KR830002739B1 - 정맥주사용 감마글로블린의 제조방법 - Google Patents

Abstract

내용없음.

Description

정맥주사용 감마글로블린의 제조방법

제1도에서 제3도까지는 종래방법에 따라 제조된 감마글 로불린의 겔여과 분석을 나타낸 도표이고,

제4도는 본 발명에 따라 제조된 정맥 주사용 감마글로불린의 겔여과 분석을 나타낸 도표이다.

본 발명은 인혈장으로부터 항브체가(抗補體價)가 낮고 고유의 성질을 유지하고 있는 정맥주사용 감마글로 불린을 제조하는 방법에 관한 것이다.

감마글로불린은 여러가지 바이러스 및 세균에 대한 항체를 함유하고 있는 혈장 단백으로서 선천적인 항체 결필자 또는 바이러스성이나 세균성 질환으로 말미암아 항체의 인위적인 보충을 픽요로 하는 환자에게 투여함으로써 질환의 예방과 치료에 사용되는 약제이다.

이러한 감마글로불린을 약제로 사용하기 위해 최초로 개발된 제제는 냉에탄올분획법에 의한 근욕 주사용 감마글로불린이다.

그러나 근육주사용 감마글로불린은 다음과 같은 문제점이 있었는바,

1) 투여량이 제한되어 대량 투여가 불가능하며

2) 주사시 주사부위에 동통현상이 나타나고

3) 항체능력을 가진 고유의 면역글로분린G(Immune Globulin G ; Ig G) 함량이 적으며

4) 주사부위의 단백분해효소에 의한 클로불린의 항체가가 감소되고

5) 최대혈중농도 도달시간은 24시간 이상이 소요된다는 것이 그것이다.

이와 같은 단점을 해결하기 위해서는 감마글로볼린을 근육주사가 아닌 정맥주사로서 투여해야만 가능하다 그렇지만 이 근육주사용 감마글로불린 제제를 정맥으로 투여할 경우 항보체활성(Anticomplementary activity)이 있는 응집체(Aggregate)에 기인하는 부작용(Anaphylactic reaction)이 심각하여 정맥주사가 불가능함에 따라 정맥주사용 제제의 개발이 요구되었다.

이에 따라 그동안 많은 학자들의 연구 결과로 여러가지 형태의 정맥주사용 감마글로불린이 개발되었는데 펩신(pepsin), 파페인(papain), 플라스민(Plasmin)등 단백분해 효소나 베타프로 피오락톤(β-propiolactone)등의 화학물질로 처리하고 구조를 변화시켜 응집체의 생성을 저지하거나 파괴하여 항보체 활성을 저하시켜 줌으로써 정맥주사가 가능하게 되었다.

이러한 제제들은 정맥 주사함에 따라 근육주사용 감마글로불린의 단점이었던 투여량의 제한, 주사 부위의 동통현상, 단백분해 효소에 의한 글로불린의 항체가 감소등이 해결되었으며 최대 혈중농도 도달시간도 수시 간이 내로 단축되었다.

그러나, 상기 정액주사용 감마글로불린은 구조를 변화시켜 항체능력을 가진 고유의 IgG는 거의 없어 보체결합능력이 저하되거나 없고, 혈중농도 반감기도 4-12일 정도로 짧아 질병의 예방과 치료에 만족할 만한 효과를 거두지 못하고 있다.

이에 대하여 근래 독일특허 제 2,604,759호 미국특허 제 4.124,576호 등에 소개된 방법은 상기 정맥주 사용 감마글로불린과는 달리 폴리에틸렌글리콜등 비이온성 계면활성제를 사용하여 항체 능력을 가진 고유의 IgG를 얻는 방법이 개발됨으로써 보체결합 능력이 있고 혈중농도 반감기가 일정도로 길어져서 질병의 예방과 치료에 좋은 효과를 거둘 수가 있게 되었다.

그러나, 폴리에틸렌 글리콜처리로 제조된 이들 제제도 항보체 활성이 있는 응집체를 완전히 제거하기가 어려워(항보체가가 0.02단위/mg 정도를 나탄냄) 부작용의 발생소지가 있으므로 항보체가의 증가를 방지하고 불안정한 제품을 안정화시키기 위하여 안정제로서 만니톨(Mannitol) 및 알부민(Albumin)등을 첨가해야 하는등 공정이 번잡하였다.

본 발명은 이와같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 항보체활성이 있는 응집체를 완전히 제거하여 항보 체가를 최소한 낮추어 줌으로써 부작용의 위험이 없으며, 항체능력을 가진 고유의 IgG 만으로된 정맥주사용 감마글로불린을 제조하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

이와같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 연구한 결과 만족할만한 결과를 얻었는 바, 이하 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 인혈장으로 부터 큰 분획법에 의해 얻어진 분폭Ⅱ나 분획 Ⅱ+Ⅲ으로 부터 폴리에틸렌글리콜처리를 하여 정맥주사용 감마글로불린을 제조하는데 있어서, 분획 G의 용해액을 pH가 6.3-7.0이 되도록 조정하고 벤토나이트(Bentonite)를 3-5 w/v% 되도록 첨가하여 원심 분리함을 특징으로하는 정맥주사용 감마 글로불린의 제조방법인 것이다.

이러한 본 발명을 공지기술을 포함한 일련의 공정으로 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 사용된 원료는 인혈장으로부터 콘분획법에 의한 분획Ⅱ+Ⅲ 및 분획 Ⅱ+Ⅲ, 또는 태반추출물로부터 얻는 분획Ⅱ 및 분획 Ⅱ+Ⅲ 중 어느 것을 사용하여도 좋다.

콘 분획 Ⅱ+Ⅲ을 원료로할 때는 분획 Ⅱ+Ⅲ 페이스트(paste)를 1kg당 발열성물질이 함유되지 않은 인산염 완충용액(Phosphate Buffer Soultion; pH7.0) 10-30ι, 좋기로는 약 20ι 현탁시키고 교반한후 불용성물질을 제거하기 위해 원심분리법(또는 여과법)으로 처리하여 1차 상청액(여과법으로 할때는 여액)을 얻는다.

이 상청액에 폴리에틸렌글리콜을 농도가 6-9w/v% 되게 첨가하고 pH를 4.2-4.6으로 조정한 후 다시 1시간 가량 더 교반하고 원심분리하여 2차 상청액을 얻은 다음, 이 2차상청액에 또다시 폴리에틸렌글리콜을 농도가 12-14w/v% 되게 첨가하여 pH를 6.3-7.0으로 조정한 후 재차 교반하고 원심분리하여 분획 G를 얻고 상청액은 폐기한다. 단, 콘 분회Ⅱ를 원료로 사용할 경우에는 전술한 제조과정에서 불용성물질을 제거한 후의 방법과 동일하므로 생략한다. 얻어진 분획G의 1kg당 발열성 물질이 함유되지 않은 인산염 완충액 약 15ι를 가하여 분획 G를 용해하고 폴리에틸렌글리콜을 농도가 5-8w/v% 되게 첨가하여 교반한 다음 25,000-40,000xg로 고속원심 분리하여 상청액을 얻는다.

발명은 이 상청액 pH를 6.3-7.0으로 조정하고 흡착침전제로 벤토나이트를 3-5w/v%가 되도록 첨가하여 교반하고 원심분리하여 상청액 얻는 바, 이로써 응집체는 완전히 침전으로 제거되는 것이다.

최종적으로 폴리에틸렌글리콜을 상기 상청액에 첨가하여 농도를 12-l4w/v%로 되게하고 pH를 6.3-7.0으로 조정한 후 재교반 및 원심 분리하여 침전으로 된 면역 글로불린 G페이스트를 얻는다. 그 다음 페이스트를 발열성 물질이 함유되지 않은 0.1M 생리 식염액으로 용해하고 안정제로 글리신(Glycine)를 0.25M이 되게 첨가하여 제균 여과한후 분주 및 동결 건조한다.

이상의 전 공정은 2-20℃에서 행하고 동결건조는 영하 20℃-영상 4℃의 온도에서 행하며, 사용되는 폴리에틸렌 글리콜의 분자량은 4,000-6,000인 바, 폴리에틸렌글리콜은 단백질의 분리정제에 널리 쓰여왔으나 본 발명에서는 분자량 4,000-6,000인 경우가 감마글로불린의 정제과정중 응집체의 발생을 억제시키는데탁월한 효과가 있어 4.000-6,000의 분자량을 가진 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이다.

이와 같은 제조과정을 통하여 제조된 정맥주사용 감마글로불린을 검사한 결과 R.1.D(Radial Immunodif-fusion) 측정법에 의한 면역글로불린의 순도는 98%이상이며 메이어(Hayer)의 투유니트 정량법(Two Unit Assay Method; Exp. Immunochemistry By E.A. Kabat and M.M Mayer and Ed. p 133 Thomas Springfield Ⅱ, 1961)에 의한 항보체가는 mg당 0.00-0.01단위였다. 또한 제 4도에서 나타낸 바와 같이 세파덱스 G-200(Sephadex G-200)에 대한 겔여과 분석에 의하여 95% 이상이 7S(침강계수)이며 응집체는 검출되지 않았다.

제 1도는 근육주사용 감마글로불린의 겔여과 분석을 나타낸 것이고, 제 2도는 효소처리한 감마글로불린의 겔여과 분석을 나타낸 것이며, 제 3도는 화학약품 처리한 정맥용 글로불린의 겔여과 분석을 나타낸 도표로서 제 4도에 나타난 본 발명에 따라 제조된 정맥주사용 감마글로불린과 비교하여 보면, 도표상의 곡선의 굴곡형태가 가장 단조롭고 곡선의 피크(Peak)가 하나인 것은 제 4도인 것임을 알 수 있고, 제 4도의 도표가 의미하는 것은 95%이상이 7s부근에 있는 것을 나타내고 있는 데 이는 순수한 감마글로불린이 7s이므로 제4도의 분석을 나타낸 본 발명에 따른 정맥주사용 감마글로불린의 제제가 순수하다는 것을 나타낸 것이다.

표 1은 이와같은 각종 방법으로 제조된 감마글로불린의 겔여과분석에 대한 분포 비교를 나타낸 것이다.

[표 1]

각종 방법으로 제조된 감마글로불린의 겔여과 분석 비교표

*겔여과는 세파덱스 G-200사용

표 2는 가종 방법에 따라 제조된 감마글로불린의 면역학적, 생물학적 성질을 나타낸 것으로서 이 표 2에서 보면 종래의 제제에 비하여 본 발명에 따라 제조된 정맥주사용 감마글로불린 제제는 혈중농도 반감기가 21일로 가장 길어 천연감마글로불린과 동일한 것으로 나타났다.

[표 2]

각종 방법에 따라 제조된 감마글로불린의 면역학적, 생물학적성질

상술한 바와같은 본 발명을 실시예를 들어 상세히 설명하면 다음과 같다.

[실시예 1]

인 혈장으로부터 콘 분회법에 의하여 얻어진 콘 분획 Ⅱ+Ⅲ 페이스트 1kg당 발열성물질이 함유되지 않은 6℃의 인산염 완충액 20ι를 가하여 5% 현탁액을 제조하고 여과하여 불용성물질을 제거하고 여액을 얻은 다음, 이 여액을 초산을 사용하여 pH 4.5로 조정하고 7w/v%가 되도록 폴리에틸렌글리콜을 가하여 1시간동안 교반한후 원심 분리하여 상청액을 얻었다. 이상청액을 0. 1N-수산화나트륨으로 pH6.5로 조정하고 13w/v%가 되도록 폴리에틸렌 글리콜을 첨가하여 충분히 교반시킨후 원심분리하여 상청액을 폐기하고 분획G를 침전으로 회수하였다. 이 분회G에 함유된 응집체를 제거하기 위하여 분획 Ikg당 발열성 물질이 함유되지 않은 4℃의 인산 염완충액 15ι를 가하여 용해시키고 폴리에틸렌글리콜을 6w/v%가 되도록 첨가하여 1시간동안 교반한후 30,000×g로 고속원심 분리하여 상청액을 얻었다. 이 상청액의 pH를 7.0으로 조정한 다음 벤토 나이트(ICN Nutritional Biochemicals제품)를 4w/v%가 되도록 첨가하여 충분히 교반하고 원심하여 응집체를 완전히 침전으로 제거하였다. 그 다음이 상청액을 다시 pH 7.0으로 하고 폴리에틸렌글리콜 농도를로 13w/v% 조정하여 첨가한 후 교반 및 원심분리하여 면역 글로불린 G페이스트를 얻었다. 전 공정중온도는 2-20℃를 유지시켰다. 얻어진 면역글로불린 G페이스트를 발열성물질이 함유되지 않은 0.9% 생리식염액으로 용해하고 글리신을 0.25M되도록 첨가한 후 제균 여과하고 무균적으로 분병하여 즉시 동결건조하였다. 동결건조된 완제품을 주사용 증류수에 용해하여 전술한 방법으로 검사한 결과 면역글로불린G가 98%이며 나머지 2%는 면역글로불린 A이고, 응집체는 검출되지 않았으며 항보체가는 mg당 0.002단위였다.

[실시예 2]

실시예 1과 같은 방법으로 얻은 콘 분획Ⅱ 페이스트 1kg당 발열성 물질을 함유하지 않은 10℃의 인산염 완충액 15ι를 가하여 약 6%의 현탁액을 만들고 0.1N-초산으로 pH를 4.2로 조정한 다음, 폴리에틸렌글리 콜을 농도가 6.0w/v% 되게 첨가하고 한시간 동안 교반한 후 원심 분리하여 상청액을 얻는다.

이 상청액 0.1N-수산화나트륨으로 pH를 6.3으로 조정하고 폴리에틸렌글리콜을 농도가 13w/v% 되도록 첨가한다음 충분히 교반하고 원심분리하여 상청은 폐기하고 분획G를 침전으로 회수하였다. 이 부획G를 발열성물질이 함유되지 않은 10℃ 인산염완충액 15ι를 가하여 용해시키고 벤토나이트를 놀도가 3.0w/v% 되게 첨가하고 pH를 6.5로 조정한 후 충분히 교반한 다음 원심 분리하여 상청액를 얻었다.

이 상청액을 0.1N-수산화나트륨으로 pH를 7.0으 되게 조정하고 폴리에틸렌 글리콜 13w/v% 되게 첨가하여 1시간동안 교반한 후 30,000×g으로 고속원심 분리하여 면역글로불린G 페이스트를 얻었으며 본 실시예의 모든 공정은 2-10℃의 온도를 유지하면서 실시하였다. 얻어진 면역글로불린 G 페이스트는 실시예1과 동일한 방법으로 용해시키고 글리신을 첨가한 다음 동절건조하였으며, 검사결과 고음의 면역글로불린 G가 98%였고 Fab 및 Fc등 분설은 고손원심에 의해 제거되었음이 확인되었고 항보체가는 ㎎당 0.004단위였다.

또한 R.I.A 방법에 의한 B형 간염바이러스 검사는 음성이었고 제조완료 1년후 까지 항보체가의 증가는 없었다.

[실시예 3]

태반 추출물조부터 얻은 콘분획 Ⅱ를 가지고 실시예 2와 동일한 방법으로 제조하였, 완제품을 비교 검사한 결과 역시 양호하였다.

이상에서 상술한 바와 같이 본 발명은 종래의 근육주사용 감마글로불린과는 달리, 콘분획 Ⅱ 및 콘분획 Ⅱ+Ⅲ으로부터 정맥주사용 감마글로불린을 제조함에 있어서 분획의 용해액을 pH6.3-7.0으로 맞추고 벤토나이트를 3-5w/v%되게 첨가하여 처리하므로서 항보체활성의 주요 원인인 응집체를 완전히 침전제거시켜, 항보체활성이 낮고 95% 이상이 항체능력이 있는 고유의 면역글로불린 G만을 함유하는 항보체가가 0.01단위/mg 이하인 정맥주사용 감마글로불린을 제조할 수 있는 것이다.

Claims (1)

1. 인혈장으로부터 콘 분획법에 의해 얻어진 분획 Ⅱ나 분획 Ⅱ+Ⅲ으로부터 폴리에틸렌 글리콜 처리를 하여 정맥주 사용 감마글로불린을 제조하는 데 있어서, 분획G의 용해액을 pH가 6.3-7.0이 되도록 조정하고 벤토나이트를 3-5w/v%가 되도록 첨가하여 원심분리함을 특징으로 하는 정맥주사용 감마글로불린의 제조방법.

Images