CN102911268A - 浓缩抗体的方法及其治疗性产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及浓缩抗体的方法及其治疗性产品。本发明提供了一种浓缩蛋白质的方法，包括在高温，例如约30℃以上依次进行超滤、渗滤及第二次超滤的工序。本发明还包括制备高度浓缩的抗体组合物和高度浓缩的抗体产品的方法。

Description

浓缩抗体的方法及其治疗性产品
本申请是申请日为2005年9月8日、中国申请号为200580038351.0、发明名称为“浓缩抗体的方法及其治疗性产品”的发明申请的分案申请。
发明背景
分离、纯化和浓缩生物材料的方法是已知的，包括例如色谱、超滤和冷冻干燥，一般性地参考，R.Hatti-Kaul等,"Downstream Processing inBiotechnology,"于《Basic Biotechnology》,第9章,187-211页,第二版,Cambridge University Press(2001)。制备用于人体施用的浓缩单克隆抗体制剂的方法是已知的，参见例如美国专利6,252,055，其利用超滤，并使所得的滤出液回流。
已有的抗体浓缩方法存在着一些问题，包括例如，通量低，过程时间长，膜面积大，机械回收产率和损失，密集的操作者介入或操作，传质速率低，能量效率低，以及浓缩设备的水压限制等。上述问题及其它问题可促使制造总成本增高，并最终增加治疗药消费者的花费。
需要改良的方法来制备高度浓缩的蛋白质制剂，例如液体抗体制品以及其治疗产品。
发明概述
在一般意义上，本发明一般地涉及浓缩蛋白质的方法，例如浓缩抗体制品的方法，含有该制品的药物制剂，及它们在人类治疗或动物治疗中的用途。
本发明在实施方案中提供制备高度浓缩的蛋白质，例如抗体制品的方法；以及通过该方法制备的治疗产品，例如治疗性抗体产品。由此，本发明提供一种浓缩蛋白质的方法，包括：对第一抗体制品进行第一超滤，以提供第二抗体制品；对第二抗体制品进行渗滤，以提供经渗滤的中间抗体制品；对经渗滤的中间抗体制品进行第二超滤，以提供第三抗体制品，其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项是在升高的温度，例如约30℃到约50℃进行的。
本发明在实施方案中还提供一种浓缩蛋白质的方法，包括：对第一蛋白质混合物进行第一超滤，以提供第二蛋白质混合物；对第二蛋白质混合物进行渗滤，以提供经渗滤的蛋白质混合物；及对经渗滤的蛋白质混合物进行第二超滤，以提供第三蛋白质混合物，其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项是在例如约45℃进行。
本发明还在实施方案中提供通过上述方法制备的高度浓缩的抗体组合物。
本发明涉及下述各项。
1．制备高度浓缩的抗体组合物的方法，包括：
对第一抗体制品进行第一超滤，以提供第二抗体制品；
对第二抗体制品进行渗滤，以提供经渗滤的中间抗体制品；及
对经渗滤的中间抗体制品进行第二渗滤，以提供第三抗体制品；
其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在约30℃到约50℃条件下完成。
2．项1的方法，其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在约35℃到约50℃条件下完成。
3．项1的方法，其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在约45℃条件下完成。
4．项1的方法，其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在45℃±5℃条件下完成。
5．项1的方法，其中所述第一抗体制品的抗体浓度为约0.1到约10克每升。
6．项1的方法，其中所述第一抗体制品的抗体浓度为约1到约5克每升。
7．项1的方法，其中所述第二抗体制品的抗体浓度为约10到约50克每升。
8．项1的方法，其中所述第二抗体制品的抗体浓度为约20到约40克每升。
9．项1的方法，其中所述第三抗体制品的抗体浓度为约50到约250克每升。
10．项1的方法，其中所述第三抗体制品的抗体浓度为约100到约230克每升。
11．项1的方法，其中所述第三抗体制品的抗体浓度为约170到约200克每升。
12．项1的方法，其中所述经渗滤的中间抗体制品和第三抗体制品包含超滤截留液。
13．项1的方法，其中所述中间抗体制品的抗体浓度为约25到约35克每升，且所述第三抗体制品的抗体浓度为约170到约200克每升。
14．项1的方法，其中所述抗体制品包含抗-IgE抗体。
15．项1的方法，其中所述方法经过约1到10小时完成。
16．项1的方法，其中所述方法经过约2到5小时完成。
17．项1的方法，其中所述方法经过约3小时完成。
18．项1的方法，其中所述第一和第二超滤使用标称孔径为约5到约50千道尔顿的超滤膜完成。
19．项1的方法，其中所述第一和第二超滤使用标称孔径为约10到约30千道尔顿的超滤膜完成。
20．项1的方法，其中所述第一抗体制品含有表观分子量为约100到约200千道尔顿的抗体。
21．项1的方法，其中所述第一抗体制品含有表观分子量为约150千道尔顿的抗体。
22．项1的方法，其中所述第一超滤浓缩第一抗体制品以提供抗体浓度为约30克每升的第二抗体制品，所述第二超滤浓缩中间抗体制品以提供抗体浓度为约170克到约200克每升的第三抗体制品。
23．项1的方法，其中所述第一超滤和第二超滤使用相同的超滤膜完成。
24．项1的方法，其中所述第一超滤和第二超滤使用再生纤维素复合材料超滤膜完成。
25．项1的方法，其中所述渗滤在恒定体积，恒定浓度，或恒定体积且恒定浓度条件下实现缓冲液交换。
26．项1的方法，其中所述渗滤实现约5到约15倍体积的缓冲液交换。
27．项1的方法，其中所述渗滤实现约8倍体积的缓冲液交换。
28．项1的方法，其中所述渗滤将第一缓冲液交换为第二缓冲液。
29．项28的方法，其中所述第一缓冲液包含氯化钠水溶液和TRIS缓冲液的混合物，第二缓冲液包含含水组氨酸氯化物和精氨酸氯化物的混合物。
30．项1的方法，其中所述第一超滤、第二超滤和渗滤利用横跨超滤膜的切向流过滤来完成。
31．项1的方法，其中所述第一超滤、第二超滤和渗滤利用横跨相同超滤膜的切向流过滤来完成。
32．项1的方法，其中所述第三抗体制品的产率高于约70重量%，是基于第一抗体制品中抗体的重量。
33．项32的方法，其中所述第三抗体制品的产率为约80到约100重量%，是基于第一抗体制品中抗体的重量。
34．项1的方法，其中第一超滤具有约0.5L/min/ft2到约5L/min/ft2的回流速率。
35．项1的方法，其中所述超滤和渗滤在约10到约50p.s.i.的跨膜压力条件下完成。
36．项1的方法，其中提供可检测的生物负荷小于约100CFU/mL的抗体浓缩物。
37．浓缩蛋白质的方法，包括：
对第一蛋白质混合物进行第一超滤，以提供第二蛋白质混合物；
对第二蛋白质混合物进行渗滤，以提供经渗滤的蛋白质混合物；及
对经渗滤的蛋白质混合物进行第二渗滤，以提供第三蛋白质混合物；其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在约30℃到约50℃条件下完成。
附图说明
图1显示本发明的实施方案中用于实现制备方法的装置。
图2到图17显示本发明的实施方案中过程的不同阶段或模式中观察或测量到的不同过程值。
图18和19显示本发明的实施方案中升高的温度对产品质量的影响。
图20和21显示本发明的实施方案中升高的温度对生物负荷控制的影响。
图22显示本发明的实施方案中升高的温度对过程流量和过程时间的影响。
图23到25显示本发明的实施方案中经放大的过程的不同阶段或模式中观察或测量到的不同过程值。
发明详述
下面将援引附图(如果有的话)对本发明的不同实施方案进行详细的描述。援引不同的实施方案并不限制本发明的范围；本发明的范围仅受本文所附的权利要求书的限制。另外，本说明书中列出的任何示例都非意在限制，而仅仅是提出被要求保护的发明的多种可能的实施方案中的一些。
除非另有说明，使用下述表述：
“超滤”(”ultrafiltering”,”ultrafiltration”,”ultrafiltered”,”UF”及类似术语)涉及，例如，使用具有合适的物理和化学性质的合成半透膜(semi-permeablemembrane)，主要基于分子大小和形状来区分混合物中的分子，实现不同分子的分离或相似分子的浓缩。
“渗滤”(”diafiltering”,”diafiltration”,”diafiltered”,”diafiltrating”,”DF”及类似术语)涉及，例如，使用超滤膜从含有蛋白质、肽、核酸或其它生物分子的溶液或混合物中去除或置换盐或溶剂，或降低盐或溶剂的浓度。
“跨膜压力”(transmembrane pressure)或“TMP”是指从膜的进液侧向滤液侧所施加的平均压力，以TMP[bar]=[(PF+PR)/2]-Pf计算，其中PF是进液压力，PR是截留液(retentate)压力，Pf是滤液压力。
“切向流过滤”(tangential flow filtration)，“错流过滤”(cross flowfiltration)，“TFF”及类似术语是指含有溶质的溶液以切向流过UF膜，并通过施加压力使低分子量的盐或溶质穿过的过滤模式。
“抗体”在本文中使用其最广的含义，具体覆盖完整(infant)单克隆抗体、多克隆抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(如双特异性抗体)、及抗体片段，只要它们展示所需生物学活性。抗体是免疫系统产生的能够识别和结合特异性抗原的蛋白质。从结构上说，抗体是一种Y形的蛋白质，由4条氨基酸链，即2条轻链和2条重链组成。在一种对于本申请而言足够的简化模型中，每个抗体主要有两个区域：一可变区和一恒定区。可变区位于Y形的臂的末端，与目标抗原结合并相互作用。可变区包括互补决定区(CDR)，其识别并结合抗原上的特定结合位点。恒定区位于Y形的尾部，被免疫系统识别并与之相互作用(Janeway,C,Travers,P.,Walport,M.,Shlomchik(2001)《Immuno Biology》,第5版,Garland Publishing,NewYork)。目标抗原通常具有多个结合位点，又称表位，它们被多种抗体上的CDR所识别。特异性结合不同表位的各种抗体具有不同的结构。因此，一种抗原可以具有多于一种相应的抗体。
基本的4链抗体单位是由两条相同的轻(L)链和两条相同的重(H)链组成的异四聚体糖蛋白(IgM抗体由5个所述异四聚体基本单位和另一称为J链的多肽组成，因此含有10个抗原结合位点，而分泌型IgA抗体可聚合形成包括2到5个基本4链单位及J链的多价的集聚体(assemblage))。对于IgG，4链单位通常为约150,000道尔顿。每条L链通过一个共价二硫键连接于一条H链，而两条H链根据其同种型通过一个或多个二硫键互相连接。每条H和L链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在N端具有可变区(VH)，其后在α和γ链同种型的情况下有3个恒定区(CH)，在μ和ε同种型的情况下有4个CH区。每条L链在N末端具有可变区(VL)随后在其另一端是恒定区(CL)。VL与VH排列在一起，CL与重链的第一个恒定区(CH1)排列在一起。认为特定的氨基酸残基在重链和轻链的可变区之间形成界面。一条VH和一条VL配对共同形成一个抗原结合位点。不同类型的抗体的结构和性质可参见，例如，《Basic and Clinical Immunology》,第8版,D.Stites,A.Terr和T.Parslow编,Appleton & Lange,Norwalk,CT,1994,第71页和第6章。
来自任何脊椎动物物种的L链，根据其恒定区的氨基酸序列，可归入两种截然不同的称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)的类型中的一种。根据其重链恒定区(CH)的氨基酸序列，可将免疫球蛋白归入不同的类别或同种型。免疫球蛋白有五种主要的类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其具有的重链分别称作α、δ、ε、γ和μ。γ和α类根据CH序列和功能的相对次要的差异进一步分为亚类，例如，人表达下面的亚类：IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。
术语“可变的”是指不同抗体的可变区特定部分的序列差异很大。V区介导抗原结合并决定具体抗体对其具体抗原的特异性。然而，在约110个氨基酸的整个可变区中可变性的分布并不均等。相反，V区组成如下：多个具有15-30个氨基酸的相对恒定序列段(称为框架区，FR)，以及位于它们之间的变异性极高的较短区域(称为高变区，每一个高变区具有9-12个氨基酸)。天然轻链和重链的可变区分别包含四个FR，它们大多采用β折叠构象，通过三个高变区相连，这些高变区与β折叠结构形成环状，有时形成部分环状。每条链的高变区通过FR连接至十分接近，并与其他链的高变区共同形成抗体的抗原结合位点(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD，(1991))。恒定区不直接参与抗体对抗原的结合，但显示多种效应功能，如使抗体参与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)。
术语“高变区”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基[如约VL的Kabat残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)左右，及约VH的Kabat残基31-35B(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)左右；(见Kabat等，同上)]和/或来自“高变环”的残基[例如约VL中的Chothia残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)左右，及VH中的Chothia残基26-32(H1)、52A-55(H2)和96-101(H3)左右；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。
本文中术语“单克隆抗体”指从实质上均一的抗体群获得的抗体，即构成该群体的抗体除了在生成所述单克隆抗体期间可能产生的通常为少量的变体以外都相同。这样的单克隆抗体通常包括含有结合靶标的多肽序列的抗体，其中获得该结合靶标的多肽序列的过程包括从多个多肽序列中选择单个结合靶标的多肽序列。例如，所述选择过程可以是从多个克隆，例如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆库中选择独特的克隆。应当理解，还可以进一步改变所选择的靶标结合序列，例如，来增加对靶标的亲和力，使靶标结合序列人源化，促进其在细胞培养中的生成，降低其体内免疫原性，产生多特异性抗体等等，并且包含改变的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，单克隆抗体制品中的每一单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体制品具有这样的优点，即它们通常没有被其它的免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表明由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来制备，包括，例如杂交瘤方法(例如，Kohler等,Nature,256:495(1975);Harlow等,Antibodies:A LaboratoryManual,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,第二版，1988);Hammerling等,于《Monoclonal Antibodies and T-CeIl Hybridomas》中，563-681,(Elsevier,N.Y.,1981))，重组DNA方法(见例如美国专利4,816,567)，噬菌体展示技术(见，例如，Clackson等,Nature,352:624-628(1991);Marks等,J.Mot Biol.,222:581-597(1991);Sidhu等,J.MoI.Biol.338(2):299-310(2004);Lee等,J.Mol.Biol.340(5):1073-l093(2004)；Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004);及Lee等,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))，以及在具有部分或全部人免疫球蛋白基因座或具有编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生产人抗体或人样(human-like)抗体的技术(见，例如，WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO 1991/10741;Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits等,Nature,362:255-258(1993);Bruggemann等,Year in Immuno.,7:33(1993);美国专利5,545,806;5,569,825;5,591,669(都授权给GenPharm);5,545,807;WO1997/17852;美国专利5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;及5,661,016;Marks等,Bio/Technology,10:779-783(1992);Lonberg等,Nature.368:856-859(1994);Morrison,Nature,368:812-813(1994);Fishwild等,Nature Biotechnology,14:845-851(1996);Neuberger,Nature Biotechnology,M:826(1996);及Lonberg和Huszar,Intern.Rev.Immunol.,13:65-93(1995)。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)的重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们显示出所需的生物学活性(美国专利4,816,567；Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。本文中使用的人源化抗体是嵌合抗体的一个亚类。
非人源(例如鼠源)抗体的“人源化”形式是最低限度含有衍生自非人源免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人源免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有所需特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人源免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基用相应的非人源残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能例如结合亲和力。通常，人源化抗体将包含基本上不少于至少一个、通常两个如下可变区，其中所有或基本上所有的高变环对应于非人源免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有的FR区是人源免疫球蛋白序列的FR区，虽然FR区可能包括一个或更多改善结合亲和力的氨基酸取代。FR中这样的氨基酸取代的数目在H链中通常不超过6个，在L链中不超过3个。任选的是，人源化抗体还将包含至少部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人源免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括完整抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab，Fab’，F(ab’)2，和Fv片段；双抗体；线性化抗体(见美国专利5,641,870，实施例2；Zapata等,Protein Ens.,8(10):1057-1062(1995))；单链抗体分子；和由抗体片段构成的多特异性抗体。
抗体经木瓜蛋白酶消化产生两个相同的称为“Fab”的抗原结合片段和一个残余“Fc”片段，Fc的名称反映了其易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab’)2片段，它有两个抗原结合位点并仍能与抗原交叉结合。
Fab片段由一条完整的L链，H链的可变区(VH)，和一条重链的第一个恒定区(CH1)组成。每条Fab片段就抗原结合而言是单价的，即，它含有单个抗原结合位点。用胃蛋白酶酶消化抗体产生一个大的F(ab’)2片段，其大致相当于具有二价抗原结合活性的由二硫键连结的两个Fab片段，并且仍能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段不同在于CH1区羧基末端多出少数残基，包括一个和多个来自抗体铰链区的半胱氨酸。Fab’-SH在本文中指代恒定区半胱氨酸残基带有游离巯基的Fab’。最初产生的F(ab’)2抗体片段是成对的Fab’片段，其间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
Fc片段包含由二硫键连结在一起的两条H链的羧基末端部分。抗体的效应物功能是由Fc区中的序列决定的，该区域也是特定细胞类型中出现的Fc受体(FcR)所识别的部分。
“Fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价结合的一个重链可变区和一个轻链可变区的二聚体组成。这两个区域的折叠产生6个高变环(H链和L链各产生3个)，它们提供用于抗原结合的氨基酸残基并赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管亲和力低于完整结合位点。
“单链Fv”，亦可缩写为“sFv”或“scFv”，是包含连接成为单条多肽链的VH和VL抗体区域的抗体片段。优选的是，该sFv多肽在VH和VL区域之间还包含多肽接头，使得scFv形成抗原结合所需的结构。关于scFv的综述参见Plückthun，在《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》中，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，269-315，1994。
“约”，在修饰例如本发明的方法中所用的组合物中成分的量、活性成分(active)的浓度、缓冲液体积(buffer volume)、渗滤体积(diavolume)、孔径(pore size)、表观分子量(apparent molecular)、分子量截留值、过程温度、过程时间、产率、流速、压力、生物负荷、以及类似的值及其范围时，是指可以由于，例如，制备浓缩物或使用溶液时通常的测量和操作步骤，在这些步骤中的无心之错，制备所述组合物或执行所述方法时所用的成分的制造、来源或纯度的不同，或其它考虑因素而造成的用数值表示的量的差异。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度或混合组成(mixture)的组合物随时间变化(aging)而差异的量。术语“约”还涵盖由于混合或加工具有特定的初始浓度或混合组成的组合物而差异的量。不管是否被“约”所修饰，权利要求都包括所述量的等价量。
“基本上由……组成”涉及获得浓缩的蛋白质组合物或抗体组合物的过程，该过程包括权利要求中所列的步骤和成分，加上对该组合物的基本性质和新颖性质无实质性影响的其它步骤或成分，例如重复的步骤或缓冲介质。实质性地影响本发明的组合物及方法的基本性质的成分带来不希望的特性，包括，例如，生物负荷，例如污染物相关的毒性或应激性。
本文中所用的不定冠词“a”或“an”及其相应的定冠词“the”应理解为表示至少一，或者说一或更多，除非另有说明。
本发明在实施方案中提供上述的方法及其浓缩的抗体产品。
在本发明的实施方案中，制备方法及其产品可以用于制备高度浓缩的抗体制品和类似的制品，例如从天然或合成来源纯化和浓缩蛋白质或类似物质，所述产品可用于治疗病症，例如哮喘，癌症，银屑病，抑制血管发生，以及类似的病症。
在上述的本发明的制备高度浓缩的抗体的方法的实施方案中，下述进一步例示了如何制备和使用本发明的制备方法和产品。
在本发明的实施方案中，提供了一种制备高度浓缩的抗体组合物的方法，例如根据按所述顺序完成下列步骤，包括：
对第一抗体制品进行第一超滤，所述第一抗体制品的浓度为，例如，约0.1到约10克每升(g/L)，以提供作为截留液的第二抗体制品，其具有更高的抗体浓度，例如约10到约50克每升；
对所得的第二抗体制品进行渗滤，以提供作为截留液的经渗滤的中间抗体制品，其与所得的第二抗体制品截留液具有约相同的浓度，即，通过渗滤实现恒定体积下的缓冲液置换；及
对所述经渗滤的中间抗体制品进行第二超滤，以提供作为截留液的第三抗体制品，其具有更高的抗体浓度，例如约150到约200克每升。
本发明的制备方法还可包括可选的产品回收步骤，例如本文所公开和说明的。
在本发明的上述方法的实施方案中，第一超滤、渗滤和第二超滤中的一项或多项可以在例如约30℃到70℃完成。在实施方案中，这些步骤可以在例如约35℃到约50℃完成。在实施方案中，这些步骤还可在例如约45℃，例如从约45℃±5℃完成。取决于抗体制品的种类，对于在约70℃以上完成的方法，制品可显示劣化(deterioration)，例如变性、聚集(agglomeration)，及类似现象的征象。对于在约30℃到约35℃的温度以下完成的方法而言，流速通常过低、过程时间过长，因此对于高效的大量生产来说，较低温度下的方法较缺乏吸引力。
在实施方案中，第一抗体制品的抗体浓度可以为，例如，约0.1到约100克每升(g/L)。抗体浓度为，例如，典型地可从例如离心、过滤、色谱及类似程序等其他初步蛋白质或抗体纯化步骤或方法获得的通常浓度。可以从第一超滤获得的第二抗体制品的抗体浓度可以为例如约10到约50克每升，例如约20到约40克每升，如30克每升。中间抗体的抗体浓度的范围可以依赖于例如多个因素的平衡，所述因素例如用特定的含第二抗体制品的缓冲液可实现的样品体积和样品流量。中间抗体制品的抗体浓度可以为例如约25到约35克每升，第三抗体制品的抗体浓度可以为例如约170到约200克每升。第三抗体制品在实施方案中可具有例如约50到约250克每升的抗体浓度，例如约100到约230克每升，约170到约200克每升，例如185克每升。
对于理解了本发明的本领域技术人员而言显而易见的是，中间抗体制品和第三抗体制品包含相同的超滤截留液，除了例如第一和第二超滤造成的抗体浓度的不同和渗滤缓冲液交换造成的悬浮缓冲介质的差异以外。因此，在本发明的实施方案中，目标蛋白质或抗体产品几乎没有组成上的变化，例如降解。
常规的超滤浓缩方法可能一般耗费更多的时间，通量效率更低，即过程时间显著更长，例如数天到数周，处理的体积显著更小，或两者兼有。
在实施方案中，本发明的蛋白质浓缩方法可以经过例如约1到10小时，优选约2到5小时，更优选约3小时完成。优选较高的流通量和较小的膜面积。
在实施方案中，第一超滤可以用例如总过程时间的约35%完成。因此，例如，在总过程时间为3小时的本发明的浓缩和纯化方法中，第一超滤可以用约45分钟完成。在实施方案中，第二超滤可以用例如总过程时间的约15%完成，因此，例如，在总过程时间为3小时的本发明的方法中，第二超滤可以用约15分钟完成。渗滤可以用例如总过程时间的约50%完成，因此，例如，在总过程时间为3小时的本发明的方法中，第二超滤可以用约90到约120分钟完成。
在实施方案中，第一超滤和第二超滤可以用标称孔径，或分子量截留为约5到约50千道尔顿的超滤膜完成。另一合适的标称孔径为，例如，约10到约40千道尔顿。另一合适的标称孔径，或分子量截留，为约30千道尔顿。
在实施方案中，第一抗体制品可含有，例如，表观分子量为例如约100到约200千道尔顿的第一抗体。在其它实施方案中，所述第一抗体制品可含有表观分子量为例如约150千道尔顿的抗体，例如当该抗体制品包含抗-IgE抗体或IgE时，参见例如授权给Genentech,Inc.的美国专利6,172,213。
适用于本发明的其它抗体包括治疗癌症的抗体，一般可参见例如：PCT/US02/19592；PCT/US01/20118；PCT/US01/25464；PCT/US01/26626；PCT/US02/28859；PCT/US02/41798；PCT/US02/12206；PCT/US03/11148；PCT/US02/12619及PCT/US02/33050。适用于本发明的其它抗体包括抗-CD20抗体和类似的抗体包括人源，非人源，鼠源，杂合，和嵌合形式。见例如美国专利6,582,959(VEGF)和美国专利申请2002/012297A1(人VEGF)。
在实施方案中，本发明的范围中包含的抗体包括杂合和重组抗体(例如，“人源化”和“人源”抗体)，无论其来源的物种、免疫球蛋白类型或亚类的指定，以及抗体片段(例如，Fab，F(ab’)2及Fv)。见美国专利4,816,567；Mage和Lamoyi，于《Monoclonal Anitibody Production Techniques andApplications》中，79-97,Marcel Dekker，Inc.New York，(1987)。
还可以使用单克隆抗体，单克隆抗体可以例如用例如Clackson等(1991)Nature,352:624-628及Marks等，(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中所述的技术从噬菌体抗体文库中分离。单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自某特定的物种或属于某特定的抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一特定的物种或属于另一特定的抗体类型或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及这样的抗体的片段，只要它们展示所需的生物活性(美国专利4,816,567，和Morrison等.(1984).Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855)。嵌合抗体可包含“灵长类化”(primatized)抗体，其包含衍生自非人灵长类动物的可变区抗原结合序列(例如旧大陆猴类，猿等)和人源恒定区序列。
单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原性位点。另外，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。单克隆抗体制品中的每一单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性以外，单克隆抗体制品具有这样的优点，即它们可以合成，且没有其它免疫球蛋白的污染。因此，修饰语“单克隆”表明由基本上同质的抗体群获得的抗体的特征，即构成该群体的单个抗体是相同的，除了可能天然发生的，并可能以次要的量存在的突变以外，并不解释为需要通过任何特定方法来生产抗体。例如，本发明中使用的单克隆抗体可通过最初由Kohler和Milstein,Nature 256:495(1975)描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法来制备(参见例如美国专利4,816,567)。其它已知的抗体生产方法记载于，例如，Goding,《Monoclonal Antibodies:Principles and Practice》,59-103,Academic Press(1986);Kozbor,J.Immunol,133:3001(1984).Brodeur等,《Monoclonal Antibody Production Techniquesand Applications》,51-63,Marcel Dekker,Inc.,New York(1987)。
已经使用了多种方法来制备单克隆抗体(Mabs)。杂交瘤技术涉及产生单一类型抗体的克隆细胞系，使用不同物种的细胞，包括小鼠(鼠源)，仓鼠，大鼠和人。另一种制备Mab的方法使用基因工程技术，包括重组DNA技术。用这些技术所制备的单克隆抗体包括例如嵌合抗体和人源化抗体等。嵌合抗体将来自多于一个物种的DNA编码区域组合起来。例如，嵌合抗体的可变区可来自于小鼠，恒定区可来自于人。人源化抗体主要地来源于人，虽然其含有非人源部分。象嵌合抗体一样，人源化抗体可含有完全人源的恒定区。但和嵌合抗体不同的是，可变区可部分地来源于人。人源化抗体的非人的，合成的部分往往来源于鼠源抗体的CDR。在任何情况下，这些区域对于使抗体得以识别和结合特定抗原都具有关键意义。
如提到过的，鼠源抗体在抗体技术中起重要作用。虽然鼠源抗体对诊断和短期疗法是有用的，它们不能长期施用于人而同时不增加有害的免疫反应。该反应称为人抗小鼠抗体(HAMA)，当人免疫系统识别鼠源抗体为外来的并对其攻击时发生。HAMA反应可导致中毒性休克或乃至死亡。嵌合抗体和人源化抗体使施用的抗体的非人源部分最小化，从而减少HAMA反应的可能。另外，嵌合抗体和人源化抗体还有活化人再次免疫反应，例如抗体依赖的细胞毒作用的益处。
“完整的”抗体包含结合抗原的可变区以及轻链恒定区(CL)和重链恒定区CH1，CH2和CH3。这些恒定区可以是天然序列的恒定区(例如，人源天然序列恒定区)或其氨基酸序列变体。完整的抗体可以有一种或多种“效应物功能”，其指可归结为抗体Fc区(天然序列的Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的生物活性。抗体效应物功能的例子包括C1q结合；补体依赖的细胞毒作用；Fc受体结合；抗体依赖细胞介导的细胞毒作用(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)的下调等。
取决于完整抗体重链恒定区的氨基酸序列，可以将完整抗体归于不同的“类型”。完整的抗体主要有五个类型：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中某些类型还可以分为“亚类”(同种型)，例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。与所述不同类型的抗体对应的重链恒定区分别称为α，β，ε，γ和μ。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
在实施方案中，第一超滤浓缩第一抗体制品以提供抗体浓度为约30克每升的第二抗体制品，第二超滤浓缩中间抗体制品(由渗滤而得)以提供抗体浓度为例如约170到约200克每升的第三抗体制品。第一超滤和第二超滤可以用相同的超滤膜完成，并且如果需要可在同一容器或过程回路中完成，例如，来最大地减少操作、损失、泄漏等等对产率、效率和经济性的影响。第一超滤和第二超滤可以用任何合适的超滤设备或超滤膜完成。能够进行切向流过滤(TFF)操作完成超滤和渗滤的合适的超滤设备及超滤膜有很多是可以商购的，例如来自Millipore，Pall Corp.，Sartorius等供应商。在实施方案中，合适的超滤膜可以是，例如，任何再生纤维素复合材料(regenerated cellulosecomposite)，与其它可获得的超滤膜，例如聚醚砜相比，该材料的蛋白质吸附曲线相对较低。
渗滤操作将第一和第二抗体制品中的第一缓冲液组合物交换为第三抗体制品中所需的第二缓冲液。在实施方案中，第一缓冲液可包含，例如，氯化钠水溶液和TRIS缓冲液的混合物，第二缓冲液可包含，例如，组氨酸氯化物和精氨酸氯化物水溶液的混合物。渗滤可以在恒定体积，恒定浓度，或恒定体积及恒定浓度条件下完成缓冲液交换。在实施方案中，渗滤在恒定体积及恒定浓度条件下完成缓冲液交换。渗滤可以完成例如约5倍到约15倍体积(即渗滤体积)的缓冲液交换。渗滤还可完成例如约8倍体积(即渗滤体积)的缓冲液交换，即，含有要交换的抗体制品的样品体积的8倍。例如，10升的抗体制品可以用5倍(渗滤体积)，或50升体积的交换缓冲液渗滤。交换体积和优选的交换体积考虑多个因素的平衡，例如过程通量效率，产品纯度，政府和消费者-患者可接受性的标准，以及类似的标准，并可依赖于，例如第一抗体制品中缓冲液(例如第一缓冲液)的浓度和类型，以及类似的考虑因素。
第一超滤、第二超滤和渗滤优选地由通过超滤膜的切向流过滤(TFF模式)完成，且优选各个步骤的渗滤膜是相同的膜。最后总物料(即第三抗体制品)中产品的收率可以是例如高于70重量%，例如约80到约100重量%，基于第一抗体制品中的抗体的重量。第三抗体制品的产率可以是，在实施方案中，高于约90重量%，在实施方案中，高于约95重量%，在实施方案中，乃至高于约98重量%，基于第一抗体制品中的抗体的重量。
第一超滤的回流速率(recirculation rate)可以为，例如，约50到1,000mL/min，优选约100到1,000mL/min。可以根据可用的膜面积对回流速率进行调节，例如，5,20,200,1,1,000平方英尺的膜面积，及类似的膜面积，所允许的回流速率依次增高。因此，合适的经调节的回流速率在实施方案中可以是例如约0.5L/min/ft2到约5L/min/ft2。超滤和渗滤可以在例如约5到约50p.s.i的跨膜压力条件下完成。超滤和渗滤可以在例如约10到约50p.s.i的跨膜压力条件下完成。在本发明的实施方案中，提供了一种制备较稀的抗体配方的抗体浓缩物的方法，该抗体浓缩物具有最小的生物负荷，例如，小于或低于检测限，例如，少于约100CFU/mL。
本发明的抗体组合物可以是，例如，用于人体施用的浓缩单克隆抗体制品，例如以大约或等于约100g/L(mg/mL)，例如约120到约170g/L。
本发明的抗体组合物可以是例如免疫球蛋白，例如来自IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类群的免疫球蛋白；其亚类；其重组体；其片段；以及前述的任何混合物。本发明的优选的抗体组合物包含重组的人源化抗-IgE抗体。本发明的抗体组合物可包含缓冲液。优选的缓冲液可以为，例如，组氨酸氯化物和精氨酸氯化物的水溶液的混合物。
本发明的制备方法优选地在相同设备中完成，没有或只有最少的操作人员的介入，例如图1所示。
第一抗体制品的提供或制备可使用多种化学、物理、机械或非机械，或生物化学方法，例如，研磨(grinding)，超声处理，匀浆(homogenization)，酶消化，溶剂萃取，离心，色谱，以及类似方法及其组合，见，例如，上面提到的R.Hatti-Kaul等,"Downstream Processing in Biotechnology,"于《BasicBiotechnology》，第9章中。第三抗体制品在需要时，可以使用例如纳滤(以除去例如二价离子)、反渗透(以除去例如单价离子)及类似的液体纯化方法来进一步加工。本发明的第三抗体制品可以被包装、储存或直接使用。在需要时，还可以使用例如更多的浓缩步骤，例如干燥、冷冻干燥、冷冻干燥-重溶(reconstitution)，及类似方法来进一步加工。所得的经过浓缩的第三抗体产品可以在一段时间后用合适的液体重溶。
参见附图，图1显示本发明的实施方案中用于实现制备方法的一种设备，该设备包括：超滤-渗滤系统(100)，其具有TFF超滤-渗滤(UF-DF)单元(110)，该单元具有UF-DF膜(115)，并与回流槽(120)连通，该槽充当进料液和截留液的主要储存容器。在实施方案中，槽(120)可具有温度控制系统，其包含，例如，绝热夹套(125)，恒温或控温的加热元件(126)，例如变阻加热器(rheostat resistive heater)或循环加热液体系统，该系统包括加热器(未显示)，流量调节器(127)，例如回流泵，以及合适的热传递流体，例如水或二醇(glycols)或其混合物。所有循环中的组件或对循环流动或加工起贡献的组件，例如管道、阀门，泵、槽和类似的组件，可任选为绝热的，或者可以适于外部加热，以严密地控制所要求的温度，并避免回流的液体回路中过滤室(110)和回流槽(120)之内和之间的温度偏差。在实施方案中，例如，当系统在例如补料分批模式下进行第一超滤时，系统可包含任选的进料槽(128)，其与回流进料槽(120)流动连通，可以用来，例如，从回流槽(120)对耗尽的液相进行补充。
泵(130)抽动进料液从槽(120)通过UF/DF单元(110)，然后将所得的截留液(进料液的未被过滤的或被膜排阻的部分)回流到回流槽(120)。第二个槽(140)在恒定体积渗滤过程中容纳缓冲液并任选地用泵(未显示)将其抽到主循环(110－120回路)中。例如，导入主循环的缓冲液的添加速率和体积优选地与滤液通过膜(115)离开主循环的速率和体积相同。缓冲液槽(140)可任选地用夹套(143)绝热，并可包含等价于上述的加热元件的装置和回流泵(未显示)。可以使用任选的惰性气体源(145)，例如氮气源，或其它压缩空气源，用于例如回收产品，压回截留液，排除氧气，冲洗(flushing)、清洗，检查膜完整性及类似操作。第三个槽(160)用来收集和回收从单元(110)流出的滤液。阀(150，170)可以视情况合适地使用来调控系统中的方向和任选地调控液体流速。所有的阀和泵都可以手动操作，通过协调的计算机控制操作，或通过上述两种方式操作。任选的第四个槽(190)和流出流(exit stream)例如当配有可选的监控装置(180)例如光密度仪、任选的滤器例如保护滤器(guard filter)和产品滤器、或其它类似的子系统时，可提供辅助的废料冲洗、产品回收、或监控系统。在实施方案中，主流体循环(110－120回路)可任选地配有在线(in-line)监测系统。
本发明的方法所制备的浓缩抗体制品可用于人体治疗性施用，包括免疫球蛋白产品，用于肌肉内(IMIG)或静脉内(IVIG)施用。本发明的浓缩抗体制品可包含稳定剂，例如，缓冲的氨基酸盐溶液，单糖，或类似的稳定剂，合适的离子螯合剂，例如EDTA或柠檬酸根离子，及其组合，参见例如，Wang,Y.-C.J.等,"Parenteral formulations of proteins and peptides:stability andstabilizers,"J.Parenteral Sd.Technol,42,Suppl.S3-S26(1988)。Derwent提供的JP01268646A(AN89-359879)的摘要称，该申请描述了一种IgG3单克隆抗体的注射制品，其浓度为0.1微克/mL到100mg/mL。这些出版物中公开的主题被认为在本发明的范围之外。
本发明的制品可基本上不含聚集物(aggregates)。聚集的污染物的可接受的水平为少于，例如，约5重量%，理想地为少于2重量%。可以实现低达0.2重量%的水平，虽然1重量%的聚集的污染物是更通常的。优选地，实施方案中的制剂也可以基本上不含有用于稳定多克隆制剂的常规赋形剂，例如甘氨酸和/或麦芽糖。
本发明提供一种用于人体施用的单克隆抗体制品，其特征在于该制品中的抗体是重组抗体，并且其浓度可为100mg/mL或更高，优选高于150mg/mL。优选地，该制剂基本上不含任何蛋白质聚集物。
本发明的药物制剂的pH将取决于具体的施用途径。但是，为了使抗体在浓缩的溶液中的溶解度最大化，该溶液的pH应该不同于抗体的等电点(pI)的pH。
在本发明的实施方案中，设想所述单克隆抗体制品可用于人体治疗。可以治疗多种人体紊乱例如癌症或感染性疾病，例如上面提到的那些，以及免疫紊乱例如T细胞介导的紊乱，包括严重脉管炎(severe vasculitis)，类风湿性关节炎，系统性红斑狼疮，以及自身免疫紊乱，例如多发性硬化，移植物抗宿主病，银屑病，青少年型糖尿病(juvenile onset diabetes)，斯耶格伦氏病，甲状腺疾病，重症肌无力，移植排斥，以及类似的紊乱或病症，以及它们的组合。
因此，本发明在实施方案中提供本文所述的浓缩的单克隆抗体制品在制备用于治疗任何上述的紊乱及类似紊乱的药物中的用途。还提供了治疗具有任何上述紊乱的人的方法，包括给予个体治疗有效量的根据本发明的制品。这样的抗体制剂的剂量将随要治疗的病症和治疗的接受者而改变，但例如可以对成人患者为每天或每周施用约50到约2,000mg，优选约100到约1,000mg，施用1到30天，并视需要重复。施用可以按单剂进行，或者分为多剂进行。
方法描述
配制(formulation)步骤通常将例如经过离子交换色谱得到的纯化的总药品(drug substance)交换为最终的赋形剂组成和浓度。在该步骤中通常除了去除小分子以外没有发生纯化。重点在于高产率、缓冲液交换、以及配制步骤的稳健性(robustness)。在通过TFF(切向流过滤)进行配制的过程中，含有蛋白质的进料溶液在泵抽动下通过膜系统并回到循环(回流)容器中。TFF膜保留蛋白质(作为截留液的一部分)，而滤液(或渗透液(permeate))在压力的驱使下通过膜。该压力称为跨膜压力(TMP)，通常用截留液压力控制阀控制该压力。该方法通常通过第一超滤(浓缩)，渗滤(恒定体积缓冲液交换)和第二超滤(进一步浓缩)的工序来实现。去除过程缓冲液组分所需的渗滤体积数(体积当量)可以容易地算出或通过实验确定。
抗-IgE通用的UF/DF方法
用0.5M磷酸水溶液将来自色谱的阴离子交换总物料的pH调节到pH约为6。通过使用标称分子量截留为10,000－30,000道尔顿的膜进行本发明的超滤/渗滤(UF/DF)过程，来对此经过pH调节的阴离子交换总物料进行配制。处理之前，用渗滤缓冲液(0.02M组氨酸，0.2M精氨酸-HCl，pH6)平衡UF膜。
然后将来自阴离子交换的产物(阴离子交换总物料)加载于系统，通过第一超滤浓缩到中间浓度。然后将总物料渗滤(8X或渗滤体积)到其配方(0.02M组氨酸，0.2M精氨酸-HCl，pH6)。然后通过第二超滤将总物料浓缩到最终总体浓度>170g/L，然后通过0.22μm无菌滤器回收。整个UF/DF方法在约45℃的温度设定点进行。该温度的控制是利用进料阴离子交换总物料及渗滤缓冲液的温度控制，以及如本文所示用于UF/DF过程的带夹套回流容器来实现的。
进行UF/DF后，将所得的总物料稀释(即，调节(condition))到0.02M组氨酸，0.2M精氨酸-HCl，0.04%聚山梨醇20，pH 6中约150g/L的总体浓度(最终配方)。在调节步骤中，让总物料的温度回到环境温度。调节后，再次通过0.22微米无菌滤器回收配制完的总物料。
UF/DF系统可以用0.1N氢氧化钠再生，并用1.4%
Figure BDA00002226561900191
消毒。不使用时，系统可保存在0.1N氢氧化钠水溶液中。UF/DF膜在工作期(campaign)之间可保存在例如0.1%
Figure BDA00002226561900192
/20%甘油-水溶液中。
通用超滤/渗滤方法步骤
操作参数：进料流速0.5L/min/ft2。恒定截留液压力(例如，10psig)控制用于清洗和使用前平衡，而Cwall、恒定截留液压力或恒定TMP用于处理。
使用前平衡：使用前用经过清洗的Pellicon-2膜包(cassette membranes)进行下列准备，以确保膜被恰当地平衡。
  体积(L/ft2)   溶液(室温)   模式
  -   -   SPFO
  1.0   WFI   SPFO
  1.0   DF缓冲液   SPFO
  0.5   DF缓冲液   TRFO，10分钟
  -   -   SPFO
过程应用：对于从先进行的分离步骤例如Q-Sepharose色谱步骤获得的初始阴离子交换总物料(Q-pool)进行下列步骤，：
第一超滤(UF1)，达到从约5g/L到供渗滤的浓度(CDF)
渗滤(DF1)，四(4)个渗滤体积(DV)，使用DF缓冲液；
继续渗滤(DF2)，四(4)个渗滤体积(DV)，使用DF缓冲液；
第二超滤(UF2)，达到最终浓度(Cfinal)，及
可选的产品回收。
上述步骤通常在低压差循环下(混合)完成，例如15分钟。
使用后清洗：使用后，立即用下表所列的工序和条件清洗Pellicon-2膜包。
TFF中操作模式的定义
滤液开放单通(Single Pass with Filtrate Open,SPFO)截留液和滤液都被导向排出通道(drain)。滤液阀开放。
滤液开放全循环(Total Recycle with Filtrate Open,TRFO)截留液和滤液都被导向循环容器。滤液阀开放。
进料分批超滤(FB-UF)。截留液被导向循环槽，滤液被导向排出通道，进料的总物料被输送到循环槽中。
分批超滤(B-UF)。截留液被导向循环槽，滤液被导向排出通道。
渗滤(DF)截留液被导向循环槽，滤液导向排出通道。
dP指压差。
产物输送.超滤膜单位和循环槽对总物料槽开放。控制氮气覆盖层的压力。先使用循环泵，再使用手工蠕动泵来输送总物料。
进料输送.将进料的总物料泵入循环槽。
滤液封闭全循环(TRFC).截留液导向循环容器。滤液阀关闭。
“Q-总物料”(“Q-pool”)指由例如在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到、并已用缓冲液调节过的蛋白质总物料，又称“调节过的总物料”。
WFI指注射用水。
实施例
下面的实施例更加充分地描述上述公开内容的实施方式，并提供本文公开的多个方面的最佳实施模式。应当理解，这些实施例不对本发明的真实范围构成任何限制，而是为了示例目的而给出的。
实施例1
rhuMAb E25的高浓度配制
使用预试级(pilot scale)UF系统浓缩/配制rhuMAb E25(一种针对IgE的重组人单克隆抗体，美国专利6,172,213)。组装带有5.7平方英尺(sqft)、10,000道尔顿再生纤维素复合材料膜的Millipore Pelicon超滤/渗滤系统。该系统由膜固定器(membrane holder)、Waukeskaw 6型旋转叶片进料泵，1/2″316L不锈钢回流管道，以及回流容器组成。压力指示器/变送器(Anderson)位于膜固定器的入口(FEED)、出口(RETENTATE)和渗透液口(FILTRATE)处。流量计(Yokogawa ADMAG)位于膜固定器的入口(FEED)和渗透液口(FILTRATE)处。反压调节阀(Mikroseal)设置在膜固定器的出口处，以控制截留液压力并产生跨膜压力(TMP)。回流容器使用40升316L带不锈钢夹套的槽。该槽装有液高指示器(level indicator)、顶置搅拌器(top-mounted agitator)(Lightnin)、涡旋消除器及底阀(NovAseptic)。利用充入槽夹套中的温度受调节的乙二醇来控制温度。
本次运行中，进料流速设定为2.85L/min(0.5L/min/ft2)的恒定速率。在所有的使用前和使用后操作中，截留液压力控制设定为10psig的恒定值。超滤和渗滤中，系统使用Cwall控制模式来控制通过膜的通量，参见例如R.vanReis等,Constant Cwaii Ultrafiltration Process Control,J.of Membrane Science,130(1997),123-140。
该过程之前，以单通－排出模式冲洗掉系统储存溶液(0.1N NaOH)，首先用2L/ft2的纯化水(PW)，然后用1L/ft2的渗滤溶液(50mM组氨酸/pH6.0)来冲洗。冲洗后，使0.5L/ft2的渗滤缓冲液回流10min来平衡系统。检查回流的溶液的pH来确认平衡。然后降低槽中的液高到可测量的最小值，以最大地减少对进料的蛋白质总物料的稀释。从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为3.2g E25/L，体积为43.1L。蛋白质溶于25mM Tris缓冲液及约200mM NaCl的溶液中，pH调节为6.2。将蛋白质总物料输送到回流容器中以开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于环境温度(20－25℃)。
在该过程中，总物料在UF1模式下被浓缩到50g E25/L(约2.8L)。渗滤开始时回流容器的温度设定点升高到40℃。温度的升高和控制是通过使加温的乙二醇流过槽的外夹套实现的。然后用8个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲溶液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料。还使用升高的温度设定点40℃进行该阶段。该最终浓缩的目标是110g/L。无需降低进料流速即实现了该目标。然后，进行低压降混合(low pressure drop mixing)，其中控制进料泵以维持5－10psig的跨进料通道压降。从回流槽取样，测得最终总体浓度为约120g/L。表1总结了UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2的处理量(throughput)和通量结果。
表1
Figure BDA00002226561900221
Figure BDA00002226561900231
图2显示，在该过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF(20)和UF2(30)中观察或测量的进料流速(210)，槽温(220)，进料压差(230)，TMP(240)和滤液流速(250)等参数的经时过程值。
图3显示观察或测量的E25浓度(310)，通量(320)和TMP(240)的经时过程值。
图4显示37℃条件下观察或测量的UF1(410)和UF2(420)压力降对蛋白质浓度的经时过程值。
通过一系列步骤回收蛋白质总物料。首先利用旋转叶片进料泵将回流槽中的蛋白质总物料从槽抽出并经过Millipac 200,0.22微米灭菌级滤器。然后，从截留液管线(retentate line)上的最高点以5psig的氮气进行吹干(blowdown)，从管道和膜单元排出蛋白质溶液。最后一个阶段是吹干槽和进料管线，同样使用5psig的氮气。
认为产品收率与在环境温度进行的实施例1相比有改善，因为超滤、渗滤或回收步骤的一步或多步中所使用的提高的温度降低了粘滞效应。例如，当产品回收过程中关闭温度控制时，系统在操作过程中缓慢冷却，对从膜单元回收造成困难。或者，可以先从膜固定器进行回收，再从回流槽进行回收。
为了确定回收中损失的质量，将1.74L DF缓冲液加入系统，回流约5分钟，并用上述同样的工序回收。分析该回收的总物料和其它总物料的蛋白浓度。结果总结于表2。
表2
Figure BDA00002226561900232
处理结束后，用0.1N NaOH，1L/ft2单通冲洗，然后0.5L/ft2全回流30min来再生膜。然后用1L/ft2PW(纯化水)冲洗。然后用300ppm
Figure BDA00002226561900233
全回流30min。用1L/ft2PW再次冲洗系统，最后用0.1N NaOH回流15min并储存。回收的总物料稀释到80g E25/L并调节为50mM组氨酸/150mM海藻糖/0.02%聚山梨醇(polysorbate)20/pH 6.0的最终配方。对进料的Q-总物料和最终回收的总物料通过大小排阻色谱(SEC)分析产品质量。数据总结于表3。
表3
Figure BDA00002226561900241
比较例2
环境温度条件下高浓度配制rhuMAb E25
完成实施例1，但有下述的不同。该过程之前，以单通－排出模式冲洗掉系统储存溶液(0.1N NaOH)，首先用2L/ft2的纯化水(PW)，然后用1L/ft2的渗滤溶液(20mM组氨酸/pH6.0)来冲洗。冲洗后，使0.5L/ft2的渗滤缓冲液回流10min来平衡系统。检查回流的溶液的pH来确认平衡。然后降低槽中的液高到可测量的最小值，以最大地减少对进料的蛋白质总物料的稀释。
从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为3.3gE25/L，体积为33.3L。蛋白质溶于25mM Tris缓冲液及约200mM NaCl的溶液中，pH调节为6.2。将蛋白质总物料输送到回流容器中以开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于环境温度(20－25℃)。在该过程中，总物料在UF1模式下被浓缩到50g E25/L(约2.2L)。然后用约8个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲溶液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。还在环境温度进行渗滤。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料。该最终浓缩的目标是110g/L。但是，由于跨进料通道的压降高，未能达到该浓度。为了尝试达到该浓度，进料流速降为1.4L/min，总体浓度为80g E25/L，因为跨进料通道的压降达到了50psig。UF2持续进行，直到再次达到50psig的高压降，过程被停止。然后尝试低压降混合，利用进料泵来维持5psig的跨进料通道压降。但这也由于蛋白质溶液的粘性而难以实现，因为旋转叶片泵达到了过压。从回流槽取样，测得最终总体浓度为约104g/L。表4总结了UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2阶段的处理量和通量结果。
表4
Figure BDA00002226561900251
图5显示，在该过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF(20)和UF2(30)中观察或测量的进料流速(210)，槽温(220)，进料压差(230)，TMP(240)和滤液流速(250)等参数的经时过程值。
图6显示观察或测量的E25浓度(310)，通量(320)和TMP(240)的经时过程值。
图7显示24℃条件下观察或测量的UF1(410)和UF2(420)压力降对蛋白质浓度的经时过程值。
通过分步回收蛋白质总物料。首先利用旋转叶片进料泵将回流槽中的蛋白质总物料从槽中抽出并经过Millipac 200,0.22微米灭菌级滤器。然后，从截留液管线上的最高点处以5psig的氮气进行吹干，从管道和膜单元排出蛋白质溶液。由于蛋白质溶液的粘性，这样获得的蛋白回收率很低。最后一个阶段是吹干槽和进料管线，同样使用5psig的氮气。
为了确定回收中损失的质量，将1.85L DF缓冲液加入系统，回流约5分钟，并用实施例1的工序回收。分析回收的总物料和其它总物料的蛋白浓度。结果总结于表5。
表5
Figure BDA00002226561900252
过程结束后，用0.1N NaOH，1L/ft2单通冲洗，然后0.5L/ft2全回流30min来再生膜。然后用1L/ft2PW冲洗。然后用300ppm
Figure BDA00002226561900253
全回流30min。用1L/ft2PW再次冲洗系统，最后用0.1N NaOH回流15min并储存。回收的总物料稀释到80g E25/L并调节为20mM组氨酸/250mM蔗糖/0.02%聚山梨醇20/pH 6.0的最终配方。对进料的Q-总物料和最终回收的总物料通过大小排阻色谱(SEC)分析产品质量。数据总结于表6。
表6
Figure BDA00002226561900261
实施例3用初始进料-分批模式高浓度配制rhuMAb E26
重复实施例1，并作下述的改变。浓缩/配制物是rhuMAb E26(一种针对IgE的重组人单克隆抗体)。从本实施例得到的产品被用于毒理分析。组装带有11.4平方英尺，30,000道尔顿的再生纤维素复合材料膜的Millipore Pelicon超滤/渗滤系统。流速设定为5.0L/min(0.44L/min/ft2)的恒定流速。超滤和渗滤操作过程中截留液压力保持在约6－8psig之间。从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为6.7g E26/L，体积为59.3L。
由于进料的总物料大于回流容器，以进料分批模式开始UF1过程。在该模式下，以与滤液通过TFF膜排出时大致相同的速率将Q-总物料加入回流容器。当剩余的Q-总物料被转移到回流容器后，以分批模式继续进行UF1过程。在UF1中总物料被浓缩到50g E26/L(约7.9L)。渗滤开始时回流容器的温度设定点升高到40℃。温度的升高和控制是通过使加温的乙二醇流过槽的外夹套实现的。然后用8个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲溶液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度为109g E26/L(3.6L)。还使用升高的温度设定点40℃进行该阶段。然后，进行低压降混合，其中控制进料泵以维持5－10psig的跨进料通道压降。表7总结了UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2的处理量和通量结果。
表7
  过程阶段   归一化处理量   归一化通量
  (g/ft2/hr)   (LMH/psig)
  UF1   26.1   3.71
  DF   19.2   2.34
  UF2   174.2   1.80
图8显示进料流速(210)，槽温(220)，进料压差(230)，TMP(240)和滤液流速(250)的观察或测量的经时过程值。
图9显示E26浓度(910)，通量(920)和TMP(940)的观察或测量的经时过程值。
图10显示观察或测量的UF1(1010)和UF2(1020)压力降对蛋白质浓度的经时过程值。
在即将回收产品之前，分析10mL的样品以检测和滴定生物负荷。通常的拒绝限(reject limit)为1,000集落形成单位(CFU)每mL。本测定的结果为1.8CFU/mL，该值在这一步是合适的，并远低于拒绝限。为了确定回收中损失的质量，将908.1mL DF缓冲液加入系统，回流约5分钟，并用上述同样的工序回收。分析该回收的总物料和其它总物料的蛋白浓度。结果总结于表8。
表8
Figure BDA00002226561900271
回收的总物料稀释到80g E25/L并调节为50mM组氨酸/150mM海藻糖/0.02%聚山梨醇20/pH 6.0的最终配方。对进料的Q-总物料、UF1后的总截留液，DF后的总截留液，以及最终回收的总物料通过大小排阻色谱(SEC)分析产品质量。数据总结于表9。
表9
  总物料   SEC结果(%单体)
  Q-总物料   99.8
  UF1结束后   99.8
  UF2结束后   99.8
  最终的总物料   99.8
实施例4
高浓度配制rhuMAb E26用于毒理分析-比较10kD和30kD
重复实施例3，并作如下改变。使用两套预试级UF系统来浓缩/配制rhuMAb E26。组装两套带有11.4平方英尺的再生纤维素复合材料膜的Millipore Pelicon超滤/渗滤系统，一套孔径为10,000道尔顿，另一套孔径为30,000道尔顿。截留液压力保持为约6－9psig。
10kD过程
从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为5.85g E26/L，体积为62.4L。在UF1中，总物料被浓缩到50g E26/L(约7.3L)。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度为107.5gE26/L(3.4L)。表10总结了UF1，DF，及UF2的处理量和通量结果。
表10
Figure BDA00002226561900281
为了确定回收中损失的质量，将987mL DF缓冲液加入系统，回流约5分钟，并用上面描述的工序回收。分析回收的总物料和其它总物料的蛋白浓度。结果总结于表11。
表11
Figure BDA00002226561900282
图11显示，在10kD过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF(20)，UF2(30)，和低压差(40)中观察或测量的进料流速(210)，槽温(220)，进料压差(230)，TMP(240)和滤液流速(250)等参数的经时过程值。
图12显示在10kD过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF(20)，UF2(30)，和低压差(40)中观察或测量的E26浓度(1210)，通量(1220)和TMP(1240)的经时过程值。
图13显示10kD过程的观察或测量的UF1(1310)和UF2(1320)压降对蛋白质浓度的经时过程值。
30kD过程
从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为5.85g E26/L，体积为64.5L。在UF1中，初始的总物料被浓缩到50g E26/L(约7.5L)。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度为117.5gE26/L(3.2L)。表12总结了UF1，DF，及UF2的处理量和通量结果。
表12
Figure BDA00002226561900291
为了确定回收中损失的质量，将918mL DF缓冲液加入系统，回流约5分钟，并用上面描述的工序回收。回收的总物料稀释到80g E26/L并调节为50mM组氨酸/150mM海藻糖/0.02%聚山梨醇20/pH 6.0的最终配方。结果总结于表13。
表13
Figure BDA00002226561900292
图14显示，在30kD过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF(20)，UF2(30)，和低压差(40)中观察或测量的进料流速(210)，槽温(220)，进料压差(230)，TMP(240)和滤液流速(250)的经时过程值。
图15显示在30kD过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF(20)，UF2(30)，和低压差(40)中观察或测量的E26浓度(1510)，通量(1520)和TMP(1540)的经时过程值。
图16显示30kD过程的观察或测量的UF1(1610)和UF2(1620)压降对蛋白质浓度的经时过程值。
实施例5
液体rhuMAb E25规模扩大
重复实施例1，并作如下改变。
使用制备级UF系统来浓缩/配制液体rhuMAb E25(一种针对IgE的重组人单克隆抗体)。该产品可用于治疗用途和生物等效性(bio-equivalency)测试。组装带有226平方英尺、30,000道尔顿孔径的再生纤维素复合材料膜的Millipore Pelicon超滤/渗滤系统。每套系统由膜固定器、Viking S3S旋转叶片进料泵、1/2″316L不锈钢回流管道，以及250-L回流容器组成。
回流容器使用一个250升316L带不锈钢夹套的槽。利用充入该槽夹套中的温度受调节的乙二醇来控制该槽的温度。分别通过充蒸汽的热交换器(steam-fed heat exchanger)或供给冷乙二醇来升高或降低充入槽夹套的乙二醇的温度。
对于本次运行，进料流速设定为114L/min(0.5L/min/ft2)的恒定速率。在另外的槽中制备渗滤缓冲液(20mM组氨酸/200mM精氨酸氯化物/pH6.0)。在过程之前将该缓冲液的温度置于45℃。这使得在整个过程中能够精确地控制温度。
该过程之前，以单通－排出模式冲洗掉系统储存溶液(0.1N NaOH)，首先用1L/ft2的注射用水(WFI)，然后用1L/ft2的渗滤溶液来冲洗。冲洗后，使0.5L/ft2的渗滤缓冲液回流10min来平衡系统。检查回流的溶液的pH来确认平衡。
从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为5.2562g E25/L，体积为1,141L。蛋白质溶于25mM Tris缓冲液及约200mMNaCl的溶液中，pH调节到6.2。即将开始运行前，将该总物料的温度设定点设为45℃。将蛋白质总物料通过0.22微米灭菌级滤器输送到回流容器中达到槽中约200L的水平来开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于(40－50℃)。由于进料的总物料大于回流容器，以进料分批模式开始UF1过程。在该模式下，以与滤液通过TFF膜排出大致相同的速率将Q-总物料加入回流容器。当剩余的Q-总物料被转移到回流容器后，以分批模式继续进行UF1过程。在UF1中总物料被浓缩到30g E25/L(约200L)。然后用8个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤过程中温度保持在40℃-50℃。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲溶液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度设定点>170g E25/L(35L)。还使用升高的温度设定点45℃+/-5℃进行UF2模式阶段。然后，进行低压降混合，其中控制进料泵以维持5－10psig的跨进料通道压降。表7总结了UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2的处理量和通量结果。在回收前取样进行光谱扫描(spec scan)以确认浓度。该样品的浓度为191g E25/L，总物料体积为31.9L。表14总结了UF1，DF(DF1+DF2)，及UF2阶段的处理量和通量结果。
表14
Figure BDA00002226561900311
即将回收产品之前，取30mL样品用于检测和滴定生物负荷。结果为<0.13CFU/mL。通过一系列步骤回收蛋白质总物料。首先利用添加到截留液管线的5L DF缓冲液以单通模式将产物从膜排出。使产物先后滤过7.4ft2，0.22微米灭菌级保护滤器和2ft2，0.22微米灭菌级终滤器，进入回收槽。然后用旋转叶片进料泵将回收槽中的总物料从槽中抽出。然后用5psig的氮气吹干来从槽和进料管线排出残余的蛋白质溶液。最后一个阶段是吹干膜单元，此时其主要含有初次产物排出带来的DF缓冲液。该阶段也是使用在截留液管线最高点施加的5psig氮气。回收的总物料先用DF缓冲液稀释到约153g E25/L。最后，将总物料调节为20mM组氨酸/200mM精氨酸-HCl/0.04%聚山梨醇20/pH6.0的最终配方。分别分析回收的总物料、稀释的总物料和调节过的总物料(Q-总物料)的蛋白质浓度。结果总结于表15。
表15
Figure BDA00002226561900321
图17显示在该阶段的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF1(20)，DF2(25)，UF2(30)，和低压差(50)中的进料流速(210)，槽温(220)，进料压差(230)，TMP(240)和滤液流速(250)等参数的经时过程值。
实施例6
液体rhuMAb E25制备
重复实施例5，并进行下列改变。使用制备级UF系统来浓缩/配制液体rhuMAb E25(E25，一种针对IgE的重组人单克隆抗体)。组装带有226平方英尺、30,000道尔顿孔径的再生纤维素复合材料膜的Millipore Pelicon超滤/渗滤系统。每套系统由膜固定器、Viking S3S旋转叶片进料泵、1/2″316L不锈钢回流管道，以及250-L回流容器组成。回流容器使用一个250升316L带不锈钢夹套的槽。进料流速设定为114L/min(0.5L/min/ft2)的恒定速率。在所有的使用前和使用后操作中，截留液压力控制设定为10psig的恒定值。超滤和渗滤中，系统使用Cwall控制模式来控制通过膜的通量。在另外的槽中制备渗滤缓冲液(20mM组氨酸/200mM精氨酸氯化物/pH6.0)。在过程之前将该缓冲液的温度置于45℃。这使得在整个过程中能够精确地控制温度。从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为5.5438gE25/L，体积为1,082L。蛋白质溶于25mM Tris缓冲液及约200mM NaCl的溶液中，pH调节到6.2。即将开始运行前，将该总物料的温度设定点设为45℃。将蛋白质总物料通过0.22微米灭菌级滤器输送到回流容器中达到槽中约200L的水平来开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于环境(40－50℃)。由于进料的总物料大于回流容器，以进料分批模式开始UF1过程。在该模式下，以与滤液通过TFF膜排出大致相同的速率将Q-总物料加入回流容器。在该模式下，以与滤液通过TFF膜排出大致相同的速率将Q-总物料加入回流容器。当剩余的Q-总物料被转移到回流容器后，以分批模式继续进行UF1过程。在UF1中总物料被浓缩到30g E25/L(约200L)。然后用8个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤过程中温度保持在40℃-50℃。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲溶液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度设定点>170g E25/L(35L)。还使用升高的温度设定点45℃+/-5℃进行该阶段。然后，进行低压降混合，其中控制进料泵以维持5－10psig的跨进料通道压降。在回收前取样进行光谱扫描以确认浓度。经时过程参数图与上述图17观察和总结的结果相似。
表14
Figure BDA00002226561900331
即将回收产品之前，取30mL样品用于检测和滴定生物负荷。该测试的结果低于检测限(<0.13CFU/mL)。
通过一系列步骤回收蛋白质总物料。首先利用添加到截留液管线的5LDF缓冲液以单通模式将产物从膜排出。使产物先后滤过7.4ft2，0.22微米灭菌级保护滤器和2ft2，0.22微米灭菌级终滤器，进入回收槽。然后用旋转叶片进料泵将回收槽中的总物料从槽中抽出。然后用5psig的氮气吹干来从槽和进料管线排出残余的蛋白质溶液。最后一个阶段是吹干膜单元，此时其主要含有初次产物排出带来的DF缓冲液。该阶段也是使用在截留液管线最高点施加的5psig氮气。回收的总物料先用DF缓冲液稀释到约153g E25/L。最后，将总物料调节为20mM组氨酸/200mM精氨酸-HCl/0.04%聚山梨醇20/pH6.0的最终配方。分别分析回收的总物料、稀释的总物料和调节过的总物料(Q-总物料)的蛋白质浓度。结果总结于表15。过程结束后，如上所述再生膜。
表15
  体积(L)   浓度   质量(g)  产率或{损
  (g/L)   失}(%)
  Q-总物料   1,082   5.5438   5,998.4   100
  回收的总物料   34.95   167.08   5,839.8   97.4
  稀释的总物料   38.2   152.14   5,810.3   96.7
实施例7
升高的温度对产品质量的影响
将组氨酸缓冲液和Q缓冲液中的30g/L和150g/L的E25样品保持在不同的温度下24小时。取样进行浊度测量和SEC分析。Q缓冲液中30g/L的E25的浊度对时间的结果如图18所示。图19显示23℃、40℃、50℃、60℃和70℃的温度条件下经时观察的E25(150g/L于50mM组氨酸缓冲液，pH6.0中)的可溶性聚集体的量。这些温度中的每个温度处的四个时段(0小时，4小时，7.5小时，24小时)从左至由表示为一组四个竖条，如1810和1910。在60℃，24小时后溶液浊度基本不变。在70℃以下没有发现显著的E25可溶性聚集体，说明这些产物样品在高达至少60℃时，经过至少24小时仍基本稳定。
实施例8
升高的温度对生物负荷的影响
用两种测试生物：一种革兰氏阳性菌株(金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus))和一种革兰氏阴性菌株(绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis))在精氨酸和组氨酸缓冲液中30g/L的E25样品。在1.5小时后和6小时后取样。图20和21所示的条形图表明两种测试生物均随温度增加而减少。每个观察的时间段的3个温度间隔(25℃，40℃，50℃小时的温度)表示为从左至右的一组3个竖条，如图20和21中的2010，2110。所示的接种在蛋白浓度为30g/L的精氨酸缓冲液中进行。
实施例9
升高的温度对过程通量的影响
评价0.2M精氨酸，25mM组氨酸，pH6.0的缓冲液10g/L的E25样品对于作为跨膜压力(TMP)函数的通量的影响。图22显示，在UF/DF操作中升高系统温度同样增加了过程通量。在不同的总体浓度和三种不同的温度条件下：23℃(2210)、40℃(2220)和46℃(2230)进行了通量变化(flux excursions)。传质系数和滤液通量增加到约2到约3倍，显著地缩短了过程时间。
实施例10
高浓度配制rhuMAB抗-CD20(“2H7”)
使用预试级UF系统浓缩和配制rhuMAb抗-CD20(2H7；一种重组人单克隆抗体)。重复实施例1并作如下改变。组装带有17.5平方英尺、30,000道尔顿孔径的再生纤维素复合材料膜的Millipore Pelicon超滤/渗滤系统。该系统由膜固定器、Viking S1L旋转叶片进料泵，1/2″316L不锈钢回流管道，以及40-L回流容器组成。反压调节阀为H.D.Baumann,Inc。利用电热交换器、冷乙二醇补给或兼用二者，根据需要来上调或下调槽夹套中充入的乙二醇的温度。
本次运行中，进料流速设定为8.5L/min(约0.5L/min/ft2)的恒定速率。图23显示在该过程的不同阶段或模式，包括UF1(10)，DF1(20)和UF2(30)中，下面各参数的值的经时变化趋势：进料流速(210)，标度为0到20；pH(212)，标度为2到12；滤液流速(250)，标度为0到5；循环槽液高(2320)，标度为0到45；以及截留液压差(2350)，标度为0到100。
在超滤和渗滤操作中，系统先使用恒定截留液压力，然后用恒定进料/截留液Δ压力的控制模式来控制通过膜的通量。在另外的槽中制备渗滤缓冲液(30mM乙酸钠/pH4.9)。为了在整个过程中精确地控制温度，在过程之前将该缓冲液的温度置于45℃。该过程之前，以单通－排出模式冲洗掉系统储存溶液(0.1N NaOH)，首先用1L/ft2的注射用水(WFI)，然后用1L/ft2的渗滤溶液来冲洗。冲洗后，使0.5L/ft2的渗滤缓冲液回流10min来平衡系统。检查回流的溶液的pH来确认平衡。
从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为2.31g 2H7/L，体积为356L。蛋白质溶于6mM HEPES不含酸/19mM HEPES钠盐及25mM乙酸钠的溶液中，该溶液已用0.5M乙酸调节到pH 5.3。即将开始运行前，将该总物料的温度设定点设为45℃。将蛋白质总物料通过0.22微米灭菌级滤器输送到回流容器中达到槽中约40L的水平来开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于40－50℃。
由于进料的总物料大于回流容器，以进料分批模式开始UF1过程(见图23)。在该模式下，以与滤液通过TFF膜排出大致相同的速率将Q-总物料加入回流容器。当剩余的Q-总物料被转移到回流容器后，以分批模式继续进行UF1过程。在UF1中总物料被浓缩到50g 2H7/L(约16L)。然后用10个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤过程中温度保持在40℃-50℃。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度设定点>190g 2H7/L(4.3L)。见图23，该阶段结束后引入50psig的恒定压差控制。还使用升高的温度设定点45℃+/-5℃进行该阶段。然后，进行低压降混合，其中控制进料泵以维持20psig的跨进料通道压降。在回收之前取样并进行密度测量来确认浓度。该样品的浓度为189g2H7/L。表16总结了处理量和通量结果。
表16
Figure BDA00002226561900361
通过一系列步骤回收蛋白质总物料。首先利用添加到截留液管线的0.2L DF缓冲液以单通模式将产物从膜排出。使产物滤过0.22微米灭菌级终滤器进入回收槽。然后用旋转叶片进料泵将回流槽中的总物料从槽中抽出。然后用5psig的氮气吹干来从槽和进料管线排出残余的蛋白质溶液。最后一个阶段是吹干膜单元，此时其主要含有初次产物排出带来的DF缓冲液。该阶段也是使用在截留液管线最高点施加的5psig氮气。
如果需要，回收的总物料先用稀释溶液(30mM乙酸钠，pH5.3)稀释到约175g 2H7/L。最后，将总物料稀释到150g 2H7/L的目标浓度并利用7X调节缓冲液(30mM乙酸钠、49%海藻糖、0.21%聚山梨醇20，pH5.3)调节为30mM乙酸钠、7%海藻糖、0.03%聚山梨醇20，pH 5的最终配方。
分析回收的总物料、稀释的总物料和调节过的总物料的蛋白质浓度。结果示于表17。
表17
Figure BDA00002226561900371
注：产率包括由于取样造成的损失。回收总物料体积和浓度包括缓冲液排出带来的添加。
过程结束后，用0.1N NaOH，1L/ft2单通冲洗，然后0.5L/ft2全回流30min来再生膜。然后用1L/ft2PW冲洗。然后用0.5L/ft2的1.4%Minncare溶液全回流30min。最后用0.1N NaOH回流15min并储存。
实施例11
高浓度配制rhuMAB抗-CD20
在GMP生产车间中，使用预试级UF系统浓缩和配制rhuMAb抗-CD20(2H7)用于人体I期临床研究。重复实施例10并作下述改变。
从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为3.729g 2H7/L，体积为262L。蛋白质溶于6mM HEPES不含酸/19mM HEPES钠盐及25mM乙酸钠的溶液中，该溶液已用0.5M乙酸调节到pH 5.3。即将开始运行前，将该总物料的温度设定点设为45℃。将蛋白质总物料通过0.22微米灭菌级滤器输送到回流容器中达到槽中约40L的水平来开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于40－50℃。
在UF1中总物料被浓缩到50g 2H7/L(约20L)。图24显示在该过程中，下面各参数的值的经时变化趋势：循环槽液高(210)，标度为0.713963到295.989；截留液压差(2420)，标度为-0.237899到98.6629；进料流速(250)，标度为-0.356981到147.994；及滤液流速(2450)，标度为-0.118994到49.3315。然后用10个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤过程中温度保持在40℃-50℃。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度设定点190g 2H7/L(5.25L)。注意图23中，该阶段结束后引入40psig的恒定压差控制。还使用升高的温度设定点45℃+/-5℃进行该阶段。然后，进行低压降混合，其中控制进料泵以维持20psig的跨进料通道压降。在回收之前取样并进行密度测量来确认浓度。该样品的浓度为194g 2H7/L。表18总结了处理量和通量结果。
表18
Figure BDA00002226561900381
即将回收产品之前，取30mL样品用于检测和滴定生物负荷。结果为阴性(即，<0.13CFU/mL)。通过实施例10的一系列步骤回收蛋白质总物料。然后分析回收的总物料、稀释的总物料和调节过的总物料的蛋白质浓度。结果示于表19。如实施例10所述那样再生膜。
表19
Figure BDA00002226561900382
实施例12
GMP高浓度配制rhuMAb抗-CD20
重复实施例11并作下述改变。从在先进行的Q-Sepharose色谱步骤得到的蛋白质总物料经测定为5.106g 2H7/L，体积为196L。蛋白质溶于6mMHEPES不含酸/19mM HEPES钠盐及25mM乙酸钠的溶液中，该溶液已用0.5M乙酸调节到pH 5.3。即将开始运行前，将该总物料的温度设定点设为45℃。将蛋白质总物料通过0.22微米灭菌级滤器输送到回流容器中达到槽中约40L的水平来开始运行。在该容器中通过顶置叶轮搅拌总物料，温度保持于40-50℃。
在UF1中总物料被浓缩到50g 2H7/L(约20L)。图25显示在该过程中，下面各参数的值的经时变化趋势：循环槽液高(210)，标度为0到300；截留液压差(2520)，标度为0到100；进料流速(250)，标度为0到150；及滤液流速(2550)，标度为0到50。然后用10个渗滤体积的渗滤缓冲液渗滤该总物料。渗滤过程中温度保持在40℃-50℃。渗滤在恒定体积下进行，这是通过使输送到回流槽中的缓冲液的流速与从系统移出的滤液的流速一致而实现的。渗滤结束后，进一步在UF2模式下浓缩总物料到最终浓度设定点190g 2H7/L(5.26L)，且仍在该阶段正好结束时使用恒定压差控制(见图25)。还使用升高的温度设定点45℃+/-5℃进行该阶段。然后，进行低压降混合，其中控制进料泵以维持20psig的跨进料通道压降。在回收之前取样并进行密度测量来确认浓度。该样品的浓度为191g 2H7/L。表20总结了处理量和通量结果。
表20
Figure BDA00002226561900391
即将回收产品之前，取30mL样品用于检测和滴定生物负荷。结果为阴性(即，<0.13CFU/mL)。通过实施例10的一系列步骤回收蛋白质总物料。然后分析回收的总物料、稀释的总物料和调节过的总物料的蛋白质浓度。结果示于表21。如实施例11所述那样再生膜。
表21
将所有出版物、专利和专利文件的全文通过引用并入本文，如同其分别通过引用并入本文那样。援引多种具体和优选的实施方案和技术对本发明进行了描述。但是应当理解，在不超出本发明的精神和范围的同时，可以作出很多的变化和修改。

Claims (10)

1.制备高度浓缩的抗体组合物的方法，包括：
对第一抗体制品进行第一超滤，以提供第二抗体制品；
对第二抗体制品进行渗滤，以提供经渗滤的中间抗体制品；及
对经渗滤的中间抗体制品进行第二渗滤，以提供第三抗体制品；
其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在约30℃到约50℃条件下完成。
2.权利要求1的方法，其中所述第一抗体制品的抗体浓度为约0.1到约10克每升。
3.权利要求1的方法，其中所述第二抗体制品的抗体浓度为约10到约50克每升。
4.权利要求1的方法，其中所述第三抗体制品的抗体浓度为约50到约250克每升。
5.权利要求1的方法，其中所述抗体制品包含抗-IgE抗体。
6.权利要求1的方法，其中所述方法经过约1到10小时完成。
7.权利要求1的方法，其中所述第一和第二超滤使用标称孔径为约5到约50千道尔顿的超滤膜完成。
8.权利要求1的方法，其中所述渗滤在恒定体积，恒定浓度，或恒定体积且恒定浓度条件下实现缓冲液交换。
9.权利要求1的方法，其中所述第三抗体制品的产率高于约70重量%，是基于第一抗体制品中抗体的重量。
10.浓缩蛋白质的方法，包括：
对第一蛋白质混合物进行第一超滤，以提供第二蛋白质混合物；
对第二蛋白质混合物进行渗滤，以提供经渗滤的蛋白质混合物；及
对经渗滤的蛋白质混合物进行第二渗滤，以提供第三蛋白质混合物；其中所述第一超滤，第二超滤和渗滤中的一项或多项在约30℃到约50℃条件下完成。
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