CN102604008B - 一种培氟沙星表面分子印迹聚合物的制备方法以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种培氟沙星表面分子印迹聚合物的制备及其应用。通过表面分子印迹的方法得到对培氟沙星具有高效识别性的聚合物。该分子印迹聚合物以硅胶为载体、以培氟沙星为模板、甲基丙烯酸为功能单体、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、甲醇水溶液作为致孔剂，采用表面分子印迹技术合成分子印迹聚合物。将所得的聚合物作为固相萃取柱的填料制备得到培氟沙星固相萃取柱。同时将其应用于实际牛乳样品中培氟沙星的检测。本发明实现的生物样品及食品中培氟沙星的高效分离、富集与纯化，克服了传统固相萃取柱的缺陷，所得固相萃取柱可重复使用，成本低，有良好的应用前景。

Description

一种培氟沙星表面分子印迹聚合物的制备方法以及应用

技术领域

本发明涉及一种基于硅胶表面培氟沙星表面分子印迹聚合物的制备方法及应用，属于食品质量检测及药物分析领域。

背景技术

培氟沙星是一种广泛应用于兽药和动物饲料添加剂的一类氟喹诺酮类抗生素。过量的使用会导致培氟沙星在动物组织中残留，使之产生耐药性和一些不良反应。而培氟沙星在食品中的残留也引起了人们的关注。由于此类药物可以通过乳汁分泌出来，因此牛乳中此类抗生素的残留也成为了人们较为关注的问题，因为培氟沙星可以引起人体的一些不良反应，如头晕、恶心、以及一些过敏症状如皮疹、皮肤瘙痒等。

培氟沙星的检测方法主要有液相色谱法、气象色谱法、酶联免疫法、气象色谱-质谱法、液相色谱-质谱法等，酶联免疫法虽然灵敏度高，但是，建立该方法需要复杂的过程包括抗原、抗体的制备，同时因其具有生物活性，因此在操作及储存过程中条件也较为严格。对于色谱检测方法，重点在于前处理，传统的前处理方法是固相萃取法，该方法具有操作简单、价格便宜、吸附容量大、易与检测仪器连用等优点，已经成为了一种常用的样品前处理技术。影响固相萃取效率的因素中，吸附剂的选择尤为重要。传统的分离抗生素的吸附剂为中性氧化铝、C18等，对于一些复杂基质的样品这些填料存在杂质去除不完全、目标样品流失等缺陷。为了克服以上缺陷，研究者发明了具有高度特异性吸附的分子印迹技术替代传统的吸附剂来作为固相萃取填料进行培氟沙星的残留分析检测。

分子印迹技术也叫分子模板技术，属于超分子化学的研究范畴，是指以某一特定的目标分子为模板制备对该分子具有特异选择性聚合物的过程。分子印迹技术因其具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性等特点，引起了众多研究者的兴趣。此外，基于分子印迹技术制备的分子印迹聚合物具有选择性高、高恶劣环境能力强、实用寿命长、稳定性好、应用范围广等优点，也正因如此，分子印迹技术在色谱分离、固相萃取、药物分析、膜分离、环境监测、食品安全监测等领域具有乐观的应用前景。

传统的分子印迹聚合物的制备方法主要有，主体聚合法、悬浮聚合法、沉淀聚合法。这些方法虽特异性强，但是存在一定的弊端，因识别位点埋藏深，使得模板分子进入和洗脱困难，因此吸附量少，制备方法也较为繁琐，而表面分子印迹的出现克服了以上的缺点。虽然已有文献报道制备出的分子印迹聚合物对有培氟沙星具有很好的选择吸附性，但是所采用的方法基本为传统的主体聚合和沉淀聚合的方法，这些方法存在这如下所述的弊端，如主体聚合法，其制备的聚合物需要研磨，此过程将会破坏很多识别位点，也有很多识别位点被掩盖，模板分子的洗脱和吸附都很困难，比表面积小，粒径不均匀导致柱效不稳定等现象的产生。

发明内容

为了解决传统的分子印迹技术上的缺陷，本发明提供一种新的培氟沙星分子印迹固相萃取材料的制备方法，并优化确定了该发明材料的使用条件。

仪器与试剂：

Nicolet Nexus470红外光谱仪(美国Thermo Electron公司)，1260 Infinity Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，Centrifuge 5804R冷冻离心机(德国eppendorf公司)，5s1020固相萃取仪(北京振翔工贸有限公司)。甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙腈、乙酸、甲苯、磷酸二氢钾、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸、四丁基溴化铵均为分析纯(国药集团)。甲基丙烯酸、偶氮二异丁腈、3-甲氧基氨丙基硅烷、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯均为化学纯(上海源叶生物有限公司)，培氟沙星标准品(中国兽医药品监察所)。

本发明制备的培氟沙星分子印迹固相萃取柱与传统的固相萃取柱相比具有如下优势：制备过程简单易行；得到的聚合物无需研磨粒径均匀；柱效稳定，可重复使用；分子识别能力强，由于识别位点都位于硅胶表面，传质速度快，吸附量大，洗脱完全；此外也可以对培氟沙星的结构类似物进行分离。从使用价值考虑可以用来做为一种色谱柱填料实现对抗生素培氟沙星的分离，克服了传统固相萃取柱所存在的缺点。

附图说明：

图1为印迹聚合物(MIPs)和非印迹聚合物(NIPs)的吸附曲线。

具体实施方式

实施例1培氟沙星表面分子印迹聚合物的制备

1、硅胶的活化

取适量硅胶将其溶于0.25mol/LNaOH，室温震荡1h，洗涤后将其溶于8mol/LHCl，90℃回流12h，洗涤后真空干燥，获得活化硅胶。

2、烷基化硅胶

将活化后的硅胶有适量的硅烷化试剂3-甲氧基氨丙基硅烷，溶于甲苯溶液中90℃搅拌回流12h，洗涤、真空干燥后获得烷基化硅胶。

3、聚合物的制备

将烷基化的硅胶、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯、偶氮二异丁腈、培氟沙星溶于甲醇/水(9∶1，v/v)溶液中，混匀后于60℃水浴震荡热聚合48h.其中，硅胶为印迹载体，甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂、培氟沙星为模板分子、而甲醇水溶液为制孔剂。模板与功能单体的摩尔比为1∶4，功能单体与交联剂的摩尔比为1∶5，引发剂与功能单体的摩尔比为1∶4～1∶6，溶剂体积用量与交联剂的摩尔比例为2∶1；

4、模板分子的去除

将所得到的聚合物依次经三氯甲烷、甲醇、水洗涤，以去除未反应的物质，真空抽滤后将聚合物以pH为3的甲醇溶液进行索氏提取，直至模板分子洗脱完全，再经60℃真空干燥，得到培氟沙星分子印迹固相萃取材料。

实施例2培氟沙星表面分子印迹聚合物的应用

1、装柱及固相萃取柱的活化

称取200mg培氟沙星分子印迹固相萃取材料(MIPs)加入到容量为3ml的聚丙烯固相萃取空柱中，在加入填料之前柱底部要事先加入一个筛板(孔径)，在填料加入后在柱的上端也要加人筛板(孔径)，用筛板插入工具压紧，取5ml甲醇，5ml水活化固相萃取柱；

2、样品预提取

牛奶样品采用冷冻离心，之后用0.22μm的微孔滤膜进行过滤。

3、上样、淋洗、洗脱及干燥定容

将上述样品提取液加入柱中，控制溶液过柱速度不超过0.5ml/min，溶液全部流出后，用1ml的二氯甲烷淋洗，抽干柱体；以3×2ml二氯甲烷淋洗柱体，弃去全部淋洗液；以3×2ml甲醇(pH＝3，乙酸调节pH)洗脱，控制洗脱流速不超过0.2ml/min，每次洗脱后要抽干柱体，收集全部洗脱液；将收集的洗脱液与40℃真空干燥至干，再以1ml的流动相复溶，过0.22μm有机滤膜，滤液供液相色谱测定(图1)。

Claims (6)

1.一种培氟沙星表面分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于以硅胶为印迹载体，甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂、偶氮二异丁腈为引发剂、培氟沙星为模板分子、甲醇水溶液为制孔剂；混匀后于60℃水浴震荡热聚合；模板与功能单体的摩尔比为1:4，功能单体与交联剂的摩尔比为1:5，引发剂与功能单体的摩尔比为1:4～1:6，溶剂体积用量与交联剂的摩尔比例为2:1；具体步骤如下：

1）硅胶的活化及烷基化：取适量硅胶将其溶于0.25mol/LNaOH，室温震荡1h,洗涤后将其溶于8mol/LHCl,90℃回流12h,洗涤后真空干燥，获得活化硅胶；将活化后的硅胶、硅烷化试剂3-甲氧基氨丙基硅烷，溶于甲苯溶液中90℃搅拌回流12h,洗涤、真空干燥后获得烷基化硅胶；

2）培氟沙星分子印迹聚合物的制备：将烷基化的硅胶2g、甲基丙烯酸4mol、乙二醇二甲基丙烯酸酯20mol、偶氮二异丁腈0.25mmol、培氟沙星1mmol溶于体积比为9:1的40ml甲醇/水溶液中，混匀后于60℃水浴震荡热聚合48h；

3）将所得到的聚合物依次经三氯甲烷、甲醇、水洗涤，以去除未反应的物质，真空抽滤后将聚合物以pH为3的甲醇溶液进行索氏提取，直至模板分子洗脱完全，再经60℃真空干燥，得到培氟沙星分子印迹固相萃取材料。

2.权利要求1所述的方法，其特征在于还包括模板分子的去除，将权利要求1制备的聚合物依次经三氯甲烷、甲醇、水洗涤，以去除未反应的物质，真空抽滤后将聚合物以pH为3的甲醇溶液进行索氏提取，直至模板分子洗脱完全，再经60℃真空干燥，得到培氟沙星分子印迹固相萃取材料。

3.权利要求2所述的方法制备的培氟沙星表面分子印迹聚合物在制备固相萃取柱中的应用方法。

4.权利要求2所述的方法制备的培氟沙星表面分子印迹聚合物在分离富集生物样品或食品中的培氟沙星中的应用方法。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于以含有权利要求1所述方法制备的培氟沙星表面分子印迹聚合物的固相萃取柱分离牛乳样品提取液，以pH为3的甲醇溶液为洗脱溶剂、甲醇和水为柱的活化溶剂。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于上述牛乳样品培氟沙星提取液的制备方法是取空白牛乳0.5ml,加入0.5mg/ml培氟沙星溶液0.5ml,震荡混匀，冷冻离心，上清液过0.22μm的有机滤膜，将滤液真空干燥后，复溶于0.5ml的流动相中，用来测定。