확인되었다(도 5e).
성상교세포의 형태를 보다 정확하게 비교하기 위해, 아래와 같이 정의된 세포 형태 지수(cell shape index, CSI)를 사용하여 성상교세포 형태의 복잡성을 결정하였다(하기 식에서 P는 세포의 둘레이고 A는 세포의 면적임):
Figure pat00001
성상교세포는 신경전달물질을 전달하거나 신경 신호를 유도하기 위해 뉴런 및 모세관과 연결되어 있다. 따라서 더 복잡한 세포는 CSI가 높다.
CRTC3 KO 마우스에서 성상교세포의 CSI는 WT 마우스의 성상교세포와 비교하여 유의하게 낮은 값을 나타냈다(도 5f). 이와 같은 CSI의 변화가 AREG에 의해 다시 회복되는지 확인한 결과, AREG는 CRTC3 KO 마우스에서 일차 성상교세포의 CSI를 WT 성상교세포의 수준으로 증가시켰다(도 5f). 이러한 결과는 AREG가 비정상적으로 변형된 CRTC3 KO 마우스의 성상교세포의 형태를 회복시켰음을 입증하는 것이다.
본 실시예 7의 결과는 CRTC3의 결여로 인해 그 형태가 손상된 성상교세포를 AREG의 처리로 회복시킬 수 있음을 보여준다.
실시예 8. CRTC3 KO 마우스에서 p-STAT3 및 GluA1의 발현 수준 감소 확인
AREG는 EGFR 리간드 패밀리 중 하나이며 EGFR과 상호 작용하여 MAPK(Mitogen-activated protein kinase), PI3K(phosphatidylinositol 3kinase)/Akt(protein kinase B) 및 STAT3(Signal transducer and activator of transcription 3)과 같은 후속 신호전달경로를 활성화한다. 이에, CRTC3의 붕괴가 AREG 신호전달 및 사회적 우세와 관련된 단백질 수준의 변화를 유발하는지 여부를 조사하기 위해, CRTC3 KO 마우스 뇌의 피질(cortex, CTX) 및 편도체(amygdala, AMY)에서 하기 실험예 1.6에 기술된 방법으로 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다(도 6).
실험 결과, CRTC3 KO 마우스 뇌의 피질(CTX) 및 편도체(AMY) 샘플 모두에서 인산화된 STAT3 즉, p-STAT3이 유의하게 감소함을 확인하였다(p < 0.005; 도 6a 및 도 6b). 이들 데이터는 CRTC3 KO 마우스에서 AREG가 감소되는 결과와 일치하는 것이며, AREG 신호전달경로의 하류 신호 분자인 p-STAT3의 발현 수준 또한 감소되어 있음을 확인한 것이다. 한편, CRTC3 KO 마우스의 편도체에서는 STAT3의 발현 수준이 증가되는 것으로 나타났다(도 6b, 우상단 그래프).
이전의 연구에 따르면, 스트레스로 인한 사회적 우세성 결핍 마우스의 내측 전전두엽 피질(medial prefrontal cortex, mPFC)에서 AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid) 수용체의 인산화가 감소되는 것으로 보고된 바 있다(문헌[Park MJ, Seo BA, Lee B, Shin HS, Kang MG. Stress-induced changes in social dominance are scaled by AMPA-type glutamate receptor phosphorylation in the medial prefrontal cortex. Sci Rep. 2018 Oct 9;8(1):15008.] 참조). 또 다른 연구에서는, 사회적 발달 장애를 특징으로 하는 자폐 스펙트럼 장애(ASD) 마우스 모델의 mPFC에서 AMPA 수용체의 서브유닛인 GluA1(Glutamate receptor 1)과 GluA2의 발현이 감소됨을 보여주었다. 이 마우스 모델에서, AMPA 양성 입체다른자리 조절제(positive-allosteric modulator, PAM)의 투여는 AMPA 수용체의 발현 수준을 개선시키고 사회적 우세의 결핍을 회복시키는 것으로 나타났다(문헌[Kim JW, Park K, Kang RJ, Gonzales ELT, Kim DG, Oh HA, Seung H, Ko MJ, Kwon KJ, Kim KC, Lee SH, Chung C, Shin CY. Pharmacological modulation of AMPA receptor rescues social impairments in animal models of autism. Neuropsychopharmacology. 2019 Jan;44(2):314-323.] 참조).
상기 연구에 기초하여, 본 실시예에서는 CRTC3 KO 마우스에서 AMPA 수용체의 GluA1 서브유닛의 발현 수준 변화를 확인하였다. 그 결과, 피질에서 GluA1의 발현 수준은 유의하게 감소되고(도 6a, 우하단 그래프; p = 0.0578), 편도체에서 GluA1의 발현 수준은 현저하게 증가되는 것이 확인되었다(도 6b, 우하단 그래프; p < 0.005).
종합하면, CTCR3 KO 마우스의 대뇌 피질 및 편도체에서 AREG 신호전달경로에 관여하는 p-STAT3이 감소되고, 사회적 우세를 조절하는 단백질 중 하나인 GluA1이 대뇌 피질에서 현저하게 감소되었다.
본 실시예 8의 결과는 CRTC3 KO 마우스의 대뇌 피질(CTX)에서 p-STAT3 및 GluA1의 발현 수준이 모두 WT 마우스의 경우와 비교하여 유의하게 감소함을 보여주는 것이다.
실시예 9. CRTC3 KO 마우스에서 AREG 또는 AREG-EGF의 투여에 의한 사회적 우세 순위의 상승 효과 확인
실시예 9.1. 실험 재료
본 실시예에서 사용하는 재조합 마우스 AREG 및 EGF는 R&D 시스템즈(미니애폴리스, 미국)에서 구입하였다. AREG-EGF 펩타이드 및 AREG-HB 펩타이드는 ㈜펩트론(대전, 대한민국)에서 구입하였다. 상기 마우스 AREG 및 EGF의 아미노산 서열과 AREG-EGF 펩타이드 및 AREG-HB 펩타이드의 아미노산 서열은 하기 표 6에 나타내었다.
종류 아미노산 서열 서열 목록
마우스 AREG SVRVEQVIKPKKNKTEGEKSTEKPKRKKKGGKNGKGRRNKKKKNPCTAKFQNFCIHGECRYIENLEVVTCNCHQDYFGERCGEKSMKTHSEDDKDLSK 서열번호 11
마우스 EGF NSYPGCPSSYDGYCLNGGVCMHIESLDSYTCNCVIGYSGDRCQTRDLRWWELR 서열번호 12
AREG-EGF 펩타이드 KKNPCNAEFQNFCIHGECKYIEHLEAVTCKCQQEYFGERCGEK 서열번호 13
AREG-HB 펩타이드 SVRVEQVVKPPQNKTESENTSDKPKRKKKGGKNGKNRRNRK 서열번호 14
한편, 실시예 1.2에서와 동일한 방식으로 3.5개월령의 CRTC3 KO 마우스를 준비하였다.
실시예 9.2. 실험 방법
CRTC3 KO 마우스에서 나타나는 낮은 사회적 우세 순위로의 행동 변화에서 AREG의 역할을 결정하기 위해, 3.5개월령의 CRTC3 KO 마우스에 뇌실내 주사(Intracerebroventricular injection, ICV)를 통해 AREG 또는 AREG-EGF를 전달하고, 사회적 우세 순위의 변화를 알아보았다(도 7).
먼저, 1개월이 되었을 때부터 CRTC3 KO 마우스와 WT 마우스를 한 그룹으로 수용시켜 2개월 동안 함께 사육하였다. 이로써 동일 그룹의 마우스들 사이에서 자연스럽게 사회적 순위가 형성되도록 하였다. 그룹 내에서 마우스의 서열 변화를 확인하기 위해, 3개월이 된 시점부터 15일 동안 매일 튜브 우세 시험에 의해 사회적 우세 순위를 매겼다. 그룹 내에서 각 마우스는 서로 교대로 시험되었으며, 그룹 내 마우스의 우세 순위는 승점에 따라 결정되었다. 그룹 내 마우스의 사회적 우세 순위가 일정하게 유지되는 것을 확인한 후, 하기 실험예 2.1에 기술된 방법에 따라 삼투 펌프를 사용하여 우뇌의 측면 뇌실에 각각 AREG(도 7a 및 도 7c), AREG-EGF(도 7d 및 도 7e) 및 AREG-HB(도 7f)를 1개월 동안 투여하였다. 실험은 CRTC3 KO 마우스와 WT 마우스가 함께 사육되는 케이지(도 7a 및 도 7e) 또는 C57BL/6만 사육된 케이지(도 7c, 도 7d 및 도 7f)의 두 가지 마우스 그룹에서 수행되었다. 각각의 케이지에서 사회적 우세 순위가 낮은 CRTC3 KO 마우스 또는 C57BL/6 마우스에 AREG, AREG-EGF, AREG-HB 또는 mEGF를 포함하는 약물을 투여하였고, 순위가 높은 WT 마우스(C57BL/6 마우스)에는 대조군으로서 PBS를 투여하였다. 마우스에 실험예 2.1에 기술된 방법에 따라 삼투 펌프를 이식한 후, 1주 동안의 회복 기간이 주어졌다. 이식 수술 후 1주가 경과한 시점부터 매일 튜브 우세 시험을 수행하였고, 사회적 우세 순위의 변화를 다시 관찰하였다.
실시예 9.3. AREG 투여의 사회적 우세 순위 상승 효과
16 마리의 CRTC3 KO 마우스를 포함하는 16개의 케이지에서 시험한 결과, CRTC3 KO 마우스에 AREG를 투여한 후 우세 순위의 변화는 13개 케이지에서 관찰되었다(13/16, 81%; 도 7a의 바 그래프). 또한, 약물 투여 전후의 승점을 비교하였을 때, AREG를 투여한 CRTC3 KO 마우스는 투여 전과 비교하여 투여 후의 승점이 증가하는 것으로 나타났다. 또 다른 순위 결정 실험인 웜 스팟 시험에서도 약물 주입 후 CRTC3 KO 마우스는 웜 스팟을 차지하는 시간이 증가하였고, 사회적 우세 순위 또한 증가하였다(도 7b). 이러한 결과는 CRTC3 KO 마우스의 낮은 사회적 우세 서열이 AREG의 투여에 의해 향상됨을 보여준다.
다음으로, AREG의 투여가 CRTC3 KO 마우스의 낮은 사회적 우세 순위를 높일 수 있다는 상기 실험 결과에 근거하여, 결과의 일관성을 확인하기 위해 WT 마우스(=C57BL/6 마우스)만 그룹화된 케이지에서 동일한 실험을 수행하였다(도 7c). 구체적으로, 3개월령의 C57BL/6 마우스를 구입하여 동일한 케이지에 수용하고, 1주일 동안 새로운 환경에 적응시켰다. 1주일이 경과한 후 마우스가 튜브를 통과하는 것에 적응하도록 하는 훈련을 시키고, 그룹 내 각 마우스의 순위가 일정하게 유지될 때까지 매일 튜브 우세 시험을 수행하였다. 사회적 서열이 가장 낮은 마우스에 대해 AREG를 투여하였으며, 약물을 투여하는 동안 상기 실험에서와 같은 우세 순위의 변화가 관찰되었다. 즉, CRTC3 KO 마우스에서 AREG의 투여에 의해 사회적 우세 순위가 상승한 상기 결과와 일치되게, C57BL/6 마우스의 경우에도 AREG의 투여에 의해 가장 서열이 낮은 마우스의 순위를 상승시키는 효과가 나타났다. 이러한 사회적 우세 순위의 상승 효과는 17개 케이지 중 12개 케이지에서 관찰되었다(12/17, 71%; 도 7c의 바 그래프).
실시예 9.4. AREG-EGF 투여의 사회적 우세 순위 상승 효과
한편, AREG 단백질에서 EGF 도메인이 사회적 우세 순위의 변화를 유발하는 중요한 요소임을 확인하기 위해, C57BL/6 마우스 그룹(도 7d) 및 WT, CRTC3 KO 마우스 그룹(도 7e)에서 각각 사회적 우세 시험이 수행되었다.
실험 결과, AREG-EGF의 투여에 의해 C57BL/6 마우스 그룹에서는 10개의 케이지 중 8개 케이지에서 가장 낮은 서열의 C57BL/6 마우스의 순위 증가가 나타났다(8/10, 80%; 도 7d의 바 그래프). 또한, 낮은 사회적 우세 순위를 보인 CRTC3 KO 마우스에 AREG-EGF를 투여하였을 때에도, 8개 케이지 중 4개 케이지에서 투여 후 승점의 변화 및 튜브 시험 순위의 상승이 확인되었다(4/8, 50%; 도 7e의 바 그래프).
추가로, AREG의 다른 도메인인 HB 도메인과 대조군으로서 마우스 EGF(mEGF)를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 실험을 수행하였다.
AREG-HB를 투여한 경우에는 단 1개의 케이지에서만 사회적 우세 순위의 상승이 관찰되었다(1/10, 10%; 도 7f 상단 그래프). mEGF 투여 그룹의 경우에는 투여 전 결정된 사회적 우세 순위에 어떠한 변화도 나타나지 않았다(0/4, 0%; 도 7f 하단 그래프). 이러한 결과는 AREG의 EGF 도메인이 우세 순위의 변화를 일으키는 중요한 영역이라는 것을 보여주는 것이다.
본 실시예 9.3 및 9.4의 결과는 사회적 우세 순위가 낮은 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 모두에서 AREG 또는 AREG-EGF의 투여에 의해 사회적 우세 순위가 상승될 수 있음을 보여준다.
실시예 10. CRTC3 KO 마우스에서 성상교세포 특이적 AREG의 발현에 의한 사회적 우세 순위의 상승 효과 확인
성상교세포에서 생산되는 AREG 단백질이 CRTC3 KO 마우스의 사회적 서열 변화를 일으키는지 확인하기 위해, 하기 실험예 2.2에 기술된 AAV5 바이러스 시스템을 이용하여 성상교세포 특이적으로 AREG단백질을 발현시켰다. 성상교세포 특이적 발현을 위해 GFAP 프로모터 시스템을 사용하였으며, 신호 서열(signal sequence) 뒤에 마우스 AREG의 아미노산 서열 중 EGF 도메인을 포함하는 아미노산 94-191이 합성되도록 작제물을 구성하였다.
상기 실시예 9에서 AREG의 EGF 도메인은 CRTC3 KO 마우스의 사회적 우세 순위를 변화시키는 중요한 도메인으로 밝혀졌기 때문에, 성상교세포에 AREG의 EGF 도메인이 특이적으로 발현되도록 하였다. 이와 같이 제작한 바이러스를 CRTC3 KO 마우스의 우측 뇌실에 주입한 후 사회적 우세 시험을 진행하였다.
바이러스 주입 후 25일이 경과한 뒤부터 CRTC3 KO 마우스의 튜브 우세 시험 승점이 증가하면서 사회적 서열이 변화하는 것을 확인할 수 있었다(도 8a). 특히, 바이러스 주입 후 30일이 경과된 뒤에는 마우스의 사회적 서열이 역전되어, CRTC3 KO 마우스가 WT 마우스보다 높은 사회적 서열을 차지하는 것이 확인되었다(도 8a).
다른 종류의 사회적 우세 확인 실험인 웜 스팟 시험에서도, CRTC3 KO 마우스는 성상교세포에서 AREG를 발현하도록 바이러스를 주입한 이후 웜 스팟을 차지하는 시간이 증가하는 것을 확인하였다(도 8b).
본 실시예 10의 결과는 사회적 우세 순위가 낮은 CRTC3 KO 마우스에서 성상교세포 특이적 AREG의 발현 유도에 의해 사회적 우세 순위가 증가할 수 있음을 보여주는 것이며, 이는 AREG 단백질 또는 AREG의 EGF 도메인을 마우스의 뇌에 직접 투여하였을 때 마우스의 사회적 우세 순위가 변화됨을 확인한 상기 실시예 9의 결과와 일치하는 것이다.
실시예 11. AREG-EGF 투여에 의한 뇌의 기능적 활성화 확인
실시예 11.1. 야생형 랫트에서의 뇌 fMRI 결과
AREG-EGF의 투여가 뇌의 어느 영역에 영향을 주는지 확인하기 위해, AREG-EGF를 주입한 야생형 랫트에서 fMRI을 수행하였다. 대조군으로서 PBS를 투여한 랫트와 AREG-EGF를 투여한 랫트를 한달 후에 fMRI로 촬영하였을 때, 뇌의 여러 영역 간 상호작용 신호를 확인하였다. 구체적으로, 랫트는 SD(Spraque Dawley) 랫트 종으로 5~6주령의 수컷 8마리를 오리엔트 바이오에서 구입하였다. AREG-EGF는 랫트 구입 후 6~7주차에 뇌실내 주사(ICV)로 투여되었고, 투여 후 21일이 경과한 시점에서 fMRI 촬영을 진행하였다. fMRI 촬영은 마취된 랫트에 대해 일상 상태에서의 촬영을 먼저 진행한 후(pre-state), 마주친 적이 없는 다른 랫트의 소변을 묻힌 솜을 촬영 중인 랫트가 냄새를 맡을 수 있도록 위치시켜 fMRI를 재촬영하였다(post-state). 설치류의 경우 상대 개체의 소변 라벨(urine marking)에 의해 사회적 식별과 같은 사회적 반응이 일어나기 때문에, 사회적 반응을 일으키기 위해 낯선 랫트의 소변을 사용하였다. AREG-EGF의 투여 및 MRI 분석의 구체적인 방법은 하기 실험예 2.1 및 실험예 3을 참조한다.
실험 결과, PFC(prefrontal cortex)와 PC(parietal cortex)사이에서 신호가 증가된 것을 확인하였다(도 9a, 좌측). 뇌의 영역 차이 값의 변화를 확인한 결과는 도 9a의 우측에 나타내었다. PFC와 PC 영역만을 평균 z-변환 상관계수(z-CorrCoef; Fisher z-변환 상관계수)로 비교하였을 경우, PBS 그룹과 비교하여 AREG-EGF 투여 그룹에서 유의하게 높은 활성을 보였다(도 9b).
fMRI 실험 결과에 의해 확인된 뇌의 부위별 변화(감소 또는 증가) 영역을 하기 표 7에 기재하였다(약어는 상기 표 1 참조).
감소 증가
영역 #1 영역 #2 영역 #1 영역 #2
Cg1(24b) Cg2(24a) PrL Hb
Cg1(24b) Cg1(24b') IL MD
Cg1(24b) PtA IL DRN
Cg2(24a) PtA Cg1(24b') Hb
Cg1(24b') PtA Cg1(24b') CPu
Cg1(24b') PPC Cg2(24a') VTA
Cg2(24a') PtA PtA NAc
Cg2(24a') PPC PtA CPu
PtA PtA PtA Amyg
PtA PPC PtA Hypo
PPC HPC PPC CPu
CPu Amyg NAc Hypo
Hypo DRN Hb VTA
Hb Hypo
다음으로, PFC에서 AREG-EGF 투여에 의해 조절되는 휴식상태 기능적 연결성(resting-state functional connectivity, rsFC)의 공간적 위치를 확인하기 위해, 시드-상관관계(seed-correlation) 공간 맵을 나타내었다(도 9c). 뇌의 Ca1/2(24b'/24a') 영역은 대상피질(Cg1, Cg2)과 후부(posterior part; 24b'및 24a')를 의미한다. 통계 맵에서 rsFC는 PC(LPtA및 MPtA)뿐만 아니라 운동(M1), 체성 감각(S1DZ, S1BF 및 S1Tr) 및 시각(V1B) 피질에서 현저하게 향상된 영역이 관찰되었다(도 9c).
실시예 11.2. 마우스에서의 뇌 fMRI 결과
야생형 랫트에서 AREG의 투여에 따른 fMRI 결과와 일치하는지 확인하기 위해, CRTC3 KO 마우스 그룹에서 fMRI을 수행하였다. 상기 실시예 11.1에서 확인된 결과, 즉 랫트에서 AREG 투여 후 rsFC이 PFC 및 PC 영역에서 활성화된다는 결과를 토대로 CRTC3 KO 마우스 그룹에서도 rsFC를 비교해 보았다.
그 결과, WT 마우스와 비교하여 CRTC3 KO 마우스에서는 다양한 뇌 영역에서 rsFC의 변화를 보였다(도 10a). 랫트에서 확인된 영역인 PFC와 PC의 rsFC가 CRTC3 KO 마우스에서도 현저하게 떨어져 있는 것으로 나타났다(도 10b; ** p = 0.0099). 시드-기반 통계 맵 분석에서도 PFC, PC 및 다른 여러 영역에서 WT 마우스 그룹과 CRTC3 KO 마우스 그룹 간의 차이가 확인되었다(도 10e의 좌측 패널(Pre-treatment 컬럼)). 이러한 결과는 CRTC3가 마우스 뇌에서 PC와 PFC 영역 간의 연결성(connectivity)에 중요한 역할을 한다는 사실을 입증한다.
또한, AREG의 투여가 랫트에서와 마찬가지로 CRTC3 KO 마우스의 PC와 PFC 영역의 rsFC에 변화를 일으키는지 확인하기 위해, AAV5-GFAP-AREG 유전자 발현 시스템을 이용한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 성상교세포에 특이적으로 AREG를 발현시키는 AAV 바이러스를 마우스의 뇌실에 주입하였다. 바이러스 주입 전후에 대한 fMRI 분석결과, CRTC3 KO 마우스에서 감소되었던 rsFC가 AREG 바이러스의 주입 후 WT 마우스 그룹과 비슷한 수준으로 회복되는 것을 확인할 수 있었다(도 10c 및 도 10d; p = 0.4751). 이와 같은 결과는 시드-기반 통계 맵 분석에서도 명확하게 확인할 수 있었다(도 10e의 중간 패널(Post-treatment 컬럼)). AREG 바이러스 투여 전에는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 그룹 간 뇌의 여러 부위에서 rsFC의 차이를 보였지만, 바이러스 투여 후에는 WT 마우스와 CRTC3 KO 마우스 그룹 간에 rsFC의 차이를 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 CRTC3에 의해 감소되었던 PC와 PFC 부위의 rsFC가 성상교세포에서 생산된 AREG에 의해 다시 회복될 수 있다는 사실을 입증한다.
본 실시예 11.1 및 실시예 11.2의 결과는 휴식 상태(resting state)에서 AREG에 의해 뇌의 PFC와 PC 사이에 기능적으로 활성이 일어남을 보여준다.
실시예 12. AREG의 EGF 및 HB 도메인의 종 간 서열 보존 확인
다른 EGF 패밀리 성장인자와 같이, AREG의 전구체(pro-AREG)는 EGF 도메인, 소수성 막 횡단 영역 및 친수성 세포질 C-말단으로 구성된다. 또한, AREG는 HB-EGF와 유사한 헤파린 결합 도메인을 포함한다. 절단, 엑토도메인 셰딩(ectodomain shedding) 동안 원형질막에서 친수성 N-말단 공정이 성숙한 단백질로서 방출되도록 한다. 본 실시예에서는 AREG의 아미노산 서열을 다양한 종에서의 AREG 서열과 정렬하여 비교하였다.
그 결과, 대부분의 AREG는 EGF 도메인 및 HB 도메인으로 보존되어 있었다(도 11a). 또한, 인간(Homo sapiens)과 마우스(Mus musculus)에서 AREG의 각 도메인 서열이 고도로 보존되어 있음을 확인하였다(도 11b).
본 실시예 12의 결과는 AREG의 EGF 및 HB 도메인이 다양한 종에서 보존되어 있음을 보여준다.
상기 실시예 5 내지 실시예 12의 결과를 종합하면, CRTC3 KO 마우스는 WT 마우스에 비해 사회적 우세 순위가 매우 낮은데, 이러한 CRTC3 KO 마우스의 사회적 열세를 다시 상승시키는 분자는 암피레귤린(AREG), 특히 AREG의 EGF 도메인이며, 상기 AREG는 뇌의 성상교세포에서 분비됨을 확인하였다. 이는 AREG의 조절에 의해 사회적 우세성이 변할 수 있음을 보여주는 것이다. 따라서 상기와 같이 새롭게 밝혀진 사실을 응용하면, 암피레귤린은 CRTC3의 결함에 의한 사회적 우세성의 저하 또는 사회적 열세로 인해 나타나는 다양한 질환 또는 상태 예를 들어, 만성 염증(chronic inflammation), 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation), 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder), 공격적 성격(aggressive personality), 만성 스트레스(chronic stress), 불안신경증(anxiety neurosis), 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애, 조현병(schizophrenia), 기분 장애, 조증(mania), 우울증(depressive disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 취약X증후군(fragile X syndrome), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 및 자폐증(autism) 등과 같은 질환 상태를 예방하거나 치료 또는 개선할 수 있다.
Ⅲ. 재료 및 방법
실험예 1. 시험관내( in vitro ) 실험의 재료 및 방법
실험예 1.1. 세포의 배양 및 분리
세포의 종류에 따른 CRTC3 및 AREG의 발현 수준 측정 및 전사체 프로파일링을 위한 qRT-PCR 및 마이크로어레이 실험에 사용된 세포는 아래와 같은 방법에 의해 준비되었다.
일차피질뉴런을 배양하기 위해, 기존의 문헌에 기술된 바에 따라 배아 16일(E16)의 마우스 새끼의 뇌로부터 뇌 피질을 수득하였다(문헌[Seibenhener ML, Wooten MW. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J Vis Exp. 2012 Jul 26;(65):3634.] 참조). 피질에서 뇌막을 제거하기 위해 무칼슘, 무마그네슘의 차가운 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)에서 피질을 절개하였다. 절개된 조직을 0.05% 트립신-EDTA와 함께 37℃에서 15분 동안 배양하였고, 5분 마다 상기 조직이 담긴 튜브를 뒤집어 주었다. 배양 후, 20% FBS(fetal bovine serum)이 함유된 DMEM으로 트립신을 불활성화시키고, 700 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 생성된 펠릿은 파스퇴르피펫(pasteur pipette)을 사용하여 부드럽게 재현탁하였다. B-27 보충제(Gibco, Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 미국)가 첨가된 신경기초 배지(neurobasal medium)에 해리된 세포를 적절한 세포 밀도를 갖도록 플레이트에 분주하였다. 상기 플레이트는 폴리-D-라이신(PDL)(시그마-알드리치, 미국) 및 라미닌(Life Technologies/Thermo Fisher Scientific, 미국)으로 코팅하여 사용하였다. 뉴런은 5% CO2, 37℃ 및 가습된 환경에서 유지되었다.
신경아교세포(glial cell)의 배양을 위해, 출생 후 1-3일차 마우스 새끼로부터 대뇌 피질을 준비하였다(문헌[Lee J, Kim DE, Griffin P, Sheehan PW, Kim DH, Musiek ES, Yoon SY. Inhibition of REV-ERBs stimulates microglial amyloid-beta clearance and reduces amyloid plaque deposition in the 5XFAD mouse model of Alzheimer's disease. Aging Cell. 2020 Feb;19(2):e13078.] 참조). 일차뉴런세포의 배양과 마찬가지로, 절개된 조직을 37℃에서 15분 동안 트립신-EDTA로 처리하였다. 세포를 700 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, GM-CSF(5 ng/ml)를 함유하는 완전 배지(complete medium)에 재현탁하였다. 재현탁된 세포를 75T 플라스크에 플레이팅하고, 10일 동안 37℃에서 배양하였다.
일차미세아교세포(primary microglia)를 분리하기 위해, 플라스크를 225 rpm에서 2시간 동안 진탕시켜 혼합된 아교세포를 수집하였다. 부유 일차미세아교세포를 PDL이 코팅된 플레이트 상에 플레이팅하였다. 진탕 플라스크는 다른 세포를 분리하기 위해 16시간 동안 유지하였다. 밤새 진탕시킨 후, 부착된 일차성상교세포(primary astrocyte cell)를 실험을 위해 플레이트에서 배양하였다.
이 연구에 사용된 모든 동물 실험 절차는 아산생명과학연구원 동물실험윤리위원회에 의해 승인되었다.
실험예 1.2. RNA의 준비 및 정량적 실시간 PCR(qRT-PCR)
총 RNA는 제조사의 지침에 따라 NucleSpin RNA 키트(ACHEREY-NAGEL, 독일)를 사용하여 세포로부터 추출하였다. RNA 농도는 ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies, 미국)를 사용하여 측정하였다. RNA의 순도 및 완전성은 ND-1000 분광 광도계(NanoDrop Technologies) 및 애질런트 2100 바이오 분석기(Agilent Technologies, 미국)를 사용하여 평가하였다.
cDNA를 합성하기 위해, 제조사의 지침에 따라 ReverTra Ace qPCR RT 키트(TOYOBO, 일본)를 사용하여 0.8 μg의 RNA를 합성하였다. 혼합물의 총 반응 부피는 iQ SYBR Green 수퍼믹스(Bio-Rad, 미국) 및 프라이머와 함께 20 μl로 구성되었다. 정량화는 제조사의 지침에 따라 LightCycler® 480 시스템(Roche diagnostics, 네덜란드)을 사용하여 수행하였다.
여기서 사용된 모든 프라이머는 코스모진텍(서울, 대한민국)에 의뢰하여 합성되었으며, 프라이머 서열은 하기 표 8에 기재된 바와 같다.
유전자 프라이머 방향 서열 서열 목록
마우스 GAPDH 정방향 5'-CCATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3' 서열번호 19
역방향 5'-GGATGACCTTGCCCACAGCCTTG-3' 서열번호 20
마우스 CRTC3 정방향 5'-CTTCACAGCACCTGGATGAGAG-3' 서열번호 21
역방향 5'-TGCTCAGAGCACTCGTGTGAAG-3' 서열번호 22
마우스 AREG 정방향 5'-GCCATTATGCAGCTGCTTTGGACG-3' 서열번호 23
역방향 5'-TGTTTTTCTTGGGCTTAATCACCT-3' 서열번호 24
실험예 1.3. 마이크로어레이(microarray) 분석
실험예 1.3.1. 실험 방법
전사체 프로파일링을 위해, 제조사의 프로토콜에 따라 GeneChip Whole Transcript PLUS reagent 키트(Affymetrix, 미국)를 사용하여 전체 전사체 발현 어레이(whole transcript expression array, Affimetrix, 미국)를 수행하였다. cDNA는 제조사의 지침에 기술된 바와 같이 GeneChip WT(Whole Transcript) 증폭 키트를 사용하여 합성하였다. 이어서, 센스 cDNA를 GeneChip WT 말단 라벨링 키트를 사용하여 말단 디옥시뉴클레오티드 전달효소(Terminal deoxynucleotidyl Transferase, TdT)로 단편화하고 비오틴으로 표지하였다. 대략 5.5 μg의 표지된 DNA 표적을 GeneChip 마우스 유전자 2.0 ST 어레이(Affymetrix, 미국)를 사용하여 45℃에서 16시간 동안 혼성화시켰다. 혼성화된 어레이를 GeneChip Fluidics Station 450에서 세척 및 염색하고 GCS3000 스캐너(Affymetrix, 미국)를 사용하여 스캔하였다. 신호 값은 GeneChip Command Console 소프트웨어(Affymetrix, 미국)를 사용하여 계산하였다.
실험예 1.3.2. 원시 데이터 처리 및 통계 분석
마이크로어레이에 의해 수득한 원시 데이터는 GeneChip Command Console 소프트웨어(Affymetrix, 미국)에서 제공하는 데이터 추출 프로토콜에 의해 자동으로 추출되었다. CEL 파일을 가져온 후, Expression Console(EC) 소프트웨어(Affymetrix, 미국)에 구현된 RMA(robust multi-array average) 방법으로 데이터를 요약하고 정규화하였다. 유전자 수준의 RMA 분석으로 결과를 출력하고, 차등적으로 발현된 유전자(differentially expressed gene, DEG) 분석을 수행하였다.
시험 샘플과 대조 샘플 사이의 비교 분석은 배수 변화(fold change)를 사용하여 수행되었다. DEG 세트에 대해, 유사성의 척도로서 완전 연계 및 유클리드 거리(Euclidean distance)를 사용하여 계층적 군집 분석(Hierarchical cluster analysis)을 수행하였다. 중요한 프로브 목록에 대한 유전자 세트 농축도 분석(Gene set enrichment analysis) 및 기능적 주석 분석(Functional annotation analysis)은 유전자 온톨로지(http://geneontology.org/) 및 KEGG(http://kegg.jp)를 사용하여 수행하였다.
DEG에 대한 모든 통계적 검정 및 시각화는 R 통계 언어(R statistical language, v.3.1.2, www.r-project.org)를 사용하여 수행하였다.
실험예 1.4. 면역세포화학법(Immunocytochemistry)
면역세포화학법은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, PDL로 코팅된 12 mm 커버슬립(Marienfeld, 독일)을 24-웰 플레이트에 넣고, 여기에 세포를 플레이팅 하였다. 이후, 세포를 4% 파라포름알데하이드(바이오세상, 대한민국)로 10분 동안 고정시켰다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후 실온에서 5분 동안 0.1% 트리톤 X-100을 함유하는 PBS로 투과화(permeabilization)시켰다. 다시 세포를 3회 세척하고, 5% BSA(Bovine serum albumin)을 함유하는 PBS로 37℃에서 30분 동안 블로킹(blocking)하였다. 세포를 3회 세척한 후 마우스 항-GFAP 항체(Chemicon-Millipore, 미국)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 세포를 5회 세척하고 2차 항체(Invitrogen, 미국)와 배양한 후, 이미징을 위해 형광 마운팅 용액(DAKO, 미국)을 이용하여 샘플을 마운팅하였다.
실험예 1.5. 면역조직화학법(Immunohistochemistry)
면역조직화학법은 다음과 같이 수행하였다. 먼저, 마우스에서 뇌를 적출하여 4% 파라포름알데히드(바이오세상, 대한민국)로 4℃에서 24시간 동안 고정시킨 후 PBS로 세척하였다. 동결절편(cryosection)을 위해, 샘플을 30% 수크로스를 함유한 PBS에 넣고 4℃에서 24시간 동안 배양하였다. 샘플을 O.C.T. 컴파운드(Tissue-Tek, Sakura Finetek, 미국)에 포매하고, 절편화(sectioning)할 때까지 -80℃에서 보관된 드라이아이스로 스냅-동결시켰다. 이후 동결된 샘플은 라이카 CM 1860을 사용하여 -25℃에서 30 μm의 두께로 절편화하였다. 수득한 절편을 PBS로 5분 동안 3회 반복 세척하고, 1% NGS(normal goat serum), 0.3% 트리톤 X-100 함유 PBS로 30분 동안 블로킹하였다. 1차 항체는 블로킹 완충액으로 희석하여 사용하였으며, 4℃에서 밤새 처리하였다. 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 토끼 항-CRTC3항체(abcam, 미국), 마우스 항-GFAP 항체(Chemicon-Millipore, 미국), 토끼 항-s100β 항체(abcam, 미국), 마우스 항-NeuN 항체(abcam, 미국), 염소 항-Iba1 항체(abcam, 미국). 이어서, PBS로 5회 세척한 후 Alexa Fluor 488 항체(Invitrogen, 미국), 비오틴화 항-토끼 IgG 항체(Vector Laboratories, 미국) 및 Alexa Flour 594 접합 스트렙타비딘(Invitrogen, 미국)을 실온에서 60분 동안 처리하였다. 이미징을 위해 형광 마운팅 용액(DAKO, 미국)을 이용하여 샘플을 마운팅하였다.
실험예 1.6. 웨스턴 블롯팅
총 단백질 추출을 위해, 세포를 얼음상에서 PRO-PREP™ 시약(인트론 바이오테크놀로지, 대한민국) 기반의 용해 완충액(lysis buffer)으로 15분 동안 용해시키고, 원심분리하여 세포 잔해물을 제거하였다. 단백질 샘플의 농도는 브래드포드 분석법을 사용하여 측정하였다.
웨스턴 블롯팅 분석을 위해, 동일한 양의 단백질을 샘플 완충액(62.5 mM Tris-HCl[pH 6.8], 1%[w/v] SDS, 2.5%[v/v] 글리세롤, 0.5%[v/v] β-머캅토에탄올 및 브로모페놀 블루)과 혼합하고, 100℃에서 5분 동안 끓인 후, 사용할 때까지 -20℃에서 저장하였다. 단백질을 일정한 전압(100V) 하에 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)에 의해 분리한 다음, 100V에서 1.5시간 동안 폴리비닐리덴 디플루오라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane, PVDF 막; 기공 크기, 0.2 mm; BioRad, 미국)으로 이동시켰다. 2%(w/v) BSA 및 2%(v/v) NHS(normal horse serum)을 함유하는 PBST 완충액(0.1%[v/v] tween-20 함유)에서 1시간 동안 배양한 후, 블롯(상기 PVDF 막)을 1차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 블롯을 PBST 버퍼로 세척하고, HRP(Horseradish peroxidase) 접합 항-IgG 항체(1:5,000; Pierce, 미국)와 함께 배양하였다. 이후 블롯에 ECL(Enhanced chemiluminescence) 시약(Amersham, 미국)을 처리하여 X-선 필름에 가시화하였다. 웨스턴 블롯팅에 사용된 1차 항체는 다음과 같다: 토끼 항-CRTC3 항체(1:1,000; Cell Signaling, 미국), 토끼 항-p-STAT3 항체(1:500, Cell Signaling, 미국), 마우스 항-STAT3 항체(1:2000, Cell Signaling, 미국), 토끼 항-p-GluA1(p831) 항체(1:2000; Millipore, 미국), 토끼 항-GluA1(p831) 항체(1:2000; Millipore, 미국), 마우스 항-β-액틴 항체(Sigma, 미국). 밴드의 강도는 ImageJ(Java 기반 이미지 처리 및 분석; National Institutes of Health, 미국)를 사용하여 측정 및 분석하였다.
실험예 2. 실험 동물에 대한 수술 방법
실험예 2.1. 삼투 펌프 이식(Osmotic pump implantation)
AREG, AREG-EGF, AREG-HB 및 마우스 EGF 단백질은 PBS에 용해하여 주입하였다. 용해된 단백질을 마이크로 삼투 펌프(모델 1004, Alzet, 프랑스)에 채우고, 25일 동안 0.11 μl/hr의 유속으로 주입되도록 하였다. 단백질로 채워진 마이크로 삼투 펌프를 4 mm 길이의 비닐 튜브(내경 0.69 mm)를 통해 캐뉼라에 연결하였다(뇌 주입 키트 3, Alzet, 프랑스). 완성된 뇌 주입용 펌프를 PBS로 채워진 원뿔형 튜브에 넣고 37℃에서 48시간 동안 프라이밍한 후 마우스의 피하에 이식하였다.
뇌 주입용 펌프의 이식은 마우스를 이소플루란(유도: 5%, 마스크: 2%)으로 마취한 후 정위고정장치(stereotaxic apparatus)를 사용하여 진행되었다. 캐뉼라는 우측 뇌실(브레그마 기준, AP[anteroposterior] = -0.3 mm, ML[mediolateral] = 1 mm)에 이식하였고, 삼투 펌프는 마우스의 등쪽에 이식하였다. 이식 수술이 끝날 무렵 마우스에 항통증 약물로서 케토프로펜(8 mg/kg)을 피하 투여하였다. 다음날 케토프로펜 주사를 한 번 더 반복 투여하였다. 회복을 위해, 이식 수술을 마친 마우스는 7일 동안 튜브 우세 시험을 수행하지 않았다.
fMRI 분석의 경우, 랫트 내에 이식된 마이크로 삼투 펌프(모델 2004, Alzet, 프랑스)를 AREG-EGF 및 PBS로 채우고 28일 동안 0.25 μl/hr의 유속으로 주입되도록 하였다. 캐뉼라는 28 게이지 PEEK(Polyether ether ketone) 캐뉼라로 교체하였다. 이 캐뉼라를 정위고정장치를 이용하여 5-6주령 랫트의 측뇌실에 이식하였다(브레그마 기준, AP = -1.2 mm, ML = -2 mm, DV[dorsoventral] = 5 mm). fMRI 촬영은 수술 21일 후 진행하였으며, 마취 후 기본 상태(일상 상태)에서 fMRI 촬영을 진행하고(pre-state), 이후 한 번도 접촉하지 않은 다른 랫트의 소변을 뭍힌 솜의 냄새를 맡도록 한 상태에서 fMRI 촬영을 진행하였다(post-state). 랫트는 모든 fMRI 촬영을 수행하고 다음날 희생되었다.
마우스에서의 fMRI 분석도 랫트의 경우와 동일한 방법으로 진행되었다. 구체적으로, 마우스에 바이러스 주입하기 일주일 전에 fMRI 촬영을 진행하고(pre injection), 바이러스 주입 후 행동 실험을 수행한 뒤 4~5주차에 fMRI 촬영을 진행하였으며(post injection), 마우스는 fMRI 촬영을 완료하고 7일 뒤에 희생되었다.
실험예 2.2. 바이러스의 정위 주입(Virus stereotaxic injection)
뇌의 성상교세포에서 AREG 단백질을 발현시키기 위한 AAV5-GFAP-mAREG SP_94_191 작제물 및 이를 이용한 AAV5-GFAP-mAREG 94-191 바이러스의 제작은 벡터빌더사에 의뢰하였다. 상기 작제물에서 mAREG 94-191의 뉴클레오타이드 서열은 하기 표 9에 기재하였다:
종류 뉴클레오타이드 서열 서열 목록
mAREG 94-191 ATGAGAACTCCGCTGCTACCGCTGGCGCGCTCAGTGCTGTTGCTGCTGGTCTTAGGCTCAGGCCATTATGCAGCTGCTTCAGTCAGAGTTGAACAGGTGATTAAGCCCAAGAAAAACAAGACAGAAGGAGAAAAGTCTACAGAAAAACCCAAAAGGAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAGGCAGAAGGAATAAGAAGAAAAAGAATCCATGCACTGCCAAGTTTCAGAACTTTTGCATTCATGGCGAATGCAGATACATCGAGAACCTGGAGGTGGTGACATGCAATTGTCATCAAGATTACTTTGGTGAACGGTGTGGAGAAAAATCCATGAAGACTCACAGCGAGGATGACAAGGACCTATCCAAGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAG 서열번호 25
생산된 바이러스는 반구(hemisphere) 당 1 × 1011 gc(genome copies)의 양으로 마우스의 우측 뇌실에 주입하였다. 구체적으로, 마우스를 마취하여 정위고정장치에 고정시키고, 마우스 개골의 브레그마(bregma)를 기준으로 AP = -0.3 mm, ML = -1.0 mm, DV = -3.0 mm 위치를 표시하였다. 표시된 상기 위치에 구멍을 뚫고 해밀턴 주사기(Hamilton syringe)를 사용하여 0.4 μl/분의 속도로 바이러스를 주입하였다. 주입 후 5분 정도가 경과한 후에 1분에 걸쳐 천천히 주사기를 제거해 주었다. 바이러스 주입이 완료된 마우스는 약 일주일 정도의 회복 기간을 거친 후, 행동 실험을 진행하였다.
실험예 3. MRI 데이터의 수집 및 분석
실험예 3.1. MRI 데이터 수집
MRI는 72 mm 송수신 체적형 코일(volume coil)과 수신용 랫트 뇌 표면 코일을 포함하는 7.0 T Bruker PharmaScan 70/16 MRI 시스템(Bruker BioSpin, 독일)을 ParaVision 6.0.1 소프트웨어와 함께 사용하여 수행되었다. 랫트는 50 mg/kg의 졸라제팜 틸레타민 복합제(Zoletil®, Virbac, 호주) 및 12.5 mg/kg의 럼푼(Bielkorea, 대한민국)으로 마취하였다. 마우스의 경우 마취제로 0.05 mg/kg의 메데토미딘(medetomidine)을 사용하였고, MRI 촬영 후 마취 회복제로 0.25 mg/kg의 아티파메졸(atipamezole)을 주입하였다.
동물의 호흡을 모니터링하면서, 순환 수조 시스템(CW-05G 항온 순환 수조; Midwest Scientific, 미국)을 사용하여 동물의 체온이 37.5±0.5℃로 꾸준히 유지되도록 하였다.
단일 샷 GE-EPI(Gradient-echo echo-planar imaging) 시퀀스는 다음과 같은 매개변수와 함께 사용되었다: 반복시간(TR) = 1000 ms; 에코시간(TE) = 20.3 ms; 매트릭스 크기 = 64Х64; 시야(FOV) = 25Х25 mm2; 슬라이스 개수 = 23; 슬라이스 두께 = 1 mm; 슬라이스 간격 = 0 mm; 플립 각도 = 45°, 스캔 당 300 볼륨.
또한, 해부학적 이미지는 다음과 같은 매개변수를 사용하여 RARE(Rapid Imaging with Refocused Echoes) 시퀀스에 의해 급속 이미징으로 획득하였다: 반복시간(TR) = 5250 ms; 에코시간(TE) = 66 ms; 매트릭스 크기 = 256Х256; 시야(FOV) = 25Х25 mm2; 슬라이스 개수 = 23; 슬라이스 두께 = 1 mm; 슬라이스 간격 = 0 mm; 여기횟수(NEX) = 2.
실험예 3.2. rsfMRI(resting state fMRI) 데이터 수집
rsfMRI의 모든 데이터는 AFNI(Analysis of Functional NeuroImages; ver.19.2.23, National Institutes of Health, 미국, 관련 문헌[PMID: 8812068, 9430344 및 9673664] 참조) 및 매트랩(MathWorks, 미국)의 내부 코드(in-house code)를 사용하여 처리되었다. 일반적으로 인간 rsfMRI 데이터 처리에서 사용되는 것을 랫트 rsfMRI 데이터 처리에 최적화되도록 조정하여 사용하였다.
전처리 파이프라인에는 다음의 5단계가 포함되었다: 첫째로, rsfMRI 이미지는 아핀 변환(affine transformation; 3dAllineate)을 사용하여 랫트 뇌의 EPI 템플릿에 공동 등록되었다. 둘째로, 공동 등록된 rsfMRI 이미지는 랫트의 머리 움직임에 맞게 수정되었고, 6-모션 매개변수는 ASCII 형식(3dvolreg)으로 출력되었다. 셋째로, 과도 스파이크 제거(3dDespike) 및 다항 추세 제거(3dDetrend)를 통해 움직임이 보정된 rsfMRI 이미지를 얻었다. 넷째로, 마스크 세트 템플릿(3dmaskave)을 사용하여 대상의 뇌척수액(CSF) 추세가 제거된(detrended) rsfMRI 이미지를 추출하였다. 마지막으로, 대역 필터링(band-pass filtering; 0.01 ~ 0.1 Hz) 및 방애물 회귀(nuisance regression)(3dTproject)가 적용된 공간 평편화(Spatial smoothing)(FWHM = 0.7 mm)를 사용하여 추세가 제거된 rsfMRI 이미지를 얻었다. 방애물 신호의 평가를 위해 6-모션 매개변수 및 CSF 신호를 평가하였다. CSF의 ROI(region of interest)는 SIGMA 랫트 뇌 템플릿(문헌[PMID: 31836716] 참조)의 CSF 마스크 템플릿을 사용하였고, 위 SIGMA CSF 마스크에는 뇌 영역의 외부 영역이 존재하기 때문에 뇌실 내부 영역을 엄격하게 포함하도록 수정하였다. 등록 후 이미지 중 일부는 원본 CSF 마스크의 외부 영역에 피질 영역을 오버레이 하였다. CSF 마스크의 외부 영역 제거는 ITK-SNAP 프로그램(ver.3.6, 문헌[PMID: 16545965] 참조)을 사용하여 수행되었다. 본 실시예에서는 엄격한 뇌실 CSF 마스크를 사용하였다. 엄격한 CSF 마스크 영역의 타임 랩스 신호의 평균은 추세가 제거된 rsfMRI 이미지(3dmaskave)에서 추산되었다.
마우스에서의 rsfMRI 데이터 수집은 랫트의 경우와 동일한 방법으로 진행되었다.
실험예 3.3. rsFC(Resting-state functional connectivity) 분석
랫트의 뇌에서 구역간 rsFC를 측정하기 위해 시드(seed)-기반 rsFC 분석을 수행하였다. 설치류의 사회적 지배 행동과 관련된 rsFC를 평가하기 위해 총 33개의 ROI를 평가하였다. 정의된 해부학적 랫트 뇌 아틀라스의 각 ROI에서 평균 시간 코스 신호(time-course signal)는 해당 영역을 SIGMA 랫트 뇌 아틀라스와 브레인 맵스(Brain maps) 4.0을 사용하여 정의된 내부 ROI 마스크를 사용하였다. 랫트의 뇌와 ROI 사이의 rsFC 강도는 피어슨 상관계수를 사용하여 추정하였다. 그 후 상관값은 정규성을 향상시키기 위해 피셔 z-변환(Fisher r-to-z transformation)을 거쳤다. 그룹 수준의 rsFC 맵이 생성되었으며, 이는 FWER(family-wise error rate) 및 FDR(false discovery rate; p < 0.05)을 사용하여 보정되었다. 시드-기반 공간 FC 맵은 후방 대상 피질(Cg 1, 24b' 및 24a')에서 1 mm의 구형 시드로 수행되었다. 그룹 수준의 시드 맵은 시드된 공간 FC 맵 각각에 대한 평균을 사용하여 계산되었다(3dTcorr1D, 3dttest++ 및 FDR 보정(p < 0.05)).
마우스에서의 rsFC 분석은 랫트의 경우와 동일한 방법으로 수행하였다.
실험예 4. 통계 분석
실시예에서 데이터 분석은 그래프패드 프리즘 5 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 행동 실험의 경우, 만-휘트니 검정(Mann-Whitney test), 독립표본 t검정(unpaired t-test), 일원분산분석 후 본페로니 다중 비교 검정(One-way ANOVA post hoc Bonferroni's Multiple Comparison Test) 및 튜키 다중 비교 검정(Tukey's Multiple Comparison Test)으로 데이터를 분석하였다. 약물 투여 실험에서 전후 비교는 윌콕슨 부호 순위 검정(Wilcoxon signed rank test)이 사용되었다. 웨스턴 블롯팅 밴드 분석을 위해, 적절한 경우 t검정 또는 만-위트니 검정을 두 그룹의 비교에 사용하였다. 바틀렛 검정(Bartlett's test)으로 평가한 분산이 검정으로 평가한 분산이 동일하지 않은 경우 크루스칼-왈리스 검정(Kruskal-Wallis test) 및 던 다중 비교 검정(Dunn's Dunn's multiple comparisons test)을 사용하여 비모수분석을 수행하였다. 데이터의 정규성 검정에는 다구스티노 피어슨 옴니버스 정규성 검정(D'Agostino-Pearson omnibus normality test)를 사용하였다. 5% 미만의 확률(p < 0.05)이 유의한 것으로 간주되었다. 모든 값은 평균±평균의 표준 오차(Mean±SEM)으로 표시하였다.

Claims (26)

  1. CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된, 사회적 우세성(social dominance) 결여 동물 모델.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 뇌 특이적으로 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 것인
    동물 모델.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 뇌의 성상교세포(astrocyte) 특이적으로 CRTC3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 것인
    동물 모델.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 CRTC3 유전자가 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)된 것인
    동물 모델.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 야생형(wildtype) 동물과 비교하여 뇌에서 암피레귤린(Amphiregulin) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 감소되는 것인
    동물 모델.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 야생형 동물과 비교하여 기억과 관련된 행동, 감각과 관련된 행동, 또는 이들 모두에 대한 변화가 나타나지 않는 것인
    동물 모델.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 야생형 동물과 비교하여 뇌의 전전두엽 피질(prefrontal cortex)과 두정엽 피질(parietal cortex)의 기능적 연결성이 저하된 것인
    동물 모델.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 동물 모델은 사회적 우세성 결여 또는 감소와 관련된 질환에 대한 모델인
    동물 모델.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 질환은 사회적 패배 스트레스(social defeat stress)를 동반하거나 이에 의해 유발되는 질환인
    약학 조성물.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 질환은 만성 염증(chronic inflammation), 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation), 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder), 공격적 성격(aggressive personality), 만성 스트레스(chronic stress), 불안신경증(anxiety neurosis), 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애, 조현병(schizophrenia), 기분 장애, 조증(mania), 우울증(depressive disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 취약X증후군(fragile X syndrome), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 및 자폐증(autism)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인
    동물 모델.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 동물은 마우스, 햄스터, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는
    동물 모델.
  12. CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는, 사회적 우세성(social dominance) 결여 동물 모델을 제조하는 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 단계는 CRTC3 유전자를 넉아웃(knockout) 또는 넉다운(knockdown)시키는 것을 포함하는
    방법.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 사회적 우세성(social dominance) 결여 동물 모델에 정신 질환의 치료를 위한 후보 약물을 투여하는 단계; 및
    상기 동물 모델의 사회적 우세성이 개선되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는
    정신 질환 치료제의 스크리닝 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 정신 질환은 사회적 우세성 결여 또는 감소 증상을 수반하는
    방법.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 확인 단계는 사회적 우세성 평가를 위한 행동 시험, 뇌파(Electroencephalogram, EEG) 분석, 뇌 MRI 분석, 상기 동물 모델에서 유래한 생물학적 시료 내 암피레귤린의 발현 또는 활성 수준 측정, 또는 이들의 조합에 의해 수행되는
    방법.
  17. 뇌의 EGF(Epidermal growth factor) 수용체에 대한 작용제(agonist)를 유효성분으로 포함하는, 사회적 우세성 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 EGF 수용체에 대한 작용제는 암피레귤린, 이의 단편 또는 이들을 암호화하는 핵산을 포함하는
    약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 암피레귤린 또는 이의 단편은 암피레귤린의 EGF 도메인을 포함하는
    약학 조성물.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 암피레귤린은 서열번호 8로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는
    약학 조성물.
  21. 제19항에 있어서,
    상기 암피레귤린의 EGF 도메인은 서열번호 10으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는
    약학 조성물.
  22. 제17항에 있어서,
    상기 질환은 CRTC3(CREB-regulated transcription coactivator 3)의 발현 장애 또는 활성 저하에 의해 유발되는 것인
    약학 조성물.
  23. 제17항에 있어서,
    상기 질환은 사회적 패배 스트레스(social defeat stress)를 동반하거나 이에 의해 유발되는 것인
    약학 조성물.
  24. 제17항에 있어서,
    상기 질환은 만성 염증(chronic inflammation), 자해(self-harming), 자살 충동(suicidal ideation), 반사회적 인격장애(anti-social personality disorder), 공격적 성격(aggressive personality), 만성 스트레스(chronic stress), 불안신경증(anxiety neurosis), 약물 중독(drug intoxication) 또는 약물 중독으로 인한 정신 또는 행동 장애, 조현병(schizophrenia), 기분 장애, 조증(mania), 우울증(depressive disorder), 양극성 장애(bipolar disorder), 취약X증후군(fragile X syndrome), 자폐 스펙트럼 장애(autism spectrum disorder) 및 자폐증(autism)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인
    약학 조성물.
  25. 제17항에 있어서,
    상기 조성물은 뇌내 주사(intracerebral injection) 또는 뇌실내 주사(Intracerebroventricular injection, ICV)에 의해 투여되는
    약학 조성물.
  26. 제17항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 약학 조성물을 대상에 투여하는 것을 포함하는, 사회적 우세성 결여 또는 감소와 관련된 질환의 예방 또는 치료 방법.
KR1020220084047A 2021-07-07 2022-07-07 사회적 우세성의 결여 또는 감소와 관련된 질환의 동물 모델 및 상기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 KR20230009326A (ko)

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