PT1786830E - Processo para a concentração de anticorpos e produtos terapêuticos dos mesmos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

PROCESSO PARA A CONCENTRAÇÃO DE ANTICORPOS E PRODUTOS TERAPÊUTICOS DOS MESMOS

Antecedentes Métodos para isolar, purificar e concentrar materiais biológicos são conhecidos e incluem, por exemplo, a cromatografia, ultrafiltração e liofilização, veja-se, em geral, R. Hatti-Kaul et al. , "Downstream Processing in Biotechnology," em Basic Biotechnology, Cap. 9, páginas 187-211, 2a ed., Cambridge University Press (2001). Os processos para fazer preparações concentradas de anticorpo monoclonal para a administração à seres humanos são conhecidos, veja-se, por exemplo, Patente US N° 6.252.055, que utiliza a ultrafiltração e que recircula o filtrado resultante.

Alguns desafios associados aos métodos de concentração de anticorpos disponíveis incluem, por exemplo, fluxos baixos, tempos longos de processo, áreas de membrana grandes, rendimento de recuperação mecânica e perdas, intervenção ou manipulação intensiva do operador e taxas de transferência de massa baixas, ineficiências energéticas e limites de pressão hidráulica sobre o equipamento de concentração. Estes e outros desafios podem contribuir a um custo total elevado de fabrico e finalmente a um alto custo aos consumidores de fármaco terapêutico. Há uma necessidade de melhorar os processos para a preparação de formulações altamente concentradas de proteínas, tais como preparações líquidas de anticorpos e produtos terapêuticos das mesmas.

Sumário

Em termos gerais, a presente divulgação refere-se, em geral, aos processos para concentrar proteínas, tais como processos para concentrar uma preparação de anticorpos, formulações farmacêuticas que contêm tal preparação e a utilização destas na terapêutica humana ou animal.

Nas formas de realização, a presente divulgação proporciona processos para preparação de proteínas altamente concentradas, tais como preparações de anticorpo de acordo com a invenção conforme definido nas reivindicações; e produtos terapêuticos preparados pelo processo, tal como produtos de anticorpos terapêuticos. Consequentemente, a presente divulgação proporciona um processo para concentração de proteínas que compreende, de acordo com invenção: uma primeira ultrafiltração de uma primeira preparação de anticorpo para proporcionar uma segunda preparação de anticorpo; uma diafiltração da segunda preparação de anticorpo para proporcionar uma preparação de anticorpos intermediária diafiltrada; e uma segunda ultrafiltração da preparação de anticorpos intermediária diafiltrada para proporcionar uma terceira preparação de anticorpos, em que uma ou mais de a primeira ultrafiltração, a segunda ultrafiltração, e a diafiltração são conseguidas a temperaturas elevadas, por exemplo, de cerca de 30 °C a cerca de 50 °C, e conforme definido nas reivindicações. A presente divulgação proporciona também, nas formas de realização da invenção, um processo para concentração de proteínas que compreende: uma primeira ultrafiltração de uma primeira mistura de proteínas para proporcionar uma segunda mistura de proteínas; uma diafiltração da segunda mistura de proteínas para proporcionar uma mistura de proteínas diafiltrada; e uma segunda ultrafiltração da mistura de proteínas diafiltrada para proporcionar uma terceira mistura de proteínas, de modo que, em que uma ou mais de a primeira ultrafiltração, a diafiltração, e a segunda ultrafiltração são conseguidas, por exemplo, cerca de 45 °C, conforme definido nas reivindicações. A presente divulgação também se refere a uma composição de anticorpos altamente concentrada preparada pelos processos acima.

Breve Descrição das Figuras A FIG. 1 ilustra um aparelho para realizar o processo preparativo, nas formas de realização da presente divulgação.

As FIGS. 2 a 17 ilustram vários valores de processo mensurados ou observados de várias fases ou modos de processo, nas formas de realização da presente divulgação.

As FIGS. 18 e 19 ilustram o efeito da temperatura elevada na qualidade do produto, nas formas de realização da presente divulgação.

As FIGS. 20 e 21 ilustram o efeito da temperatura elevada sobre o controlo de biocarga, nas formas de realização da presente divulgação. A FIG. 22 ilustra o efeito da temperatura elevada no processo de fluxo e no processo de tempo, nas formas de realização da presente divulgação.

As FIGS. 23 a 25 ilustram vários valores de processo mensurados ou observados de várias fases ou do processo de aumento de escala, nas formas de realização da presente divulgação.

Descrição Pormenorizada

As várias formas de realização da presente revelada no presente documento serão descritas em pormenores com referência aos desenhos, se existirem. A referência às várias formas de realização não limita o âmbito da invenção, que é limitada apenas pelo âmbito das reivindicações anexadas ao presente documento. Adicionalmente, qualquer exemplo determinado nesta memória descritiva não tem a intenção de ser limitativo e meramente determina algumas de muitas formas de realização possíveis para a invenção reivindicada.

Os seguintes são usados, a menos que descrito de outra maneira: "Ultrafiltrar", "ultrafiltração", "ultrafiltrado," "UF," e termos similares referem-se a, por exemplo, discriminar entre as moléculas na mistura, primeiramente com base no tamanho e na forma molecular, e realizar a separação de moléculas diferentes ou realizar a concentração de moléculas similares utilizando membranas sintéticas semipermeáveis, com propriedades físicas e químicas apropriadas. "Diafiltrar," "diafiltração," "diafiltrado," "diafiltrando," "DF," e termos similares referem-se a, por exemplo, remover, substituir ou diminuir a concentração de sais ou de solventes das soluções ou misturas que contêm proteínas, péptidos, ácidos nucleicos ou outras biomoléculas utilizando-se uma membrana de ultrafiltração. "Pressão Transmembrana" ou "PTM" referem-se à pressão média aplicada da alimentação ao lado do filtrado da membrana calculada como PTM [bar] = [ (PF + PR )/2] - Pf onde PF é a pressão de alimentação, o PR é a retropressão e Pf é a pressão do filtrado. "Filtração de fluxo tangencial," "filtração de fluxo cruzado," "TFF," como termos referem-se a uma modalidade de filtração em que a solução contendo o soluto passa tangencialmente através da membrana de UF e sais ou solutos de baixo peso molecular passam completamente com a aplicação de pressão. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo e cobre especificamente anticorpos monoclonais intatos, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) formados a partir de pelo menos dois anticorpos intatos, e fragmento de anticorpos contanto que eles exibam atividade biológica desejada. Um anticorpo é uma proteína gerada pelo sistema imune que é capaz de reconhecer e se ligar a um antigénio especifico. Descrito nos termos de sua estrutura, um anticorpo é uma proteína em forma de Y que consiste em quatro cadeias de aminoácido, duas cadeias leves e duas cadeias pesadas. Num modelo suficientemente simplificado para esta apelação, cada anticorpo tem primeiramente duas regiões: uma região variável e uma região constante. A região variável, situada nas extremidades dos braços do Y, liga-se e interage com o antigénio alvo. Esta região variável inclui uma região determinante de complementaridade (CDR) que reconhece e liga o anticorpo a um local de ligação especifico num antigénio particular. A região constante, situada na cauda do Y, é reconhecida pelo sistema imune e interage com este (Janeway, C, Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5a Ed, Garland Publishing, Nova Iorque) . Um antigénio do alvo tem, em geral, numerosos locais de ligação, chamados também epítopos, reconhecidos por CDRs em anticorpos múltiplos. Cada anticorpo que se liga especif icamente a um epítopo diferente tem uma estrutura diferente. Assim, um antigénio pode ter mais de um anticorpo correspondente. A unidade básica do anticorpo de 4 cadeias é uma glicoproteina heterotetramérica composta de duas cadeias leves (1) idênticas e de duas cadeias pesadas (H) idênticas (um anticorpo IgM consiste em 5 das unidades básicas heterotetraméricas juntamente com um polipéptido adicional denominado cadeia J, e contém consequentemente 10 locais de ligação de antigénio, enquanto os anticorpos IgA segregados podem polimerizar para formar polivalentes reunidos que contém de 2 a 5 unidades básicas de 4 cadeias juntamente com a cadeia J) . No caso de IgGs, a unidade de 4 cadeias tem, em geral, cerca de 150.000 Daltons. Cada cadeia 1 está ligada a uma cadeia H por uma ligação covalente de bissulfureto, enquanto as duas cadeias H são ligadas por um ou mais ligações de bissulfureto dependendo do isotipo da cadeia H. Cada cadeia leve e pesada também contém pontes bissulfureto intracadeias regularmente espaçadas. Cada cadeia H contém, no N-terminal, um domínio variável (VH) seguido por uma série de domínios constantes (CH) para cada uma das cadeias α e γ e quatro domínios constantes CH para os isotipos μ e ε. Cada cadeia 1 contém, no N-terminal, um domínio variável (VL) seguido por um domínio constante (CL) em sua outra extremidade. O VL é alinhado com o VH e o CL alinhado com o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1) · Acredita-se que resíduos de aminoácido particulares formam uma relação entre a cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada. O emparelhamento de uma VH e VL juntas formam um único local de ligação ao antigénio. Para a estrutura e as propriedades das diferentes classes de anticorpo, veja-se, por exemplo, Basic and Clinicai Immunology, 8a edição, D. Stites, A. Terr e T. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, página 71 Capítulo 6. A cadeia 1 de qualquer espécie de vertebrado pode ser atribuída a um dos dois tipos claramente distintos, denominados capa e lambda, baseados nas sequências de aminoácido de seus domínios constantes. Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas (CH) , as imunoglobulinas podem ser atribuídas às classes ou isotipos diferentes. Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM tendo a cadeia pesada denominados α, δ, ε, γ e μ, respetivamente. As classes yea são adicionalmente divididas em subclasses na base de diferenças relativamente menores na sequência e na função de CH, por exemplo, os seres humanos expressam as seguintes subclasses: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2. 0 termo "variável" refere-se ao fato de certos segmentos dos domínios variáveis apresentarem sequências extensamente diferentes entre os anticorpos. 0 domínio V media a ligação de antigénios e define a especificidade de um anticorpo específico para o seu antigénio específico. No entanto, a variabilidade não é distribuída regularmente ao longo da série de 110 aminoácidos dos domínios variáveis. Ao contrário, as regiões V consistem de segmentos relativamente invariáveis denominados regiões de estrutura (FRs) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiões mais curtas de extrema variabilidade denominadas "regiões hipervariáveis" que apresentam de 9 a 12 aminoácidos de comprimento. Os domínios variáveis de cadeias leve e pesada nativas compreendem 4 FRs cada, adotando em grande parte configuração de folha β, conectadas durante 3 regiões hipervariáveis, que formam alças (loops) que conectam e, em alguns casos, fazem parte da estrutura de folha β. As regiões hipervariáveis de cada cadeia são mantidas juntas em boa proximidade pelas FRs e, com as regiões hipervariáveis da outra cadeia, contribuem com a formação do local de ligação de antigénios de anticorpos (veja-se Rabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Os domínios constantes não estão diretamente envolvidos na ligação de um anticorpo ao antigénio, mas exibem diversas funções efetoras, tais como a participação do anticorpo em citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC). A expressão "região hipervariável", quando utilizada no presente, designa os resíduos de aminoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antigénios. A região hipervariável compreende em geral resíduos de aminoácidos de uma "região determinante de complementaridade ou "CDR" (por exemplo, por volta dos resíduos 24 a 34 (Ll), 50 a 56 (L2) e 89 a 97 (L3) no VL, e por volta de cerca de 31 a 35 (Hl), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) no VH (veja-se Rabat et al., supra) e/ou aqueles resíduos de uma "alça (loop) hipervariável" (por exemplo, ao redor dos resíduos de Chothia 26 a 32 (Ll), 50 a 52 (L2) e 91 a 96 (L3) no VL, e 26 a 32 (Hl), 52A a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) no VH (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)). O termo "anticorpo monoclonal" da forma utilizada no presente documento refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou ligam-se ao (s) mesmo(s) epítopo(s) exceto por possíveis variações que podem ocorrer durante a produção da anticorpo monoclonal, que podem estar presentes em menores quantidades. Tal anticorpo monoclonal inclui tipicamente um anticorpo que consta de uma sequência de polipéptido que se liga a um alvo, onde a sequência do polipéptido de ligação ao alvo foi obtida por um processo que inclui a seleção de uma sequência do polipéptido de ligação de único alvo de uma variedade de sequências de polipéptidos. Por exemplo, o processo de seleção pode ser a seleção de um único clone de uma variedade de clones como, por exemplo, um conjunto de clones de hibridoma, clone por fago ou clone por ADN recombinante. Deve-se compreender que a sequência de ligação ao alvo selecionada pode adicionalmente ser alterada, por exemplo, para melhorar a afinidade ao alvo, para humanizar a sequência de ligação ao alvo, para melhorar sua produção na cultura de células, para reduzir sua imunogenicidade in vivo, para criar um anticorpo multiespecíficos, etc.; e que um anticorpo que consta da sequência de ligação ao alvo alterada é também um anticorpo monoclonal na presente invenção. Em contraste, às preparações de anticorpo policlonal que incluem tipicamente os anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epitopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal são dirigidos contra um único determinante num antigénio. Além de sua especificidade, as preparações de anticorpo monoclonal são vantajosas pelo fato de que tipicamente não são contaminadas por outras imunoglobulinas. 0 adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo de ser obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea e não deve ser considerado como exigindo a produção do anticorpo através de qualquer método especifico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo, por exemplo, o método de hibridoma (por exemplo, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a Ed. 1988); Hammerling et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), métodos de ADN recombinante (Veja-se, por exemplo, Patente US 4.816.567), tecnologia de bibliotecas de fagos (veja-se, por exemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol Biol, 222: 581 - 597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol 338(2):299-310 (2004), Lee et al., J. Mol. Biol.340 (5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sei. USA 101 (34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119- 132 (2004), e tecnologias para produção de anticorpos humanos ou parecidos com estes nos animais que têm partes ou todo o loci ou genes que codificam sequências da imunoglobulina humana (veja-se, por exemplo, documento WO 1998/24893; documento WO 1996/34096; documento WO 1996/33735; documento WO 1991/10741; Jakobovits, et al.,

Proc. Nail. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits, et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann, et al. , Year in Immuno., 7:33 (1993); patente US 5.545.806; patente US 5.569.825; patente US 5.591.669 (todas da GenPharm); patente US 5.545.807; documento WO 1997/17852; patente US 5.545.807; patente US 5.545.806; patente US 5.569.825; patente US 5.625.26; patente US 5.633.425; e patente US 5.661.016; Marks, et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg, et al., Nature. 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature. 368: 812-813 (1994); Fishwild, et al., Nature Biotechnology. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); e Lonberg e Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995) .

Anticorpos "quiméricos" (imunoglobulinas) em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica a ou homologa às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie especifica, ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo especifica, enquanto que o restante da cadeia é idêntico, ou homólogo, a sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, de forma a exibir a atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison, et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)). Anticorpo humanizado como usado no presente é um subconjunto de anticorpos quiméricos.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, murinos) são anticorpos quiméricos que contêm sequência mínima derivada de imunoglobulina não humana. Na maior parte, os anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo recetor) nas quais os resíduos de uma região hipervariável do paciente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo dador) tal como ratinho, rato, coelho ou primata não humano que possui a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos da região estrutural (FR) da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo recetor ou no anticorpo dador. Essas modificações são feitas para refinar adicionalmente o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as alças (loops) hipervariáveis correspondem aos de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as FRs são as de uma sequência de imunoglobulina humana embora as regiões FR possam incluir uma ou mais substituições de aminoácidos que melhoram a afinidade de ligação. 0 número destas substituições de aminoácidos na região FR tipicamente não é mais do que 6 na cadeia H, e não mais do que 3 na cadeia 1. 0 anticorpo humanizado opcionalmente também constará de pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais pormenores, veja-se: Jones, et al., Nature 321: 522-525 (1986), Reichmann, et al., Nature 332:323-329 (1988); e Presta, Curr. Op. Struct Biol. 2 :593-596 (1992) . "Fragmentos de anticorpos" compreendem uma porção de anticorpo intato, preferencialmente o ligante do antigénio ou a região variável de um anticorpo intato. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem fragmentos Fab, Fab' , F (ab')2 e Fv; diabodies; anticorpos lineares; (veja-se Patente US 5.641.870, Exemplo 2; Zapata, et al., Protein Eng., 8(10): 1057- 1062 (1995)); moléculas de anticorpos de cadeia única; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. A digestão de anticorpos por papaína produz dois fragmentos de ligação de antigénios idênticos, denominados fragmentos "Fab", cada qual com um único local de ligação de antigénios, e um fragmento "Fc" residual, cujo nome reflete a sua capacidade de rápida cristalização. 0 fragmento de Fab consiste numa cadeia 1 inteira juntamente com a região do domínio variável da cadeia H (VH) , e o primeiro domínio constante da cadeia pesada (CH1) · Cada fragmento de Fab é monovalente com respeito a ligação do antigénio, isto é, tem um único local de ligação ao antigénio. 0 tratamento com pepsina gera um fragmento F(ab')2 que corresponde cerca de a dois fragmentos de Fab ligados por pontes de bissulfureto de que têm a atividade de ligação ao antigénio divalente e ainda é capaz de reticular antigénio. Os fragmentos Fab diferem dos fragmentos de Fab tendo adicionalmente poucos resíduos na região carboxi-terminal do domínio do CH1 incluindo uma ou mais cisteínas da região de dobradiça do anticorpo. 0 Fab'-SH é a designação no presente para Fab' no qual o(s) resíduo(s) de cisteína(s) dos domínios constantes carregam um grupo tiol livre. Fragmentos de anticorpos F(ab')2 foram originalmente produzidos como pares de fragmentos Fab' o qual tem cisteínas de dobradiça entre eles. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos. 0 fragmento Fc compreende das parcelas do carboxi-terminal de ambas as cadeias H unidas por pontes bissulfuretos. As funções efetoras dos anticorpos são determinadas por sequências na região de Fc, que é também reconhecida em parte pelos recetores de Fc (FcR) encontrados em determinados tipos celulares. ”Fv" é o fragmento de anticorpo mínimo que contém um local completo de reconhecimento e ligação de antigénios. Dito fragmento consiste num dímero de um domínio de região variável de cadeia leve e de cadeia pesada em associação forte e não covalente. Da dobra desses 2 domínios emanam 6 alças (loops) hipervariáveis (3 alças (loops) da cadeia H e 3 alças (loops) da cadeia L) que contribuem com os resíduos de aminoácidos para ligação de antigénios e conferem especificidade de ligação de antigénios ao anticorpo. No entanto, mesmo um domínio variável simples (ou metade de um Fv que compreende apenas três CDRs específicas para um antigénio) possui a capacidade de reconhecer e ligar antigénio, embora a uma afinidade menor que todo o local de ligação.

Fragmentos de anticorpos "Fv de cadeia única" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL de anticorpo, em que esses domínios estão presentes numa única cadeia de polipéptido. Preferencialmente, o polipéptido Fv compreende adicionalmente um ligante de polipéptido entre os domínios VH e VL que permite que o scFv forme a estrutura desejada para ligação de antigénios. Para análise de scFv, veja-se Pluckthun em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., Springer-Verlag, Nova Iorque, Estados Unidos, págs. 269-315 (1994). "Cerca de" modifica, por exemplo, a quantidade de um ingrediente nas composições, concentração de um ativo, volume de tampão, diavolumes, o tamanho de poro, aparência molecular, diminuição do peso molecular, temperatura do processo, tempo do processo, rendimentos, taxas de fluxo, pressões, biocarga, e como valores e escalas destes, utilizados nos métodos da invenção, referem-se à variação na quantidade numérica que pode ocorrer, por exemplo, com os procedimentos de medição e de manipulação típicos utilizados na produção de concentrados ou soluções de utilização; através do erro inadvertido nestes procedimentos; através de diferenças no fabrico, na fonte, ou na pureza dos ingredientes utilizados para fazer as composições ou para realizar os métodos; e como considerações. 0 termo "cerca de" abrange também as quantidades que diferem devido ao tempo de uma composição com uma concentração ou uma mistura inicial particular. 0 termo "cerca de" abrange também as quantidades que diferem devido a mistura ou a processamento de uma composição com uma concentração ou mistura inicial. Se são modificadas ou não pelo termo "cerca de" as reivindicações incluem equivalentes às quantidades. "Consistindo essencialmente em" refere-se ao processo de obter-se uma composição concentrada de proteína ou a composição de anticorpo que incluam etapas e ingredientes listados na reivindicação, além de outras etapas e ingredientes que não afetam substancialmente as propriedades básicas e originais da composição, tais como a multiplicidade das etapas ou meio de tampão. Os ingredientes que afetam substancialmente as propriedades básicas da composição e do método da presente divulgação dão características indesejáveis incluindo, por exemplo, biocarga, tal como a toxicidade indesejável ou a irritabilidade associada aos contaminantes. 0 artigo indefinido "um" ou "uma" e seu artigo definitivo correspondente "o/a" como usado no presente são compreendidos para designar pelo menos um ou mais, ao menos que especificado de outra maneira. A presente divulgação proporciona, nas formas de realização, os processos acima mencionados da invenção conforme definido nas reivindicações e os produtos de anticorpos concentrados dos mesmos.

Nas formas de realização da presente divulgação, os processos preparativos e os produtos dos mesmos podem ser utilizados na fazer preparações de anticorpos altamente concentradas e preparações similares, como, por exemplo, purificar e concentrar proteínas ou substâncias parecidas de fontes naturais ou sintéticas, e tais produtos podem ser úteis no tratamento de condições patológicas, tais como, asma, cancro, psoríase, inibindo a angiogénese e condições patológicas desconhecidas.

Nas formas de realização do processo acima mencionado para preparar composições de anticorpos altamente concentradas da divulgação, seguem exemplificações adicionais de como fazer e usar os processos preparativos e os produtos da divulgação.

Nas formas de realização da presente divulgação, é proporcionado um processo para preparar composições de anticorpos altamente concentradas, por exemplo, de acordo com a realização das seguintes etapas na ordem enumerada, que compreende: uma primeira ultrafiltração de uma primeira preparação de anticorpos, tendo uma concentração de, por exemplo, cerca de 0,1 a 10 gramas por litro (g/1), para proporcionar uma segunda preparação de anticorpos como o retentado, tendo uma maior concentração de anticorpo, por exemplo, de cerca de 10 a 50 gramas por litro; uma diafiltração da segunda preparação de anticorpos resultante para proporcionar uma preparação de anticorpos intermediária diafiltrada como o retentado, tendo uma concentração mais ou menos idêntica como o segundo retentado de preparação de anticorpos resultante, isto é, a diafiltração para realizar uma permuta de tampão em volume constante; e uma segunda ultrafiltração da preparação de anticorpos intermediária diafiltrada para proporcionar uma terceira preparação de anticorpos como o retentado, tendo uma maior concentração de anticorpo, por exemplo, de cerca de 150 a 200 gramas por litro. O processo preparativo da divulgação pode compreender ainda uma etapa ou etapas opcionais de recuperação de produto, por exemplo, como divulgado e ilustrado no presente documento.

Nas formas de realização do processo acima mencionado da divulgação, uma ou mais de a primeira ultrafiltração, a diafiltração, e a segunda ultrafiltração, podem ser realizadas, por exemplo, de cerca de 30 °C a 70 °C. Nas formas de realização, estas etapas podem também ser realizadas, por exemplo, de cerca de 30 °C a 50 °C. Nas formas de realização, estas etapas podem também ser realizadas, por exemplo, de cerca de 35 °C a 50 °C. Nas formas de realização, estas etapas podem também ser realizadas, por exemplo, de cerca de 45 °C, tal como, cerca de 45 °C mais ou menos 5 °C. Dependendo do tipo da preparação de anticorpos acima, para os processos realizados em temperaturas acima de cerca de 70 °C, a preparação pode mostrar sinais de deterioração, tais como a desnaturação, aglomeração e fenômenos similares. Para os processos realizados em temperaturas abaixo de cerca de 30 °C a 35 °C, as taxas de fluxo são indesejavelmente baixas e o tempo do processo é indesejavelmente longo, tornando o processo em baixas temperaturas menos atrativo para a produção comercial eficiente. A primeira preparação de anticorpos pode ter uma concentração de anticorpo de, por exemplo, cerca de 0,1 a cerca de 100 gramas por litro (g/1) . A concentração de anticorpo é, por exemplo, uma concentração comum tipicamente disponível de outras etapas ou métodos preliminares de purificação da proteína ou anticorpo, tais como, centrifugação, filtração, cromatografia e procedimentos parecidos. A segunda preparação de anticorpos resultante obtida da primeira ultrafiltração pode ter uma concentração de anticorpo, por exemplo, de cerca de 10 a cerca de 50 gramas por litro, por exemplo, de cerca de 20 a 40 gramas por litro, tal como 30 gramas por litro. Uma escala para a concentração de anticorpo da preparação de anticorpos intermediária pode depender, por exemplo, de um balanço de fatores, tais como o volume da amostra e o fluxo da amostra obtida com um tampão especial que contém a segunda preparação de anticorpo. A preparação de anticorpos intermediária pode ter uma concentração de anticorpo de, por exemplo, cerca de 25 a cerca de 35 gramas por litro e a terceira preparação de anticorpos pode ter uma concentração de anticorpo, por exemplo, de cerca de 170 a cerca de 200 gramas por litro. A terceira preparação de anticorpos, nas formas de realização, pode ter uma concentração, por exemplo, de cerca de 50 a cerca de 250 gramas por litro de anticorpo, como de cerca de 100 a 230 gramas por litro, e de cerca de 170 a 200 gramas por litro, como, por exemplo, 185 gramas por litro.

Será evidente para um perito na especialidade, compreender na presente divulgação, que a preparação de anticorpos intermediária e a terceira preparação de anticorpos compreendem o mesmo retentado ultrafiltrado à exceção de, por exemplo, diferenças na concentração do anticorpo resultante da primeira e segunda concentração por ultrafiltração, e diferenças no meio de suspensão de tampão resultante da permuta de tampão na diafiltração. Assim, há pouca, se existir, mudança na composição, tais como a degradação do produto da proteína ou anticorpo alvo nas formas de realização da presente divulgação.

Os métodos convencionais de concentração por ultrafiltração podem, em geral, ter um tempo maior e transferências (through-put) poucas e ineficientes tendo um processo consideravelmente longo, como, por exemplo, um processo de diversos dias a diversas semanas, um processo com volume consideravelmente pequeno, ou ambos.

Nas formas de realização, o processo de concentração da proteína da divulgação pode ser realizado dentro, por exemplo, de cerca de 1 a 10 horas, preferivelmente dentro de cerca de 2 a 5 horas, e mais preferivelmente em cerca de 3 horas. As preferências favorecem um fluxo de produção mais elevado e áreas menores de membrana. A primeira ultrafiltração pode ser realizada, por exemplo, em cerca de 35 % do tempo total do processo. Assim, por exemplo, num processo de purificação e concentração da divulgação com cerca de 3 hora de tempo total do processo, a primeira ultrafiltração pode ser realizada em cerca de 45 minutos. A segunda ultrafiltração pode ser realizada, por exemplo, em cerca de 15 % do tempo total do processo. Assim, por exemplo, num processo de purificação e concentração da divulgação com cerca de 3 hora de tempo total do processo, a segunda ultrafiltração pode ser realizada em cerca de 15 minutos. A diafiltração pode ser realizada, por exemplo, em cerca de 50 % do tempo total do processo. Assim, por exemplo, no processo da divulgação com cerca de 3 horas de tempo total do processo, a diafiltração pode ser realizada em cerca de 90 a cerca de 120 minutos.

Nas formas de realização, a primeira e a Segunda ultrafiltração podem ser realizadas, por exemplo, com uma membrana de ultrafiltração que tem um tamanho nominal do poro, ou corte de peso molecular, de cerca de 5 a cerca de 50 kiloDaltons. Um outro tamanho nominal de poro apropriado é, por exemplo, de cerca de 10 a 40 kiloDaltons. Contudo um outro tamanho nominal de poro apropriado ou o corte de peso molecular, é de cerca de 30 kiloDaltons.

Nas formas de realização, a primeira preparação de anticorpos pode conter, por exemplo, um anticorpo que tem um peso molecular evidente de, por exemplo, cerca de 100 a 200 kiloDaltons. Em outras formas de realização, a primeira preparação de anticorpos pode conter um anticorpo que tem um peso molecular evidente de, por exemplo, cerca de 150 kiloDaltons como, por exemplo, quando a preparação de anticorpos compreende de anticorpo anti-IgE ou IgE, veja-se, por exemplo, patente US 6.172.213 cedida a Genentech, Inc.

Outros anticorpos para a utilização na presente divulgação incluem os anticorpos para tratamento de cancro, veja-se, por exemplo: documento PCT/US02/19592; documento PCT/US01/20118; documento PCT/US01/25464; documento PCT/US01/26626; documento PCT/US02/28859; documento PCT/US02/41798; documento PCT/US02/12206; documento PCT/US03/11148; documento PCT/US02/12619; e documento PCT/US02/33050. Ainda outros anticorpos apropriados para a utilização na presente divulgação incluem um anticorpo anti-CD20 e anticorpos parecidos incluindo formas humanas, não humanas, murinas, híbrida e quimérica. Veja-se, por exemplo, Patente US 6.582.959 (VEGF) e pedido de patente US 2002/0122797 AI (VEGF humano).

Nas formas de realização, os anticorpos incluídos no âmbito da divulgação incluem anticorpos híbridos e recombinantes (por exemplo, anticorpos "humanizados" e "humanos") sem levar em conta a espécie de origem ou classe da imunoglobulina ou da subclasse de designação, bem como, fragmentos de anticorpo (por exemplo, Fab, F(ab')2r e Fv) . Veja-se, patente US 4.816.567; Mage e Lamoyi, em Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 79-97, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987).

Os anticorpos monoclonais podem ser isolados a partir de bibliotecas de anticorpo por fago utilizando as técnicas descritas em Clackson et al., 1991, Nature 352:624-628 e Marks et al., 1991, J. Mol Blol. 222:581-597, por exemplo. Os anticorpos monoclonais da presente invenção incluem especificamente anticorpos "quiméricos" em que uma porção da cadeia leve e/ou pesada é idêntica a ou homologa às sequências correspondentes nos anticorpos derivados de uma espécie específica, ou que pertence a uma classe ou subclasse de anticorpo específica, enquanto que o restante da cadeia é idêntico, ou homólogo, a sequências correspondentes nos anticorpos derivados de outras espécies ou pertencentes a outra classe ou subclasse de anticorpo, bem como fragmentos de tais anticorpos, de forma a exibira atividade biológica desejada (Patente US 4.816.567; e Morrison et al. , 1984, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:6851-6855) . Os anticorpos podem incluir anticorpos "primatizados" que compreendem sequências de ligação de antigénios de domínio variável derivadas de primatas não humanos (por exemplo, Macacos do Velho Mundo, Chipanzé, etc) e sequências de região constante humana.

Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local antigénico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diferentes anticorpos direcionados contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal são direcionados contra um único determinante sobre o antigénio. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por não serem contaminados por outros anticorpos. 0 adjetivo "monoclonal" indica o caráter do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogénea de anticorpos, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos à exceção das possíveis mutações naturais que podem estar presentes em quantidades menores, e não devem ser interpretados como requisito para a produção de anticorpo por nenhum método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem utilizados para a utilização na presente divulgação podem ser preparados por meio do método de hibridoma primeiramente descrito por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), ou podem ser fabricados por meio de métodos de ADN recombinante. Outros métodos conhecidos para a produção de anticorpo são descritos, por exemplo, em Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103, Academic Press (1986) ; Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984). Brodeur, et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque (1987) . Vários métodos foram utilizados para produzir anticorpos monoclonais (MAbs). A tecnologia de Hibridoma, que se refere a uma linha de células clonadas que produzem um único tipo de anticorpo, usa as células de várias espécies, incluindo ratinho (murino), hamster, ratos e humanas. Um outro método para preparar a MAbs é a engenharia genética incluindo técnicas de ADN recombinante. Os anticorpos monoclonais feitos por estas técnicas incluem, entre outros, anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados. Um anticorpo quimérico combina regiões de ADN codificante de mais de um tipo de espécie. Por exemplo, um anticorpo quimérico pode derivar a região variável de um rato e a região constante de um ser humano. Um anticorpo humanizado vem predominantemente de um ser humano, mesmo que contenha porções não humanas. Como um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado pode conter uma região constante humana completa. Mas ao contrário de um anticorpo quimérico, a região variável pode ser parcialmente derivada de um ser humano. As porções não humanas, sintéticas de um anticorpo humanizado vêm frequentemente de CDRs em anticorpos murinos. Em qualquer evento, estas regiões são cruciais para permitir que o anticorpo reconheça e se ligue a um antigénio especifico.

Como observado, os anticorpos murinos desempenham um papel importante na tecnologia do anticorpo. Enquanto úteis para o diagnóstico e terapias a curto prazo, os anticorpos murinos não podem ser administrados por um longo prazo sem aumentar o risco de uma resposta imunogénica deletéria. Esta resposta, chamada de anticorpo humano anti-ratinho (HAMA), ocorre quando um sistema imune humano reconhece o anticorpo murino como estranho e ataca-o. Uma resposta de HAMA pode causar choque tóxico ou mesmo morte. Os anticorpos quiméricos e humanizados reduzem a probabilidade de uma resposta de HAMA minimizando as parcelas não humanas dos anticorpos administrados. Além disso, os anticorpos quiméricos e humanizados têm o beneficio adicional de ativar respostas imunes humanas secundárias, tais como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo.

Um anticorpo "intato" é aquele que compreende de uma região variável de ligação ao antigénio bem como um domínio constante da cadeia leve (CL) e domínios constantes da cadeia pesada CHI, CH2 e CH3. Os domínios constantes podem ser domínios constantes de sequência nativa (por exemplo, domínios constantes da sequência nativa humana) ou sequência de aminoácido variante deste. 0 anticorpo intato pode ter uma ou mais "funções efetoras" que se referem a aquelas atividades biológicas atribuídas à região Fc (uma região da sequência nativa de Fc ou região da sequência de aminoácido variante de Fc) de um anticorpo. Os exemplos de funções efetoras do anticorpo incluem a ligação do Clq; citotoxicidade dependente do complemento, ligação ao recetor de Fc; citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC); fagocitose; baixa regulação dos recetores de superfície celular (por exemplo, recetor da célula B; BCR), etc.

Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de suas cadeias pesadas, ao anticorpo intato pode ser atribuído diferentes "classes". Existem cinco classes principais de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e muitos destas podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl, e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondam às classes de diferentes anticorpos são denominados α, δ, ε, γ e μ, respetivamente. As estruturas das subunidades e as configurações tridimensionais das diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.

Nas formas de realização, a primeira ultrafiltração concentra a primeira preparação de anticorpos para proporcionar a segunda preparação de anticorpos que tem uma concentração de cerca de 30 gramas de anticorpo por litro, e a segunda ultrafiltração concentra a preparação de anticorpos intermediária (obtida pela diafiltração) para proporcionar a terceira preparação de anticorpos que tem uma concentração de, por exemplo, cerca de 170 a cerca de 200 gramas de anticorpo por litro. A primeira e a segunda ultrafiltração podem ser realizadas com a mesma membrana do ultrafiltro, e se for desejado, dentro do mesmo recipiente ou circuito do processo, por exemplo, para minimizar a manipulação, as perdas, extravasamento, com impactos no rendimento, na eficiência, e na economia. A primeira e segunda ultrafiltração podem ser realizadas com todos os aparelhos ou membrana apropriada do ultrafiltro. Muitos aparelhos e membranas apropriadas do ultrafiltro, que são capazes de realizar a operação de filtração de fluxo tangencial (TFF) , ultrafiltrações e a diafiltração, são disponíveis comercialmente, como pela Millipore, Pali Corp. Nas formas de realização, uma membrana de ultrafiltro apropriada pode ser, por exemplo, qualquer composto regenerado de celulose, que tiver um perfil relativamente baixo de absorção de proteína comparado a outras membranas disponíveis do ultrafiltro como, por exemplo, polietersulfona. A operação de diafiltração permuta uma primeira composição de tampão presente na primeira e segunda preparação de anticorpos por um segundo tampão desejado na terceira preparação de anticorpo. Nas formas de realização, o primeiro tampão pode constar, por exemplo, de uma mistura de cloreto de sódio aquoso e um tampão de TRIS, e o segundo tampão pode compreender, por exemplo, uma mistura do cloreto de histidina aquosa e cloreto da arginina. A diafiltração pode ser realizada por uma permuta de tampão em volume constante, concentração constante ou em ambos. Nas formas de realização, a diafiltração realiza uma permuta do tampão a um volume constante e concentração constante. A diafiltração pode realizar uma permuta de tampão, por exemplo, de cerca de 5 a 15 vezes o volume da (isto é, diavolumes) . A diafiltração pode realizar uma permuta de tampão, por exemplo, de cerca de 8 vezes o volume (8 diavolumes), isto é, 8 vezes o volume da amostra que contém a preparação de anticorpos a ser permutada. Por exemplo, uma preparação de anticorpos de 10 1 pode ser diafiltrada em 5 (diavolumes) ou o volume de 50 1 de tampão de permuta. O volume de permuta e as preferências para o volume de permuta consideram um contrapeso dos fatores, por exemplo, eficiência do processo de transferência, pureza do produto, padrões de aceitação governamentais e do cliente-paciente, e com padrões parecidos, e podem depender, por exemplo, da concentração e do tipo de tampão (por exemplo, o primeiro tampão) na primeira preparação do anticorpo e considerações similares. A primeira, a segunda ultrafiltração e a diafiltração são realizadas preferivelmente com filtração de fluxo tangencial (modo TFF) através de uma membrana do ultrafiltro, e a membrana do ultrafiltro é preferivelmente a mesma membrana para cada etapa. O rendimento do produto no conjunto final (isto é, a terceira preparação de anticorpo) pode ser, por exemplo, maior que cerca de 70 % em peso, como, por exemplo, cerca de 80 a 100 % em peso baseado no peso dos anticorpos da primeira preparação de anticorpo. O rendimento da terceira preparação de anticorpos pode ser, em formas de realização, maior que cerca de 90 % em peso, em formas de realização, maior que cerca de 95 % em peso, e em formas de realização, maior que cerca de 98 % em peso baseado no peso dos anticorpos da primeira preparação de anticorpos. A primeira ultrafiltração pode ter uma taxa de recirculação, por exemplo, de cerca de 50 a 1000 ml/min, e preferivelmente de cerca de 100 a 1000 ml/min. A taxa da recirculação pode ser escalada de acordo com a área da membrana disponível, por exemplo, as áreas da membrana de 0,46, 1,85, 18,58, 92,90 m2 e áreas similares permitem uma taxa cada vez mais elevadas de recirculação. Assim, uma escala apropriada da taxa de recirculação, nas formas de realização, pode ser, por exemplo, de cerca de 5,38 1/min/m2 a cerca de 53,82 1/min/m2. Ultrafiltração e diafiltração podem ser realizadas, por exemplo, em pressões de transmembrana de cerca de 34,47 a cerca de 344,74 kPa. A ultrafiltração e diafiltração podem ser realizadas, por exemplo, em pressões de transmembrana de cerca de 68,95 a cerca de 344,74 kPa. Nas formas de realização da presente divulgação é proporcionado um processo de preparação de um concentrado para uma formulação mais diluída de anticorpo, o concentrado de anticorpo que tem uma biocarga mínima, por exemplo, menor ou abaixo do limite detetável como, por exemplo, menos que cerca de 100 UFC/ml.

As composições de anticorpos da divulgação podem ser, por exemplo, preparação de anticorpos monoclonais concentrado para a administração aos seres humanos, como numa concentração maior ou o igual que cerca de 100 g/1 (mg/ml) como, por exemplo, de cerca de 120 a cerca de 170 g/1.

As composições de anticorpos da divulgação podem ser, por exemplo, imunoglobulinas, como do grupo IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, subclasses destes; recombinantes destes; fragmentos destes; e misturas destes ou qualquer um antecedente. Numa composição preferida de anticorpo da divulgação inclui anticorpos anti-IgE recombinantes humanizados. As composições de anticorpos da divulgação podem incluir um tampão. Um tampão preferido pode ser, por exemplo, uma mistura aquosa de cloreto de histidina e cloreto da arginina.

Os processos preparativos da divulgação são realizados preferivelmente no mesmo aparelho e sem intervenção ou com intervenção mínima do operador, por exemplo, como ilustrado na FIG.1. A primeira preparação de anticorpos pode ser proporcionada ou preparada usando uma variedade de métodos químicos, físicos, mecânicos ou não mecânicos, ou métodos bioquímicos, tais como, moer, ultrasonicação, homogeneização, digestão enzimática, extração por solvente, centrifugação, cromatografia e métodos parecidos, e combinações destes, veja-se, por exemplo, o acima mencionado R. Hatti-Kaul et al., "Downstream Processing in Biotechnology", em Basic Biotechnology, Cap. 9. A terceira preparação de anticorpos pode ser adicionalmente processada, se for desejado, usando-se, por exemplo, a nanofiltração (para remover, por exemplo, iões divalentes), osmose reversa (para remover, por exemplo, iões monovalentes), e métodos parecidos de purificação liquida. A terceira preparação de anticorpos da presente divulgação pode ser empacotada, armazenada, ou ser diretamente usada. A terceira preparação de anticorpos pode ser, adicionalmente processada utilizando-se, por exemplo, uma etapa e concentração adicional como, por exemplo, métodos de secagem, liofilização, liofilização e reconstituição e métodos parecidos. 0 terceiro produto de anticorpo concentrado resultante pode reconstituído posteriormente, se for desejado, com um líquido apropriado.

Com referência às figuras, a FIG. 1 ilustra um aparelho, nas formas de realização da presente divulgação, para realizar o processo preparativo incluindo um sistema de ultrafiltração e diafiltração (100) que tem uma unidade de ultrafiltração-difiltração TFF (UF-DF) (110), tendo uma membrana UF-DF (115), a qual esta em comunicação com o tanque de recirculação (120) este tanque serve como uma alimentação principal e um reservatório do retentado. Nas formas de realização, o tanque (120) pode ter um sistema de controlo de temperatura constando, por exemplo, de um revestimento isolante (125), um termostato ou elemento de aquecimento de temperatura controlada (126), tal como um elemento calefator por resistência ou um sistema líquido aquecido circulando que inclua um aquecedor (não mostrado), um regulador de fluxo (127), como uma bomba de recirculação, e um líquido apropriado para transferência de calor, tal como a água, glicóis, ou misturas destes. Todos os componentes no circuito ou componente no circuito que contribuem ao fluxo ou que processam, como as tubulações, válvulas, bombas, tanques, e componentes parecidos, podem opcionalmente ser isolados ou opcionalmente adaptado para que o aquecedor externo mantenha o controlo rigoroso sobre especificações de temperatura e evita alterações da temperatura na alça de fluido recirculador dentro e entre a câmara do filtro (110) e do tanque da recirculação (120). Nas formas de realização, por exemplo, quando o sistema (100) está realizando a primeira ultrafiltração ou ultrafiltrando primeiramente, tal como no modo descontínuo de alimentação, o sistema pode incluir um tanque de alimentação opcional (128) que esteja em comunicação fluida com o tanque de alimentação de recirculação (120) e possa ser usada, por exemplo, compensar, reabastecer ou suplementar a fase líquida esgotada do tanque da recirculação (120) .

Uma bomba (130) bombeia a alimentação do líquido do tanque (120) através da unidade de UF/DF (110) e recircula depois disso, o retentado resultante (a parcela não filtrada ou porção do líquido de alimentação excluída da membrana) para o tanque recirculante (120). Um segundo tanque (140) armazena e opcionalmente bombeia (não mostrado) um tampão no circuito principal (alça 110-120) durante a diafiltração de volume constante. Por exemplo, a taxa da adição e o volume do tampão introduzido no circuito principal são preferivelmente na mesma taxa e volume em que o filtrado deixa o circuito principal através da membrana (115) . O tanque do tampão (140) pode opcionalmente ser isolado com revestimento (143) e pode incluir o equivalente do elemento de aquecimento acima mencionado e de uma bomba de recirculação (não mostrados) . Uma fonte opcional de gás inerte (145), como o azoto, ou outras fontes comprimidas de gás podem ser usadas, por exemplo, para a recuperação do produto, para pressurizar o retorno do retentado, para excluir o oxigénio, para nivelar, para a limpeza, para testar a integridade da membrana e para operações parecidas. Um terceiro tanque (160) é usado para coletar e recuperar o filtrado retirando a unidade (110) . As válvulas (150,170) podem ser usadas como apropriado para regular o sentido e opcionalmente a taxa de fluxo liquida no sistema. Todos os valores e bombas podem ser atuados manualmente, coordenado por controlo de computador, ou por ambos. Um quarto tanque opcional (190) e fluxo de salda que pode proporcionar uma descarga de resíduo subordinado, recuperação do produto, ou sistema de monitorização, por exemplo, quando equipamento com um dispositivo de monitorização opcional (180), como um medidor de densidade ótica, filtro (s) opcional (is) (185) como um filtro protetor, filtro de produto e subsistemas opcionais. Nas formas de realização, o circuito fluido principal (laço 110-120) pode opcionalmente ser equipado com um sistema de monitorização em linha.

As preparações concentradas de anticorpo preparadas por processos da presente divulgação podem ser usadas para a administração terapêutica humana, incluindo produtos de imunoglobulina, para administração intramuscular (IVIG) ou intravenosa (IMIG). As preparações concentradas de anticorpo da divulgação podem incluir um estabilizador, por exemplo, uma solução salina de aminoácido tamponado, açúcares simples, ou como estabilizantes, quelantes de iões apropriados iões, tais como o EDTA ou ião de citrato, e combinações destes, veja-se, por exemplo, Wang, Y.-C. J. et al., "Parenteral formulations of proteins and peptides: stability and stabilizers," J. Parenteral Sci. Technol, 42, Supl. S3-S26 (1988) . 0 resumo de Derwent do documento JP01268646A (AN89-359879) relata que o pedido descreve uma preparação da injeção de um anticorpo IgG3 monoclonal que tem uma concentração de 0,1 microgramas/ml a 100 mg/ml.

Acredita-se que o assunto divulgado nestas publicações esteja fora do âmbito da presente divulgação.

As preparações de acordo com a divulgação podem estar substancialmente livres de agregados. Os níveis aceitáveis de contaminantes agregados seriam menos do que, por exemplo, cerca de 5 % em peso, e idealmente menos de 2 % em peso. Níveis tão baixos como 0,2 % em peso podem ser obtidos, embora os contaminantes agregados de cerca de 1 % de peso sejam mais típicos. A preparação nas formas de realização, pode também preferivelmente estar livre dos excipientes utilizados tradicionalmente para estabilizar a formulação policlonal, por exemplo, glicina e/ou maltose. A presente divulgação pode proporcionar uma preparação de anticorpos monoclonais para a administração a um ser humano caracterizado pelo fato de que o anticorpo da preparação é um anticorpo recombinante e pode estar numa concentração de 100 mg/ml ou maior, preferivelmente maior que 150 mg/ml A preparação é preferentemente substancialmente livre de qualquer agregação de proteína. O pH de formulação farmacêutica da divulgação dependerá em particular da via de administração. No entanto, a fim de maximizar a solubilidade do anticorpo na solução concentrada, o pH da solução deve ser diferente do pH do ponto isoelétrico (pi) do anticorpo.

Nas formas de realização da divulgação, a preparação monoclonal pode estar prevista para a utilização na terapêutica humana. Vários distúrbios humanos podem ser tratados como o cancro ou as doenças infeciosas, por exemplo, as aquelas mencionadas acima, e distúrbios imunes, tais como, distúrbios mediados por células T incluindo a vasculite severa, artrite reumatoide, lúpus sistémico, também distúrbios autoimunes tais como a esclerose múltipla, doenças enxerto contra o hospedeiro, psoríase, diabetes juvenil, doença de Sjõgren, doença de tireoide, miastenia grave, rejeição de transplante, doença inflamatória do intestino, asma, distúrbios mediados por IgE, e distúrbios ou condições similares, ou combinações dos mesmos. A divulgação proporciona, portanto, nas formas de realização, a utilização de uma preparação de anticorpos monoclonais concentrada como descrito no presente documento no fabrico de medicamento para o tratamento de alguns dos distúrbios acima mencionados e distúrbios similares. É proporcionado também um método de tratamento de um ser humano, tendo um distúrbio, que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma preparação de acordo com a divulgação. As dosagens de tais preparações de anticorpos variarão com as circunstâncias que estão a ser tratadas e o recetor do tratamento, mas podem, por exemplo, ser na escala de cerca de 50 a cerca de 2000 mg para um paciente adulto, preferivelmente cerca de 100 a 1000 mg administrado diariamente ou semanalmente por um período entre 1 e 30 dias e repetida como necessário. As doses podem ser administradas como dose única ou doses múltiplas.

Descrição do Processo. A etapa da formulação permuta tipicamente um grande volume da substância purificada do fármaco, por exemplo, resultando da cromatografia por permuta de iões, na composição e nas concentrações finais do excipiente. Não havia tipicamente nenhuma purificação obtida nesta etapa à exceção da remoção de pequenas moléculas. A ênfase estava no rendimento, na permuta de tampão, e na robustez elevada na etapa da formulação. Durante a formulação através de TFF (filtração de fluxo tangencial), a proteína contida na solução de alimentação foi bombeada através do sistema de membrana e voltou à recipiente do reciclo (recirculação). A membrana da TFF reteve a proteína (como parte do retentado) quando o filtrado (ou o permeado) foi passado através da membrana pela pressão. A pressão é chamada a pressão transmembrana (PTM) e é tipicamente controlada pela utilização de uma válvula de controlo da pressão do retentado. 0 processo foi conseguido obtido pela sequência de uma primeira ultrafiltração (concentração), diafiltração (permuta constante do volume de tampão), e de uma segunda ultrafiltração (concentração adicional). 0 número de diavolumes (equivalentes volumétricos) necessários para remover os componentes o tampão do processo pode prontamente ser calculado ou determinado experimentalmente.

Processo de UF/DF em geral para Anti-IgE. 0 pH de um conjunto da cromatografia de permuta de aniões foi ajustado a um pH de cerca de 6 usando-se 0,5 M de ácido fosfórico aquoso. O pH ajustado do conjunto de permuta de aniões foi formulado pelo processo da ultrafiltração /diafiltração (UF/DF) da presente divulgação usando uma membrana que tem uma eliminação molecular nominal de 10.000 - 30.000 Daltons. Antes de processar, a membrana UF foi equilibrada com tampão de diafiltração (0,02 M de histidina, 0,02 M de HCl-arginina, pH 6). O produto de uma permuta aniónica (conjunto da permuta de aniões) foi então carregado no sistema e concentrado a uma concentração intermediária pela primeira ultrafiltração. O conjunto foi então diafiltrado (8 X ou 8 diavolumes) em sua formulação (0,02 M de histidina, 0,02 M de HCl-arginina, pH 6). O conjunto foi então concentrado pela segunda ultrafiltração a uma concentração final maioria que 170 g/1 e recuperado através de um filtro estéril de 0,22 micrómetros. O processo inteiro de UF/DF foi executado num ponto da temperatura ajustado de cerca de 45 °C. Este controlo de temperatura foi obtido usando o controlo de temperatura da permuta de aniões do conjunto entrante, do tampão da diafiltração e do utilização de um revestimento isolante do tanque de recirculação para o processo de UF/DF como ilustrado no presente documento.

Após a UF/DF, o conjunto recuperado foi diluído (isto é, condicionado) a uma concentração de cerca de 150 g/1 em 0,02 M de histidina e 0,2 M de HCl-arginina, 0,04 % de polisorbato-20 em pH 6 (formulação final) . Durante as etapas condicionantes foi permitida que a temperatura do volume formulado retorna-se à temperatura ambiente. Após condicionar, o volume formulado foi recuperado outra vez através de um filtro estéril de 0,22 micrómetros. O sistema de UF/DF pode ser regenerado com 0,1 N de hidróxido de sódio e sanitizado com Minncare® 1,4 %. Quando não usado o sistema pode ser armazenado em 0,1 N de hidróxido de sódio aquoso. As membranas de UF/DF podem ser armazenadas, por exemplo, em 0,1 % de Roccal®/20 % de solução de água-glicerol entre as campanhas.

Procedimentos Gerais do Processo de

Ultrafiltração/Diafiltração

Parâmetros de operação: Taxa de fluxo da alimentação a 5,38 1/min/m2. Um controlo constante da pressão do retentado (por exemplo, 68,95 kPa) foi usado para a limpeza e balanceamento de pré-utilização, visto que Cparede/· a pressão constante do retentado ou PTM constante foi usada para o processo.

Balanceamento de Pré-Utilização: As seguintes preparações foram realizadas nas membranas de cassetes Pellicon-2 limpas antes da utilização para assegurar que as membranas foram apropriadamente equilibradas.

Utilização do Processo: 0 seguinte foi executado no conjunto de permuta de aniões inicial resultante (conjunto Q) obtido de uma etapa de separação anterior, por exemplo, uma etapa de cromatografia de Q-Sepharose: ultrafiltrar primeiro ou uma primeira ultrafiltração (UF1) a uma concentração de cerca de 5 g/1 a uma concentração para a diafiltração (CDf) ; diafiltrar ou diafiltração (DF1) com quatro (4) volumes de diafiltração (DV) com o tampão DF; diafiltrar continuamente (DF2) com quatro (4) volumes de diafiltração (DV) de tampão DF; ultrafiltrar uma segunda vez ou segunda ultrafiltração (UF2) a uma concentração final (CFmai) ; e recuperação opcional do produto.

As etapas anteriores foram realizadas tipicamente a baixa Reciclagem de dP (mistura), por exemplo, 15 minutos.

Limpeza Pós-Utilização: As seguintes sequência e condições tabuladas foram usadas para a limpeza nas membranas de cassetes Pellicon-2 imediatamente após a utilização.

Definições para Modos de Operação em TFF. Única passagem com o Filtrado aberto (SPFO). 0 retentado e o filtrado são dirigidos para drenar. Válvula do Filtrado aberta.

Reciclagem total com o Filtrado aberto (TRFO). 0 retentado e o filtrado são dirigidos para o recipiente de reciclagem. Válvula do Filtrado aberta.

Ultrafiltração Escalonada (FB-UF). 0 retentado é dirigido ao tanque de reciclagem, o filtrado dirigido para o dreno, e o conjunto entrante é transferido ao tanque de reciclagem.

Ultrafiltração Descontinua (B-UF). 0 retentado é dirigido ao tanque de reciclagem e o filtrado é dirigido para o dreno.

Diafiltração (DF). 0 retentado é dirigido ao tanque de reciclagem, o filtrado é dirigido para o dreno, e o tampão da diafiltração é transferido ao tanque de reciclagem. dP refere-se à pressão diferencial.

Transferência do produto. A unidade da membrana do ultrafiltro e do tanque de reciclagem está aberta ao tanque do conjunto. A pressão de azoto é controlada. 0 conjunto é transferido primeiramente usando a bomba de reciclagem e então é usado uma bomba peristáltica manual.

Transferência da alimentação. 0 conjunto entrante é bombeado ao tanque de reciclagem.

Reciclagem Total com o Filtrado Fechado (TRFC). 0 retentado é dirigido ao recipiente de reciclagem. Válvula do Filtrado fechada. "conjunto Q" refere-se ao conjunto de proteína resultante de, por exemplo, uma etapa anterior da cromatografia em Q-Sepharose que seja condicionada com tampão, referida também como conjunto condicionado. WFI refere-se a água para injeção.

EXEMPLOS

Os seguintes exemplos servem para descrever de forma mais completa os modos de utilização da divulgação acima descrita, bem como determinar os melhores modos contemplados para a realização de vários aspetos da divulgação. Compreende-se que estes exemplos de nenhuma maneira servem para limitar o verdadeiro âmbito desta divulgação, mas é preferivelmente apresentado para finalidades ilustrativas.

Exemplo 1

Formulação de Concentração Alta de rhuMAb E25

Um sistema piloto de UF para produção em escala foi usado para concentrar/formular o rhuMAb E25 (um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE, patente US 6.172.213). Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana 0,52 metros quadrados, composta de celulose regenerada para 10.000

Daltons. O sistema consistiu num suporte para membrana, uma bomba de alimentação de lóbulo giratório Waukeskaw modelo 6, encanamento da recirculação em aço inoxidável 316L de 1,27 cm, e um recipiente de recirculação. Os indicadores/ transmissores de pressão (Anderson) foram situados na entrada (ALIMENTAÇÃO), no escoador (RETENTADO) e no permeado (FILTRADO) do suporte da membrana. Os medidores de fluxo (Yokogawa ADMAG) foram situados na entrada (ALIMENTAÇÃO) e no permeado (FILTRADO) do suporte da membrana. Uma válvula regulando a retro-pressão (Mikroseal) foi situada na no escoador do suporte da membrana para controlar a pressão do retentado e para efetuar a pressão transmembrana (PTM). Um tanque envolvido de aço inoxidável 316L de 40 1 foi usado para o recipiente de recirculação. Este tanque foi colocado com um indicador de nível, um agitador montado no topo (Lightnin) , um disjuntor e uma válvula do fundo do vórtex (NovAseptic). O controlo de temperatura foi conseguido com a utilização da temperatura modulado por alimentação de glicol ao revestimento do tanque.

Durante este funcionamento, a taxa de fluxo da alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 2,85 1/min (5,38 1/min/m2) . Durante toda operação pré-utilização e pós-utilização o controlo de pressão do retentado foi ajustado a uma constante de 68,95 kPa. Durante as operações de ultrafiltração e diafiltração o sistema usou um esquema de controlo de Cparede para controlar o fluxo através da membrana, veja-se, por exemplo, Reis, et al., Constant Cwau Ultrafiltration Process Control, J. of Membrane Science, 130 (1997), 123-140.

Antes do processo, a solução de armazenamento do sistema (NaOH a 0,1 N) foi descarregada numa única passagem para o modo de drenagem, primeiramente purificada com água 21,53 1/m2 (AP) e então com 10,76 1/m2 de tampão de diafiltração (50 mM de histidina/pH 6,0). Depois que descarregado, o sistema foi equilibrado re-circulando o tampão de diafiltração 5,38 1/m2 durante 10 minutos. O pH da solução re-circulada foi verificado para confirmar o equilíbrio. O nível no tanque foi reduzido então a um valor mínimo mensurável para minimizar a diluição do conjunto entrante de proteína. O conjunto de proteína resultante de uma etapa anterior da cromatografia em Q-Sepharose foi mensurado como sendo 3,2 g de E25/1 e teve um volume de 43,1 1. A proteína estava numa solução de 25 mM de tampão TRIS e cerca de 200 mM de NaCl e pH ajustado para 6,2. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido á recipiente de recirculação. No recipiente o conjunto foi agitado através de um impulsor montado no topo e a temperatura foi mantida em temperatura ambiente (20-25 °C) .

Durante o processo o conjunto foi concentrado no modo UF1 a 50 g de E25/1 (cerca de 2,8 1) . No começo da diafiltração o ponto da temperatura ajustada no recipiente foi aumentado para 40 °C. O aumento na temperatura e no controlo foi afetado pelo fluxo quente de glicol através do revestimento exterior do tanque. O conjunto foi diafiltrado então com 8 diavolumes de tampão de diafiltração. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2. Esta fase foi executada também ajuntando o ponto da temperatura a 40 °C. O alvo para esta concentração final foi de 110 g/1. Isto foi obtido sem a necessidade reduzir a taxa de fluxo da alimentação. Em seguida, mistura uma redução a pressão baixa foi executada onde a bomba de alimentação foi controlada para manter uma pressão mínima de 34,74-68,95 kPa através do canal da alimentação. Uma amostra foi puxada do tanque de recirculação e uma concentração do volume final de cerca de 120 g/1 foi mensurada. O Quadro 1 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UF1, DF (DF1+DF2), e UF2.

A FIG. 2 mostra os valores do processo observado ou medido sobre os parâmetros de tempo para a taxa de fluxo da alimentação (210), temperatura do tanque (220), dP da alimentação (230), PTM (240), taxa de fluxo do filtrado (250) durante as várias fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30). A FIG. 3 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a concentração E25 (310), fluxo (320) e PTM (240) . A FIG. 4 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a diminuição da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(410) e UF2 (420) a 37 °C. O conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro o conjunto de recirculação foi bombeado para o tanque através de um Millipac 200, com um filtro de 0,22 micra esterilizado usando a bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução da proteína foi deslocada em seguida da unidade do encanamento e da membrana com um fluxo do gás azoto de 34,47 kPa aplicado para baixo do ponto mais elevado na linha do retentado. A fase final foi um fluxo para abaixo do tanque e da linha de alimentação, também usando o gás azoto a 34,47 kPa.

Acredita-se que a recuperação do produto foi melhorada em comparação com o Exemplo 1 quando conduzida na temperatura ambiente porque a temperatura elevada utilizada numa ou mais da ultrafiltração, diafiltração ou etapas de recuperação reduziu o efeito viscoso. Por exemplo, quando o controlo de temperatura foi desligado durante a recuperação do produto, o sistema arrefeceu lentamente durante esta operação o que causou dificuldades na recuperação da unidade da membrana. Alternativamente, a recuperação pode ser executada primeiramente pelo suporte da membrana e então pelo recipiente de recirculação.

Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 1,74 1 de tampão de DF foram adicionados ao sistema e re-circulados durante cerca de 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência que descrita acima. Este volume foi analisado então para a concentração da proteína com os outros conjuntos. 0 Quadro 2 sumariza os resultados.

Pós-processamento, a membrana foi regenerada usando NaOH a 0,1 N, 10,76 1/m2 de lavagem de única passagem seguido pela recirculação total de 5,38 1/m2 durante 30 minutos. Isto foi seguido pela lavagem por 10,76 1/m2 de AP (água pura). Seguido por uma recirculação total da solução de 300 ppm de Minncare® durante 30 minutos. O sistema foi de novo lavado com 10,76 1/m2 de AP e re-circulado finalmente durante 15 minutos com NaOH a 0,1 N e armazenado. O conjunto recuperado foi diluído a 80 g de E25/1 e condicionado na formulação final de 50 mM de histidina /150 mM de trehalose /0,02 % de polisorbato 20 / pH 6,0. A qualidade de produto foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para o Conjunto Q entrante e para o volume final recuperado. Estes dados são sumarizados no Quadro 3.

Exemplo Comparativo 2

Formulação de Alta Concentração de rhuMAb E25 a Temperatura Ambiente 0 Exemplo 1 foi realizado com as seguintes exceções. Antes do processo, a solução de armazenamento do sistema (NaOH a 0,1 N) foi lavada numa única passagem ao modo de drenagem primeiro com 21,53 1/m2 de água purificada (AP) e em seguida com 10,76 1/m2 de tampão de diafiltração (20 mM de histidina /pH 6,0) . Após as lavagens, o sistema foi equilibrado por meio da recirculação de 5,38 1/m2 de tampão de diafiltração durante 10 minutos. O pH da solução recirculada foi verificado para confirmar o equilíbrio. O nível no tanque foi reduzido então a um valor mínimo mensurável para minimizar a diluição do conjunto entrante de proteína. O conjunto de proteína que resultante da etapa da cromatografia em Q-Sepharose foi medido para ser 3,3 g E25/1 e ter um volume de 33,3 1. A proteína estava numa solução tampão de TRIS 25 mM e cerca de 200 mM de NaCl e pH ajustados para 6,2. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação. No recipiente o conjunto foi agitado através de um impulsor montado no topo e a temperatura foi mantida em temperatura ambiente (20-25 °C) . Durante o processo o conjunto foi concentrado a baixo no modo UF1 a 50 g E25/1 (cerca de 2,2 1) . O conjunto foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. A diafiltração foi executada num volume constante, em que o volume foi obtido por meio da combinação da taxa de fluxo de tampão que está a ser transferido no tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. A diafiltração foi executada também em temperatura ambiente. No final da diafiltração, o conjunto foi mais concentrado no modo UF2. O alvo para esta concentração final era 110 g/1. No entanto, devido a uma redução da alta pressão através do canal da alimentação, esta concentração não foi obtida. Numa tentativa de se conseguir esta concentração a taxa de fluxo da alimentação foi reduzida a 1,4 1/min numa concentração adicional de cerca de 80 g de E25/1, devido uma queda de pressão através do canal da alimentação que alcançou 344,74 kPa. UF2 continuou até que a queda de alta pressão de 344,74 kPa fosse novamente alcançada e o processo foi interrompido. Em seguida, uma queda de baixa pressão foi tentada com uma bomba de alimentação para manter uma queda de pressão de 34,47 kPa através do canal da alimentação. Outra vez, a natureza viscosa da solução de proteína se tornou difícil de conseguir que a bomba de lóbulo giratório alcançasse pressões adicionais. Uma amostra foi retirada do tanque de recirculação e uma concentração final de cerca de 104 g/1 foi mesurada. O Quadro 4 sumariza a produção e o fluxo mensurado durante as fases UF1, DF (DF1+DF2), e UF2.

A FIG. 5 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), PTM (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) durante as vária fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30). A FIG. 6 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a concentração E25 (310), fluxo (320) e PTM (240) . A FIG. 7 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a diminuição da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(410) e UF2 (420) a 24 °C. O conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o conjunto de recirculação foi bombeado para o tanque através de um Millipac 200, com um filtro de 0,22 micra esterilizado usando a bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução da proteína foi deslocada em seguida da unidade do encanamento e da membrana com um fluxo do gás azoto de 34,47 kPa aplicado para baixo do ponto mais elevado na linha do retentado. A fase final foi um fluxo para abaixo do tanque e da linha de alimentação, também usando o gás azoto a 34,47 kPa.

Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 1,85 1 de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por cerca de 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência do Exemplo 1. Este volume foi analisado então para a concentração da proteína com os outros conjuntos. O Quadro 5 sumariza os resultados.

Após o processo, a membrana foi regenerada usando NaOH a 0,1 N, com uma lavagem de passagem única de 10,76 1/m2 seguido pela recirculação total de 5,38 1/m2 durante 30 minutos. Isto foi seguido pela lavagem por 10,76 1/m2 de AP (água pura). Seguido por uma recirculação total da solução de 300 ppm de Minncare® durante 30 minutos. O sistema foi outra vez lavado com 10,76 1/m2 de AP e recirculado finalmente durante 15 minutos com NaOH a 0,1 N e armazenado. O conjunto recuperado foi diluído a 80 g de E25/1 e condicionado na formulação final de 20 mM de histidina / 250 mM de sacarose /0,02 % de polisorbato 20 / pH 6,0. A qualidade de produto foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para o Conjunto Q entrante e para o volume final recuperado. Estes dados são sumarizados no Quadro 6.

Exemplo 3

Formulação de Alta Concentração de rhuMAb E26 com Modo Escalonado Inicial O Exemplo 1 foi repetido com as seguintes exceções. O concentrado/fórmula era o rhuMAb E26 (um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE). Os produtos deste exemplo foram usados na avaliação toxicológica. Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração/Diafiltração foi montado com um 1,06 metros quadrados, 30.000 Daltons em membrana composta de celulose regenerada. A taxa de fluxo de alimentação estabeleceu-se a uma taxa constante de 5,0 1/min (4,30 1/min/m2) . Durante as operações de ultrafiltração e diafiltração a pressão do retentado foi mantida entre cerca de 41,37-55,16 kPa. O conjunto de proteína que resultou da etapa anterior por cromatografia em Q-Sepharose foi mensurado para ser 6,7 g E26/1 e teve um volume de 59,3 1.

Devido a que o conjunto entrante era maior que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo descontínuo de alimentação. Neste modo, o Conjunto Q foi adicionado ao recipiente de recirculação aproximadamente na mesma taxa que o filtrado passava através da membrana TFF para o dreno. Após o Conjunto Q restante ter sido transferido ao recipiente de recirculação, o processo UFl continuou em modo descontínuo. Durante o UFl, o conjunto foi concentrado a 50 g de E26/1 (cerca de 7,9 1). No começo do diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi aumentado para 40 °C. O aumento na temperatura e o controlo foi afetado pelo fluxo quente de glicol através do revestimento exterior do tanque. O conjunto foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente no modo UF2 a uma concentração final de 109 g de E26/1 (3,6 1) . Esta fase foi executada também usando um ponto de temperatura elevado de 40 °C. Em seguida, uma mistura de queda de pressão baixa foi executada onde a bomba de alimentação foi controlada para manter uma pressão mínima de 34,47-68,95 kPa através do canal da alimentação. O Quadro 7 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UFl, DF (DF1+DF2), e UF2.

A FIG. 8 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), PTM (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) . A FIG. 9 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a concentração E26 (910), fluxo (920) e PTM (940) . A FIG. 10 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a queda da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1 (1010) e UF2 (1020).

Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 10 ml foi analisada para a deteção e uma titulação da biocarga. Um limite típico de rejeição é a 1000 unidades formadoras de colónia (UFC) por ml Os resultados deste teste foram 1,8 UFC/ml, um valor apropriado para esta etapa e bem abaixo do limite de rejeição. Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 908,1 ml de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por cerca de 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência descrita acima. Este volume foi analisado então para a concentração de proteína com os outros conjuntos. O Quadro 8 sumariza os resultados.

0 conjunto recuperado foi diluído a 80 g de E25/1 e condicionado na formulação final de 50 mM de histidina / 150 mM de trehalose /0,02 % de polisorbato 20 / pH 6,0. A qualidade de produto foi avaliada por cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) para o Conjunto Q entrante, o conjunto de retentado após UF1, o conjunto do retentado após DF e para o volume final recuperado. Estes dados são sumarizados no Quadro 9.

Exemplo 4

Formulação de Alta Concentração de rhuMAb E26 para Avaliação Toxicológica- Comparação de lOkD e 30kD 0 Exemplo 3 foi repetido com as seguintes exceções. Dois sistemas de UF para produção em escala foram usados para concentrar/ formular o rhuMAb E26. Dois sistemas do Ultrafiltração /Diafiltração da Millipore Pelicon foram montados com todos 1,06 metros quadrados, em membrana composta de celulose regenerada com um tamanho de poro para 10.000 Daltons e outra com um tamanho de poro para 30.000 Daltons. As pressões do retentado foram mantidas cerca de a 41,37-62,05 kPa.

Processo de 10 kDa O conjunto de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose anterior foi mensurado como sendo 5,85 g de E26/1 e teve um volume de 62,4 1. Durante a UFI, o conjunto foi concentrado a 50 g de E26/1 (cerca de 7,3 1) . No fim da diaf iltração, o conjunto foi adicionalmente concentrado no modo UF2 a uma concentração final de 107,5 g de E26/1 (3,4 1). O Quadro 10 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UFI, DF e UF2.

Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 987 ml de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados durante cerca de 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência descrita acima. Este volume foi analisado então para a concentração da proteína com os outros conjuntos. 0 Quadro 11 sumariza os resultados.

A FIG. 11 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), PTM (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) durante as vária fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 10 kDa. A FIG. 12 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a concentração E26 (1210), fluxo (1020) e PTM (1240) durante as vária fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 10 kDa. A FIG. 13 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a queda da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1(1310) e UF2 (1320) para o processo de 10 kDa.

Processo de 30 kDa O conjunto de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q- Sepharose anterior foi mensurada como sendo 5,85 g de E26/1 e teve um volume de 64,5 1. Durante a UFI, o conjunto foi concentrado a 50 g de E26/1 (cerca de 7,5 1) . No fim da diafiltração, o conjunto foi adicionalmente concentrado no modo UF2 a uma concentração final de 117,5 g de E26/1 (3,2 1). O Quadro 12 sumariza os resultados da produção e do fluxo de UFI, DF e UF2.

Para determinar a perda de massa durante a recuperação, 918 ml de tampão de DF foram adicionados ao sistema e recirculados por cerca de 5 minutos e recuperados usando a mesma sequência descrita acima. O conjunto recuperado foi diluído a 80 g de E25/1 e condicionado na formulação final de 50 mM de histidina / 150 mM de trehalose /0,02 % de polisorbato 20 / pH 6,0. O Quadro 13 sumariza os resultados.

A FIG. 14 mostra os valores do processo observados ou medidos sobre a tempo para os parâmetros da taxa de fluxo da alimentação (210), a temperatura do tanque (220), o dP da alimentação (230), PTM (240), e da taxa de fluxo do filtrado (250) durante as vária fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 30 kD. A FIG. 15 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a concentração E26 (1510), fluxo (1520) e PTM (1540) durante as vária fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF (20), UF2 (30) e baixo dP (40), para o processo de 30 kD. A FIG. 16 mostra os valores do processo observado ou medido ao longo do tempo para a queda da pressão contra a concentração da proteína observada para UF1 (1610) e UF2 (1620) para o processo de 30 kD.

Exemplo 5

Aumento em Escala de rhuMAb E25 Liquido O Exemplo 1 foi repetido com as seguintes exceções.

Um sistema de UF para produção em escala foi usado concentrar/ formular um rhuMAb E25 líquido (um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE). O produto pode ser usado na aplicação terapêutica e na pesquisa de bioequivalência em humanos. Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração com 0,52 metros quadrados foi montado com uma membrana composta de celulose regenerada, com um tamanho de poro para 30.000 Daltons. Cada sistema consistiu de um suporte para membrana, uma bomba de alimentação giratória Viking S3S, encanamento da recirculação do aço inoxidável 316L de 3,83 cm e um recipiente de recirculação 250 1.

Um tanque revestido de aço inoxidável 316L de 250 1 foi usado para o recipiente de recirculação. O controlo de temperatura deste tanque foi conseguido pela modulação da temperatura por alimentação de glicol no revestimento do tanque. A temperatura de alimentação do glicol no revestimento do tanque foi aumentada ou diminuída usando-se permuta de calor por vapor ou fonte fria de glicol respetivamente.

Para este funcionamento, a taxa de fluxo de alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 114 1/min (0,5 1/min/h). O tampão de diafiltração (20 mM de histidina / 200 mM de cloreto de arginina / pH 6,0) foi preparado num tanque separado. A temperatura deste tampão foi ajustada para 45 °C antes do início do processo. Isto permitiu o controlo exato da temperatura durante todo o processo.

Antes de processar, a solução de armazenamento do sistema (NaOH a 0,1 N) foi equilibrada numa única passagem para drenar primeiramente com 10,76 1/m2 de água para injeção (WFI) e em seguida com 10,76 1/m2 de tampão de diafiltração. Após as lavagens, o sistema foi equilibrado por meio da recirculação de 5,38 1/m2 de tampão de diafiltração durante 10 minutos. O pH da solução re-circulada foi verificado para confirmar o equilíbrio. O conjunto de proteína resultante da etapa da cromatografia em Q-Sepharose foi medido como sendo 5,2562 g de E25/1 e tendo um volume de 1.141 1. A proteína estava numa solução de 25 mM de tampão TRIS e cerca de 200 mM de NaCl e o pH ajustado para 6,2. Justo antes da execução o ponto ajustado da temperatura do conjunto foi ajustado a 45 °C. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro a um nível de cerca de 200 1 no tanque. Como o conjunto entrante era maior que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo escalonado. Neste modo, o Conjunto Q foi adicionado ao recipiente de recirculação cerca de na mesma taxa que o filtrado passava através da membrana de TFF ao dreno. Depois o Conjunto Q restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo descontínuo. Durante o modo UFl, o conjunto foi concentrado a cerca de 30 g de E25/1 (cerca de 200 1) . O conjunto foi então diafiltrado com cerca de 8 diavolumes de tampão de diafiltração. Durante a diafiltração, a temperatura foi mantida entre 40 e 50 °C. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente no modo UF2 a uma concentração final > 170 g de E25/1 (35 1). Esta fase do modo UF2 foi executada também num ponto de temperatura elevada de 45 °C +/- 5 °C. Em seguida, uma mistura de queda de pressão baixa foi realizada onde a bomba de alimentação foi controlada para manter uma queda de pressão de 34,47-68,95 kPa através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e um exame espetrofotométrico foi executado para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 219 g de E25/1. O Quadro 14 sumariza os resultados da produção e do fluxo mensurado durante as fases UFl, DF (DF1+DF2) e UF2.

Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 ml foi analisada para a deteção e uma titulação da biocarga. 0 resultado deste teste foi <0,13 UFC/ml. O conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o produto foi deslocado da membrana num modo de passagem única usando 5 1 de tampão de DF adicionados à linha do retentado. O produto foi filtrado num tanque de recuperação através de um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro de 0,69 m2, seguido por um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro de 0,19 m2. O conjunto no tanque da recirculação foi bombeado então para o tanque usando uma bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução de proteína residual foi deslocada em seguida para baixo da linha do tanque e da alimentação com um fluxo de gás azoto a 34,47 kPa. A fase final foi um fluxo para baixo da unidade da membrana, que constava agora na maior parte de tampão de DF do deslocamento inicial do produto. Esta fase usou também o gás azoto a 34,47 kPa aplicado sobre ponto o mais elevado na linha do retentado. O conjunto recuperado foi primeiramente diluído a cerca de 153 g de E25/1 usando o tampão de DF. Finalmente, o conjunto foi condicionado na forma final de 20 mM de histidina / 200 mM de HCl-arginina /0,04 % de polisorbato 20 / pH 6,0. Os volumes do conjunto recuperado, do conjunto diluído, e do conjunto condicionado (conjunto Q) foram então analisados individualmente para a concentração da proteína. 0 Quadro 15 sumariza os resultados.

A FIG. 17 mostra os parâmetros do fluxo da alimentação (210), temperatura do tanque (220), dP da alimentação (230), PTM (240), taxa de fluxo do filtrado (250) durante as vária fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF1 (20), DF2 (25), UF2 (30) e dP baixo (50).

Exemplo 6

Preparação do rhuMAb E25 Líquido O Exemplo 5 foi repetido com as seguintes exceções. Um sistema de UF para produção em escala foi usado concentrar/ formular um rhuMAb E25 líquido (E25, um anticorpo monoclonal humano recombinante para IgE). Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana composta de celulose regenerada com 20,99 metros quadrados, com um tamanho de poro para 30.000 Daltons. Cada sistema consistiu de um suporte para membrana, uma bomba de alimentação giratória Viking S3S, encanamento da recirculação do aço inoxidável 316L de 3,81 cm e um recipiente de recirculação de 250 1. Um tanque 316L revestido de aço inoxidável de 250 1 foi usado para o recipiente de recirculação. A taxa de fluxo de alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 114 1/min (5,38 1/min/m2) . Durante toda a operação de pré-utilização e pós-utilização o controlo de pressão do retentado foi ajustado a uma constante de 68,95 kPa. Durante as operações da ultrafiltração e diafiltração o sistema usou o esquema do controlo Cparede para controlar o fluxo através da membrana. 0 tampão de diafiltração (20 mM de histidina / 200 mM de cloreto de arginina / pH 6,0) foi preparado num tanque separado. A temperatura deste tampão foi ajustada para 45 °C antes do inicio do processo. Isto permitiu o controlo exato da temperatura durante todo o processo. O controlo de temperatura deste tanque foi conseguido pela modulação da temperatura por alimentação de glicol no revestimento do tanque. O conjunto de proteína que resultante da etapa da cromatografia em Q-Sepharose foi medido para ser 5,5438 g de E25/1 e ter um volume de 1082 1. A proteína estava numa solução de 25 mM de tampão TRIS e cerca de 200 mM de NaCl e pH ajustados para 6,2. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste conjunto foi ajustada a 45 °C. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro; a um nível de cerca de 200 1 no tanque. No recipiente o conjunto foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a (40— 50 °C). Porque o conjunto entrante era maior que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo descontínuo de alimentação. Neste modo, o Conjunto Q foi adicionado ao recipiente de recirculação cerca de na mesma taxa que filtrado passava através da membrana TFF para o dreno. Depois o Conjunto Q restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo descontínuo. Durante o UF1 o conjunto foi concentrado a 30 g E25/1 (cerca de 200 1) . O conjunto foi então diafiltrado com 8 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50 °C. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 170 g de E25/1 (35 1) . Esta fase do modo UF2 foi executada também por meio do ajuste da elevação da temperatura a 45 °C +/- 5 °C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão de 34,47-68,95 kPa através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e um exame espetrofotométrico foi executado para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 191 g de E25/1 e o volume do conjunto foi de 31,9 1. Um gráfico do processo do parâmetro tempo excedente era comparável aqueles acima observados e sumariados na FIG. 17.

Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 ml foi analisada para a deteção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi abaixo do limite de deteção (< 0,13 UFC/ml). O conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o produto foi deslocado da membrana num modo de passagem única usando 5 1 de tampão de DF adicionados à linha do retentado. 0 produto foi filtrado num tanque de recuperação através de um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro de 0,69 m2, seguido por um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro de 0,19 m2. O conjunto no tanque da recirculação foi bombeado então para o tanque usando uma bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução de proteína residual foi deslocada em seguida para baixo da linha do tanque e da alimentação com um fluxo de gás azoto a 34,47 kPa. A fase final foi um fluxo para baixo da unidade da membrana, que constava agora na maior parte de tampão de DF do deslocamento inicial do produto. Esta fase usou também o gás azoto a 34,47 kPa aplicado sobre ponto o mais elevado na linha do retentado. O conjunto recuperado foi primeiramente diluído a cerca de 153 g de E25/1 usando o tampão de DF. Finalmente, o conjunto foi condicionado na forma final de 20 mM de histidina / 200 mM de HCl-arginina / 0,04 % de polisorbato 20 / pH 6,0. Os volumes do conjunto recuperado, do conjunto diluído, e do conjunto condicionado (conjunto Q) foram então analisados individualmente para a concentração da proteína. O Quadro 15 sumariza os resultados.

Exemplo 7

Efeito da Temperatura Elevada na Qualidade do Produto

As amostras de E25 a 30 g/1 e 150 g/1 em histidina e tampões Q foram mantidas em várias temperaturas durante 24 horas. As amostras foram submetidas a mensuração por turbidimetria e ensaios SEC. Os resultados da turbidimetria contra a temperatura para E25 a 30 g/1 no tampão Q são mostrados na FIG. 18. A FIG. 19 mostra a quantidade de agregado solúvel de E25 (150 g/1 em tampão histidina 50 mM, pH 6,0) observado ao longo do tempo e a temperatura de 23 °C, 40 °C, 50 °C, 60 °C e 70 °C. Os quatro intervalos de tempo (0 hora, 4 horas, 7,5 horas, e 24 horas) para cada uma destas temperaturas são mostrados como o conjunto de quatro barras da esquerda para a direita como 1810 e 1910, nas FIGS. 18 e 19. A turbidimetria da solução estava essencialmente inalterada após 24 horas a 60 °C. Nenhum agregado solúvel de E25 significativo foi observado abaixo de 70 C, que sugere que as amostras do produto eram substancialmente estáveis até pelo menos 60 °C e pelo menos 24 horas.

Exemplo 8

Efeito da Temperatura Elevada na Biocarga

As amostras de E25 a 30 g/1 em tampão de arginina e histidina foram inoculadas com 103 unidades formadoras de colónias por o ml para dois organismos do teste: um Gram positivo (Staphylococcus aureus) ; e um Gram negativo (Pseudomonas chlororaphis). As amostras foram feitas após 1,5 hora e 6 horas. Os resultados mostrados nos gráficos de barra das FIGS. 20 e 21 indicam que estes organismos estão ambos diminuídos com o aumento da temperatura. Os três intervalos de temperatura (25 °C, 40 °C, e 50 °C) para cada intervalo observado de tempo são mostrados como conjunto de três barras da esquerda para a direita como 2010 e 2110, nas FIGS. 20 e 21. As inoculações mostradas foram conduzidas em tampão de arginina com concentrações de proteína a 30 g/1.

Exemplo 9

Efeito da Temperatura no Fluxo do Processo

As amostras de E25 a 10 g/1 em arginina a 0,2 M, 25 mM de tampão histidina, pH 6,0 foram avaliadas para sua influência no fluxo contra a pressão transmembrana (PTM). A FIG. 22 mostra que a elevação da temperatura no sistema

aumentou também o fluxo do processo durante as operações de UF/DF. Excursões do fluxo a vários volumes de concentrações e em três temperaturas diferentes de 23 °C (2210), 40 °C (2220) e 46 °C (2230) foram executados. O coeficiente de transferência de massa e o fluxo de filtrado aumentaram em cerca de 2 a cerca de 3 vezes proporcionando consideravelmente um tempo de processo reduzido.

Exemplo 10

Formulação de Alta Concentração de rhuMAB anti-CP20 ("2H7")

Um sistema piloto de UF para produção em escala foi usado para concentrar/formular o rhuMAb anti-CD20 (2H7, um anticorpo monoclonal humano recombinante). O exemplo 1 foi repetido com as seguintes exceções. Um sistema Millipore Pelicon de Ultrafiltração /Diafiltração foi montado com uma membrana 1,63 metros quadrados, composta de celulose regenerada para 30.000 Daltons. Cada sistema consistiu de um suporte para membrana, uma bomba de alimentação giratória Viking S3S, encanamento da recirculação do aço inoxidável 316L de 1,27 cm e um recipiente de recirculação de 40 1. Válvulas reguladores de contrapressão foram H.D. Baumann, Inc. A temperatura da alimentação de glicol no revestimento do tanque foi elevada ou diminuída regulado como necessário utilizando um permutador de calor elétrico, uma fonte fria do glicol, ou ambos.

Durante este funcionamento, a taxa de fluxo da alimentação foi ajustada a uma taxa constante de 8,5 1/min (cerca de 5,38 1/min/m2) . A FIG. 23 expõe que o valor ao longo do tempo tende para a taxa de fluxo da alimentação (210) escala de 0 a 20, pH (212) escala de 2 a 12, taxa de fluxo do filtrado (250) escala de 0 0 5, tanque de reciclagem (2320) escala de 0 a 45, dP do retentado (2350) escala de 0 a 100 durante as várias fases ou modo do processo incluindo UF1 (10), DF1 (20), e UF2 (30).

Durante as operações de ultrafiltração e diafiltração o sistema usou a pressão constante do retentado seguida por um esquema constante de controlo de pressão delta de alimentação/retentado para controlar o fluxo através da membrana. O tampão de diafiltração (30 mM de acetato do sódio / pH 4,9) foi preparado num tanque separado. A temperatura deste tampão foi ajustada a 45 °C antes do processo para o controlo exato da temperatura no processo inteiro. Antes de processar, a solução do armazenamento do sistema (0,1 N de NaOH) foi equilibrada numa única passagem para drenar primeiramente com 10,76 1/m2 de água para injeção (WFI) e em seguida com 10,76 1/m2 de tampão de diafiltração. Após as lavagens, o sistema foi equilibrado por meio da recirculação de 5,38 1/m2 de tampão de diafiltração durante 10 minutos. O pH da solução recirculada foi verificado para confirmar o equilíbrio. O conjunto de proteínas que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose anterior foi mensurado como sendo 2,31 g de 2H7/1 e teve um volume de 356 1. A proteína estava numa solução de 6 mM de HEPES livre de ácido / 19 mM de HEPES sal do sódio e 25 mM de acetato do sódio que tinha sido ajustado a um pH 5,3 com ácido acético a 0,5 M. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste conjunto foi ajustado a 45 °C. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro a um nível de cerca de 40 1 no tanque. No recipiente o conjunto foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a 40-50 °C.

Devido ao conjunto entrante ser maior que o recipiente de recirculação, o processo UF1 começou no modo descontinuo de alimentação (veja-se FIG. 23). Neste modo, o Conjunto Q foi adicionado ao recipiente de recirculação cerca de na mesma taxa que filtrado passava através da membrana TFF para o dreno. Depois o Conjunto Q restante ser transferido ao recipiente de recirculação, o processo UF1 continuou no modo descontinuo. Durante o UF1 o conjunto foi concentrado a 50 g de 2H7/1 (cerca de 16 1) . O conjunto foi então diafiltrado com 10 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50 °C. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 190 g de 2H7/1 (4,3 1) . Veja-se na FIG. 23 a incorporação do controlo constante de dP em 344,74 kPa no fim desta fase. Esta fase foi executada também por meio do ajuste da elevação da temperatura a 45 °C +/- 5 °C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão onde a bomba de alimentação foi controlada para manter 137,9 kPa através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma medida da densidade foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 189 g de 2H7/1. O Quadro 16 sumariza os resultados de produção e fluxo.

0 conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas. Primeiro, o produto foi deslocado da membrana num modo de passagem única usando 0,2 1 de tampão de DF adicionados à linha do retentado. O produto foi filtrado num tanque de recuperação através de um filtro estéril da classe de 0,22 micra de poro. O conjunto no tanque da recirculação foi bombeado então para o tanque usando uma bomba de alimentação de lóbulo giratória. A solução de proteína residual foi deslocada em seguida para baixo da linha do tanque e da alimentação com um fluxo de gás azoto a 34,47 kPa. A fase final foi um fluxo para baixo da unidade da membrana, que constava agora na maior parte de tampão de DF do deslocamento inicial do produto. Esta fase usou também o gás azoto a 34,47 kPa aplicado sobre ponto o mais elevado na linha do retentado.

Se for necessário, o conjunto recuperado foi primeiramente diluído a cerca de 175 g de 2H7/1 usando o tampão de diluição (30 mM de acetato de sódio, pH 5,3) . Finalmente, o conjunto foi diluído a uma concentração de 150 g de 2H7/1 e condicionado na forma final de 30 mM de acetato de sódio, 49 % de trehalose, 0,21 % de polisorbato, pH 5,3.

Os volumes do conjunto recuperado, do conjunto diluído, e do conjunto condicionado foram então analisados para a concentração da proteína. 0 Quadro 17 apresenta os resultados.

Após o processo, a membrana foi regenerada usando NaOH a 0,1 N, com uma lavagem de passagem única de 10,76 1/m2 seguido pela recirculação total 5,38 1/m2 durante 30 minutos. Isto foi seguido pela lavagem por 10,76 1/m2 de AP (água pura). Seguido por uma recirculação total da solução de Minncare® durante 30 minutos. O sistema foi outra vez lavado com 10,76 1/m2 de AP e recirculado finalmente durante 15 minutos com NaOH a 0,1 N e armazenado.

Exemplo 11

Formulação de Alta Concentração de rhuMAb Anti-CD20

Um sistema piloto de UF para produção em escala foi usado para concentrar/formular o rhuMAb anti-CD20 (2H7) para a utilização num estudo clínico de fase I em humanos numa facilidade de fabrico GMP. O Exemplo 10 foi repetido com as seguintes exceções. O conjunto de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose anterior foi mensurado como

sendo 3,729 g de 2H7/1 e teve um volume de 262 1. A proteína estava numa solução de 6 mM de HEPES livre de ácido / 19 mM de HEPES sal do sódio e 25 mM de acetato do sódio que tinha sido ajustado a um pH 5,3 com ácido acético 0,5 M. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste conjunto foi ajustada a 45 °C. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro; a um nível de cerca de 40 1 no tanque. No recipiente o conjunto foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a 40-50 °C.

Durante o UF1 o conjunto foi concentrado a 50 g de 2H7/1 (cerca de 20 1). A FIG. 24 demonstra que a tendência de valor sobre a hora para o tanque de reciclagem (210) escala de -0,713963 a 295,989, dP do retentado (2420), escala de -0,237899 a 98,6629, taxa de fluxo da alimentação (250) escala de -0,356981 a 147, 994 e taxa de fluxo do filtrado (2450) escala de -0,118994 a 49,3315 durante o processo. O conjunto foi então diafiltrado com 10

diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50 °C. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 190 g de 2H7/1 (5,25 1) . Veja-se na FIG. 24 a incorporação do controlo constante de dP em 275,79 kPa no fim desta fase. Esta fase foi executada também por meio do ajuste da elevação da temperatura a 45 °C +/- 5 °C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão onde a bomba de alimentação foi controlada para manter 137,9 kPa através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma medida da densidade foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 194 g de 2H7/1. 0 Quadro 18 sumariza os resultados de produção e fluxo.

Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 ml foi analisada para a deteção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi abaixo do limite de deteção (isto é, <0,13 UFC/ml). O conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas do exemplo 10. Os volumes do conjunto recuperado, do conjunto diluído, e do conjunto condicionado foram então analisados para a concentração da proteína. O Quadro 19 apresenta os resultados. A membrana foi regenerada como no Exemplo 10.

Exemplo 12

Formulação de Alta Concentração de rhuMAb Anti-CD20 GMP 0 Exemplo 11 foi repetido com as seguintes exceções. 0 conjunto de proteína que resultou da etapa de cromatografia em Q-Sepharose anterior foi mensurado como sendo 5,106 g de 2H7/1 e teve um volume de 196 1. A proteína estava numa solução de 6 mM de HEPES livre de ácido / 19 mM de HEPES sal do sódio e 25 mM de acetato do sódio que tinha sido ajustado a um pH 5,3 com ácido acético 0,5 M. Apenas antes do funcionamento, a temperatura deste conjunto foi ajustado a 45 °C. Para iniciar o funcionamento o conjunto de proteína foi transferido ao recipiente de recirculação, através de um filtro com 0,22 micra de poro a um nível de cerca de 40 1 no tanque. No recipiente o conjunto foi agitado por agitador montado no topo e a temperatura foi mantida a 40-50 °C.

Durante o UFl o conjunto foi concentrado a 50 g de 2H7/1 (cerca de 20 1). A FIG. 24 demonstra que a tendência de valor sobre a hora para o tanque de reciclagem (210) escala de 0 a 150, dP do retentado (2520) , escala de 0 a 100, taxa de fluxo da alimentação (250) escala de 0 a 100 e taxa de fluxo do filtrado (2550) escala de 0 a 50 durante o processo. O conjunto foi então diafiltrado com 10 diavolumes do tampão de diafiltração. Durante a

diafiltração o ponto ajustado da temperatura do recipiente de recirculação foi mantido entre 40 e 50 °C. A diafiltração foi executada num volume constante, que foi conseguido por meio da combinação da taxa de fluxo da solução protegida que está a ser transferida ao tanque de recirculação à taxa de fluxo do filtrado que está a ser removido do sistema. No final da diafiltração, o conjunto foi concentrado adicionalmente na modalidade UF2 a uma concentração final > 190 g de 2H7/1 (5,26 1) outra vez utilizando o controlo de dP constante no final desta fase (veja-se, FIG. 25). Esta fase foi executada também por meio do ajuste da elevação da temperatura a 45 °C +/- 5 °C. Em seguida, mantendo uma queda na pressão onde a bomba de alimentação foi controlada para manter 137,9 kPa através do canal de alimentação. Uma amostra foi puxada e uma medida da densidade foi executada para confirmar a concentração antes da recuperação. A concentração desta amostra foi de 191 g de 2H7/1. O Quadro 20 sumariza os resultados de produção e fluxo.

Apenas antes da recuperação do produto, uma amostra de 30 ml foi analisada para a deteção e uma titulação da biocarga. O resultado deste teste foi abaixo do limite de deteção (isto é, <0,13 UFC/ml). O conjunto de proteína foi recuperado por uma série das etapas do Exemplo 11. Os volumes do conjunto recuperado, do conjunto diluído, e do conjunto condicionado foram então analisados para a concentração da proteína. 0 Quadro 21 apresenta os resultados. A membrana foi regenerada como no Exemplo 11.

A divulgação foi descrita com referência às várias formas de realização e técnicas específicas e preferidas.

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 6252055 B [0001] • US 4816567 A [0015] [0016] [0040] [0041] • WO 199824893 A [0015] • WO 199634096 A [0015] • WO 199633735 A [0015] • WO 199110741 A [0015] • US 5545806 A [0015] • US 5569825 A [0015] • US 5591669 A [0015] • US 5545807 A [0015] • WO 199717852 A [0015] • US 5625126 A [0015] • US 5633425 A [0015] • US 5661016 A [0015] • US 5641870 A [0018] • US 6172213 B [0038] • US 0219592 W [0039] • US 0120118 W [0039] • US 0125464 W [0039] • US 0126626 W [0039] • US 0228859 W [0039] • US 0241798 W [0039] • US 0212206 W [0039] • US 0311148 W [0039] • US 0212619 W [0039] • US 0233050 W [0039] • US 6582959 B [0039] • US 20020122797 A1 [0039] • JP 01268646 A [0057] • US P6172213 B [0084]

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Lisboa, 20 de Janeiro de 2015

Claims (49)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para preparar composições de anticorpos altamente concentradas, que compreende: a) uma primeira ultrafiltração de uma primeira preparação de anticorpos para proporcionar uma segunda preparação de anticorpos que compreende o retentado da primeira ultrafiltração; b) uma diafiltração da segunda preparação de anticorpos para proporcionar uma preparação de anticorpos intermediária diafiltrada que compreende o retentado da diafiltração; e c) uma segunda ultrafiltração da preparação de anticorpos intermediária diafiltrada para proporcionar uma terceira preparação de anticorpos que compreende o retentado da segunda ultrafiltração; em que uma ou mais das etapas a) , b) , e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 30 °C a cerca de 70 °C.
2. 2. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais das etapas a) , b) , e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 30 °C a cerca de 50 °C.
3. 3. O processo de acordo com a reivindicação 2, em que as etapas a), b), e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 30 °C a cerca de 50 °C.
4. 4. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais das etapas a) , b) , e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 35 °C a cerca de 50 °C.
5. 5. O processo de acordo com a reivindicação 4, em que as etapas a), b), e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 35 °C a cerca de 50 °C.
6. 6. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais das etapas a) , b) , e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 45 °C.
7. 7. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais das etapas a) , b) , e c) são levadas a cabo a uma temperatura de cerca de 40 °C a cerca de 50 °C.
8. 8. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais das etapas a) , b) e c) são levadas a cabo a uma temperatura de 40 °C.
9. 9. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que uma ou mais das etapas a) e b) e c) são levadas a cabo a uma temperatura de 40 °C a 50 °C, ou 45 °C ± 5 °C.
10. 10. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o processo é conseguido em: i. de cerca de 1 a cerca de 10 horas; ii. de cerca de 2 a cerca de 5 horas; ou iii. cerca de 3 horas.
11. 11. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 0,1 a 10 g/1.
12. 12. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que a primeira preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 1 a 5 g/1.
13. 13. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a segunda preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 10 a 50 g/1.
14. 14. O processo de acordo com a reivindicação 13, em que a segunda preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 20 a 40 g/1.
15. 15. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a terceira preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 50 a 250 g/1.
16. 16. O processo de acordo com a reivindicação 15, em que a terceira preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 100 a 230 g/1.
17. 17. O processo de acordo com a reivindicação 16, em que a terceira preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de cerca de 170 a 200 g/1.
18. 18. O processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, em que a preparação de anticorpos intermediária tem uma concentração de anticorpos de cerca de 25 a cerca de 35 g/1 e a terceira preparação de anticorpos tem uma concentração de anticorpos de desde cerca de 170 até cerca de 200 g/1.
19. 19. O processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que a primeira ultrafiltração concentra a primeira preparação de anticorpos para proporcionar a segunda preparação de anticorpos que tem uma concentração de anticorpos de cerca de 30 g/1 e a segunda ultrafiltração concentra a preparação de anticorpos intermediária para proporcionar a terceira preparação de anticorpos que tem uma concentração de anticorpos de cerca de 170 a cerca de 200 g/1.
20. 20. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o rendimento da terceira preparação de anticorpos é superior a cerca de 70 % em peso com base no peso de anticorpos na primeira preparação de anticorpos.
21. 21. O processo de acordo com a reivindicação 20, em que o rendimento da terceira preparação de anticorpos é de cerca de 80 a cerca de 100 % em peso com base no peso de anticorpos na primeira preparação de anticorpos.
22. 22. O processo de acordo com a reivindicação 21, em que o rendimento da terceira preparação de anticorpos é superior a cerca de 98 % em peso com base no peso de anticorpos na primeira preparação de anticorpos.
23. 23. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as etapas de filtração a) , b) , e c) utilizam uma membrana de ultrafiltração.
24. 24. O processo de acordo com a reivindicação 23, em que as etapas de filtração a) , b) , e c) são conseguidas por meio de filtração de fluxo tangencial através de uma membrana de ultrafiltração.
25. 25. O processo de acordo com a reivindicação 23 ou a reivindicação 24, em que uma membrana de ultrafiltração utilizada na etapa de filtração a) é usada na etapa b) e na etapa c).
26. 26. O processo de qualquer uma das reivindicações 23-24, em que a membrana de ultrafiltração usada nas etapas a) e c) compreende uma membrana de ultrafiltração de compósito de celulose regenerada.
27. 27. O processo de qualquer uma das reivindicações 23-24, em que a membrana de ultrafiltração usada nas etapas a) e c) tem um tamanho de poro nominal de cerca de 5 a 50 kiloDaltons.
28. 28. O processo de acordo com a reivindicação 1, em que a membrana de ultrafiltração usada nas etapas a) e c) tem um tamanho de poro nominal de cerca de 10 a 30 kiloDaltons.
29. 29. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a primeira preparação de anticorpos compreende um anticorpo que tem um peso molecular aparente de cerca de 100 a 200 kiloDaltons.
30. 30. O processo de acordo com a reivindicação 29, em que a primeira preparação de anticorpos compreende um anticorpo que tem um peso molecular aparente de cerca de 150 kiloDaltons.
31. 31. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a diafiltração permuta um primeiro tampão por um segundo tampão.
32. 32. O processo de acordo com a reivindicação 31, em que o primeiro tampão compreende uma mistura de cloreto de sódio aquoso e um tampão TRIS, e o segundo tampão compreende uma mistura de cloreto de arginina e cloreto de histidina aquoso.
33. 33. O processo de acordo com a reivindicação 30 ou a reivindicação 31, em que a etapa de diafiltração consegue uma permuta de tampões em volume constante, concentração de anticorpos constante, ou ambos.
34. 34. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a diafiltração consegue uma permuta de tampões de desde cerca de 5 até 15 vezes o volume.
35. 35. 0 processo de acordo com a reivindicação 34, em que a diafiltração consegue uma permuta de tampões de cerca de 8 vezes o volume.
36. 36. 0 processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que etapa b) compreende uma ou mais etapas de diafiltração.
37. 37. 0 processo de acordo com a reivindicação 36, em que uma primeira etapa de diafiltração consegue uma permuta de tampões de cerca de 4 vezes o volume e uma segunda etapa de diafiltração consegue uma permuta de tampões de cerca de 4 vezes o volume.
38. 38. 0 processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a primeira ultrafiltração tem uma taxa de recirculação de desde cerca de 5,38 1/min/m2 até cerca de 53,82 1/min/m2.
39. 39. 0 processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a ultrafiltração e diafiltração são conseguidas a uma pressão transmembrana de desde cerca de 34,47 até cerca de 344,74 kPa.
40. 40. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que as etapas a), b), e c) são conseguidas a uma pressão transmembrana de cerca de 68,95 a cerca de 344,74 kPa.
41. 41. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a terceira preparação de anticorpos tem uma biocarga detetável de menos de cerca de 100 UFC/ml.
42. 42. O processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo anti-IgE.
43. 43. 0 processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o nível de contaminantes de agregados na terceira preparação de anticorpos é inferior a 5 porcento em peso.
44. 44. 0 processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o nível de contaminantes de agregados na terceira preparação de anticorpos é inferior a 2 porcento em peso.
45. 45. 0 processo de qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.
46. 46. 0 processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 44, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado, ou um anticorpo humano.
47. 47. 0 processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 44, em que o anticorpo é um diabody, um anticorpo linear, um anticorpo de cadeia única, ou um anticorpo multiespecífico.
48. 48. 0 processo de qualquer uma das reivindicações 1 a 44, em que o anticorpo é um fragmento de ligação a antigénio selecionado a partir do grupo que consiste em fragmento Fab, Fab', F(ab')2, e Fv.
49. 49. 0 processo de acordo com a reivindicação 45, em que o anticorpo é rhuMAbE25 anti-IgE ou fragmento de ligação a antigénio do mesmo. Lisboa, 20 de Janeiro de 2015