CN103224589A - 一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法及其应用。以链霉素作为模板分子、甲基丙烯酸为功能单体、乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用热引发聚合方式得到有固定孔穴大小和形状目标分子印迹聚合物，将其作为固相萃取柱填料，所制成固相萃取柱对链霉素类抗生素具有高选择性富集，提取回收率高，可用于动物源性食品中链霉素类抗生素残留检测的样品前处理。

Description

一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法及应用

技术领域

本发明涉及分析化学领域，尤其涉及一种应用于测定动物源食品中氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法及应用。

背景技术

分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymers,MIP）是近年来出现的一种可获得在空间结构和结合位点上与特定分子完全匹配的、具有高选择性识别功能的新型聚合物材料。MIP的高选择性可用作固相萃取能够从复杂样品基质中选择性吸附目标样品分子，非常适用于复杂样品预处理与富集。

作为一种广谱型抗生素，氨基糖苷类抗生素在以肉制品为代表的食品中残留问题非常普遍。由于氨基糖苷类抗生素本身结构复杂且食品基质本身也极其复杂，传统的固相萃取吸附剂如C18、聚合物无法有效的萃取出氨基糖苷类抗生素，如何有效的从复杂的食品基体中将痕量氨基糖苷类抗生素萃取出目前仍然是个挑战。鉴于MIP的高选择性的识别能力，发展出氨基糖苷类抗生素类MIP将有利于对其进行选择性富集，从而有利于后续的分离分析。迄今为止，尚未见有关氨基糖苷类抗生素的分子印迹聚合物的制备方法以及将其用作为固相萃取材料的报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是，提供一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法。

本发明所要解决的第二个技术问题是，提供氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物在萃取氨基糖苷类抗生素中的应用。

为了解决上述第一个技术问题，本发明提供了一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）称取1-5mmol的模板分子溶于10mL纯水中，所述模板分子为链霉素，加入功能单体4-20mmol，所述功能单体为羧酸类非共价化合物，将此混合溶液于室温下搅拌，使模板分子与功能单体充分混合；然后加入交联剂15-90mL和甲醇溶剂20-100mL，所述交联剂为多烯或烯酸酯类结构的化合物；再加入偶氮二异腈，所得溶液超声振荡使之混合均匀，用氮气吹；将反应液置于60℃水浴中并在1000rpm转速下搅拌加热，得到白色固体聚合物；

（2）将步骤（1）所得的白色固体聚合物粉碎、研磨过75目筛后，加入到装有体积比为1:1的4M盐酸-甲醇的圆底烧瓶中加热回流72h，减压抽滤，用水和甲醇洗涤，红外干燥箱中干燥，再将聚合物溶于装有体积比为7:3的浓盐酸-水的反应釜中加热回流30-80min以洗脱聚合物中的模板分子，减压抽滤，洗涤干燥后用丙酮沉降三次以除去粒径太小的颗粒，再洗涤干燥，得到氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物。

作为一个优选方案，所述功能单体是甲基丙烯酸。

作为一个优选方案，所述交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯。

作为又一个优选方案，所述模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1:14:60。

作为又一个优选方案，步骤（2）中聚合物溶于装有体积比为7:3的浓盐酸-水的反应釜中加热回流洗脱模板分子的升温程序为：0-5min，0-155℃；5-10min，155℃；10-15min，155-185℃；15-50min，185℃。

为了解决本发明第二个技术问题，本发明提供了按照上述制备方法获得的氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物在萃取氨基糖苷类抗生素中的应用。

本发明的优点在于，本发明采用热引发聚合方式得到有固定孔穴大小和形状目标分子印迹聚合物，将其作为固相萃取柱填料，所制成固相萃取柱对链霉素类抗生素具有高选择性富集，提取回收率高，可用于动物源性食品中链霉素类抗生素残留检测的样品前处理。

附图说明

图1为去除模板前后MIP的红外光谱图。

图2为MIPs的扫描电镜图。

图3为MIPs对四种氨基糖苷类抗生素提取回收率。

图4为空白蜂蜜中氨基糖苷类物质的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1.氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法

（1）称取1-5mmol的链霉素模板分子溶于10mL纯水中，加入功能单体甲基丙烯酸4-20mmol，将此混合溶液于室温下搅拌30min，使模板分子与功能单体充分混合；然后加入交联剂乙二醇二甲基丙烯酸酯15-90ml和甲醇溶剂20-100mL；再加入偶氮二异腈5mmol，所得溶液超声振荡10min使之混合均匀，用氮气吹15min；将反应液置于60℃水浴中并在1000rpm转速下搅拌加热24h，得到白色固体聚合物；

（2）将步骤（1）所得的白色固体聚合物粉碎、研磨过75目筛后，加入到装有体积比为1:1的4M盐酸-甲醇的圆底烧瓶中加热回流72h，减压抽滤，用水和甲醇洗涤，红外干燥箱中干燥，再将聚合物溶于装有体积比为7:3的浓盐酸-水的反应釜中加热回流50min以洗脱聚合物中的模板分子，减压抽滤，洗涤干燥后用丙酮沉降三次以除去粒径太小的颗粒，再洗涤干燥，得到氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物。

步骤（2）中聚合物溶于装有体积比为7:3的浓盐酸-水的反应釜中加热回流洗脱模板分子的升温程序为：0-5min，0-155℃；5-10min，155℃；10-15min，155-185℃；15-50min，185℃。

实施例2.MIP对氨基糖苷类抗生素萃取效果验证

（1）经在不同配比下测定分子印迹聚合物对模板分子的吸附性能，最终确立了以模板分子：功能单体：交联剂=1:14:60为最佳配比。所得到的分子印迹聚合物（MIP）用红外光谱进行表征，见图1。由红外谱图可知经洗脱模板分子前后的材料中都含有波数为1638.63cm^-1为碳碳双键峰，经去除模板后的MIP的红外光谱图中增加了一个波数为3441.76cm^-1的峰，由3441.76cm^-1、1732.5cm^-1、1259.65cm^-1这三个峰可以确定洗脱后的材料结构中增加了羧基，说明所得到的MIP材料中模板分子已经去除完全。

（2）分子印迹聚合物MIP电镜照片

MIP材料扫描电镜图片见图2所示。可以看出MIP颗粒表面粗糙，平均粒径在20-50μm，粗糙的颗粒表面具有大量的孔穴，因此具有较大的比表面积和孔径体积，从而有较高吸附容量。

为了说明合成的MIP上存在印迹位点，分别以200mg的MIP和NIP作为SPE填料，以分别溶有4μg/mL链霉素、二氢链霉素、庆大霉素、大观霉素的2g蜂蜜样品为上样液进行萃取回收率的平行对比实验，洗脱液用LC-MS/MS的方法进行分析检测。结果如图3所示。MIP对链霉素、二氢链霉素、庆大霉素、大观霉素四种氨基糖苷类抗生素的回收率分别是98.7,94.7,100.8,93.7%，NIP对链霉素、二氢链霉素、庆大霉素、大观霉素四种氨基糖苷类抗生素的回收率分别是70.8,64,29.3,55.6%。可见MIPs对氨基糖苷类抗生素具有更好的萃取效果。

实施例3.MIP柱检测市售蜂蜜

（1）将上述得到的分子印迹聚合物(MIP)200mg填充至3mL小柱空管作为固相萃取（SPE）柱填料制成SPE小柱。先用3mL甲醇和3mL水活化；然后用浓度为20mmol/L K₂HPO₄缓冲溶液（pH=7.4）上样，3mL水淋洗，最后用FA/ACN=20/80(v/v)的混合液洗脱。洗脱物通过LC-MS/MS进行分析检测。

（2）配置标准溶液：用0.1mg/mL的四种氨基糖苷类霉素储备液配置4μg/mL的混标溶液，然后逐级配置成一系列标准浓度溶液。

（3）准确称取空白蜂蜜样品2g,置于15mL聚丙烯塑料管中，再加入5mL浓度为20mmol K₂HPO₄缓冲溶液，涡旋30s后，4500rpm下离心10min，将离心后的溶液作为SPE的上样液。

(4)在(3)的条件下的蜂蜜样品经MIP柱处理后进行LC-MS/MS分析检测。结果如图4所示。可知所选市售蜂蜜未经检出链霉素、二氢链霉素、大观霉素，但是含有庆大霉素。

为了上述处理方法的可靠性进行了加标实验：分别向空白蜂蜜中添加1mL浓度为100、400、4000ng/mL3个浓度水平的氨基糖苷类抗生素的混合标准液，按上述的方法提取、净化后用LC-MS/MS进行分析检测，每个添加水平重复测定6次。结果见表1。

表1不同添加水平下各目标物的添加回收率和相对标准偏差(n=6)

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）称取1-5mmol的模板分子溶于10mL纯水中，所述模板分子为链霉素，加入功能单体4-20mmol，所述功能单体为羧酸类非共价化合物，将此混合溶液于室温下搅拌，使模板分子与功能单体充分混合；然后加入交联剂15-90mL和甲醇溶剂20-100mL，所述交联剂为多烯或烯酸酯类结构的化合物；再加入偶氮二异腈，所得溶液超声振荡使之混合均匀，用氮气吹；将反应液置于60℃水浴中并在1000rpm转速下搅拌加热，得到白色固体聚合物；

（2）将步骤（1）所得的白色固体聚合物粉碎、研磨过75目筛后，加入到装有体积比为1:1的4M盐酸-甲醇的圆底烧瓶中加热回流72h，减压抽滤，用水和甲醇洗涤，红外干燥箱中干燥，再将聚合物溶于装有体积比为7:3的浓盐酸-水的反应釜中加热回流30-80min以洗脱聚合物中的模板分子，减压抽滤，洗涤干燥后用丙酮沉降三次以除去粒径太小的颗粒，再洗涤干燥，得到氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物。

2.根据权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述功能单体是甲基丙烯酸。

3.根据权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述交联剂是乙二醇二甲基丙烯酸酯。

4.根据权利要求1—3任一所述的一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述模板分子：功能单体：交联剂的摩尔比为1:14:60。

5.根据权利要求1所述的一种氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中聚合物溶于装有体积比为7:3的浓盐酸-水的反应釜中加热回流洗脱模板分子的升温程序为：0-5min，0-155℃；5-10min，155℃；10-15min，155-185℃；15-50min，185℃。

6.利用权利要求1所述制备方法获得的氨基糖苷类抗生素分子印迹聚合物在萃取氨基糖苷类抗生素中的应用。

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