CN103497277A - 黄芩素分子印迹聚合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
黄芩素分子印迹聚合物及其制备方法和应用，由黄芩素、功能单体混合溶解在致孔剂中，形成黄芩素－功能单体复合物，再加入有效剂量的引发剂、交联剂，超声混合均匀，将上步所得的混合溶液通入氮气密封；在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用有机溶剂进行洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中检测不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后将分子印迹聚合物真空干燥而得。本发明所制备的沉淀分子印迹聚合物微球，与传统的本体分子印记聚合物相比较，具有单分散性好、粒径均一、大小可控，制备简单、无复杂的后处理过程和周期较短等优点。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种分子印迹聚合物的制备方法，特别是一种对黄芩素及其体内代谢物具有特异性识别的分子印迹聚合物的制备方法。
背景技术
黄芩为唇形科植物黄芩Scutellaria baicalensis Georgi.的干燥根，具有抗炎、抗病毒、抗变态反应、抗氧化、抗肿瘤等广泛的药理作用，是我国常用中药材之一。黄芩素是黄芩的主要有效成分之一，对多种疾病包括炎症、肿瘤、纤维化性疾病、心脑血管性疾病以及神经性疾病具有良好的防治作用。目前对于黄芩素的提取大多应用有机溶剂提取或树脂吸附，存在着前处理步骤繁琐，有机溶剂消耗量大，环境污染，且选择性差，富集容量低，提取率极低。因此，随着黄芩素研究的不断深入，迫切需要一种对黄芩中有效成分更为简便实用，且高灵敏度的专一的现代分离检测方法。
分子印迹技术是模仿“抗原-抗体”识别原理发展的一种特异性识别目标分子的技术。由于分子印迹聚合物兼有高效、稳定和特异选择性且合成价格低廉的特点，近年来在越来越多的领域广泛应用，并取得良好效果。有文献报道【杨清清，李娟，等.药物分析杂志，2011，31(1)】以原位聚合法合成黄芩素分子印迹整体柱，并对黄芩素和汉黄芩素进行了分离。此方法以原位聚合法引入分子印迹技术，直接在HPLC柱内制备连续棒形聚合物，制备过程简单。但是聚合物颗粒不均匀，单分散性差，大量印记位点位于材料内部，大大降低了聚合物的吸附效率和亲和力。
中国专利CN103102444A公开了一种金属配位黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，采用辐射聚合和分子印迹技术相结合，一改过去传统的本体聚合方法，节省时间。但是合成的聚合物需要碾磨过筛，大量印记位点被破坏，而且颗粒单分散性和均匀度均较差。同时存在后处理较繁琐的缺点。所以制备均一单分散的分子印迹聚合物，并与固相萃取相结合来分离提纯黄芩提取物的研究，具有广阔的应用前景和研究意义。
发明内容
解决的技术问题：本发明的目的在于提供一种黄芩素分子印迹聚合物及其制备方法和应用，以黄芩素分子印迹聚合物为新型分离吸附材料，并与固相萃取相结合，从黄芩提取物中定向高效的分离、富集、纯化黄芩素的方法，从而克服现有分离纯化技术的不足，使其能够简单、快速、特异性地吸附黄芩素分子或其结构类似物，实现对黄芩药材及生物代谢样品中化学成分的选择性分离、高效富集。
技术方案：黄芩素分子印迹聚合物，由黄芩素、功能单体混合溶解在致孔剂中，静置2h，形成黄芩素－功能单体复合物，再加入有效剂量的引发剂、交联剂，超声5～10min，混合均匀，其中：黄芩素、功能单体的摩尔比为1:4～1:8，功能单体与交联剂的摩尔比为1:3～1:6；致孔剂体积用量与交联剂摩尔比为5～10:1（mL/mmol）；引发剂的用量是黄芩素、功能单体和交联剂总质量的3%～5%；将上步所得的混合溶液通入氮气10min，密封；在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，其中转速为100～200r/min，聚合温度为50～70℃，聚合反应时间为20～36小时；聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用有机溶剂进行洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中检测不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后将分子印迹聚合物45℃真空干燥24h而得。
一种黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于制备步骤为：1）将黄芩素、功能单体混合溶解在致孔剂中，静置2h，形成黄芩素－功能单体复合物，再加入有效剂量的引发剂、交联剂，超声5～10min，混合均匀，其中：a.黄芩素、功能单体的摩尔比为1:4～1:8，功能单体与交联剂的摩尔比为1:3～1:6；b.致孔剂体积用量与交联剂摩尔比为5～10:1（mL/mmol）；c.引发剂的用量是黄芩素、功能单体和交联剂总质量的3%～5%；2）将步骤1）中所得的混合溶液通入氮气10min，密封；3）在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，其中转速为100～200r/min，聚合温度为50～70℃，聚合反应时间为20～36小时；4）聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用有机溶剂进行洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中检测不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后将分子印迹聚合物45℃真空干燥24h。
所述的功能单体为：丙烯酸类：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或三氟甲基丙烯酸；酰胺类：丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；吡啶类：2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶。
所述的引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈。
所述的致孔剂为四氢呋喃、乙腈、氯仿或二氯甲烷。
所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N'-亚甲基二丙烯酰胺。
所述步骤4）中的有机溶剂为甲醇和醋酸的混合溶液，甲醇和醋酸的体积比为4:1～9:1。
黄芩素分子印迹聚合物在分离纯化黄芩素中的应用，将该分子聚合物作为固相萃取柱的固定相，先用体积比5:1的甲苯-甲醇淋洗分子印迹聚合物柱上的非选择性组分，然后用酸性溶剂将黄芩素洗脱下来。
有益效果：
1.黄芩药材中存在的化合物结构非常相似，且含量低、干扰大，非选择性的分析材料很难对其进行分离纯化。本发明合成的黄芩素分子印记聚合物为生物样品中活性成分的高亲和力、高选择性分离提供了可能。
2.本发明所制备的沉淀分子印迹聚合物微球，与传统的本体分子印记聚合物相比较，具有单分散性好、粒径均一、大小可控，制备简单、无复杂的后处理过程和周期较短等优点。
附图说明
图1是本发明中黄芩素单分散均一沉淀分子印迹聚合物的合成示意图；
图2是本发明合成的黄芩素沉淀分子印迹聚合物的扫描电镜图；
图3是本发明合成的黄芩素分子印记聚合物的静态吸附等温线图；
图4是分子印迹聚合物定向分离、富集黄芩药材中的黄芩素的色谱图。A为药材提取液，B为淋洗液，C为洗脱液，I为黄芩素。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明。
甲基丙烯酸(MAA)；
丙烯酰胺（AM）
三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）
N，N'-亚甲基二丙烯酰胺（MBA）
乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）
偶氮二异丁腈(AIBN)
实施例1：
称取0.5mmol黄芩素，溶于60mL乙腈中，加入4.0mmol MAA，超声10min，室温放置2h。再加入TRIM12mmol，AIBN0.066g，超声10min，通氮气10min，密封，50℃，150r/min震荡培养箱上反应25h。反应结束时，将黄芩素分子印迹聚合物先以甲醇－冰醋酸（5:1，V/V）洗脱10次，甲醇洗5次，然后45℃真空干燥24h，得到黄芩素分子印迹聚合物（MIP-1）。
除合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤均与黄芩素分子印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-1）。
实施例2：
称取0.5mmol黄芩素，溶于70mL四氢呋喃中，加入2.5mmol AM，超声10min，室温放置2h。再加入MBA10mmol，AIBN0.056g，超声10min，通氮气10min，密封，60℃，200r/min震荡培养箱上反应25h。反应结束时，将黄芩素分子印迹聚合物先以甲醇－冰醋酸（4:1，V/V）洗脱10次，甲醇洗5次，然后45℃真空干燥24h，得到黄芩素分子印迹聚合物（MIP-2）。
除合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤均与黄芩素分子印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-2）。
实施例3：
称取0.5mmol黄芩素，溶于50mL四氢呋喃中，加入2.5mmol AM，超声10min，室温放置2h。再加入EGDMA10mmol，AIBN0.066g，超声10min，通氮气10min，密封，60℃，200r/min震荡培养箱上反应25h。反应结束时，将黄芩素分子印迹聚合物先以甲醇－冰醋酸（4:1，V/V）洗脱10次，甲醇洗5次，然后45℃真空干燥24h，得到黄芩素分子印迹聚合物（MIP-3）。
除合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤均与黄芩素分子印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-3）。
实施例4：
称取0.5mmol黄芩素，溶于90mL氯仿中，加入3.0mmol甲基丙烯酰胺，超声10min，室温放置2h。再加入MBA9mmol，AIBN0.056g，超声10min，通氮气10min，密封，70℃，150r/min震荡培养箱上反应25h。反应结束时，将黄芩素分子印迹聚合物先以甲醇－冰醋酸（6:1，V/V）洗脱10次，甲醇洗5次，然后45℃真空干燥36h，得到黄芩素分子印迹聚合物（MIP-4）。
除合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤均与黄芩素分子印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-4）。
实施例5：
称取0.5mmol黄芩素，溶于100mL氯仿中，加入3.5mmol AM，超声10min，室温放置2h。再加入EGDMA14mmol，AIBN0.066g，超声5min，通氮气10min，密封，50℃，100r/min震荡培养箱上反应25h。反应结束时，将黄芩素分子印迹聚合物先以甲醇－冰醋酸（8:1，V/V）洗脱10次，甲醇洗5次，然后45℃真空干燥30h，得到黄芩素分子印迹聚合物（MIP-5）。
除合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤均与黄芩素分子印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-5）。
实施例6：
称取0.5mmol黄芩素，溶于200mL乙腈中，加入4.0mmol4-乙烯基吡啶，超声10min，室温放置2h。再加入TRIM20mmol，AIBN0.066g，超声5min，通氮气10min，密封，70℃，100r/min震荡培养箱上反应25h。反应结束时，将黄芩素分子印迹聚合物先以甲醇－冰醋酸（9:1，V/V）洗脱10次，甲醇洗5次，然后45℃真空干燥36h，得到黄芩素分子印迹聚合物（MIP-6）。
除合成过程中不添加模板分子以外，其余步骤均与黄芩素分子印迹聚合物制备步骤相同，得到非印迹聚合物（NIP-6）。
测试实施例
取上述实施例3中合成的分子印迹聚合物MIP-3进行如下测试实验。
测试实施例1.透射电镜表征
图2是本发明合成的黄芩素沉淀分子印迹聚合物的透射电镜图。可见，制备的印记聚合物微球大约900nm左右，且粒径均一、单分散性好，作为固相萃取的固定相将会得到理想的柱压和较高的分离效率。
测试实施例2.静态吸附试验
精密称取14份20mg印迹聚合物及非印迹聚合物，分别超声分散于5mL系列浓度为0.25～2.5mmol/L的黄芩素四氢呋喃溶液中，密闭，室温振摇4h，吸附平衡后用0.22μm的尼龙膜过滤，定量稀释，紫外-可见分光光度仪于280nm处测定吸附前后黄芩素溶液浓度，根据式（1）计算出平衡吸附量Qe，平行操作三次。
式中，Qe（μmol/g）是平衡吸附量；V（L）是溶液的体积；C0（mmol/L）是溶液的初始浓度；Ce（mmol/L）是溶液的平衡浓度；m（g）是聚合物的质量。
结果表明MIP对黄芩素的吸附不同于物理吸附，而是一种有特异性识别位点的选择性吸附，其最大吸附量达到60.34μmol/g，重复利用10次后仍能保持其较稳定的吸附量。
测试实施例3.应用例固相萃取定向分离富集黄芩药材中的黄芩素
将制备的黄芩素分子印迹聚合物作为固相萃取固定相，定向分离富集黄芩药材中的黄芩素，整个的分离过程依靠两步洗脱完成，首先用甲苯-甲醇（5:1，V/V）作为淋洗液，其次用甲醇-冰醋酸（9:1）作为解吸附溶液。各个淋洗液和解吸附溶液的液相色谱图如图4所示。从图4中可以看出，萃取前黄芩提取物中存在着多种组成成分；在通过填充MIP颗粒作为吸附相的固相萃取柱后，一次性处理黄芩素的回收率达到95%，纯度可达到97%，说明合成的分子印记聚合物对黄芩素分子具有高度的亲和力，是一种高效分离富集黄芩素的新吸附材料。
以上实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.黄芩素分子印迹聚合物，其特征在于由黄芩素、功能单体混合溶解在致孔剂中，静置2 h，形成黄芩素－功能单体复合物，再加入有效剂量的引发剂、交联剂，超声5~10 min，混合均匀，其中： 黄芩素、功能单体的摩尔比为1:4~1:8，功能单体与交联剂的摩尔比为1:3~1:6； 致孔剂体积用量与交联剂摩尔比为5~10:1（mL/mmol）；引发剂的用量是黄芩素、功能单体和交联剂总质量的3%~5%；将上步所得的混合溶液通入氮气10 min，密封；在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，其中转速为100~200 r/min，聚合温度为50~70 ℃，聚合反应时间为20~36 小时；聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用有机溶剂进行洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中检测不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后将分子印迹聚合物45 ℃真空干燥24 h而得。
2.一种黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于制备步骤为：
1)将黄芩素、功能单体混合溶解在致孔剂中，静置2 h，形成黄芩素－功能单体复合物，再加入有效剂量的引发剂、交联剂，超声5~10 min，混合均匀，其中：
a. 黄芩素、功能单体的摩尔比为1:4~1:8，功能单体与交联剂的摩尔比为1:3~1:6；
b. 致孔剂体积用量与交联剂摩尔比为5~10:1（mL/mmol）；
c. 引发剂的用量是黄芩素、功能单体和交联剂总质量的3%~5%；
2) 将步骤1）中所得的混合溶液通入氮气10 min，密封；
3)在氮气保护下，分子印迹聚合物采用热引发，置于振荡培养箱中进行聚合反应，其中转速为100~200 r/min，聚合温度为50~70 ℃，聚合反应时间为20~36 小时；
4)聚合反应结束后，所得到的分子印迹聚合物用有机溶剂进行洗脱，除去模板分子，直至洗脱液中检测不出模板分子后，再用甲醇洗至中性，最后将分子印迹聚合物45 ℃真空干燥24 h。
3.根据权利要求2所述的黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述的功能单体为：丙烯酸类：丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或三氟甲基丙烯酸；酰胺类：丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺；吡啶类：2-乙烯基吡啶或4-乙烯基吡啶。
4.根据权利要求2所述的黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述的引发剂为过氧化苯甲酰或偶氮二异丁腈。
5.根据权利要求2所述的黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述的致孔剂为四氢呋喃、乙腈、氯仿或二氯甲烷。
6.根据权利要求2所述的黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于所述的交联剂为乙二醇二甲基丙烯酸酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯或N,N'-亚甲基二丙烯酰胺。
7.根据权利要求2所述的黄芩素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中的有机溶剂为甲醇和醋酸的混合溶液，甲醇和醋酸的体积比为4:1~9:1。
8.权利要求1所述黄芩素分子印迹聚合物在分离纯化黄芩素中的应用。
9.根据权利要求8所述黄芩素分子印迹聚合物在分离纯化黄芩素中的应用，其特征在于：将该分子聚合物作为固相萃取柱的固定相，先用体积比5:1的甲苯-甲醇溶液淋洗分子印迹聚合物柱上的非选择性组分，然后用酸性溶剂将黄芩素洗脱下来。
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