CN103554363A - 纳米二氧化硅基强力霉素分子印迹聚合物的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及纳米SiO₂基强力霉素分子印迹聚合物的制备方法，该方法以纳米二氧化硅（Nano-SiO₂)为载体，强力霉素（DOC）为模板分子，α-甲基丙烯酸（MAA）、乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）及2,2'-偶氮二异丁腈（AIBN）分别为功能单体、交联剂及引发剂，N,N-二甲基甲酰胺（DMF）为溶剂，通过溶解、聚合、氢氟酸（HF）除SiO₂、洗脱等步骤得到已除去纳米SiO₂的DOC分子印迹聚合物。该印迹聚合物用于固相萃取柱的填料，所制得的固相萃取柱对模板分子（DOC）及3种模板分子类似物四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）均有良好的识别性，对DOC的吸附率可以达到90.2%，对TC的吸附率可以达到85.4%，对OTC的吸附率可以达到83.7%，CTC的吸附率可以达到86.1%。因此，此印迹聚合物可用于动物源性食品中四环素类抗生素残留检测的样品前处理。

Description

纳米二氧化硅基强力霉素分子印迹聚合物的制备及应用

技术领域

本发明涉及分子印迹聚合物的制备方法；具体说是动物源性食品中四环素类抗生素的分子印迹聚合物的制备方法。 

背景技术

分子印迹技术(Molecular Imprinting Techniqe，MIT)是近年来出现的制备具有识别功能的聚合物材料的新技术，可获得在空间结构和结合位点上与某一分子完全匹配的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers，MIPs)。分子印迹识别的高选择性来源于印迹聚合物基体中大量在大小、形状及功能基等方面与目标分子相匹配的结合位点。这一技术已经应用于单一目标化合物的固相萃取柱制备，但是同时高效应用于同类多种化合物的分离的分子印迹型固相萃取柱制备方法未见报道。 

纳米SiO₂是一种极其重要的无机新材料，其粒径小，比表面积大，使其有很强的表面吸附能力和分散性能好的特点，以其优越的稳定性、补强性、增稠性和触变性，在众多学科及领域内独具特性，有着不可取代的作用。以纳米SiO₂为载体的表面印迹技术近年来受到了研究者们的关注和重视。 

四环素类抗生素是一类广泛应用的广谱抗生素，有良好的抗生和抗炎作用，经常作为饲料添加剂用于畜牧及水产养殖中，临床上用四环素治疗不少非感染性疾病,取得了很好的疗效。常见的四环素类药物包括土霉素、金霉素、四环素和强力霉素。近年来，一些不法分子为了经济效益，常滥用这类药物，导致动物性食品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素大量残留，严重影响公众健康。 

发明内容

本发明的目的在于提供纳米SiO₂基强力霉素分子印迹聚合物的制备方法，通过该分子印迹聚合物制得固相萃取柱用于检测动物性食品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素残留。 

本发明解决技术问题采用如下技术方案： 

纳米SiO₂基强力霉素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述分子印迹聚合物以强力霉素(DOC)为模板分子、以甲基丙烯酸（MAA）为功能单体、以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂，以纳米SiO₂为载体，按如下方法制备， 

将1.0mmol强力霉素(DOC)溶解于20mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，加入4.0mmol甲基丙烯酸（MAA），于室温下在超声振荡30min，使DOC与MAA充分结合,然后加1.0mmol 纳米SiO₂，超声处理30min使纳米SiO₂充分混合均匀；然后再加入20.0mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）；再加入0.3mmol偶氮二异丁腈（AIBN），混合均匀，于室温下超声振荡15min，充氮除氧10min后，密封，于60℃水浴中反应16h，得到黄色固体聚合物； 

将步骤（1）将所得的黄色固体聚合物粉碎，研磨过200目筛，再过250目筛，得到200-250之间目数的粉末；将所得粉末加入20ml4%的HF中，加入3ml丙酮和3ml乙醇，充分搅拌，反应3h，以除去Nano-SiO₂，再用超纯水洗涤聚合物至洗脱液呈中性，滤渣于烘箱60℃干燥，得除去纳米SiO₂的DOC分子印迹聚合物；用体积比7:1.5:1.5的甲醇-水-乙酸溶液洗脱聚合物中的模板分子（DOC），再依次用甲醇、去离子水洗脱至紫外分光光度计检测不出DOC为止，且洗脱液为中性；收集产物于烘箱60℃干燥，得到已除去纳米SiO₂的DOC分子印迹聚合物。 

一种检测动物性食品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素残留的样品前处理方法，包括待测样品提取液的制备（现有技术），其特点在于，将如上制备的分子分子印迹聚合物经粉碎后与膨松剂或硅藻土混合装柱，制得固相萃取柱，将待测样品提取液以1mL/min的流速过柱；分别用5ml的体积分数50%甲醇-水溶液、正己烷、二氯甲烷淋洗，弃淋洗液；再用5mL甲醇/乙酸/水（体积比为7:1.5:1.5）溶液进行洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发干，用体积分数50%甲醇-水溶液溶解并定容到10ml，通过紫外分光光度计分析样品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素残留。 

与已有技术相比，本发明有益效果体现在： 

本发明以强力霉素（DOC）为分子印迹聚合物的模板，纳米SiO₂为牺牲载体，制得分子印迹聚合物，经粉碎后与不同比例膨松剂（硅藻土）混合装柱，所制得的固相萃取柱对模板分子（DOC）及3种模板分子类似物四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）均有良好的识别性，对DOC的吸附率可以达到90.2%，对TC的吸附率可以达到85.4%，对OTC的吸附率可以达到83.7%，CTC的吸附率可以达到86.1%。 

附图说明

图1为分子印迹聚合物（MIP）的傅里叶红外光谱（FTIR）图 

图2为非分子印迹聚合物（NIP）的傅里叶红外光谱（FTIR）图 

图3为原聚合物（含Nano-SiO₂）的傅里叶红外光谱（FTIR）图 

图4为纳米二氧化硅（Nano-SiO₂）的傅里叶红外光谱（FTIR）图 

图5为分子印迹聚合物（MIP）的扫描电镜(SEM）图。 

图6为非分子印迹聚合物（NIP）的扫描电镜（SEM）图。 

图7为原聚合物（含Nano-SiO₂）的扫描电镜（SEM）图。 

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明技术方案做进一步说明。实施例中的试验步骤和试验所用产品，若未特别说明均为本领域常规技术手段和常规产品。 

实施例1 

（1）通过分别加入5mL的水、甲醇、N,N-二甲基酰胺、乙腈、乙酸、乙醇、丙酮、氯仿、四氢呋喃做为溶剂，考察不同溶剂的对DOC和MAA的溶解效果，见表1。综合考虑选择N,N-二甲基甲酰胺作为致孔剂。 

表1不同溶剂的对DOC和MAA的溶解效果 

（2）功能单体MAA、交联剂EDMA、纳米二氧化硅与模板分子DOC用量之比的影响 

功能单体MAA与模板分子DOC用量之比的影响： 

实验固定模板分子用量，改变功能单体的量，考察功能单体与模板分子的摩尔比为2:1、4:1、6:1、8:1、10:1时功能单体和模板分子间的相互作用情况，在N,N-二甲基甲酰胺溶液中使模板分子与功能单体充分结合后，用日立U-5100型紫外可见分光光度计于350nm处测定N,N-二甲基甲酰溶液中剩余模板分子DOC的吸光度值分别为0.717，0.439，0.433，0.430，0.428。当随着功能单体量的增多，吸光度不断下降，说明模板分子与功能单体相互作用形成主客体复合物。当功能单体与模板分子的摩尔比由4:1再增多时，吸光度变化不再明显，说明此时模板分子与功能单体已经作用充分，多余的功能单体会发生自身缔合，形成非特异性的结合位点，使得吸附传质阻力增加，不利于制备印迹聚合物，所以功能单体与模板分子的摩尔比4：1为最佳选择。 

交联剂EDMA与模板分子DOC用量之比的影响： 

实验合成乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）与DOC摩尔比为10:1、20:1、30:1、40:1、50：1的聚合物，分别称取上述5个不同比例的分子印迹聚合物粉末各20mg,加入0.4mmol/L的DOC标准溶液2mL，振荡吸附4h后，测溶液中剩余DOC的含量，然后计算分子印迹聚合物粉末的吸附量，结果如表2所示。 

表2不同比例的分子印迹聚合物粉末与强力霉素（DOC）的结合量 

n（EDMA）：n（DOC）	10：1	20：1	30：1	40：1	50：1
						结合量Q（μmol/g）	7.4	25.9	21.1	16.9	14.4

由上表可见，随着交联剂用量的增加，分子印迹聚合物MIP的平衡吸附量呈现先上升再下降的趋势。如果交联剂量少，则聚合物刚性过小，聚合效果不好，进而吸附量太少；如果交联剂量过多，则聚合物刚性过大，不易研磨，且可能导致模板不容易洗脱下来，进而吸附量太少。如表2，当n(EDMA):n(DOC)=20:1时，结合量Q达到最大值。因此，本实验选择n(EDMA):n(DOC)=20:1为最佳比例。 

纳米二氧化硅与模板分子DOC用量之比的影响： 

实验合成模板分子、功能单体、交联剂及纳米二氧化硅摩尔比分别为1:4:20:0.5、1:4:20:1、1:4:20:2、1:4:20:3、1:4:20:4、1:4:20:5的聚合物。分别称取上述6个不同比例的分子印迹聚合物粉末各20mg,加入0.4mmol/L的DOC标准溶液2mL，振荡吸附4h后，测溶液中剩余DOC的含量，然后计算分子印迹聚合物粉末的吸附量，结果如表3所示。表3不同量的纳米二氧化硅载体的DOC分子印迹聚合物粉末与强力霉素（DOC）的结合量 

n(DOC):n(Nano-SiO2)	1:0.5	1:1	1:2	1:3	1:4	1:5
							结合量Q（μmol/g）	26.9	35.7	30.1	27.7	22.4	18.1

由上表可见，随着纳米二氧化硅用量的增加，分子印迹聚合物MIP的平衡吸附量呈现先上升再下降的趋势。如果纳米二氧化硅量太少，载体数量少，能在载体表面聚合的聚合物的数量也少，不能起到提高吸附的效果；如果纳米二氧化硅量太多，虽然载体数量多了，但是反应过程中会阻碍模板分子、功能单体及交联剂三者之间的作用，进而导致聚合效果不好，最终吸附效果差。如表3，当n(DOC):n(Nano-SiO₂)=1:1时，结合量Q达到最大值。因此，实验选择n(DOC):n(Nano-SiO₂)=1:1为最佳比例。 

经在不同配比下测定分子印迹聚合物对模板分子的吸附性能，最终确立了以模板分子：功能单体：交联剂：载体=1:4:20:1为最佳配比。 

（3）对比甲醇/乙酸（9/1，指体积比，下同）、甲醇/乙酸（8/2）、甲醇/乙酸（7/3）、甲醇/乙酸/水（7/1.5/1.5)、甲醇/乙酸/水（7/2/1)、甲醇/乙酸/水（8/1/1)六种溶液对模板的去除效果。结果表明，六种溶液均可以洗脱掉模板分子，甲醇/乙酸/水（7/1.5/1.5)溶液较其他溶液洗脱时间更短，效率更高，所以实验选择甲醇/乙酸/水（7/1.5/1.5)作为除去模板的溶液。 

（4）称取3.000g印迹聚合物放入索氏提取器中，于磨口锥形瓶中加入150mL的甲醇 /乙酸/水（V:V:V=7:1.5:1.5）溶液，90℃水浴使之回流洗脱，每隔4小时取索氏提取器中液体，用紫外分光光度计检测，直至索氏提取器中溶液检测不出DOC分子为止，结果表明24h后索氏提取器中溶液几乎不含DOC,证明洗脱完全。 

（5）分子印迹聚合物MIP、非分子印迹聚合物NIP及原聚合物三者之间的结果比较 

用傅里叶红外光谱测Nano-SiO₂、原聚合物、MIP及NIP的红外光谱，以纯的KBr为底样测试，在波数范围4000～400cm^-1测定。如图1所示，波数1093cm^-1处是Nano-SiO₂分子中的Si-O伸缩振动峰。如图2所示，当分子印迹聚合物在Nano-SiO₂表面制备后，该吸收峰移到1047cm^-1处，而除去Nano-SiO₂后的聚合物（MIP）中，该吸收峰消失；波数3434cm^-1和2961cm^-1分别为羟基－OH的O－H伸缩振动和甲基－CH₃的C－H伸缩振动，波数1725cm^-1、1643cm^-1、1456cm^-1、1261cm^-1、1161cm^-1分别为C＝O、烯烃中C＝C、芳香环中C＝C、C－C及C－O键伸缩振动吸收峰。如图3所示，经过氢氟酸除二氧化硅和洗脱后，羟基O－H伸缩振动峰移动到3375cm^-1，甲基的C－H伸缩振动峰移动到2884cm^-1,C＝O、烯烃中C＝C、芳香环中C＝C、C－C及C－O键伸缩振动峰分别移动到1652cm^-1、1556cm^-1、1383cm^-1、1188cm^-1和1084cm^-1处。对比图3和图4，发现只是伸缩振动峰值的整体迁移，图形大体走向一致，证明MIP达到了模板的全部去除。该光谱显示了在Nano-SiO₂表面的成功印迹及Nano-SiO₂作为牺牲载体的有效去除。同时，这几个峰的出现说明MIP具有形成氢键的作用点。 

采用S-4800扫描电子显微镜观察MIP、NIP及原聚合物的形貌粒径，见图5、6、7。结果表明，NIP及原聚合物微球表面相对光滑，平均粒径约为0.5～1μm，分布较为均匀；而MIP微球表面粗糙，粒径分布较宽，粗糙的微球表面具有大量的孔穴，因此具有较大的比表面积和孔体积，有利于结合位点和底物的接触，从而有较高的负载量和对底物的较高识别性。 

采用Scatchard分析法测定了MIP和NIP对底物分子的结合量，结果表明，MIP对底物分子的结合量明显地大于NIP对底物分子的结合量。说明印迹过程中模板分子在MIP中留下的结合位点决定了MIP对模板分子高的亲和性和特异识别性。 

实施例2 

比较质量比1：0、1：1、3：2、2：1、3：1的MIP和硅藻土的装填效果。比较样品溶液通过分子印迹固相萃取柱（MISPE）的速率以及对模板分子的吸附效果，结果见表3， 

表3分子印迹聚合物固相萃取柱制备条件的选择 

聚合物：硅藻土

1:0

1：1

3：2

2：1

3：1

[0048] 

滤过速度（mL/min）	0	2.5	1.8	1.2	0.4
						吸附量（μmol/g）	0	19.8	23.3	30.1	35.8

由表3可以看出：当MIP与硅藻土比例为3:1时，MISPE的吸附效果较佳，但是上样速率过慢，当配比为1:1和3:2时虽然样品通过速率较快但是吸附效果较差。因此选择最佳配比为2:1。 

DOC分子印迹固相萃取柱的制备称取150mg MIP及75mg硅藻土（MIP：硅藻土=2:1）装入3mL空的固相萃取（SPE）柱中，用筛板压紧，继续轻敲小柱，直至筛板与聚合物结合紧密为止。 

经检测本实施例制得的固相萃取柱对模板分子（DOC）及3种模板分子类似物四环素（TC）、土霉素（OTC）、金霉素（CTC）均有良好的识别性，对DOC的吸附率可以达到90.2%，对TC的吸附率可以达到85.4%，对OTC的吸附率可以达到83.7%，CTC的吸附率可以达到86.1%。 

实施例3 

（1）将1.0mmol DOC加入到20ml DMF中，超声至其完全溶解，加入4mmol MAA，超声处理30min使DOC与MAA充分作用，加入1.0mmol纳米SiO₂，超声处理30min使纳米SiO₂充分溶解，加入20mmol EDMA和0.3mmol AIBN，超声15min，混合均匀，充氮除氧10min后，密封，于60℃水浴中反应16h，得棒状聚合物,研磨过200目筛，再过250目筛，得到200-250之间目数的粉末，备用。 

（2）将（1）所得聚合物粉末置于20ml4%的HF中，加入3ml丙酮和3ml乙醇，充分搅拌，反应3h，用超纯水洗涤聚合物至洗脱液呈中性。滤渣于60℃烘箱干燥，得到除去纳米SiO₂的聚合物。 

（3）将（2）所得聚合物依次用（甲醇：水：乙酸=7：1.5：1.5）混合溶液、甲醇、超纯水洗至紫外分光光度计检测不出DOC为止，且洗脱液为中性。得到的聚合物于60℃烘箱干燥6h，即得到除去纳米SiO₂的DOC分子印迹聚合物MIP。不加模板，按照同样的步骤制得非印迹聚合物NIP。 

在3mL固相萃取小柱空管中自下而上依次装入筛板和以DOC为模板制备的分子印迹聚合物，敲实并使表面平齐，上面再加入一层筛板，装填高度约为0.5cm，制成DOC MISPE柱。DOC MISPE柱先用3mL甲醇活化，以3mL/min的流速过柱；再加入3mL水平衡，以3mL/min的流速过柱；再用3ml50%甲醇-水混合溶液冲洗，以1ml/min的流速过柱。取 1mL一定浓度的强力霉素标准溶液以1mL/min的流速过柱；分别用5ml的50%甲醇-水溶液、正己烷、二氯甲烷淋洗，弃淋洗液；再用5mL甲醇/乙酸/水（体积比为7:1.5:1.5）溶液进行洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发干，用50%甲醇-水溶液溶解并定容到10ml，用紫外分光光度计对其测量。 

Claims (2)

1.纳米SiO₂基强力霉素分子印迹聚合物的制备方法，其特征在于，所述分子印迹聚合物以强力霉素(DOC)为模板分子、以甲基丙烯酸（MAA）为功能单体、以乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）为交联剂，以偶氮二异丁腈为引发剂，以纳米SiO₂为载体，按如下方法制备，

（1）将1.0mmol强力霉素(DOC)溶解于20mL N,N-二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，加入4.0mmol甲基丙烯酸（MAA），于室温下在超声振荡30min，使DOC与MAA充分结合,然后加1.0mmol纳米SiO₂，超声处理30min使纳米SiO₂充分混合均匀；然后再加入20.0mmol乙二醇二甲基丙烯酸酯（EDMA）；再加入0.3mmol偶氮二异丁腈（AIBN），混合均匀，于室温下超声振荡15min，充氮除氧10min后，密封，于60℃水浴中反应16h，得到黄色固体聚合物；

（2）将步骤（1）将所得的黄色固体聚合物粉碎，研磨过200目筛，再过250目筛，得到200-250之间目数的粉末；将所得粉末加入20ml4%的HF中，加入3ml丙酮和3ml乙醇，充分搅拌，反应3h，以除去Nano-SiO₂，再用超纯水洗涤聚合物至洗脱液呈中性，滤渣于烘箱60℃干燥，得除去纳米SiO₂的DOC分子印迹聚合物；用体积比7:1.5:1.5的甲醇-水-乙酸溶液洗脱聚合物中的模板分子（DOC），再依次用甲醇、去离子水洗脱至紫外分光光度计检测不出DOC为止，且洗脱液为中性；收集产物于烘箱60℃干燥，得到已除去纳米SiO₂的DOC分子印迹聚合物。

2.一种检测动物性食品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素残留的样品前处理方法，包括待测样品提取液的制备，其特征在于，将权利要求1制备的分子分子印迹聚合物经粉碎后与膨松剂或硅藻土混合装柱，制得固相萃取柱，将待测样品提取液以1mL/min的流速过柱；分别用5ml的体积分数50%甲醇-水溶液、正己烷、二氯甲烷淋洗，弃淋洗液；再用5mL甲醇/乙酸/水（体积比为7:1.5:1.5）溶液进行洗脱；收集洗脱液，旋转蒸发干，用体积分数50%甲醇-水溶液溶解并定容到10ml，通过紫外分光光度计分析样品中土霉素、金霉素、四环素、强力霉素残留。

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