CN109843906A - 处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法及其用途 - Google Patents

处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法及其用途 Download PDF

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Abstract

本文提供了处理流体的方法，其包括使用包括切向流过滤(TFF)单元的回路系统和包括切向流病毒过滤(TFVF)单元的回路系统中的一个或两个。还提供了用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的过程，其包括使用本文提供的任何方法处理包含重组治疗性蛋白质的流体的步骤。

Description

处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法及其用途
对相关申请的交叉引用
本申请要求2016年8月16日提交的美国临时专利申请序号62/375,689的优先权；其全部内容通过提述并入本文。
技术领域
本发明涉及重组蛋白的生物技术和生物制备的方法。
背景技术
含有编码重组蛋白的核酸的哺乳动物细胞经常用于产生治疗或商业上重要的蛋白质。在目前的多种多样产品渠道的环境中，生物技术公司越来越多地致力于开发高度灵活且成本效益好地制备治疗性蛋白质药物的创新解决方案。
发明概述
本发明至少部分地基于以下发现：包括切向流过滤(TFF)单元或切向流病毒过滤(TFVF)单元的回路系统可分别用于连续进行超滤/渗滤和病毒过滤的单元操作。鉴于该发现，本文提供了处理流体的方法，其包括使用包含切向流过滤(TFF)单元的回路系统和包含切向流病毒过滤(TFVF)单元的回路系统中的一个或两个。还提供了用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的过程，其包括使用本文提供的任何方法处理包含重组治疗性蛋白质的流体的步骤。
本文提供了处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括：(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单元，和(ii)所述第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出所述系统或使流体流入和流出所述系统的至少一个端口，其中配置所述系统，使流体可流过所述导管和所述TFF单元，并且可以从所述TFF单元收集不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第一段时间；(c)通过所述至少一个端口中的一个，使渗滤介质连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第二段时间；和(d)在所述第一和第二段时间之后，通过所述至少一个端口中的一个，收集存在于所述回路系统中的包含所述重组治疗性蛋白质的流体。在这些方法的一些实施方案中，步骤(b)包括使所述流体以约0.1mL/分钟至约100L/分钟(例如，约0.5mL/分钟至约200L/分钟)的速率连续地流入所述回路系统。在这些方法的一些实施方案中，第一段时间为约0.1分钟至约12小时(例如，约10分钟至约4小时)。在这些方法的一些实施方案中，步骤(b)中所述流体流入所述回路系统单向地发生。在这些方法的一些实施方案中，步骤(c)包括使所述渗滤介质以约0.1mL/分钟至约100L/分钟(例如，约0.5mL/分钟至约200L/分钟)的速率连续地流入所述回路系统。在这些方法的一些实施方案中，第二段时间为约5分钟至约12小时(例如，约10分钟至约4小时)。在这些方法的一些实施方案中，在步骤(c)中渗滤介质流入所述回路系统单向地发生。在这些方法的一些实施方案中，所述导管具有约5mm至约5cm(例如，约10mm至约3cm)的内径。在这些方法的一些实施方案中，所述TFF单元包含一个或多个具有约0.1cm2至约50cm2(例如，约0.5cm2至约20cm2)的表面积的切向过滤器。在这些方法的一些实施方案中，回路系统进一步包含设置在所述导管中的泵(例如，蠕动泵)。
这些方法的一些实施方案进一步包括：(e)提供第二回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流病毒过滤(TFVF)单元，和(ii)所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出所述第二系统或流入和流出所述第二系统的至少一个端口，其中配置所述第二系统，使流体可流过所述导管和所述TFVF单元，并且可以从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；和(f)使用在所述系统的端口和所述第二系统的端口之间流体连通的连接导管使步骤(d)的收集的流体流入所述第二系统，并且从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第三段时间。在这些方法的一些实施方案中，步骤(f)包括使所述流体以约0.1mL/分钟至约100L/分钟(例如，约0.5mL/分钟至约200L/分钟)的速率流入所述第二系统。在这些方法的一些实施方案中，所述第三段时间为约0.1分钟至约12小时(例如，约10分钟至约2小时)。在这些方法的一些实施方案中，步骤(f)中所述流体流入所述第二系统单向地发生。在这些方法的一些实施方案中，所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管具有约5mm至约5cm(例如，约10mm至约3cm)的内径。在这些方法的一些实施方案中，所述TFVF单元包含一个或多个具有约0.1cm2至约100m2(例如，约0.5cm2至约200m2)的表面积的切向病毒过滤器。在这些方法的一些实施方案中，所述连接导管具有约5mm至约10cm(例如，约10mm至约5cm)的内径。在这些方法的一些实施方案中，第二系统进一步包括设置在所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管中的泵(例如，蠕动泵)。
还提供了处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，所述方法包括：(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流病毒过滤(TFVF)单元，和(ii)所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出系统或流入和流出系统的至少一个端口，其中配置所述系统，使流体可流过所述导管和所述TFVF单元，并且可以从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续一段时间。在这些方法的一些实施方案中，步骤(b)包括使所述流体以约0.1mL/分钟至约100L/分钟(例如，约0.5mL/分钟至约200L/分钟)的速率连续地流入所述系统。在这些方法的一些实施方案中，所述一段时间为约5分钟至约12小时(例如，约10分钟至约3小时)。在这些方法的一些实施方案中，步骤(b)中所述流体流入所述系统单向地发生。在这些方法的一些实施方案中，所述导管具有约5mm至约5cm(例如，约10mm至约3cm)的内径。在这些方法的一些实施方案中，所述TFVF单元包含一个或多个具有约0.1cm2至约100m2(例如，约0.5cm2至约200m2)的表面积的切向病毒过滤器。在这些方法的一些实施方案中，系统进一步包含设置在所述导管中的泵(例如蠕动泵)。
还提供了用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的方法，所述方法包括：(a)提供基本上没有细胞的包含重组治疗性蛋白质的液体培养基，其中使所述液体培养基进料至第一多柱色谱系统(MCCS1)；(b)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的重组治疗性蛋白质，其中使含有所述重组治疗性蛋白质的MCCS1的洗脱液连续进料至第二多柱色谱系统(MCCS2)；(c)使用所述MCCS2纯化和抛光所述重组治疗性蛋白质，其中来自所述MCCS2的洗脱液是包含所述重组治疗性蛋白质的流体；(d)使用本文所述的任何方法处理包含重组治疗性蛋白质的流体；其中所述方法被整合，并从所述液体培养基连续运行至包含所述重组治疗性蛋白质的收集的流体或滤液，其中收集的流体或滤液是所述治疗性蛋白质药物。在这些方法的一些实施方案中，MCCS1进行至少两个不同单元操作。在这些方法的一些实施方案中，所述MCCS1进行捕获所述重组治疗性蛋白质和灭活病毒的单元操作。在这些方法的一些实施方案中，MCCS1或MCCS2的使用或两者的使用涉及柱转换。在这些方法的一些实施方案中，所述MCCS1和/或MCCS2利用至少两个色谱柱。在这些方法的一些实施方案中，所述MCCS1和/或MCCS2利用至少两个色谱膜。在这些方法的一些实施方案中，所述MCCS1和/或MCCS2利用至少一个色谱柱和至少一个色谱膜。在这些方法的一些实施方案中，所述MCCS1是第一周期性逆流色谱系统(PCCS1)。在这些方法的一些实施方案中，所述PCCS1包含四柱PCCS。在这些方法的一些实施方案中，所述四柱PCCS中的四个柱中的三个进行从所述液体培养基中捕获所述重组治疗性蛋白质的单元操作。在这些方法的一些实施方案中，所述捕获使用亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱或分子筛色谱进行。在这些方法的一些实施方案中，所述亲和色谱用选自下组的捕获机制进行：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。在这些方法的一些实施方案中，所述亲和色谱用蛋白A结合捕获机制进行，并且所述重组治疗性蛋白质是抗体或抗体片段。在这些方法的一些实施方案中，使来自所述四柱PCCS的四个柱中的三个的含有重组治疗性蛋白质的洗脱液进料至所述四柱PCCS的第四柱。在这些方法的一些实施方案中，所述四柱PCCS的第四柱通过使含有重组治疗性蛋白质的洗脱液保持在低pH进行病毒灭活来进行灭活病毒的单元操作。在这些方法的一些实施方案中，所述四柱PCCS的第四柱使含有重组治疗性蛋白质的洗脱液保持在低pH进行病毒灭活持续约10分钟至约1.5小时的一段时间。
在这些方法的一些实施方案中，所述MCCS2是第二周期性逆流色谱系统(PCCS2)。这些方法的一些实施方案进一步包括在使来自所述四柱PCCS的第四柱的洗脱液进料至所述PCCS2之前，使用管线内缓冲液调节储存器调节来自所述四柱PCCS的第四柱的洗脱液的pH。在这些方法的一些实施方案中，所述PCCS2包含三个色谱柱和一个色谱膜。在这些方法的一些实施方案中，所述PCCS2中的三个色谱柱通过阳离子或阴离子交换色谱进行纯化来自所述PCCS1的洗脱液的重组治疗性蛋白质的单元操作。在这些方法的一些实施方案中，使来自所述PCCS2的三个色谱柱的洗脱液进料至所述PCCS2的色谱膜。在这些方法的一些实施方案中，所述PCCS2中的色谱膜通过阳离子或阴离子交换色谱进行抛光存在于来自所述PCCS2的三个色谱柱的洗脱液中的所述重组治疗性蛋白质的单元操作。在这些方法的一些实施方案中，所述PCCS2的色谱膜进行通过阳离子交换色谱的抛光的单元操作。在这些方法的一些实施方案中，所述流过色谱膜和洗涤色谱膜包含重组治疗性蛋白质。这些方法的一些实施方案进一步包括在使来自所述PCCS2的三个柱的洗脱液进料至所述PCCS2的色谱膜之前，使用管线内缓冲液调节来调节来自所述PCCS2的三个柱的洗脱液的离子浓度。这些方法的一些实施方案进一步包括使用所述PCCS1和所述PCCS2之间的断流水箱。这些方法的一些实施方案进一步包括在使来自所述PCCS1的洗脱液进料至所述PCCS2之前对其过滤。这些方法的一些实施方案进一步包括将所述治疗性蛋白质药物配制成药物组合物。在本文所述的任何方法或过程的一些实施方案中，所述重组治疗性蛋白质是抗体或抗体片段、酶、经工程改造的蛋白质或免疫原性蛋白或蛋白质片段。
如本文所使用的，名词前的单词“a”表示一个或多个该特定名词。例如，短语“哺乳动物细胞”代表“一个或多个哺乳动物细胞”。
术语“切向流过滤单元”或“TFF单元”是本领域已知的并且意指包括至少一个外壳(诸如圆筒)和至少一个横流(切向)过滤器的装置，该横流过滤器位于外壳中使得过滤器表面的大部分位于与通过该单元的流体(例如，细胞培养物)的流动平行的位置。TFF单元在本领域中是公知的并且是可商购的。外壳可包括第一入口/出口和第二入口/出口，第一入口/出口和第二入口/出口的放置例如允许流体穿过第一入口/出口，穿过至少一个横流过滤器，并穿过第二入口/出口。在一些实例中，回路系统可以包括多个TFF单元，例如，串联和/或并联连接的多个TFF单元。例如，包括两个或更多个TFF单元的回路系统可以包括流体地连接系统中的相邻TFF单元对的流体管道。在其他实例中，回路系统可包括两组或更多组通过流体管道流体地连接的两个或更多个TFF单元。本文描述的或本领域已知的任何TFF单元能够在第一流动方向和第二流动方向接收流体。
术语“切向流病毒过滤单元”或“TFVF单元”是本领域已知的并且意指包括至少一个外壳(诸如圆筒)和至少一个横流(切向)病毒过滤器的装置，该横流过滤器位于外壳中使得病毒过滤器表面的大部分位于与通过该单元的流体(例如，细胞培养物)的流动平行的位置。外壳可包括第一入口/出口和第二入口/出口，第一入口/出口和第二入口/出口的放置例如允许流体穿过第一入口/出口，穿过至少一个横流病毒过滤器，并穿过第二入口/出口。在一些实例中，回路系统可以包括多个TFVF单元，例如，串联和/或并联连接的多个TFVF单元。例如，包括两个或更多个TFVF单元的回路系统可以包括流体地连接系统中的相邻TFVF单元对的流体管道。在其他实例中，回路系统可包括两组或更多组通过流体管道流体地连接的两个或更多个TFVF单元。本文描述的或本领域已知的任何TFVF单元能够在第一流动方向和第二流动方向接收流体。
术语“横流过滤器”或“切向过滤器”是本领域已知的并且意指设计成使其可以位于TFF或TFVF单元中的过滤器，从而过滤器表面的大部分与流体(例如，包含重组治疗性蛋白质的流体)的流动(例如，流体的第一和第二流动方向)平行。例如，横流过滤器可以具有允许切向流过滤的任何形状，例如管状或矩形。特别有用的横流过滤器被设计成当流体(例如，单向流动到双向流动)穿过横流过滤器的表面时，在流体(例如，细胞培养物)中产生少量的流体湍流或剪切应力。横流过滤器可从例如Sartorius、MembraPure、Millipore和PallCorporation商购。
术语“低湍流泵”或“LTP”是本领域已知的并且意指这样的装置：其可以使流体(例如，包含重组治疗性蛋白质的流体)在系统或回路内以单一方向(例如，第一或第二流动方向)移动或使流体(例如，包含重组治疗性蛋白质的流体)在系统内以两个方向(第一和第二流动方向)可逆地流动，而不会在流体(例如，包含重组治疗性蛋白质的流体)中引起大量的剪切应力或流体湍流。当LTP用于使流体(例如，包含重组治疗性蛋白质的流体)以交替的第一和第二流动方向流动时，第二流动方向与第一流动方向的流动方向近乎相反。LTP的一个实例是蠕动泵。LTP的其他实例是本领域已知的。
术语“哺乳动物细胞”意指来自或衍生自任何哺乳动物(例如人、仓鼠、小鼠、绿猴、大鼠、猪、牛或兔)的任何细胞。例如，哺乳动物细胞可以是永生化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是分化细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是未分化细胞。本文描述了哺乳动物细胞的非限制性实例。哺乳动物细胞的另外的实例是本领域已知的。
术语“基本上没有”意指至少或约90％没有(例如，至少或约95％、96％、97％、98％、或者至少或约99％、或约100％没有)指定物质(例如，哺乳动物细胞)的组合物(例如，液体培养基)。
术语“0.5x体积”意指该体积的约50％。术语“0.6x体积”意指该体积的约60％。同样地，0.7x、0.8x、0.9x和1.0x分别意指该体积的约70％、80％、90％或100％。
术语“培养”或“细胞培养”意指在一组受控的物理条件下维持或增殖哺乳动物细胞。
术语“哺乳动物细胞培养物”意指含有在一组受控的物理条件下维持或增殖的大量哺乳动物细胞的液体培养基。
术语“液体培养基”意指含有足够营养物以允许细胞(例如哺乳动物细胞)在体外生长或增殖的流体。例如，液体培养基可含有以下中的一个或多个：氨基酸(例如，20种氨基酸)、嘌呤(例如，次黄嘌呤)、嘧啶(例如，胸苷)、胆碱、肌醇、硫胺素、叶酸、生物素、钙、烟酰胺、吡哆醇、核黄素、胸苷、氰钴胺、丙酮酸盐(pyruvate)、硫辛酸、镁、葡萄糖、钠、钾、铁、铜、锌和碳酸氢钠。在一些实施方案中，液体培养基可含有来自哺乳动物的血清。在一些实施方案中，液体培养基不含有来自哺乳动物的血清或另一种提取物(确定的液体培养基)。在一些实施方案中，液体培养基可含有痕量金属、哺乳动物生长激素和/或哺乳动物生长因子。液体培养基的另一个实例是基本培养基(例如，仅含有无机盐、碳源和水的培养基)。本文描述了液体培养基的非限制性实例。液体培养基的另外的实例是本领域已知的并且是可商购的。液体培养基可含有任何密度的哺乳动物细胞。例如，如本文所使用的，从生物反应器中取出的一定体积的液体培养基可以基本上没有哺乳动物细胞。
术语“不含动物来源成分的液体培养基”意指不含任何源自哺乳动物的成分(例如，蛋白质或血清)的液体培养基。
术语“不含血清的液体培养基”意指不含哺乳动物血清的液体培养基。
术语“含血清的液体培养基”意指含有哺乳动物血清的液体培养基。
术语“化学成分确定的液体培养基”是本领域的术语，意指其中所有化学成分都已知的液体培养基。例如，化学成分确定的液体培养基不含胎牛血清、牛血清白蛋白或人血清白蛋白，因为这些制剂通常含有白蛋白和脂质的复杂混合物。
术语“不含蛋白质的液体培养基”意指不含任何蛋白质(例如，任何可检测的蛋白质)的液体培养基。
术语“搅动”意指在生物反应器中搅拌或以其他方式移动一部分液体培养基。这是为了例如增加生物反应器中液体培养基中溶解的O2浓度而进行的。搅动可以使用任何本领域已知的方法例如仪器或搅拌叶片进行。可用于在生物反应器中进行部分液体培养基搅动的示例性装置和方法是本领域已知的。
术语“治疗性蛋白质药物”意指已经从污染蛋白质、脂质和核酸(例如，存在于液体培养基中或来自宿主细胞(例如，来自哺乳动物、酵母或细菌宿主细胞)的污染蛋白质、脂质和核酸)和生物污染物(例如，病毒和细菌污染物)中充分纯化或分离并且不需要任何进一步的实质性纯化和/或净化步骤就可以配制成药剂的重组蛋白质(例如，免疫球蛋白、蛋白质片段、工程改造的蛋白质或酶)。
术语“整合过程”意指使用合作发挥作用以实现特定结果(例如，从液体培养基中产生治疗性蛋白质药物)的结构元件进行的过程。
术语“连续过程”意指通过系统的至少一部分连续进料流体的过程。例如，在本文所述的任何示例性连续生物制造系统中，含有重组治疗性蛋白质的液体培养基在系统运行时被连续进料到该系统中，并且治疗性蛋白质药物被从该系统中输出。在另一个实例中，连续过程是从生物反应器通过第一MCCS连续地进料含有重组治疗性蛋白质的液体培养基的过程。连续过程的另一个实例是从生物反应器通过第一和第二MCCS连续进料含有重组治疗性蛋白质的液体培养基的过程。另外的实例包括通过第一MCCS连续进料含有重组治疗性蛋白质的液体培养基的过程，通过第一和第二MCCS连续进料含有重组治疗性蛋白质的液体培养基的过程，或通过第二MCCS连续进料含有重组治疗性蛋白质的液体的过程。
术语“免疫球蛋白”意指含有氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列具有含有免疫球蛋白的至少15个氨基酸(例如，至少20、30、40、50、60、70、80、90或100个氨基酸)(例如，可变结构域序列、框架序列或恒定结构域序列)。免疫球蛋白可以包括例如轻链免疫球蛋白的至少15个氨基酸、例如重链免疫球蛋白的至少15个氨基酸。免疫球蛋白可以是分离的抗体(例如，IgG、IgE、IgD、IgA或IgM)。免疫球蛋白可以是IgG的亚类(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。免疫球蛋白可以是抗体片段，例如，Fab片段、F(ab′)2片段或scFv片段。免疫球蛋白还可以是双特异性抗体或三特异性抗体，或二聚体、三聚体或多聚体抗体，或双抗体、或免疫球蛋白也可以是含有至少一个免疫球蛋白结构域的工程改造的蛋白质(例如，融合蛋白)。本文描述了免疫球蛋白的非限制性实例，并且免疫球蛋白的另外的实例是本领域已知的。
术语“蛋白质片段”或“多肽片段”意指多肽序列的一部分，其长度为至少或约4个氨基酸、至少或约5个氨基酸、至少或约6个氨基酸、至少或约7个氨基酸、至少或约8个氨基酸、至少或约9个氨基酸、至少或约10个氨基酸、至少或约11个氨基酸、至少或约12个氨基酸、至少或约13个氨基酸、至少或约14个氨基酸、至少或约15个氨基酸、至少或约16个氨基酸、至少或约17个氨基酸、至少或约18个氨基酸、至少或约19个氨基酸或者至少或约20个氨基酸的长度，或多于20个氨基酸。可以使用本文描述的任何方法产生重组蛋白片段。
术语“工程改造的蛋白质”意指不是由生物体(例如，哺乳动物)内存在的内源核酸天然编码的多肽。工程改造的蛋白质的实例包括酶(例如，具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入或添加，这导致工程改造的酶的稳定性和/或催化活性增加)、融合蛋白、抗体(例如，二价抗体、三价抗体或双抗体)和含有至少一个重组支架序列的抗原结合蛋白。
术语“多柱色谱系统”或“MCCS”意指具有总共两个或更多个互相连接或转换的色谱柱和/或色谱膜的系统。多柱色谱系统的非限制性实例是周期性逆流色谱系统(PCC)，其含有总共两个或更多个互相连接或转换的色谱柱和/或色谱膜。多柱色谱系统的另外的实例在本文中描述，并且是本领域已知的。
术语“捕获”意指被进行以实现以下目的的步骤：从存在于液体培养基或稀释的液体培养基中的一种或多种其他组分(例如，培养基蛋白质或存在于哺乳动物细胞中或从哺乳动物细胞分泌的一种或多种其他组分(例如，DNA、RNA或其他蛋白质))中部分纯化或分离(例如，按重量计至少或约5％，例如，至少或约10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或者至少或约95％纯)、浓缩和稳定重组治疗性蛋白质。一般地，使用结合重组治疗性蛋白质的树脂(例如，通过使用亲和色谱法)进行捕获。本文描述了用于从液体培养基或稀释的液体培养基中捕获重组治疗性蛋白质的非限制性方法，其他方法是本领域已知的。可以使用至少一个色谱柱和/或色谱膜(例如，本文所述的任何色谱柱和/或色谱膜)从液体培养基中捕获重组治疗性蛋白质。
术语“纯化”意指被进行以实现以下目的的步骤：从存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的一种或多种其他杂质(例如，大量杂质)或组分(例如，液体培养基蛋白质或存在于哺乳动物细胞中或从哺乳动物细胞分泌的一种或多种其他组分(例如，DNA、RNA、其他蛋白质、内毒素、病毒等))分离重组治疗性蛋白质。例如，可以在初始捕获步骤期间或之后进行纯化。可以使用树脂、膜或结合重组治疗性蛋白质或污染物的任何其他固体支持物(例如，通过使用亲和色谱、疏水相互作用色谱、阴离子或阳离子交换色谱或者分子筛色谱)进行纯化。可以使用至少一个色谱柱和/或色谱膜(例如，本文所述的任何色谱柱或色谱膜)从含有重组治疗性蛋白质的流体中纯化重组治疗性蛋白质。
术语“抛光”是本领域的术语，意指被进行以实现以下目的的步骤：从含有接近最终所需纯度的重组治疗性蛋白质的流体中除去残留的痕量或少量污染物或杂质。例如，可以通过使含有重组治疗性蛋白质的流体通过一个或多个色谱柱或一个或多个膜式吸收塔来(membrane absorber)进行抛光，所述色谱柱或膜式吸收塔选择性地结合靶重组治疗性蛋白质或存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的少量污染物或杂质。在这样的实例中，一个或多个色谱柱或一个或多个膜式吸收塔的洗脱液/滤液含有该重组治疗性蛋白质。
术语“洗脱液/滤液”是本领域的术语，意指从含有可检测量的重组治疗性蛋白质的色谱柱或色谱膜发出的流体。
术语“过滤”意指从液体(例如，存在于本文所述的任何系统或进程中的液体培养基或流体)中除去至少部分(例如，至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％)不希望的生物污染物(例如，哺乳动物细胞、细菌、酵母细胞、病毒或分枝杆菌)和/或颗粒物质(例如，沉淀的蛋白质)。
术语“分泌蛋白”或“分泌重组蛋白”意指其在哺乳动物细胞内翻译时最初含有至少一个分泌信号序列，并且通过在哺乳动物细胞中至少部分酶促切割分泌信号序列而至少部分分泌到胞外空间(例如，液体培养基)中的蛋白质(例如，重组蛋白质)。熟练的从业者将理解“分泌的”蛋白质不需要完全与该细胞分离就可以被认为是分泌蛋白。
术语“灌注生物反应器”意指含有在第一液体培养基中的多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中培养存在于生物反应器中的细胞包括定期或连续除去第一液体培养基，并且在同时或不久之后将基本相同体积的第二液体培养基添加到生物反应器中。在一些实例中，在培养期间(例如，培养基每天重新进料速率)，在递增时间段(例如，约24小时的时间段，约1分钟和约24小时之间的时间段，或超过24小时的时间段)内除去和添加的第一液体培养基的体积递增变化(例如，增加或减少)。每天除去和替换的培养基部分可以根据正在培养的特定细胞、初始接种密度和特定时间的细胞密度而变化。“RV”或“反应器体积”意指培养过程开始时存在的培养基的体积(例如，接种后存在的培养基的总体积)。
术语“补料分批生物反应器”是本领域的术语，意指含有在第一液体培养基中的多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的生物反应器，其中培养存在于生物反应器中的细胞包括定期或连续向第一液体培养基中添加第二液体培养基，而不从细胞培养物中大量或显著地除去第一液体培养基或第二液体培养基。第二液体培养基可以与第一液体培养基相同。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基是第一液体培养基的浓缩形式。在补料分批培养的一些实例中，第二液体培养基作为干粉添加。
术语“澄清的液体培养基”意指从细菌或酵母细胞培养物中获得的基本上没有(例如，至少80％、85％、90％、92％、94％、96％、98％或99％不含)细菌或酵母细胞的液体培养基。
术语“单元操作”是本领域的术语，意指可以在从液体培养基制备治疗性蛋白质药物的过程中进行的功能性步骤。例如，操作单元可以是过滤(例如，从含有重组治疗性蛋白质的流体中除去污染的细菌、酵母、病毒或分枝杆菌和/或特定物质)、捕获、表位标签除去、纯化、保持或保存、抛光、病毒灭活、调节离子浓度和/或含有重组治疗性蛋白质的流体的pH、以及除去不想要的盐。
“比产生率”或“SPR”是本领域的术语，并且如本文所使用的，指每个哺乳动物细胞每天产生的重组治疗性蛋白质的质量或酶活性。重组治疗性抗体的SPR通常测量为质量/细胞/天。重组治疗性酶的SPR通常测量为单位/细胞/天或(单位/质量)/细胞/天。
“体积生产率”或“VPR”是本领域的术语，并且如本文所使用的，指每体积培养物(例如，每升生物反应器、容器或管体积)每天产生的重组治疗性蛋白质的质量或酶活性。重组治疗性抗体的VPR通常测量为质量/L/天。重组治疗性酶的VPR通常测量为单位/L/天或质量/L/天。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；另外，也可以使用本领域已知的合适方法和材料。材料、方法和实施例仅是示例说明性的而不意图是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献都通过提述以其整体并入。如果发生矛盾，则以本说明书(包括定义)为准。
从以下详细说明和附图以及从权利要求中，本发明的其他特征和优点将变得明显。
附图说明
图1是显示与灌注培养生物反应器连接的双PCCS制备系统的示意图，该系统导致连续制备治疗性蛋白质药物。星号表示示例性的位置，其中包括切向流过滤(TFF)单元的回路系统(例如，包括本文所述的TFF单元的任何回路系统)和包括切向流病毒过滤(TFVF)单元的回路系统(例如，包括本文所述的TFVF单元的任何回路系统)中的一个或两个可以位于该示例性制备系统中。
图2是显示与灌注培养生物反应器连接的制备系统的示意图，该系统导致连续制造治疗性蛋白质药物。星号表示示例性位置，其中包括TFF单元的回路系统(例如，包括本文所述的TFF单元的任何回路系统)和包括切向流病毒过滤(TFVF)单元的回路系统(例如，本文所述的TFVF单元的任何回路系统)中的一个或两个可以位于该示例性制备系统中。
图3是包含三个色谱柱的PCC系统循环的图。在循环开始时，将进料溶液装载到柱1上，流出物变成废弃物直到发生产物穿透(步骤1)。此时，来自柱1的流出物被引导至柱2以捕获来自柱1的未结合的重组治疗性蛋白质(步骤2)。一旦柱1完全装载，现在将进料装载到柱2上，同时洗涤、洗脱、再生并重新平衡柱1以进行下一循环(步骤3和4)。柱2现在经过步骤3-5，这与柱1的步骤1-3相同。最后，柱3经过步骤5-6，与柱1和柱2相同。一旦所有3个柱均完成了这些步骤，循环从柱1重新开始。
图4是演示基于-UV的柱切换原理的示意图。T1表示-UV已经达到预定阈值水平的时间。一旦达到该阈值水平，来自柱1的流出物就被引导到柱2而不是变成废弃物。T2表示柱已被产品饱和的时间。T1和T2二者的-UV值是过程特定的。
图5是包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入系统(“转移”)和丢弃不包含重组治疗性蛋白质的滤液(“渗透物”)时，在第一段时间内，包括切向流过滤单元的回路系统的示意图(左图)，和显示在第一段时间内的质量通量(g/h)随时间(h)的图(右图)。在第一段时间内重组治疗性蛋白质保留在回路系统内并再循环通过回路系统(“渗余物”)。
图6是渗滤介质连续地流入系统(“DF缓冲液”)和丢弃不包含重组治疗性蛋白质的滤液(“渗透物”)时，在第二段时间内，包括切向流过滤单元的回路系统的示意图(左图)，和显示在第二段时间内的质量通量(g/h)随时间(h)的图(右图)。在第二段时间内重组治疗性蛋白质保留在回路系统内并再循环通过回路系统(“渗余物”)。
图7是示例说明使用示例性的包括切向流过滤单元的回路系统对包含重组治疗性蛋白质的流体进行超滤/渗滤的结果的图。显示了通量(LMH)、重组治疗性蛋白质的倍数浓度(倍数)、回路系统中的流体的体积、透析体积(diavolume)和包括切向流过滤单元的回路系统的跨膜压强(TMP)随着时间的变化。
图8是示例说明使用示例性的包括切向流过滤单元的回路系统对包含重组治疗性蛋白质的流体进行超滤/渗滤的结果的图。显示了通量(LMH)、重组治疗性蛋白质的倍数浓度(倍数)、回路系统中的流体的体积、透析体积和包括切向流过滤单元的回路系统的跨膜压强(TMP)随着时间的变化。
图9是示例说明使用示例性的包括切向流过滤单元的回路系统对包含重组治疗性蛋白质的流体进行超滤/渗滤的结果的图。显示了通量(LMH)、重组治疗性蛋白质的倍数浓度(倍数)、回路系统中的流体的体积、透析体积和包括切向流过滤单元的回路系统的跨膜压强(TMP)随着时间的变化。
图10是当包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入系统(“来自UF”)并且连续收集包含重组治疗性蛋白质的滤液时(“VF产物”)，包括切向流病毒过滤单元的回路系统的示意图。
图11是示出示例性的包括切向流病毒过滤单元的回路系统的示意图。
图12是显示使用包括切向流病毒过滤单元的回路系统进行病毒过滤获得的数据的图。黑线代表压强(psi)，灰线代表渗透物质量(kg)随时间的变化。
图13是示例说明使用示例性的包括TFVF单元的回路系统，使用在12psi下操作的PlanovaTM20N过滤器，以1-2mL/min的不同再循环速率，从重组人抗体(mAb)进行鼠细小病毒(MMV)的病毒过滤的结果的图。显示了包括TFVF单元的回路系统在2.5小时内的质量和压强曲线。
图14是示例说明使用示例性的包括TFVF单元的回路系统，使用在6.6psi下操作的PlanovaTM20N过滤器，以2mL/min的不同再循环速率，从重组人抗体(mAb)进行鼠细小病毒(MMV)的连续病毒过滤的结果的图。显示了TFVF单元在22小时内的质量和压强曲线。
图15是示例说明使用示例性的包括TFVF单元的回路系统，使用在19.8psi下操作的PlanovaTMBioEx(3cm2面积)，以1mL/min的不同再循环速率，以重新进料的方式，从重组人抗体(mAb)进行鼠细小病毒(MMV)的连续病毒过滤的结果的图。显示了TFVF单元在29小时内的质量和压强曲线。
图16是示例说明使用示例性的包括TFVF单元的回路系统，使用在19.8psi下操作的PlanovaTMBioEx(10cm2面积)，以3mL/min的不同再循环速率，以重新进料的方式，从重组人抗体(mAb)进行鼠细小病毒(MMV)的连续病毒过滤的结果的图。显示了TFVF单元超过29小时的质量和压力曲线。
发明详述
本文提供了处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单元，和(ii)所述第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出所述系统或流入和流出所述系统的至少一个端口，其中配置所述系统，使流体可流过所述导管和所述TFF单元，并且可以从所述TFF单元收集不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第一段时间；(c)通过所述至少一个端口中的一个，使渗滤介质连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液持续第二段时间；和(d)在所述第一和第二段时间之后，通过所述至少一个端口中的一个，收集包含存在于所述回路系统中的所述重组治疗性蛋白质的流体。还提供了处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括：(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流病毒过滤(TFVF)单元，和(ii)所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出所述系统或流入和流出所述系统的至少一个端口，其中配置所述系统，使流体可流过所述导管和所述TFVF单元，并且可以从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；和(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液持续一段时间。如本领域技术人员可以理解的，这些方法的一些实施方案可以进一步包括再循环未穿过TFVF单元中的一个或多个切向病毒过滤器的在包括TFVF单元的回路系统的导管中的包含重组治疗性蛋白质的任何流体(例如，当新体积的包含重组治疗性蛋白质的流体流入包括TFVF单元的回路系统的导管中时，充当缓冲液)。
还提供了用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的过程，其包括：(a)提供基本上没有细胞的包含重组治疗性蛋白质的液体培养基，其中使所述液体培养基进料至第一多柱色谱系统(MCCS1)；(b)使用所述MCCS1在捕获所述液体培养基中的所述重组治疗性蛋白质，其中使含有所述重组治疗性蛋白质的MCCS1的洗脱液连续进料至第二多柱色谱系统(MCCS2)；(c)使用所述MCCS2纯化和抛光所述重组治疗性蛋白质，其中来自所述MCCS2的洗脱液是包含所述重组治疗性蛋白质的流体；(d)使用本文所述的任何方法处理所述包含重组治疗性蛋白质的流体，其中所述过程被整合并从所述液体培养基连续运行至包含所述重组治疗性蛋白质的收集的流体或滤液，其中收集的流体或滤液是所述治疗性蛋白质药物。
处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括使用包括TFF单元的回路系统
本文提供了处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括：(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单元，和(ii)所述第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出所述系统或流入和流出所述系统的至少一个端口；(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第一段时间；(c)通过所述至少一个端口中的一个，使渗滤介质连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第二段时间；和(d)在所述第一和第二段时间点之后，通过所述至少一个端口中的一个，收集存在于所述回路系统中的包含所述重组治疗性蛋白质的流体。如本领域技术人员可以理解的，这些方法的一些实施方案包括再循环未穿过所述TFF单元中的一个或多个切向病毒过滤器的在包括TFVF单元的回路系统的导管中的包含重组治疗性蛋白质的任何流体(例如，当新体积的包含重组治疗性蛋白质的流体和/或渗滤介质流入包括TFF单元的回路系统的导管中时，充当缓冲液)。
在一些实施方案中，TFF单元包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11个或12个切向过滤器.在这些方法中的一些实例中，TFF单元可包括一个或多个切向过滤器，其具有以下的表面积：约0.05cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2、约1.0cm2、约0.5cm2或约0.1cm2；约0.1cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2、约1.0cm2或约0.5cm2；约0.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2或约1.0cm2；约1.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2；约1.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2或约2.0cm2；约2.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2或约2.5cm2；约2.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2或约3.0cm2；约3.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2或约3.5cm2；约3.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2或约4.0cm2；约4.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2或约4.5cm2；约4.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2或约5.0cm2；约5.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2或约5.5cm2；约5.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2或约6.0cm2；约6.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2或约6.5cm2；约6.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2或约7.0cm2；约7.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2或约7.5cm2；约7.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2或约8.0cm2；约8.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2或约8.5cm2；约8.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2或约9.0cm2；约9.0cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2或约9.5cm2；约9.5cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2或约10cm2；约10cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2，或约12cm2；约12cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2或约14cm2；约14cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2或约16cm2；约16cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2或约18cm2；约18cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2或约20cm2；约20cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2或约22cm2；约22cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2或约24cm2；约24cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2或约26cm2；约26cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2或约28cm2；约28cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2或约30cm2；约30cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2或约32cm2；约32cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2或约34cm2；约34cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2或约36cm2；约36cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2或约38cm2；约38cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2或约40cm2；约40cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2、约44cm2或约42cm2；约42cm2至约50cm2，约48cm2、约46cm2或约44cm2；约44cm2至约50cm2，约48cm2或约46cm2；约46cm2至约50cm2或约48cm2；或约48cm2至约50cm2。
在一些实施方案中，TFF单元中的一个或多个切向过滤器可具有以下的截留分子量：约1kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa、约100kDa、约80kDa、约60kDa、约40kDa、约20kDa、约10kDa或约5kDa；约5kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa、约100kDa、约80kDa、约60kDa、约40kDa、约20kDa或约10kDa；约10kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa、约100kDa、约80kDa、约60kDa、约40kDa或约20kDa；约20kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa、约100kDa、约80kDa、约60kDa或约40kDa；约40kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa、约100kDa、约80kDa或约60kDa；约60kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa、约100kDa或约80kDa；约80kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa、约150kDa或约100kDa；约100kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa、约200kDa或约150kDa；约150kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa、约250kDa或约200kDa；约200kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa、约300kDa或约250kDa；约250kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa、约350kDa或约300kDa；约300kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa、约400kDa或约350kDa；约350kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa、约450kDa或约400kDa；约400kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa、约500kDa或约450kDa；约450kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa、约550kDa或约500kDa；约500kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa、约600kDa或约550kDa；约550kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa、约650kDa或约600kDa；约600kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa、约700kDa或约650kDa；约650kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa、约750kDa或约700kDa；约700kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa、约800kDa或约750kDa；约750kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa、约850kDa或约800kDa；约800kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa、约900kDa或约850kDa；约850kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa、约950kDa或约900kDa；约900kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa、约1,000kDa或约950kDa；约950kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa、约1,200kDa或约1,000kDa；约1,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa、约1,400kDa或约1,200kDa；约1,200kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa、约1,600kDa或约1,400kDa；约1,400kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa、约1,800kDa或约1,600kDa；约1,600kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa、约2,000kDa或约1,800kDa；约1,800kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa、约4,000kDa或约2,000kDa；约2,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa、约6,000kDa或约4,000kDa；约4,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa、约8,000kDa或约6,000kDa；约6,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa、约10,000kDa或约8,000kDa；约8,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa、约12,000kDa或约10,000kDa；约10,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa、约14,000kDa或约12,000kDa；约12,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa、约16,000kDa或约14,000kDa；约14,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa、约18,000kDa或约16,000kDa；约16,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa、约20,000kDa或约18,000kDa；约18,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa、约22,000kDa或约20,000kDa；约20,000kDa至约25,000kDa，约24,000kDa或约22,000kDa；约22,000kDa至约25,000kDa或约24,000kDa；或约23,000kDa至约25,000kDa。在一些实施方案中，TFF单元包括一个或多个由例如纤维素(例如，再生纤维素)或聚醚砜制成的切向过滤器。可在TFF单元中使用的一个或多个切向过滤器的非限制性实例可从Millipore商购获得(例如，和)。可在TFF单元中使用的一个或多个切向过滤器的另外的商业来源是本领域已知的。
导管可以是简单的管，例如，生物相容的管。有用管的非限制性实例包括硅橡胶、聚氨酯、聚二氧杂环己酮(PDO)、聚羟基链烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯或聚酐，或包含这些和/或其它聚合物的共聚物或衍生物。替代性地或另外地，本文所述的任何导管可包括聚氯乙烯。导管可以是，例如，可焊接的输送管。
在一些实施方案中，导管的内径可以为约5mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm、约12mm、约10mm、约8mm或约6mm；约6mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm、约12mm、约10mm或约8mm；约8mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm、约12mm或约10mm；约10mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm或约12mm；约12mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm或约14mm；约14mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm或约16mm；约16mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm或约18mm；约18mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm或约20mm；约20mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm或约22mm；约22mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm或约24mm；约24mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm或约26mm；约26mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm或约28mm；约28mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm或约30mm；约30mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm或约32mm；约32mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm或约34mm；约34mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm或约36mm；约36mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm,至约38mm；约38mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm或约40mm；约40mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm或约42mm；约42mm至约50mm，约48mm、约46mm或约44mm；约44mm至约50mm，约48mm或约46mm；约46mm至约50mm或约48mm；或约48mm至约50mm。
在一些实施方案中，导管具有以下的总长度：约1.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm、约8.0cm、约6.0cm、约4.0cm或约2.0cm；约2.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm、约8.0cm、约6.0cm或约4.0cm；约4.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm、约8.0cm或约6.0cm；约6.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm或约8.0cm；约8.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm或约10cm；约10cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm或约12cm；约12cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm或约14cm；约14cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm或约16cm；约16cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm或约18cm；约18cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm或约20cm；约20cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm或约25cm；约25cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm或约30cm；约30cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm或约35cm；约35cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm或约40cm；约40cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm或约45cm；约45cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm或约50cm；约50cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm或约55cm；约55cm至约75cm，约70cm、约65cm或约60cm；约60cm至约75cm，约70cm或约65cm；约65cm至约75cm或约70cm；或约70cm至约75cm。
可在回路系统中使用的导管和导管特性的另外的实例是本领域技术人员公知的。
在一些实例中，回路系统包括1、2、3、4或5个端口。在一些实例中，至少一个端口可以是阀。在其他实例中，至少一个端口可以是注射端口或者可以具有肋状螺纹(ribbedthreading)。至少一个端口可以是本领域公知的任何类型的端口。
在一些实例中，回路系统可进一步包括设置在导管中的泵(例如，低湍流泵，例如蠕动泵)。
在一些实施方案中，步骤(b)包括以以下速率使包含重组治疗性蛋白质的流体连续流动(例如，单向或双向流动)到回路系统中：约0.05mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟、约1.0mL/分钟、约0.5mL/分钟或约0.1mL/分钟；约0.1mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟、约1.0mL/分钟或约0.5mL/分钟；约0.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟或约1.0mL/分钟；约1.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟或约1.5mL/分钟；约1.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟或约2.0mL/分钟；约2.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟或约2.5mL/分钟；约2.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟或约3.0mL/分钟；约3.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟或约3.5mL/分钟；约3.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟或约4.0mL/分钟；约4.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟或约4.5mL/分钟；约4.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟或约5.0mL/分钟；约5.0mL/分钟至约25mL/分钟，约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟或约5.5mL/分钟；约5.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟或约6.0mL/分钟；约6.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟或约6.5mL/分钟；约6.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟或约7.0mL/分钟；约7.0mL/分钟至约25mL/分钟，约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟或约7.5mL/分钟；约7.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟或约8.0mL/分钟；约8.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟或约8.5mL/分钟；约8.5mL/分钟至约25mL/分钟，约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟或约9.0mL/分钟；约9.0mL/分钟至约25mL/分钟，约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟或约9.5mL/分钟；约9.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟或约10mL/分钟；约10mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟或约12mL/分钟；约12mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟或约14mL/分钟；约14mL/分钟至约25mL/分钟，约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟或约16mL/分钟；约16mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分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在一些实例中，步骤(b)包括使包含以下浓度的重组治疗性蛋白质的流体连续流动(例如，单向或双向流动)到回路系统中：约0.01mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL、约1.0mg/mL、约0.5mg/mL、约0.1mg/mL，或约0.05mg/mL；约0.05mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL、约1.0mg/mL、约0.5mg/mL或约0.1mg/mL；约0.1mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL、约1.0mg/mL或约0.5mg/mL；约0.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL或约1.0mg/mL；约1.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL或约1.5mg/mL；约1.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL、约2.5mg/mL或约2.0mg/mL；约2.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL、约3.0mg/mL或约2.5mg/mL；约2.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL、约3.5mg/mL或约3.0mg/mL；约3.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL、约4.0mg/mL或约3.5mg/mL；约3.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL、约4.5mg/mL或约4.0mg/mL；约4.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL、约5.0mg/mL或约4.5mg/mL；约4.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL、约5.5mg/mL或约5.0mg/mL；约5.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL、约6.0mg/mL或约5.5mg/mL；约5.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL、约6.5mg/mL或约6.0mg/mL；约6.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL、约7.0mg/mL或约6.5mg/mL；约6.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL、约7.5mg/mL或约7.0mg/mL；约7.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL、约8.0mg/mL或约7.5mg/mL；约7.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL、约8.5mg/mL或约8.0mg/mL；约8.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL、约9.0mg/mL或约8.5mg/mL；约8.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL,9.5mg/mL或约9.0mg/mL；约9.0mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL或9.5mg/mL；约9.5mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL或约10mg/mL；约10mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL或约12mg/mL；约12mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL或约14mg/mL；约14mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL或约16mg/mL；约16mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL或约18mg/mL；约18mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL或约20mg/mL；约20mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL或约22mg/mL；约22mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL或约24mg/mL；约24mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL或约26mg/mL；约26mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL或约28mg/mL；约28mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL或约30mg/mL；约30mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL或约32mg/mL；约32mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL或约34mg/mL；约34mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL或约36mg/mL；约36mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL或约38mg/mL；约38mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL或约40mg/mL；约40mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL或约42mg/mL；约42mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL、约46mg/mL或约44mg/mL；约44mg/mL至约50mg/mL，约48mg/mL或约46mg/mL；约46mg/mL至约50mg/mL或约48mg/mL；或约48mg/mL至约50mg/mL。
在一些实施方案中，第一段时间可以是约0.1分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟、约2分钟或约1分钟；约1分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟或约2分钟；约2分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟；约5分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟或约10分钟；约10分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟或约15分钟；约15分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟或约20分钟；约20分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟或约25分钟；约25分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟或约30分钟；约30分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟或约35分钟；约35分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟或约40分钟；约40分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟或约45分钟；约45分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟或约50分钟；约50分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时或约55分钟；约55分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时或约1.0小时；约1.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时或约1.5小时；约1.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时或约2.0小时；约2.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时或约2.5小时；约2.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时或约3.0小时；约3.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时或约3.5小时；约3.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时或约4.0小时；约4.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时或约4.5小时；约4.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时或约5.0小时；约5.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时或约5.5小时；约5.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时或约6.0小时；约6.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时或约6.5小时；约6.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时或约7小时；约7小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时或约7.5小时；约7.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时或约8.0小时；约8.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时或约8.5小时；约8.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时或约9.0小时；约9.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时或约9.5小时；约9.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时或约10小时；约10小时至约12小时，约11.5小时、约11小时或约10.5小时；约10.5小时至约12小时，约11.5小时或约11小时；约11小时至约12小时或约11.5小时。
在一些实例中，步骤(c)包括使渗滤介质以以下速率连续流动(例如，单向或双向流动)到回路系统中：约0.05mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟、约1.0mL/分钟、约0.5mL/分钟或约0.1mL/分钟；约0.1mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟、约1.0mL/分钟或约0.5mL/分钟；约0.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟或约1.0mL/分钟；约1.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟或约1.5mL/分钟；约1.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟或约2.0mL/分钟；约2.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟或约2.5mL/分钟；约2.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟或约3.0mL/分钟；约3.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟或约3.5mL/分钟；约3.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟或约4.0mL/分钟；约4.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约8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钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟或约500mL/分钟；约500mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟或约550mL/分钟；约550mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟或约600mL/分钟；约600mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟或约650mL/分钟；约650mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟或约700mL/分钟；约700mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟或约750mL/分钟；约750mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟或约800mL/分钟；约800mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟或约850mL/分钟；约850mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟或约900mL/分钟；约900mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟或约950mL/分钟；约950mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟或约1L/分钟；约1L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟或约5L/分钟；约5L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟或约10L/分钟；约10L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟或约20L/分钟；约20L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟或约30L/分钟；约30L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟或约40L/分钟；约40L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟或约50L/分钟；约50L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟或约60L/分钟；约60L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟或约70L/分钟；约70L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟或约80L/分钟；约80L/分钟至约100L/分钟或约90L/分钟；或约90L/分钟至约100L/分钟。
渗滤介质可以是，例如生理上可接受的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲盐水或用于配制重组治疗性蛋白质的缓冲液，例如，包含甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、膨胀剂(例如，非还原性碳水化合物，例如蔗糖)，表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80、Triton X-100和Tween)中的一个或多个的缓冲液。
在这些方法的一些实例中，第二段时间可以是约0.1分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟、约2分钟或约1分钟；约1分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟或约2分钟；约2分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟；约5分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟或约10分钟；约10分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟或约15分钟；约15分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟或约20分钟；约20分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟或约25分钟；约25分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟或约30分钟；约30分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟或约35分钟；约35分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟或约40分钟；约40分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟或约45分钟；约45分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟或约50分钟；约50分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时或约55分钟；约55分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时或约1.0小时；约1.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时或约1.5小时；约1.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时或约2.0小时；约2.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时或约2.5小时；约2.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时或约3.0小时；约3.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时或约3.5小时；约3.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时或约4.0小时；约4.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时或约4.5小时；约4.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时或约5.0小时；约5.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时或约5.5小时；约5.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时或约6.0小时；约6.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时或约6.5小时；约6.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时或约7小时；约7小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时或约7.5小时；约7.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时或约8.0小时；约8.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时或约8.5小时；约8.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时或约9.0小时；约9.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时或约9.5小时；约9.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时或约10小时；约10小时至约12小时，约11.5小时、约11小时或约10.5小时；约10.5小时至约12小时，约11.5小时或约11小时；约11小时至约12小时或约11.5小时。
在一些实施方案中，步骤(d)中收集的包含重组治疗性蛋白质的流体包含以下浓度的重组治疗性蛋白质：约0.1mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL、约1.0mg/mL或约0.5mg/mL；约0.5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL或约1.0mg/mL；约1.0mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL或约1.5mg/mL；约1.5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL或约2.0mg/mL；约2.0mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL或约2.5mg/mL；约2.5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL或约3mg/mL；约3mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL或约4mg/mL；约4mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL或约5mg/mL；约5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL或约6mg/mL；约6mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL或约7mg/mL；约7mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约8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在一些实施方案中，在第一段时间和第二段时间之后实现的这些渗滤倍数(fold-diafiltration)是约1倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍；约2倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍、约5倍、约4倍或约3倍；约3倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍、约5倍或约4倍；约4倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍、约6倍或约5倍；约5倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍、约8倍、约7倍或约6倍；约6倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍、约8倍或约7倍；约7倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍、约9倍或约8倍；约8倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍、约10倍或约9倍；约9倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍、约11倍或约10倍；约10倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍、约12倍或约11倍；约11倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍、约13倍或约12倍；约12倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍、约14倍或约13倍；约13倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍、约15倍或约14倍；约14倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍、约16倍或约15倍；约15倍至约20倍，约19倍、约18倍、约17倍或约16倍；约16倍至约20倍，约19倍、约18倍或约17倍；约17倍至约20倍，约19倍或约18倍；约18倍至约20倍或约19倍；或约19倍至约20倍。
在一些实例中，回路系统不包括存储罐(holding tank)。
在该方法的其他实施方案中，在第一段时间内，包含重组治疗性蛋白质的流体和渗滤介质一起连续地流入回路系统，然后在第二段时间内，仅渗滤介质连续流入回路系统。
可以使用注射器、重力或泵(例如，设置在导管中的蠕动泵)在步骤(d)中收集流体。在步骤(d)中收集包含重组治疗性蛋白质的流体的另外的方法是本领域已知的。
这些方法的一些实例进一步包括：(e)提供第二回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流病毒过滤(TFVF)单元，和(ii)在TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出第二系统或流入和流出第二系统的至少一个端口，其中第二系统被配置成使得流体可以流过导管和TFVF单元，并且可从TFVF单元收集包含重组治疗性蛋白质的滤液；和(f)使用在所述系统中的端口和所述第二系统中的端口之间流体连通的连接导管使步骤(d)的收集的流体流入第二系统，并且收集来自所述TFVF单元的包含重组治疗性蛋白质的滤液，持续第三时间段。如本领域技术人员可以理解的，这些方法的一些实施方案可以进一步包括再循环未穿过TFVF单元中的一个或多个切向病毒过滤器的在第二回路系统(包括TFVF单元)的导管中的包含重组治疗性蛋白质的任何流体(例如，当新体积的包含重组治疗性蛋白质的流体流入包括TFVF单元的回路系统的导管中时，充当缓冲液)。
在一些实施方案中，TFVF单元包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个切向病毒过滤器。在这些方法的一些实例中，TFVF单元可包括一个或多个具有以下表面积的切向病毒过滤器：约0.05cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2、约1.0cm2、约0.5cm2或约0.1cm2；约0.1cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2、约1.0cm2或约0.5cm2；约0.5cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2、约1.5cm2或约1.0cm2；约1.0cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2、约2.0cm2或约1.5cm2；约1.5cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2、约2.5cm2或约2.0cm2；约2.0cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2、约3.0cm2或约2.5cm2；约2.5cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2、约3.5cm2或约3.0cm2；约3.0cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2、约4.0cm2或约3.5cm2；约3.5cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2、约4.5cm2或约4.0cm2；约4.0cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2、约5.0cm2或约4.5cm2；约4.5cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约9.0cm2、约8.5cm2、约8.0cm2、约7.5cm2、约7.0cm2、约6.5cm2、约6.0cm2、约5.5cm2或约5.0cm2；约5.0cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2、约26cm2、约24cm2、约22cm2、约20cm2、约18cm2、约16cm2、约14cm2、约12cm2、约10cm2、约9.5cm2、约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2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2、约28cm2或约26cm2；约26cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2、约30cm2或约28cm2；约28cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2、约32cm2或约30cm2；约30cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2、约34cm2或约32cm2；约32cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2、约36cm2或约34cm2；约34cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2、约38cm2或约36cm2；约36cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2、约40cm2或约38cm2；约38cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2、约42cm2或约40cm2；约40cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2、约44cm2或约42cm2；约42cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2、约46cm2或约44cm2；约44cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2、约48cm2或约46cm2；约46cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2、约50cm2或约48cm2；约48cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2、约100cm2或约50cm2；约50cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2、约150cm2或约100cm2；约100cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2、约200cm2或约150cm2；约150cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2、约400cm2或约200cm2；约200cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2、约600cm2或约400cm2；约400cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2或约600cm2；约600cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2、约1m2、约800cm2；约800cm2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2、约5m2或约1m2；约1m2至约50m2，约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2、约10m2或约5m2；约5m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2、约15m2或约10m2；约10m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2、约20m2或约15m2；约15m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2、约25m2或约20m2；约20m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2、约30m2或约25m2；约25m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2、约40m2、约35m2或约30m2；约30m2至约50m2，约45m2、约40m2或约35m2；约35m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2、约45m2或约40m2；约40m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2、约50m2或约45m2；约45m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2、约60m2或约50m2；约50m2至约100m2，约90m2、约80m2、约70m2或约60m2；约60m2至约100m2，约90m2、约80m2或约70m2；约70m2至约100m2，约90m2或约80m2；约80m2至约100m2或约90m2；或约90m2至约100m2。
在一些实施方案中，TFVF单元包括一个或多个具有以下孔径的切向病毒过滤器：约5nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm、约25nm、约20nm、约15nm或约10nm；约10nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm、约25nm、约20nm或约15nm；约15nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm、约25nm或约20nm；约20nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm、约30nm或约25nm；约25nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm、约35nm或约30nm；约30nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm、约40nm或约35nm；约35nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm、约50nm、约45nm或约40nm；约45nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm、约55nm或约50nm；约50nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm、约60nm或约55nm；约55nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm、约65nm或约60nm；约60nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm、约70nm或约65nm；约65nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm、约75nm或约70nm；约70nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm、约80nm或约75nm；约75nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm、约85nm或约80nm；约80nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm、约90nm或约85nm；约85nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm、约95nm或约90nm；约90nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm、约100nm或约95nm；约95nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm、约110nm或约100nm；约100nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm、约120nm或约110nm；约110nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm、约130nm或约120nm；约120nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm、约140nm或约130nm；约130nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm、约150nm或约140nm；约140nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm、约160nm或约150nm；约150nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm、约170nm或约160nm；约160nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm、约180nm或约170nm；约170nm至约220nm，约210nm、约200nm、约190nm或约180nm；约180nm至约220nm，约210nm、约200nm或约190nm；约190nm至约220nm，约210nm或约200nm；约200nm至约220nm或约210nm；或约210nm至约220nm。可在TFVF单元中使用的多种病毒过滤器是本领域中已知的。例如，可在TFVF单元中使用的病毒过滤器从Asahi Kasei(Tokyo,Japan)商购可得。在一些实施方案中，病毒过滤器是PlanovaTM过滤器(例如，PlanovaTM15N、PlanovaTM20N、PlanovaTM35N或PlanovaTM75N)。在一些实施方案中，病毒过滤器是PlanovaTMBioEX过滤器。可在TFVF单元中使用的病毒过滤器可包括例如中空纤维膜。
连接导管和第二回路系统中的导管可以是简单的管，例如，生物相容的管。有用管的非限制性实例包括硅橡胶、聚碳酸酯、聚丙烯、聚氨酯、聚二氧杂环己酮(PDO)、聚羟基链烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯或聚酐，或包含这些和/或其他聚合物的共聚物或衍生物。替代性地或另外地，本文所述的任何导管可包括聚氯乙烯。本文所述的任何导管可以是例如可焊接的输送管。
在一些实施方案中，连接导管和/或第二回路系统中的导管的内径可以是：约5mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm、约12mm、约10mm、约8mm或约6mm；约6mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm、约12mm、约10mm或约8mm；约8mM至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm、约12mm或约10mm；约10mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm、约14mm或约12mm；约12mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm、约16mm或约14mm；约14mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm、约18mm或约16mm；约16mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm、约20mm或约18mm；约18mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm、约22mm或约20mm；约20mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm、约24mm或约22mm；约22mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm、约26mm或约24mm；约24mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm、约28mm或约26mm；约26mm至约50mm，约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm、约30mm或约28mm；约28mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm、约32mm或约30mm；约30mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm、约34mm或约32mm；约32mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm、约36mm或约34mm；约34mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm、约38mm或约36mm；约36mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm、约40mm或约38mm；约38mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm、约42mm或约40mm；约40mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm、约44mm或约42mm；约42mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm、约46mm或约44mm；约44mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm、约48mm或约46mm；约46mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm、约50mm或约48mm；约48mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm、约55mm或约50mm；约50mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm、约60mm或约55mm；约55mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm、约65mm或约60mm；约60mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm、约70mm或约65mm；约65mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm、约75mm或约70mm；约70mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm、约80mm或约75mm；约75mm至约100mm，约95mm、约90mm、约85mm或约80mm；约80mm至约100mm，约95mm、约90mm或约85mm；约85mm至约100mm，约95mm或约90mm；约90mm至约100mm或约95mm；或约95mm至约100mm。
在一些实施方案中，连接导管和/或第二回路系统中的导管具有以下的总长度：约1.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm、约8.0cm、约6.0cm、约4.0cm或约2.0cm；约2.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm、约8.0cm、约6.0cm或约4.0cm；约4.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm、约8.0cm或约6.0cm；约6.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm、约10cm或约8.0cm；约8.0cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm、约12cm或约10cm；约10cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm、约14cm或约12cm；约12cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm、约16cm或约14cm；约14cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm、约18cm或约16cm；约16cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm、约20cm或约18cm；约18cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm、约25cm或约20cm；约20cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm、约30cm或约25cm；约25cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm、约35cm或约30cm；约30cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm、约40cm或约35cm；约35cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm、约45cm或约40cm；约40cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm、约50cm或约45cm；约45cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm、约55cm或约50cm；约50cm至约75cm，约70cm、约65cm、约60cm或约55cm；约55cm至约75cm，约70cm、约65cm或约60cm；约60cm至约75cm，约70cm或约65cm；约65cm至约75cm或约70cm；或约70cm至约75cm。
可在第二回路系统中使用的导管和导管特性的另外的实例是本领域技术人员公知的。
在一些实例中，第二回路系统包括1、2、3、4或5个端口。在一些实例中，第二回路系统中的至少一个端口可以是阀。在其他实例中，第二回路系统中的至少一个端口可以是注射端口或者可以具有肋状螺纹。第二回路系统中的至少一个端口可以是本领域公知的任何类型的端口。
在一些实例中，第二回路系统可进一步包括设置在连接导管和/或第二系统中的导管中的泵(例如，低湍流泵，例如蠕动泵)。在一些实施方案中，第二回路系统不包括存储罐。在一些实施方案中，连接导管不与存储罐流体连接。
在一些实例中，步骤(f)包括包括以以下速率将步骤(d)的收集的流体连续(使用连接导管)流动(例如，单向或双向流动)到第二系统：约0.05mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟、约1.0mL/分钟、约0.5mL/分钟或约0.1mL/分钟；约0.1mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟、约1.0mL/分钟或约0.5mL/分钟；约0.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟、约1.5mL/分钟或约1.0mL/分钟；约1.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟、约2.0mL/分钟或约1.5mL/分钟；约1.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟、约2.5mL/分钟或约2.0mL/分钟；约2.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟、约3.0mL/分钟或约2.5mL/分钟；约2.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟、约3.5mL/分钟或约3.0mL/分钟；约3.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟、约4.0mL/分钟或约3.5mL/分钟；约3.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟、约4.5mL/分钟或约4.0mL/分钟；约4.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟、约5.0mL/分钟或约4.5mL/分钟；约4.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟、约5.5mL/分钟或约5.0mL/分钟；约5.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟、约6.0mL/分钟或约5.5mL/分钟；约5.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟、约6.5mL/分钟或约6.0mL/分钟；约6.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟、约7.0mL/分钟或约6.5mL/分钟；约6.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟、约7.5mL/分钟或约7.0mL/分钟；约7.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟、约8.0mL/分钟或约7.5mL/分钟；约7.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟、约8.5mL/分钟或约8.0mL/分钟；约8.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟、约9.0mL/分钟或约8.5mL/分钟；约8.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟、约9.5mL/分钟或约9.0mL/分钟；约9.0mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/分钟、约16mL/分钟、约14mL/分钟、约12mL/分钟、约10mL/分钟或约9.5mL/分钟；约9.5mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约24mL/分钟、约22mL/分钟、约20mL/分钟、约18mL/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450mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟或约500mL/分钟；约500mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟或约550mL/分钟；约550mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟或约600mL/分钟；约600mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟或约650mL/分钟；约650mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟或约700mL/分钟；约700mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟或约750mL/分钟；约750mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟或约800mL/分钟；约800mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟或约850mL/分钟；约850mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟或约900mL/分钟；约900mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟或约950mL/分钟；约950mL/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟或约1L/分钟；约1L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟或约5L/分钟；约5L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟、约20L/分钟或约10L/分钟；约10L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟、约30L/分钟或约20L/分钟；约20L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟、约40L/分钟或约30L/分钟；约30L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟、约50L/分钟或约40L/分钟；约40L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟、约60L/分钟或约50L/分钟；约50L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟、约70L/分钟或约60L/分钟；约60L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟、约80L/分钟或约70L/分钟；约70L/分钟至约100L/分钟，约90L/分钟或约80L/分钟；约80L/分钟至约100L/分钟或约90L/分钟；或约90L/分钟至约100L/分钟。
在一些实例中，在步骤(f)中从TFVF单元收集的滤液包括以下浓度的重组治疗性蛋白质：约0.1mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL、约1.0mg/mL或约0.5mg/mL；约0.5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL、约1.5mg/mL或约1.0mg/mL；约1.0mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL、约2.0mg/mL或约1.5mg/mL；约1.5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL、约2.5mg/mL或约2.0mg/mL；约2.0mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL、约3mg/mL或约2.5mg/mL；约2.5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL、约4mg/mL或约3mg/mL；约3mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL、约5mg/mL或约4mg/mL；约4mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL、约6mg/mL或约5mg/mL；约5mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL、约7mg/mL或约6mg/mL；约6mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/mL、约80mg/mL、约78mg/mL、约76mg/mL、约74mg/mL、约72mg/mL、约70mg/mL、约68mg/mL、约66mg/mL、约64mg/mL、约62mg/mL、约60mg/mL、约58mg/mL、约56mg/mL、约54mg/mL、约52mg/mL、约50mg/mL、约48mg/mL、约46mg/mL、约44mg/mL、约42mg/mL、约40mg/mL、约38mg/mL、约36mg/mL、约34mg/mL、约32mg/mL、约30mg/mL、约28mg/mL、约26mg/mL、约24mg/mL、约22mg/mL、约20mg/mL、约18mg/mL、约16mg/mL、约14mg/mL、约12mg/mL、约10mg/mL、约9mg/mL、约8mg/mL或约7mg/mL；约7mg/mL至约100mg/mL，约98mg/mL、96mg/mL、约94mg/mL、约92mg/mL、约90mg/mL、约88mg/mL、约86mg/mL、约84mg/mL、约82mg/m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在这些方法的一些实例中，第三段时间可以是约0.1分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟、约2分钟或约1分钟；约1分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟、约5分钟或约2分钟；约2分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟、约10分钟或约5分钟；约5分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约15分钟或约10分钟；约10分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟或约15分钟；约15分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟或约20分钟；约20分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟或约25分钟；约25分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟或约30分钟；约30分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟或约35分钟；约35分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟或约40分钟；约40分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟、约50分钟或约45分钟；约45分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时、约55分钟或约50分钟；约50分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.0小时或约55分钟；约55分钟至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时或约1.0小时；约1.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时、约2.0小时或约1.5小时；约1.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时、约2.5小时或约2.0小时；约2.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时、约3.0小时或约2.5小时；约2.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时、约3.5小时或约3.0小时；约3.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时、约4.0小时或约3.5小时；约3.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时、约4.5小时或约4.0小时；约4.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时、约5.0小时或约4.5小时；约4.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时、约5.5小时或约5.0小时；约5.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时、约6.0小时或约5.5小时；约5.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时、约6.5小时或约6.0小时；约6.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时、约7小时或约6.5小时；约6.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时、约7.5小时或约7小时；约7小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时、约8.0小时或约7.5小时；约7.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时、约8.5小时或约8.0小时；约8.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时、约9.0小时或约8.5小时；约8.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时、约9.5小时或约9.0小时；约9.0小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时、约10小时或约9.5小时；约9.5小时至约12小时，约11.5小时、约11小时、约10.5小时或约10小时；约10小时至约12小时，约11.5小时、约11小时或约10.5小时；约10.5小时至约12小时，约11.5小时或约11小时；约11小时至约12小时或约11.5小时。
在这些方法的一些实例中，第三段时间可以是，例如约12小时至约72小时、约12小时至约69小时、约12小时至约66小时、约12小时至约63小时、约12小时至约60小时、约12小时至约57小时、约12小时至约54小时、约12小时至约51小时、约12小时至约48小时、约12小时至约45小时、约12小时至约42小时、约12小时至约39小时、约12小时至约36小时、约12小时至约33小时、约12小时至约30小时、约12小时至约27小时、约12小时至约24小时、约12小时至约21小时、约12小时至约18小时、约12小时至约15小时、约15小时至约72小时、约15小时至约69小时、约15小时至约66小时、约15小时至约63小时、约15小时至约60小时、约15小时至约57小时、约15小时至约54小时、约15小时至约51小时、约15小时至约48小时、约15小时至约45小时、约15小时至约42小时、约15小时至约39小时、约15小时至约36小时、约15小时至约33小时、约15小时至约30小时、约15小时至约27小时、约15小时至约24小时、约15小时至约21小时、约15小时至约18小时、约18小时至约72小时、约18小时至约69小时、约18小时至约66小时、约18小时至约63小时、约18小时至约60小时、约18小时至约57小时、约18小时至约54小时、约18小时至约51小时、约18小时至约48小时、约18小时至约45小时、约18小时至约42小时、约18小时至约39小时、约18小时至约36小时、约18小时至约33小时、约18小时至约30小时、约18小时至约27小时、约18小时至约24小时、约18小时至约21小时、约21小时至约72小时、约21小时至约69小时、约21小时至约66小时、约21小时至约63小时、约21小时至约60小时、约21小时至约57小时、约21小时至约54小时、约21小时至约51小时、约21小时至约48小时、约21小时至约45小时、约21小时至约42小时、约21小时至约39小时、约21小时至约36小时、约21小时至约33小时、约21小时至约30小时、约21小时至约27小时、约21小时至约24小时、约24小时至约72小时、约24小时至约69小时、约24小时至约66小时、约24小时至约63小时、约24小时至约60小时、约24小时至约57小时、约24小时至约54小时、约24小时至约51小时、约24小时至约48小时、约24小时至约45小时、约24小时至约42小时、约24小时至约39小时、约24小时至约36小时、约24小时至约33小时、约24小时至约30小时、约24小时至约27小时、约27小时至约72小时、约27小时至约69小时、约27小时至约66小时、约27小时至约63小时、约27小时至约60小时、约27小时至约57小时、约27小时至约54小时、约27小时至约51小时、约27小时至约48小时、约27小时至约45小时、约27小时至约42小时、约27小时至约39小时、约27小时至约36小时、约27小时至约33小时、约27小时至约30小时、约30小时至约72小时、约30小时至约69小时、约30小时至约66小时、约30小时至约63小时、约30小时至约60小时、约30小时至约57小时、约30小时至约54小时、约30小时至约51小时、约30小时至约48小时、约30小时至约45小时、约30小时至约42小时、约30小时至约39小时、约30小时至约36小时、约30小时至约33小时、约33小时至约72小时、约33小时至约69小时、约33小时至约66小时、约33小时至约63小时、约33小时至约60小时、约33小时至约57小时、约33小时至约54小时、约33小时至约51小时、约33小时至约48小时、约33小时至约45小时、约33小时至约42小时、约33小时至约39小时、约33小时至约36小时、约36小时至约72小时、约36小时至约69小时、约36小时至约66小时、约36小时至约63小时、约36小时至约60小时、约36小时至约57小时、约36小时至约54小时、约36小时至约51小时、约36小时至约48小时、约36小时至约45小时、约36小时至约42小时、约36小时至约39小时、约39小时至约72小时、约39小时至约69小时、约39小时至约66小时、约39小时至约63小时、约39小时至约60小时、约39小时至约57小时、约39小时至约54小时、约39小时至约51小时、约39小时至约48小时、约39小时至约45小时、约39小时至约42小时、约42小时至约72小时、约42小时至约69小时、约42小时至约66小时、约42小时至约63小时、约42小时至约60小时、约42小时至约57小时、约42小时至约54小时、约42小时至约51小时、约42小时至约48小时、约42小时至约45小时、约45小时至约72小时、约45小时至约69小时、约45小时至约66小时、约45小时至约63小时、约45小时至约60小时、约45小时至约57小时、约45小时至约54小时、约45小时至约51小时、约45小时至约48小时、约48小时至约72小时、约48小时至约69小时、约48小时至约66小时、约48小时至约63小时、约48小时至约60小时、约48小时至约57小时、约48小时至约54小时、约48小时至约51小时、约51小时至约72小时、约51小时至约69小时、约51小时至约66小时、约51小时至约63小时、约51小时至约60小时、约51小时至约57小时、约51小时至约54小时、约54小时至约72小时、约54小时至约69小时、约54小时至约66小时、约54小时至约63小时、约54小时至约60小时、约54小时至约57小时、约57小时至约72小时、约57小时至约69小时、约57小时至约66小时、约57小时至约63小时、约57小时至约60小时、约60小时至约72小时、约60小时至约69小时、约60小时至约66小时、约60小时至约63小时、约63小时至约72小时、约63小时至约69小时、约63小时至约66小时、约66小时至约72小时、约66小时至约69小时或约69小时至约72小时。
在这些方法的一些实施方案中，连续流入包括TFVF单元的第二回路系统的步骤(d)的收集的流体可包括以下的总病毒滴度：约10-1至约10-20、约10-1至约10-19、约10-1至约10-18、约10-1至约10-17、约10-1至约10-16、约10-1至约10-15、约10-1至约10-14、约10-1至约10-13、约10-1至约10-12、约10-1至约10-11、约10-1至约10-10、约10-1至约10-9、约10-1至约10-8、约10-1至约10-7、约10-1至约10-6、约10-1至约10-5、约10-1至约10-4、约10-1至约10-3、约10-1至约10-2、约10-2至约10-20、约10-2至约10-19、约10-2至约10-18、约10-2至约10-17、约10-2至约10-16、约10-2至约10-15、约10-2至约10-14、约10-2至约10-13、约10-2至约10-12、约10-2至约10-11、约10-2至约10-10、约10-2至约10-9、约10-2至约10-8、约10-2至约10-7、约10-2至约10-6、约10-2至约10-5、约10-2至约10-4、约10-2至约10-3、约10-3至约10-20、约10-3至约10-19、约10-3至约10-18、约10-3至约10-17、约10-3至约10-16、约10-3至约10-15、约10-3至约10-14、约10-3至约10-13、约10-3至约10-12、约10-3至约10-11、约10-3至约10-10、约10-3至约10-9、约10-3至约10-8、约10-3至约10-7、约10-3至约10-6、约10-3至约10-5、约10-3至约10-4、约10-4至约10-20、约10-4至约10-19、约10-4至约10-18、约10-4至约10-17、约10-4至约10-16、约10-4至约10-15、约10-4至约10-14、约10-4至约10-13、约10-4至约10-12、约10-4至约10-11、约10-4至约10-10、约10-4至约10-9、约10-4至约10-8、约10-4至约10-7、约10-4至约10-6、约10-4至约10-5、约10-5至约10-20、约10-5至约10-19、约10-5至约10-18、约10-5至约10-17、约10-5至约10-16、约10-5至约10-15、约10-5至约10-14、约10-5至约10-13、约10-5至约10-12、约10-5至约10-11、约10-5至约10-10、约10-5至约10-9、约10-5至约10-8、约10-5至约10-7、约10-5至约10-6、约10-6至约10-20、约10-6至约10-19、约10-6至约10-18、约10-6至约10-17、约10-6至约10-16、约10-6至约10-15、约10-6至约10-14、约10-6至约10-13、约10-6至约10-12、约10-6至约10-11、约10-6至约10-10、约10-6至约10-9、约10-6至约10-8、约10-6至约10-7、约10-7至约10-20、约10-7至约10-19、约10-7至约10-18、约10-7至约10-17、约10-7至约10-16、约10-7至约10-15、约10-7至约10-14、约10-7至约10-13、约10-7至约10-12、约10-7至约10-11、约10-7至约10-10、约10-7至约10-9、约10-7至约10-8、约10-8至约10-20、约10-8至约10-19、约10-8至约10-18、约10-8至约10-17、约10-8至约10-16、约10-8至约10-15、约10-8至约10-14、约10-8至约10-13、约10-8至约10-12、约10-8至约10-11、约10-8至约10-10、约10-8至约10-9、约10-9至约10-20、约10-9至约10-19、约10-9至约10-18、约10-9至约10-17、约10-9至约10-16、约10-9至约10-15、约10-9至约10-14、约10-9至约10-13、约10-9至约10-12、约10-9至约10-11、约10-9至约10-10、约10-10至约10-20、约10-10至约10-19、约10-10至约10-18、约10-10至约10-17、约10-10至约10-16、约10-10至约10-15、约10-10至约10-14、约10-10至约10-13、约10-10至约10-12、约10-10至约10-11、约10-11至约10-20、约10-11至约10-19、约10-11至约10-18、约10-11至约10-17、约10-11至约10-16、约10-11至约10-15、约10-11至约10-14、约10-11至约10-13、约10-11至约10-12、约10-12至约10-20、约10-12至约10-19、约10-12至约10-18、约10-12至约10-17、约10-12至约10-16、约10-12至约10-15、约10-12至约10-14、约10-12至约10-13、约10-13至约10-20、约10-13至约10-19、约10-13至约10-18、约10-13至约10-17、约10-13至约10-16、约10-13至约10-15、约10-13至约10-14、约10-14至约10-20、约10-14至约10-19、约10-14至约10-18、约10-14至约10-17、约10-14至约10-16、约10-14至约10-15、约10-15至约10-20、约10-15至约10-19、约10-15至约10-18、约10-15至约10-17、约10-15至约10-16、约10-16至约10-20、约10-16至约10-19、约10-16至约10-18、约10-16至约10-17、约10-17至约10-20、约10-17至约10-19、约10-17至约10-18、约10-18至约10-20、约10-18至约10-19或约10-19至约10-20。
在一些实施方案中，可以进行将步骤(d)的收集的流体连续流入包括TFVF单元的第二回路系统的步骤，使得穿过TFVF单元中过滤器或一个或多个过滤器的通量是例如，约10LMH至约50LMH、约10LMB至约48LMH、约10LMH至约46LMH、约10LMH至约44LMH、约10LMH至约42LMH、约10LMH至约40LMH、约10LMH至约38LMH、约10LMH至约36LMH、约10LMH至约34LMH、约10LMH至约32LMH、约10LMH至约30LMH、约10LMH至约28LMH、约10LMH至约26LMH、约10LMH至约24LMH、约10LMH至约22LMH、约10LMH至约20LMH、约10LMH至约18LMH、约10LMH至约16LMH、约10LMH至约15LMH、约15LMH至约50LMH、约15LMB至约48LMH、约15LMH至约46LMH、约15LMH至约44LMH、约15LMH至约42LMH、约15LMH至约40LMH、约15LMH至约38LMH、约15LMH至约36LMH、约15LMH至约34LMH、约15LMH至约32LMH、约15LMH至约30LMH、约15LMH至约28LMH、约15LMH至约26LMH、约15LMH至约24LMH、约15LMH至约22LMH、约15LMH至约20LMH、约15LMH至约18LMH、约20LMH至约50LMH、约20LMB至约48LMH、约20LMH至约46LMH、约20LMH至约44LMH、约20LMH至约42LMH、约20LMH至约40LMH、约20LMH至约38LMH、约20LMH至约36LMH、约20LMH至约34LMH、约20LMH至约32LMH、约20LMH至约30LMH、约20LMH至约28LMH、约20LMH至约26LMH、约20LMH至约24LMH、约20LMH至约22LMH、约22LMH至约50LMH、约22LMB至约48LMH、约22LMH至约46LMH、约22LMH至约44LMH、约22LMH至约42LMH、约22LMH至约40LMH、约22LMH至约38LMH、约22LMH至约36LMH、约22LMH至约34LMH、约22LMH至约32LMH、约22LMH至约30LMH、约22LMH至约28LMH、约22LMH至约26LMH、约22LMH至约24LMH、约24LMH至约50LMH、约24LMB至约48LMH、约24LMH至约46LMH、约24LMH至约44LMH、约24LMH至约42LMH、约24LMH至约40LMH、约24LMH至约38LMH、约24LMH至约36LMH、约24LMH至约34LMH、约24LMH至约32LMH、约24LMH至约30LMH、约24LMH至约28LMH、约24LMH至约26LMH、约26LMH至约50LMH、约26LMB至约48LMH、约26LMH至约46LMH、约26LMH至约44LMH、约26LMH至约42LMH、约26LMH至约40LMH、约26LMH至约38LMH、约26LMH至约36LMH、约26LMH至约34LMH、约26LMH至约32LMH、约26LMH至约30LMH、约26LMH至约28LMH、约28LMH至约50LMH、约28LMB至约48LMH、约28LMH至约46LMH、约28LMH至约44LMH、约28LMH至约42LMH、约28LMH至约40LMH、约28LMH至约38LMH、约28LMH至约36LMH、约28LMH至约34LMH、约28LMH至约32LMH、约28LMH至约30LMH、约30LMH至约50LMH、约30LMB至约48LMH、约30LMH至约46LMH、约30LMH至约44LMH、约30LMH至约42LMH、约30LMH至约40LMH、约30LMH至约38LMH、约30LMH至约36LMH、约30LMH至约34LMH、约30LMH至约32LMH、约32LMH至约50LMH、约32LMB至约48LMH、约32LMH至约46LMH、约32LMH至约44LMH、约32LMH至约42LMH、约32LMH至约40LMH、约32LMH至约38LMH、约32LMH至约36LMH、约32LMH至约34LMH、约34LMH至约50LMH、约34LMB至约48LMH、约34LMH至约46LMH、约34LMH至约44LMH、约34LMH至约42LMH、约34LMH至约40LMH、约34LMH至约38LMH、约34LMH至约36LMH、约36LMH至约50LMH、约36LMB至约48LMH、约36LMH至约46LMH、约36LMH至约44LMH、约36LMH至约42LMH、约36LMH至约40LMH、约36LMH至约38LMH、约38LMH至约50LMH、约38LMB至约48LMH、约38LMH至约46LMH、约38LMH至约44LMH、约38LMH至约42LMH、约38LMH至约40LMH、约40LMH至约50LMH、约40LMB至约48LMH、约40LMH至约46LMH、约40LMH至约44LMH、约40LMH至约42LMH、约42LMH至约50LMH、约42LMB至约48LMH、约42LMH至约46LMH、约42LMH至约44LMH、约44LMH至约50LMH、约44LMB至约48LMH、约44LMH至约46LMH、约46LMH至约50LMH、约46LMB至约48LMH或约48LMH至约50LMH。
在一些实施方案中，可以进行将来自步骤(d)的收集的流体连续流入包括TFVF单元的第二回路系统的步骤，使得TFVF单元中的过滤器或一个或多个过滤器上的压力或包括TFVF的第二系统中的压强为，例如，约2psi至约40psi、约2psi至约38psi、约2psi至约36psi、约2psi至约34psi、约2psi至约32psi、约2psi至约30psi、约2psi至约28psi、约2psi至约26psi、约2psi至约24psi、约2psi至约22psi、约2psi至约20psi、约2psi至约18psi、约2psi至约16psi、约2psi至约14psi、约2psi至约12psi、约2psi至约10psi、约2psi至约8psi、约2psi至约6psi、约2psi至约4psi、约4psi至约40psi、约4psi至约38psi、约4psi至约36psi、约4psi至约34psi、约4psi至约32psi、约4psi至约30psi、约4psi至约28psi、约4psi至约26psi、约4psi至约24psi、约4psi至约22psi、约4psi至约20psi、约4psi至约18psi、约4psi至约16psi、约4psi至约14psi、约4psi至约12psi、约4psi至约10psi、约4psi至约8psi、约4psi至约6psi、约6psi至约40psi、约6psi至约38psi、约6psi至约36psi、约6psi至约34psi、约6psi至约32psi、约6psi至约30psi、约6psi至约28psi、约6psi至约26psi、约6psi至约24psi、约6psi至约22psi、约6psi至约20psi、约6psi至约18psi、约6psi至约16psi、约6psi至约14psi、约6psi至约12psi、约6psi至约10psi、约6psi至约8psi、约8psi至约40psi、约8psi至约38psi、约8psi至约36psi、约8psi至约34psi、约8psi至约32psi、约8psi至约30psi、约8psi至约28psi、约8psi至约26psi、约8psi至约24psi、约8psi至约22psi、约8psi至约20psi、约8psi至约18psi、约8psi至约16psi、约8psi至约14psi、约8psi至约12psi、约8psi至约10psi、约10psi至约40psi、约10psi至约38psi、约10psi至约36psi、约10psi至约34psi、约10psi至约32psi、约10psi至约30psi、约10psi至约28psi、约10psi至约26psi、约10psi至约24psi、约10psi至约22psi、约10psi至约20psi、约10psi至约18psi、约10psi至约16psi、约10psi至约14psi、约10psi至约12psi、约12psi至约40psi、约12psi至约38psi、约12psi至约36psi、约12psi至约34psi、约12psi至约32psi、约12psi至约30psi、约12psi至约28psi、约12psi至约26psi、约12psi至约24psi、约12psi至约22psi、约12psi至约20psi、约12psi至约18psi、约12psi至约16psi、约12psi至约14psi、约14psi至约40psi、约14psi至约38psi、约14psi至约36psi、约14psi至约34psi、约14psi至约32psi、约14psi至约30psi、约14psi至约28psi、约14psi至约26psi、约14psi至约24psi、约14psi至约22psi、约14psi至约20psi、约14psi至约18psi、约14psi至约16psi、约16psi至约40psi、约16psi至约38psi、约16psi至约36psi、约16psi至约34psi、约16psi至约32psi、约16psi至约30psi、约16psi至约28psi、约16psi至约26psi、约16psi至约24psi、约16psi至约22psi、约16psi至约20psi、约16psi至约18psi、约18psi至约40psi、约18psi至约38psi、约18psi至约36psi、约18psi至约34psi、约18psi至约32psi、约18psi至约30psi、约18psi至约28psi、约18psi至约26psi、约18psi至约24psi、约18psi至约22psi、约18psi至约20psi、约20psi至约40psi、约20psi至约38psi、约20psi至约36psi、约20psi至约34psi、约20psi至约32psi、约20psi至约30psi、约20psi至约28psi、约20psi至约26psi、约20psi至约24psi、约20psi至约22psi、约22psi至约40psi、约22psi至约38psi、约22psi至约36psi、约22psi至约34psi、约22psi至约32psi、约22psi至约30psi、约22psi至约28psi、约22psi至约26psi、约22psi至约24psi、约24psi至约40psi、约24psi至约38psi、约24psi至约36psi、约24psi至约34psi、约24psi至约32psi、约24psi至约30psi、约24psi至约28psi、约24psi至约26psi、约26psi至约40psi、约26psi至约38psi、约26psi至约36psi、约26psi至约34psi、约26psi至约32psi、约26psi至约30psi、约26psi至约28psi、约28psi至约40psi、约28psi至约38psi、约28psi至约36psi、约28psi至约34psi、约28psi至约32psi、约28psi至约30psi、约30psi至约40psi、约30psi至约38psi、约30psi至约36psi、约30psi至约34psi、约30psi至约32psi、约32psi至约40psi、约32psi至约38psi、约32psi至约36psi、约32psi至约34psi、约34psi至约40psi、约34psi至约38psi、约34psi至约36psi、约36psi至约40psi、约36psi至约38psi或约38psi至约40psi。
处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括使用包括TFVF单元的回路系统
还提供了处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，其包括：(a)提供回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的TFVF单元，和(ii)在TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，其包括用于使流体流入或流出系统或流入和流出系统的至少一个端口，其中系统被配置成使得流体可以流过导管和TFVF单元，并且可从TFVF单元收集包含重组体治疗性蛋白质的滤液；(b)通过至少一个端口中的一个使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入回路系统，并从TFVF单元收集包含重组治疗性蛋白质的滤液持续一段时间。如本领域技术人员可以理解的，这些方法的一些实施方案可以进一步包括再循环未穿过TFVF单元中的一个或多个切向病毒过滤器的在包括TFVF单元的回路系统的导管中的包含重组治疗性蛋白质的任何流体(例如，当新体积的包含重组治疗性蛋白质的流体流入包括TFVF单元的回路系统的导管中时，充当缓冲液)。
在一些实施方案中，TFVF单元包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个切向病毒过滤器。在这些方法的一些实例中，TFVF单元可包括一个或多个具有约0.05cm2至约100m2的表面积的切向病毒过滤器(或本文所述的该范围的任何子范围)。
在一些实施方案中，TFVF单元包括一个或多个孔径为约5nm至约220nm的切向病毒过滤器(或本文所述的该范围的任何子范围)。可在TFVF单元中使用的多种病毒过滤器在本领域中是已知的。例如，可在TFVF单元中使用的病毒过滤器可从Asahi Kasei(Tokyo，Japan)商购获得。在一些实施方案中，病毒过滤器是PlanovaTM过滤器(例如，PlanovaTM15N、PlanovaTM20N、PlanovaTM35N、PlanovaTM75N)。在一些实施方案中，病毒过滤器是PlanovaTMBioEX过滤器。可在TFVF单元中使用的病毒过滤器可包括例如中空纤维膜。
导管可以是简单的管，例如生物相容的管。有用的管的非限制性实例包括硅橡胶、聚氨酯、聚二氧杂环己酮(PDO)、聚羟基链烷酸酯、聚羟基丁酸酯、聚(癸二酸甘油酯)、聚乙交酯、聚丙交酯、聚己内酯或聚酐，或包含这些和/或其它聚合物的共聚物或衍生物。替代性地或另外地，导管可包括聚氯乙烯。导管可以是例如可焊接的输送管。
在一些实施方案中，回路系统中导管的内径可为约5mm至约50mm(例如，或本文所述的其任何子范围)。在一些实施方案中，回路系统中的导管具有约1.0cm至约75cm的总长度(或本文所述的该范围的任何子范围)。可用于第二回路系统的导管和导管特性的另外的实例是本领域技术人员公知的。
在一些实例中，回路系统包括1、2、3、4或5个端口。在一些实例中，回路系统中的至少一个端口可以是阀。在其他实例中，回路系统中的至少一个端口可以是注射端口或者可以具有肋状螺纹。回路系统中的至少一个端口可以是本领域公知的任何类型的端口。在一些实例中，回路系统可进一步包括设置在导管中的泵(例如，低湍流泵，例如蠕动泵)。在一些实施方案中，回路系统不包括存储罐。
在一些实例中，步骤(b)包括以约0.05mL/分钟至约25mL/分钟(或本文所述的该范围的任何子范围)的速率使包含重组治疗性蛋白质的流体连续流动(例如，单向或双向流动)到回路系统中。在一些实例中，在步骤(b)中从TFVF单元收集的滤液包括浓度为约0.1mg/mL至约100mg/mL(或本文所述的该范围的任何子范围)的重组治疗性蛋白质。在这些方法的一些实例中，该段时间可为约5分钟至约12小时(或本文所述的该范围的任何子范围)。
在这些方法的一些实例中，该时间段可以是例如约12小时至约72小时(或本文所述的该范围的任何子范围)。
在一些实施方案中，通过至少一个端口中的一个连续流入包括TFVF单元的回路系统的流体可包括约10-1至约10-20(或本文所述的该范围的任何子范围)的总病毒滴度。
在一些实施方案中，可以进行使流体连续流过包括TFVF单元的回路系统的步骤，使得穿过TFVF单元中的过滤器或一个或多个过滤器的通量为例如约10LMH至约50LMH(或本文描述的该范围的任何子范围)。
在一些实施方案中，可以进行使流体连续流过包括TFVF单元的回路系统的步骤，使得TFVF单元中的过滤器或一个或多个过滤器上的压强，或包括TFVF的系统中的压强是例如，约2psi至约40psi(或本文所述的该范围的任何子范围)。
在一些实施方案中，该方法可以进一步包括对包含重组蛋白的流体进行一个或多个单元操作。这些单元操作的非限制性实例包括：捕获重组治疗性蛋白质，纯化重组治疗性蛋白质，抛光重组治疗性蛋白质，病毒灭活，病毒过滤，调节含有重组治疗性蛋白质的流体的离子浓度和/或pH，过滤含有重组治疗性蛋白质的流体，沉淀和絮凝，双水相萃取，冻干和结晶。本文描述了这些示例性单元操作中的每一个的非限制性方面。
用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的过程
本文提供了用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的过程。这些过程包括提供基本上没有细胞的含有重组治疗性蛋白质的液体培养基，其中使液体培养基进料至第一多柱色谱系统(MCCS1)；使用MCCS1捕获液体培养基中的重组治疗性蛋白质，其中使含有重组治疗性蛋白质的MCCS1的洗脱液连续进料至第二多柱色谱系统(MCCS2)；使用MCCS2纯化和抛光重组治疗性蛋白质，其中来自MCCS2的洗脱液是包含重组治疗性蛋白质的流体；使用本文所述的任何方法处理包含重组治疗性蛋白质的流体，其中所述过程被整合并从液体培养基连续运行至包含重组治疗性蛋白质的收集的流体或滤液，其中收集的流体或滤液是治疗性蛋白质药物。可用于进行这些过程的系统的实例如图1和图2所示(其中星号表示包括切向流过滤单元的回路系统和包括切向流病毒过滤单元的回路系统中的一个或两个可被任选地引入系统的位置)。例如，包括切向流过滤单元的回路系统和包括切向流病毒过滤单元的回路系统中的一个或两个可以在进行第一单元操作之前，在进行第一和第二单元操作之间，在进行第二和第三单元操作之间，在进行第三和第四单元操作之间，在进行第四和第五单元操作之间，在进行第五和第六单元操作之间，在进行第六和第七单元单元操作之间，在进行第七和第八单元操作之间，和/或在进行第八和第九单元操作之间使用。
本文所述的过程提供了从液体培养基中连续且时间有效地产生治疗性药物。例如，使含有治疗性蛋白质的流体(例如，液体培养基)进料到第一MCCS至从第二MCCS洗脱治疗性蛋白质药物(含有治疗性蛋白质)之间经过的时间可以是，例如，约4小时～约48小时，包括端值，例如，约4小时～约40小时、约4小时～约35小时、约4小时～约30小时、约4小时～约28小时、约4小时～约26小时、约4小时～约24小时、约4小时～约22小时、约4小时～约20小时、约4小时～约18小时、约4小时～约16小时、约4小时～约14小时、约4小时～约12小时、约6小时～约12小时、约8小时～约12小时、约6小时～约20小时、约6小时～约18小时、约6小时～约14小时、约8小时～约16小时、约8小时～约14小时、约8小时～约12小时、约10小时～20小时、约10小时～18小时、约10小时～16小时、约10小时～14小时、约12小时～约14小时、约10小时～约40小时、约10小时～约35小时、约10小时～约30小时、约10小时～约25小时、约15小时～约40小时、约15小时～约35小时、约15小时～约30小时、约20小时～约40小时、约20小时～约35小时或约20小时～约30小时，包括端值。在其他实例中，从使含有治疗性蛋白质的流体(例如，液体培养基)进料到MCCS1至从MCCS2洗脱治疗性蛋白质药物(含有治疗性蛋白质)之间经过的时间是，例如，大于约4小时且小于约40小时，包括端值，例如，大于约4小时且小于约39小时、约38小时、约37小时、约36小时、约35小时、约34小时、约33小时、约32小时、约31小时、约30小时、约29小时、约28小时、约27小时、约26小时、约25小时、约24小时、约23小时、约22小时、约21小时、约20小时、约19小时、约18小时、约17小时、约16小时、约15小时、约14小时、约13小时、约12小时、约11小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时或约4.5小时，包括端值。
一些示例性的过程不利用存储步骤(例如，在整个过程中不使用贮存器(例如，断流水箱))。其他过程可以在整个过程中使用最多1、2、3、4或5个储存器(例如，断流水箱)。本文所述的任何过程可在整个过程中利用最多1、2、3、4或5个储存器(例如，断流水箱)，其中每个断流水箱仅存储治疗性蛋白质持续以下的总时间段：例如，约5分钟和小于约6小时之间，包括端值，例如，约5分钟～约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时或约30分钟，包括端值。在本文所述的过程中使用的任何储存器(例如，断流水箱)可具有的容量为，例如，1mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(包括端值)；约5mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(包括端值)；约10mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL或约20mL(包括端值)；约20mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL或约40mL(包括端值)；约40mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL或约60mL(包括端值)；约60mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL或约80mL(包括端值)；约80mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL或约100mL(包括端值)；约100mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL或约120mL(包括端值)；约120mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL或约140mL(包括端值)；约140mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL或约160mL(包括端值)；约160mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL或约180mL(包括端值)；约180mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL或约200mL(包括端值)；约200mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL或约220mL(包括端值)；约220mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL或约240mL(包括端值)；约240mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL或约260mL(包括端值)；约260mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL或约280mL(包括端值)；约280mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL或约300mL(包括端值)；约300mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL或约350mL(包括端值)；约350mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL或约400mL(包括端值)；约400mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL或约450mL(包括端值)；约450mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL或约500mL(包括端值)；约500mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL或约550mL(包括端值)；约550mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL或约600mL(包括端值)；约600mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL或约650mL(包括端值)；约650mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL或约700mL(包括端值)；约700mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL或约750mL(包括端值)；约750mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL、约850mL或约800mL(包括端值)；约800mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL、约900mL或约850mL(包括端值)；约850mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L、约950mL或约900mL(包括端值)；约900mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L、约1,000L或约950mL(包括端值)；约950mL～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L、约1,500L或约1,000L(包括端值)；约1,000L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L、约2,000L或约1,500L(包括端值)；约1,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L、约2,500L或约2,000L(包括端值)；约2,000L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L、约3,000L或约2,500L(包括端值)；约2,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L、约3,500L或约3,000L(包括端值)；约3,000L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L、约4,000L或约3,500L(包括端值)；约3,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L、约4,500L或约4,000L(包括端值)；约4,000L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L、约5,000L或约4,500L(包括端值)；约4,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L、约5,500L或约5,000L(包括端值)；约5,000L～约10,000L，约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L、约6,000L或约5,500L(包括端值)；约5,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L、约6,500L或约6,000L(包括端值)；约6,000L～约10,000L，约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L、约7,000L或约6,500L(包括端值)；约6,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L、约7,500L或约7,000L(包括端值)；约7,000L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L、约8,000L或约7,500L(包括端值)；约7,500L～约10,000L、约9,500L、约9,000L、约8,500L或约8,000L(包括端值)；约8,000L～约10,000L，约9,500L、约9,000L或约8,500L(包括端值)；约8,500L～约10,000L、约9,500L或约9,000L(包括端值)；约9,000L～约10,000L或约9,500L(包括端值)；或约9,500L～约10,000L(包括端值)。
在流体进入第一MCCS之前保持流体(在本文所述的任何过程中)使用的任何储存器(例如，断流水箱)可具有的容量为，例如1mL～第一MCCS的第一柱的装载体积的约100％，包括端值，例如，1mL～约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(包括端值)。在进入第二MCCS之前(并且在流体离开第一MCCS之后)保持流体(在本文所述的任何过程中)所使用的任何储存器(例如，断流水箱)可以具有的容量为，例如，1mL～第二MCCS的第一柱的装载体积的约100％，包括端值，例如，1mL～约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％，包括端值。
这些过程的多种其他方面在以下详细描述，并且可以在本文提供的过程中以任何组合使用而没有限制。以下描述了所提供的过程的示例性方面；然而，本领域技术人员将理解的是，可以将另外的步骤(例如，进行另外的单元操作)添加到本文描述的过程中，并且可以使用其他材料来进行本文所述的过程的任何步骤。
液体培养基
基本上没有细胞的含有重组治疗性蛋白质的液体培养基可以来源于任何来源。例如，液体培养基可以从重组细胞培养物(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞培养物)获得。液体培养基可以从补料分批细胞(例如，哺乳动物细胞)培养物(例如，含有分泌重组治疗性蛋白质的哺乳动物细胞的培养物的补料分批生物反应器)或灌注细胞(例如，哺乳动物细胞)培养物(例如，含有分泌重组治疗性蛋白质的哺乳动物细胞的培养物的灌注生物反应器)获得。液体培养基也可以是来自分泌重组治疗性蛋白质的细菌或酵母细胞的培养物的澄清液体培养基。
可以过滤或澄清从重组细胞培养物获得的液体培养基，以获得基本上没有细胞和/或病毒的液体培养基。用于过滤或澄清液体培养基以除去细胞的方法是本领域已知的(例如，0.2-μm过滤和使用交替切向流(ATFTM)系统的过滤)。
用于过滤或澄清液体培养基的另外的示例性方法包括，例如，固定化细胞分离(例如，中空纤维膜、平板膜、凝胶包封、陶瓷基质和流化床，例如，如在Kühtreiber et al.,Springer Science&Business Media,2013；Meuwly et al.,Biotechnol.Adv.25(1):45-56,2007；Jen et al.,Biotechnol.Bioeng.50(4):357-364,1996；Piret et al.,Biotechnol.Adv.8(4):763-783,1990；和Tyo et al.,Enzyme Microb.Technol.9(9):514-520,1987中所述的)；基于密度的细胞分离(例如，重力沉降(例如，使用锥形沉降柱进行的重力沉降)(例如，如在Kitano et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.24(4):282-286,1986；Shintani et al.,Cytotechnology 6(3):197-208,1991中所述的)，反应器内沉降区(例如，如在Takazawa et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.32(3):280-284,1989中所述的)，多特蒙德沉降器(例如，如在Hülscher et al.,Biotechnol.Bioeng.39(4):442-446,1992中所述的)，和斜式沉降器(例如，如在Boycott et al.,Nature 104:532,1920；Acrivos et al.,J.Fluid Mechanics 92(3):435-457,1979；Searles et al.,Biotechnol.Prog.10(2):198-206,1994；Kohara et al.,J.Chem.Eng.Japan 28(6):703-707,1995；Shen et al.,Biotechnol.Prog.27(5):1282-1296,2011；Wang et al.,Biotechnol.Prog.26(5):1361-1366,2010；Pohlscheidt et al.,Biotechnol.Prog.29(1):222-229,2013；Hecht et al.,Biotechnol.Prog.30(3):607-615,2014中所述的))；离心(例如，连续离心(例如，如在Hamamoto et al.,J.Ferment.Bioeng.67(3):190-194,1989；Tokashiki et al.,Cytotechnology 3(3):239-244,1990；和Takamatsu et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.45(4):454-457,1996中所述的)，Centritech离心(可从Pneumatic Scale Angelus商购，和如在例如Johnson et al.,Biotechnol.Prog.12(6):855-864,1996；Kim et al.,Biotechnol.Prog.23(5):1186-1197,2007；Kim et al.,Biotechnol.Prog.24(1):166-174,2008；Hecht et al.,Biotechnol.Prog.30(3):607-615,2014；Chotteau et al.,Perfusion Processes,In:Al-Rubeai M(Ed.),Animal CellCulture,Springer,Cham,Switzerland,2015中所述的)，和利用连续逆流的离心机(例如，如在Pattasseril et al.,BioProcess Int.11(3):38-47,2013中所述的))；声学沉降(例如，使用声学沉降器，例如，在Kilburn et al.,Biotechnol Bioeng.34(4):559-562,1989；Shirgaonkar et al.,Biotechnol.Adv.22(6):433-444,2004；Doblhoff-Dier et al.,Biotechnol.Prog.10(4):428-432,1994；Gaida et al.,Biotechnol.Prog.12(1):73-76,1996；Bierau et al.,J.Biotechnol.62(3):195-207,1998；Crowley et al.,BioProcessInt.2(3):46-50,2004；Gorenflo et al.,Biotechnol.Prog.19(1):30-36,2003；Pui etal.,Biotechnol.Prog.11(2):146-152,1995；Gorenflo et al,Biotechnol.Bioeng.80(4):438-444,2002；Dalm et al.,Biotechnol.Bioeng.88(5):547-557,2004；Gorenflo etal.,Biotechnol.Prog.19(1):30-36,2005中所述的声学沉降器)；和水力旋流分离(例如，使用在Elsayed et al.,Int.J.Biotechnol.Wellness Indust.2(4):153,2013；Castilhoet al.,Continuous animal cell perfusion processes:the first step towardintegrated continuous biomanufacturing,in Subramanian G.(Ed.),ContinuousProcessing in Pharmaceutical Manufacturing,Wiley-VCH,Weinheim,Germany,2014；Jockwer et al.,The use of hydroclones for mammalian cell retention inperfusion bioreactors,in Animal Cell Technology:From Target to Market,Springer,pp.301-306,2001；Pinto et al.,Cytotechnology 56(1):57-67,2008；Elsayedet al.,Eng.Life Sci.6(4):347-354,2006；Elsayed et al.,BMC Proceedings 5(Supp.8):p65,2001；Castilho et al.,Animal cell separation,in Castilho et al.(Ed.),Animal Cell Technology:From Biopharmaceuticals to Gene Therapy,Taylor&Francis,New York,NY,pp.273-294,2008中所述的水力旋流分离器)。
用于过滤或澄清液体培养基的另外的示例性方法包括例如基于大小的细胞分离，例如使用旋转过滤进行的(例如，如在Himmelfarb et al.,Science 164(3879):555-557,1969；Tolbert et al.,In Vitro 17(10):885-890,1981；Reuveny et al.,J.Immunol.Methods 86(1):61-69,1986；Avgerinos et al.,Nat.Biotechnol.8(1):54-58,1990；Kim et al.,Biotechnol.Prog.24(1):166-174,2008；Bierau et al.,J.Biotechnol.62(3):195-207,1998；Castilho et al.,Biotechnol.Prog.18(4):776-781,2002；Deo et al.,Biotechnol.Prog.12(1):57-64,1996；Emery et al.,Appl.Microbiol.Biotechnol.43(6):1028-1033,1995；Hecht et al.,Biotechnol.Prog.30(3):607-615.,2014；Vallez-Chetreaunu et al.,J.Biotechnol.130(3):265-273,2007；Yabannavar et al.,Biotechnol.Bioeng.40(8):925-933,1992；Yabannavar et al.,Biotechnol.Bioeng.40(8):925-933,1994；Deo et al.,Biotechnol.Prog.12(1):57-64 1996；和Castilho et al.,Biotechnol.Prog.18(4):776-781,2002中描述的旋转过滤)；中空纤维过滤(例如，直接放置在生物反应器内的中空纤维筒的布置(例如，如在Seamans et al.,J.Ferment.Bioeng.70(4):241-245,1990,和Kyunget al.,Cytotechnology 14(3):183-190,1994中描述的)，切向流过滤(TFF)(例如，如在Brennan et al.,Biotechnol.Tech.1(3):169-174,1987；Velez et al.,Biotechnol.Bioeng.33(7):938-940,1989；de la Broise et al.,Biotechnol.Bioeng.38(7):781-787,1991；Greenfield et al.,Bioprocess Eng.6(5):213-219,1991；Kawaharaet al.,Cytotechnology 14(1):61-66,1994；Karst et al.,Biochem.Eng.J.110:17-26,2016；Martin et al.,BMC Proceedings 9:p1,2015；Clincke et al.,Biotechnol.Prog.29(3):754-767,2013中描述的)；交替切向流(ATF)过滤(例如，如在Kelly et al.,Biotechnol.Prog.30(6):1291-1300,2014；Karst et al.,Biochem.Eng.J.110:17-26,2016；Kim et al.,Cytotechnology pp.1-10,2015；Xu etal.,J.Biotechnol.231:149-159,2016；Warikoo et al.,Biotechnol.Bioeng.109(12):3018-3029,2012；Clincke et al.,Biotechnol.Prog.29(3):754-767,2013；Wright etal.,Bioprocess International,Volume 13,March 10,2015；Yang et al.,Biotechnol.Prog.30(3):616-625,2014；和Padawer et al.,Biotechnol.Prog.29(3):829-832,2013中描述的)；使用一次性浮动过滤器(例如，Tao et al.,Biotechnol.Prog.27(3):824-829,2011)；涡流过滤(VFF)(例如，如在Mercille et al.,Biotechnol.Bioeng.43(9):833-846,1994；Mercille et al.,Biotechnol.Bioeng.67(4):435-450,2000；和Rothet al.,Pharmaceutical Technology 21(10),1997中描述的)；和连续深度过滤(如在Vogel et al.,Biotechnol.Bioeng.109(12):3049-3058,2012,和Klutz et al.,ChemicalEngineering Processing:Process Intensification 102:88-101,2015中描述的)。
还可以使用离心并移出上清液(该上清液是基本上没有细胞的液体培养基)，或者通过使细胞沉降到含有液体培养基的容器(例如，生物反应器)的重力底部并移出远离沉降的重组细胞的液体培养基(基本上没有细胞的液体培养基)，而从液体培养基中除去重组细胞。
液体培养基可以从产生本文所述的任何重组治疗性蛋白质的重组细胞(例如重组细菌、酵母或哺乳动物细胞)的培养物中获得。本文描述的任何过程的一些实例可进一步包括培养产生重组治疗性蛋白质的重组细胞(例如，重组细菌、酵母或哺乳动物细胞)的步骤。
液体培养基可以是本文所述或本领域已知的任何类型的液体培养基。例如，液体培养基可以选自下组：无动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基、含血清的液体培养基、化学成分确定的液体培养基和无蛋白质液体培养基。在本文所述的任何过程中，从培养物中获得的液体培养基可以在使其进料至第一MCCS(例如，第一PCCS)之前通过添加第二流体(例如，缓冲液)来稀释。
在使液体培养基进料至第一MCCS(例如，第一PCCS)之前，可以储存基本上没有细胞的含有重组治疗性蛋白质的液体培养基(例如，在低于约15℃的温度(例如，低于约10℃、低于约4℃、低于约0℃、低于约-20℃、低于约-50℃，低于约-70℃或低于约-80℃)至少1天(例如，至少约2天、至少约5天、至少约10天、至少约15天、至少约20天或至少约30天)。或者，在一些实例中，使液体培养基直接从生物反应器进料至第一MCCS(例如，第一PCCS)(例如，在过滤或澄清步骤之后，直接从生物反应器进料至第一MCCS(例如，第一PCCS))。
重组治疗性蛋白质
可通过本文提供的方法产生的重组治疗性蛋白质的非限制性实例包括免疫球蛋白(包括轻链和重链免疫球蛋白、抗体或抗体片段(例如，本文所述的任何抗体片段)、酶(例如，半乳糖苷酶(例如，α-半乳糖苷酶)、Myozyme或Cerezyme)、蛋白质(例如，人促红细胞生成素、肿瘤坏死因子(TNF)或干扰素α或β)，或免疫原性或抗原性蛋白质或蛋白质片段(例如，用于在疫苗中使用的蛋白质)。重组治疗性蛋白质可以是工程改造的抗原结合多肽，其含有至少一个多功能重组蛋白质支架(参见，例如，Gebauer et al.,CurrentOpin.Chem.Biol.13:245-255,2009和美国专利申请公开号2012/0164066中描述的重组抗原结合蛋白(通过提述以其整体并入本文))。作为抗体的重组治疗性蛋白质的非限制性实例包括：帕尼单抗(panitumumab)，奥马珠单抗(omalizumab)，阿巴伏单抗(abagovomab)，阿昔单抗(abciximab)，阿克托克单抗(actoxumab)，阿达木单抗(adalimumab)，阿德木单抗(adecatumumab)，阿非莫单抗(afelimomab)，阿托珠单抗(afutuzumab)，阿珠单抗(alacizumab)，阿珠单抗(alacizumab)，阿仑珠单抗(alemtuzumab)，阿利库单抗(alirocumab)，阿妥莫单抗(altumomab)，阿麦妥昔单抗(amatuximab)，阿麦妥昔单抗(amatuximab)，安莫单抗(anatumomab)，安芦珠单抗(anrukinzumab)，阿泊珠单抗(apolizumab)，阿西莫单抗(arcitumomab)，阿缇努单抗(atinumab)，托珠单抗(tocilizumab)，basilizimab，贝妥莫单抗(bectumomab)，贝利木单抗(belimumab)，贝伐珠单抗(bevacizumab)，贝索单抗(besilesomab)，bezlotoxumab，比西单抗(biciromab)，卡那奴单抗(canakinumab)，塞妥珠单抗(certolizumab)，西妥昔单抗(cetuximab)，西妥木单抗(cixutumumab)，达克珠单抗(daclizumab)，地舒单抗(denosumab)，densumab，依库珠单抗(eculizumab)，依决洛单抗(edrecolomab)，依法利珠单抗(efalizumab)，依芬古单抗(efungumab)，依帕珠单抗(epratuzumab)，厄马索单抗(ertumaxomab)，埃达珠单抗(etaracizumab)，figitumumab，戈利木单抗(golimumab)，替伊莫单抗(ibritumomabtiuxetan)，伊戈伏单抗(igovomab)，尹戈妥珠单抗(imgatuzumab)，英利昔单抗(infliximab)，伊诺莫单抗(inolimomab)，伊珠单抗(inotuzumab)，拉贝珠单抗(labetuzumab)，来金珠单抗(lebrikizumab)，moxetumomab，那他珠单抗(natalizumab)，阿托珠单抗(obinutuzumab)，奥戈伏单抗(oregovomab)，帕利珠单抗(palivizumab)，帕木单抗(panitumumab)，培妥珠单抗(pertuzumab)，雷珠单抗(ranibizumab)，利妥昔单抗(rituximab)，托珠单抗(tocilizumab)，托西莫单抗(tositumomab)，tralokinumab，tucotuzumab，曲妥珠单抗(trastuzumab)，维妥珠单抗(veltuzumab)，扎芦木单抗(zalutumumab)和zatuximab。可通过本文所述方法产生的重组治疗性抗体的另外的实例是本领域已知的。可通过本方法产生的重组治疗性蛋白质的另外的非限制性实例包括：阿葡糖苷酶α、拉罗尼酶、阿巴西普、加硫酶、促黄体素α、抗血友病因子、阿加糖酶β、干扰素β-1a、达贝泊α、替奈普酶、依那西普、凝结因子IX、滤泡刺激激素、干扰素β-1a、伊米苷酶、阿法链道酶、epoetinα、胰岛素或胰岛素类似物、美卡舍明、因子VIII、因子VIIa、抗凝血酶III、蛋白C、人白蛋白、促红细胞生成素、粒细胞集落刺激因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-11、拉罗尼酶、idursuphase、galsulphase、α-1蛋白酶抑制剂、乳糖酶、腺苷脱氨酶、组织纤溶酶原激活剂、促甲状腺激素α(例如，)和阿替普酶。可通过本方法产生的重组蛋白质的另外的实例包括酸性α-葡糖苷酶，阿葡糖苷酶α(例如，和)，α-L-艾杜糖醛酸酶(例如，)，艾杜糖醛酸硫酸酯酶，乙酰肝素N-硫酸酯酶，半乳糖-6-硫酸酯酶，酸性β-半乳糖苷酶，β-葡糖苷酸酶，N-乙酰葡糖胺-1-磷酸转移酶，α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶，酸性脂肪酶，溶酶体酸性神经酰胺酶，酸性鞘磷脂酶，β-葡萄糖苷酶(例如，和)，半乳糖基神经酰胺酶，α-半乳糖苷酶-A(例如，)，酸性β-半乳糖苷酶，β-半乳糖苷酶，神经氨酸酶，己糖胺酶A和己糖胺酶B。
通过从细胞(例如，哺乳动物细胞)移出或以其他方式物理分离液体培养基，可以从液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中回收分泌的可溶性重组治疗性蛋白质。用于从细胞(例如，哺乳动物细胞)移出液体培养基的多种不同方法是本领域已知的，包括例如离心、过滤、移液和/或抽吸。然后可以使用多种生化技术从液体培养基中回收并进一步纯化分泌的重组治疗性蛋白质，所述技术包括多种类型的色谱法(例如，亲和色谱法、分子筛色谱法、阳离子交换色谱法或阴离子交换色谱法)和/或过滤(例如，截留分子量过滤)。
多柱色谱系统
本文描述的方法包括使用两个或更多个(例如，两个、三个、四个、五个或六个)多柱色谱系统(MCCS)。MCCS可包括两个或更多个色谱柱，两个或更多个色谱膜，或至少一个色谱柱和至少一个色谱膜的组合。在非限制性实例中，MCCS(例如，本文任何过程中描述的第一和/或第二MCCS)可包括四个色谱柱，三个色谱柱和一个色谱膜，三个色谱柱，两个色谱柱，两个色谱膜，和两个色谱柱与一个色谱膜。本领域技术人员可以设想色谱柱和/或色谱膜的组合的另外的实例用于MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)而没有限制。存在于MCCS中的个体色谱柱和/或色谱膜可以是相同的(例如，具有相同的形状、体积、树脂、捕获机制和单元操作)，或者可以是不同的(例如，具有一个或多个不同的形状、体积、树脂、捕获机制和单元操作)。存在于MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)中的一个或多个个体色谱柱和/或一个或多个色谱膜可以进行相同的单元操作(例如，捕获、纯化或抛光的单元操作)或不同的单元操作(例如，选自例如下组的不同单元操作：捕获、纯化、抛光、灭活病毒、调节含有重组治疗性蛋白质的流体的离子浓度和/或pH，和过滤)。
可存在于MCCS中(例如，存在于第一和/或第二MCCS中)的一个或多个色谱柱可具有以下的树脂体积，例如，至少约2mL、至少约5mL、至少约10mL、至少约15mL、至少约20mL、至少约25mL、至少约30mL、至少约35mL、至少约40mL、至少约45mL、至少约50mL、至少约55mL、至少约60mL、至少约65mL、至少约70mL、至少约75mL、至少约80mL、至少约85mL、至少约90mL、至少约95mL、至少约100mL、至少约110mL、至少约120mL、至少约130mL、至少约140mL、至少约150mL、至少约160mL、至少约170mL、至少约180mL、至少约190mL、至少约200mL、至少约250mL、至少约300mL、至少约350mL、至少约400mL、至少约450mL、至少约500mL、至少约550mL、至少约600mL、至少约650mL、至少约700mL、至少约750mL、至少约800mL、至少约850mL、至少约900mL、至少约950mL、至少约1L、至少约10L、至少约20L、至少约30L、至少约40L、至少约50L、至少约60L、至少约70L、至少约80L、至少约90L、至少约100L、至少约110L、至少约120L、至少约130L、至少约140L、至少约150L、至少约160L、至少约170L、至少约180L、至少约190L或至少约200L。
可存在于MCCS中(例如，存在于第一和/或第二MCCS中)的一个或多个色谱柱可具有以下的树脂体积：约2mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL、约10mL或约5mL；约5mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL或约10mL；约10mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL或约15mL；约15mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL或约20mL；约20mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL或约25mL；约25mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL或约30mL；约30mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL、约40mL或约35mL；约35mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL、约45mL或约40mL；约40mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL、约50mL或约45mL；约45mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL、约60mL或约50mL；约50mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL、约70mL或约60mL；约60mL～约200L，约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL、约80mL或约70mL；约70mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL、约90mL或约80mL；约80mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL、约100mL或约90mL；约90mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL、约200mL或约100mL；约100mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL、约300mL或约200mL；约200mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL、约400mL或约300mL；约300mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL、约500mL或约400mL；约400mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL、约600mL或约500mL；约500mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约700mL或约600mL；约600mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL或约700mL；约700mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL或约800mL；约800mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L或约900mL；约900mL～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L或约1L；约1L～约200L，约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L或约5L；约5L～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L或约10L；10L～约200L，约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L或约20L；20L～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L或约40L；约40L～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L或约60L；约60L～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L或约80L；约80L～约200L、约180L、约160L、约140L、约120L或约100L；约100L～约200L、约180L、约160L、约140L或约120L；约120L～约200L、约180L、约160L或约140L；约140L～约200L、约180L或约160L；约160L～约200L或约180L；或约180L～约200L。
在本文所述的任何过程中使用的MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)中的一个或多个色谱柱可具有基本相同的树脂体积或可具有不同的树脂体积。用于MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)中的一个或多个色谱柱的流速可以是，例如，约0.2mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟，约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟、约5mL/分钟、约2mL/分钟或约1mL/分钟；约1mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟，约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟、约5mL/分钟或约2mL/分钟；约2mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟或约5mL/分钟；约5mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟或约10mL/分钟；约10mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟或约15mL/分钟；约15mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟或约20mL/分钟；约20mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟、约30mL/分钟或约25mL/分钟；约25mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟、约40mL/分钟或约30mL/分钟；约30mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟、约50mL/分钟或约40mL/分钟；约40mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟、约60mL/分钟或约50mL/分钟；约50mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟、约70mL/分钟或约60mL/分钟；约60mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟、约80mL/分钟或约70mL/分钟；约70mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约90mL/分钟或约80mL/分钟；约80mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟或约90mL/分钟；约90mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟或约100mL/分钟；约100mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟或约150mL/分钟；约150mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟或约200mL/分钟；约200mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟或约250mL/分钟；约250mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟或约300mL/分钟；约300mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟或约350mL/分钟；约350mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟或约400mL/分钟；约400mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟、约500mL/分钟或约450mL/分钟；约450mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟、约600mL/分钟或约500mL/分钟；约500mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟、约700mL/分钟或约600mL/分钟；约600mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟、约800mL/分钟或约700mL/分钟；约700mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约900mL/分钟或约800mL/分钟；约800mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟或约900mL/分钟；约900mL/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟或约1L/分钟；约1L/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟或约5L/分钟；约5L/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟或约10L/分钟；约10L/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟或约20L/分钟；约20L/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟或约40L/分钟；约40L/分钟～约100L/分钟、约80L/分钟或约60L/分钟；约60L/分钟～约100L/分钟或约80L/分钟；或约80L/分钟～约100L/分钟。
MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)中的一个或多个色谱柱可具有基本相同的形状或可具有基本上不同的形状。例如，MCCS中(例如，在第一和/或第二MCCS中)的一个或多个色谱柱可以具有基本上圆柱形状或可以具有基本相同形状的椭圆柱形状。
可存在于MCCS中(例如，存在于第一和/或第二MCCS中)的一个或多个色谱膜可具有以下床体积：例如，约1mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL、约10mL或约5mL(包括端值)；约2mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL、约10mL或约5mL(包括端值)；约5mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL或约10mL(包括端值)；约10mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL或约15mL(包括端值)；约15mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL或约20mL(包括端值)；约20mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL或约25mL(包括端值)；约25mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL或约30mL(包括端值)；约30mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL或约35mL(包括端值)；约35mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL或约40mL(包括端值)；约40mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL或约45mL(包括端值)；约45mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL或约50mL(包括端值)；约50mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL或约55mL(包括端值)；约55mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL、约375mL、约350mL、约325mL、约300mL、约275mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL或约60mL(包括端值)；约60mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900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约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL、约400mL或约375mL(包括端值)；约375mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL、约425mL或约400mL(包括端值)；约400mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL、约450mL或约425mL(包括端值)；约425mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约475mL或约450mL(包括端值)；约450mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL或约475mL(包括端值)；约475mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL或约500mL(包括端值)；约500mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL或约550mL(包括端值)；约550mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL或约600mL(包括端值)；约600mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL或约650mL(包括端值)；约650mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL或约700mL(包括端值)；约700mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL或约750mL(包括端值)；约750mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL或约800mL(包括端值)；约800mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL、约900mL或约850mL(包括端值)；约850mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L、约950mL或约900mL(包括端值)；约900mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L、约1L或约950mL(包括端值)；约950mL～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L、约1.5L或约1L(包括端值)；约1L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L、约2L或约1.5L(包括端值)；约1.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L、约2.5L或约2L(包括端值)；约2L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L、约3L或约2.5L(包括端值)；约2.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L、约3.5L或约3L(包括端值)；约3.0L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L、约4L或约3.5L(包括端值)；约3.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L、约4.5L或约4L(包括端值)；约4L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L、约5L或约4.5L(包括端值)；约4.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L、约5.5L或约5L(包括端值)；约5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L、约6L或约5.5L(包括端值)；约5.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L、约6.5L或约6L(包括端值)；约6L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L、约7L或约6.5L(包括端值)；约6.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L、约7.5L或约7L(包括端值)；约7L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L、约8L或约7.5L(包括端值)；约7.5L～约10L、约9.5L、约9L、约8.5L或约8L(包括端值)；约8L～约10L、约9.5L、约9L或约8.5L(包括端值)；约8.5L～约10L、约9.5L或约9L(包括端值)；约9L～约10L或约9.5L(包括端值)；或约9.5L～约10L。
在本文所述的任何过程中使用两个或更多个MCCS期间可以采用一种或多种(例如，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23或24种)不同类型的缓冲液。如本领域已知的，在本文所述的过程中使用的两个或更多个MCCS中使用的一种或多种类型的缓冲液将取决于两个或更多个MCCS(例如，第一和第二MCCS)的一个或多个色谱柱和/或一个或多个色谱膜中存在的树脂、重组治疗性蛋白质和由两个或更多个MCCS的特定的一个或多个色谱柱和/或色谱膜进行的单元操作(例如，本文所述的任何示例性单元操作)。在本文所述的任何过程中使用两个或更多个MCCS期间采用的缓冲液的体积和类型也可以由本领域技术人员确定(例如，下面更详细地讨论)。例如，可以选择在本文所述的任何过程中使用两个或更多个MCCS期间采用的缓冲液的体积和一种或多种类型，以优化重组蛋白质药物产物的以下一个或多个参数：重组治疗性蛋白质的总产率、重组治疗性蛋白质的活性、重组治疗性蛋白质的纯度水平、以及从含有重组治疗性蛋白质的液体中除去生物污染物(例如，不存在活性病毒、分枝杆菌、酵母、细菌或哺乳动物细胞)。
第一和/或第二MCCS可以是周期性逆流色谱系统(PCCS)。PCCS可以例如包括两个或更多个色谱柱(例如，3个柱或4个柱)，其被转换以允许从两个或更多个色谱柱连续洗脱重组治疗性蛋白质。PCCS可包括两个或更多个色谱柱，两个或更多个色谱膜，或至少一个色谱柱和至少一个色谱膜。柱操作通常由装载、洗涤、洗脱和再生步骤组成。在PCCS中，多个柱用于以循环方式分离地和连续地运行相同的步骤。由于柱是串联操作的，因此通过另一个柱捕获来自一个柱的流出物和洗涤物。PCCS的这种独特特征允许树脂的装载接近其静态结合能力而不是动态结合能力，这在批量模式色谱中是典型的。图3中显示了在包含三个柱的PCCS中使用的三柱转换技术的示例。一个循环被定义为三个完整的柱操作，产生来自柱转换技术中使用的三个柱中每个柱的洗脱池。完成循环中的所有步骤后，重新开始循环。作为连续循环和洗脱的结果，连续处理进入PCCS的流体，并连续产生含有重组治疗性蛋白质的洗脱液。
为了在PCCS循环(例如图3中所示的示例性循环)中从一个步骤前进到另一个步骤，采用柱转换策略。柱转换方法在图3所示的示例性PCCS系统中的三个柱中每个柱采用两个自动转换操作，第一个操作与初始产品穿透相关，而第二个操作与柱饱和同时发生。通过监测来自PCCS中存在的每个色谱柱的洗脱液中的重组治疗性蛋白质浓度(例如，通过UV监测进行的监测)来确定何时应进行柱转换操作的决定。例如，柱转换可以由任何能够通过反馈控制管线内测量产品浓度的PAT工具确定。PAT工具能够通过反馈控制实时管线内测量产品浓度。
图4描绘了基于进料入口和柱出口之间的UV吸光度差(-UV)的示例性PCCS中的柱转换的实例。例如，在柱装载期间(步骤1；图3)，PCC控制系统在吸光度稳定时确定杂质基线水平。随着产品穿透(步骤2；图3)，出口UV信号在杂质基线上方增加。在-UV达到预定阈值(例如，3％产物穿透)时，来自柱1的流出物被引导到柱2而不是到废弃物(t1；图4)。当柱1接近产品饱和且-UV达到预定值(t2；图4)时，进料切换到柱2。PCCS中使用的柱转换策略允许均匀装载柱而不用考虑进料产品浓度和容量如何。可以设计基于在每个柱的洗脱液中检测到的重组蛋白水平的类似柱转换。如本领域已知的，还可以基于通过第一或第二MCCS中的一个或多个色谱柱和/或色谱膜的时间或流体(例如，缓冲液)量来设计柱转换。
在PCCS中，重组治疗性蛋白质在PCCS中存在的每个色谱柱和/或色谱膜上的停留时间(RT)可以在不增加柱/膜尺寸的情况下降低，因为在PCCS中的另一个柱/膜上可以捕获来自第一柱/膜的穿透物。可以使用等式V＝D*RT通过改变柱/膜体积(V)和RT来设计以任何灌注速率(D)处理液体培养基的连续处理系统。
可通过在目前描述的过程中使用的至少两个MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)进行的一个或多个单元操作包括，例如，捕获重组治疗性蛋白质，灭活含有重组治疗性蛋白质的流体中存在的病毒，纯化重组治疗性蛋白质，抛光重组治疗性蛋白质，保持含有重组治疗性蛋白质的流体(例如，使用本文所述的任何示例性断流水箱)，从含有重组治疗性蛋白质的流体中过滤或除去颗粒材料和/或细胞，和调节含有重组治疗性蛋白质的流体的离子浓度和/或pH。
可以使用一个或多个MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)来进行捕获的单元操作，所述MCCS包括至少一个色谱柱和/或色谱树脂，例如利用捕获机制的色谱柱和/或色谱树脂。捕获机制的非限制性实例包括蛋白A结合捕获机制，抗体或抗体片段结合捕获机制，底物结合捕获机制，适体结合捕获机制，标签结合捕获机制(例如，基于多His标签的捕获机制)和辅因子结合捕获机制。也可以使用可用于进行阳离子交换或阴离子交换色谱或分子筛色谱的树脂进行捕获。本文描述了可用于捕获重组治疗性蛋白质的非限制性树脂。可用于捕获重组治疗性蛋白质的树脂的另外的实例是本领域已知的。
灭活存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的病毒的单元操作可以使用一个或多个MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)进行，所述MCCS包括例如色谱柱、色谱膜或存储罐，其能够在约3.0～5.0(例如，在约3.5～约4.5，在约3.5～约4.25，在约3.5～约4.0，在约3.5～约4.0，约3.5至约3.8，或约3.75)的pH温育含有重组治疗性蛋白质的流体至少30分钟的时间段(例如，约30分钟～1.5小时的时间段，约30分钟～1.25小时的时间段，约0.75小时～1.25小时的时间段，或约1小时的时间段)。
纯化重组蛋白的单元操作可以使用一个或多个MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)进行，所述MCCS包括，例如，包含树脂的色谱柱或色谱膜，例如，利用捕获系统的树脂。捕获机制的非限制性实例包括蛋白A结合捕获机制，抗体或抗体片段结合捕获机制，底物结合捕获机制，适体结合捕获机制，标签结合捕获机制(例如，基于多His标签的捕获机制)和辅因子结合捕获机制。也可以使用可用于进行阳离子交换或阴离子交换色谱或分子筛色谱的树脂进行纯化。本文描述了可用于纯化重组治疗性蛋白质的非限制性树脂。可用于纯化重组治疗性蛋白质的树脂的另外的实例是本领域已知的。
抛光重组蛋白质的单元操作可以使用一个或多个MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)进行，所述MCCS包括例如包含树脂的色谱柱或色谱膜，例如，可以用于进行阳离子交换、阴离子交换或分子筛色谱的树脂。本文描述了可用于抛光重组治疗性蛋白质的非限制性树脂。可用于抛光重组治疗性蛋白质的树脂的另外的实例是本领域已知的。
保持含有重组治疗性蛋白质的流体的单元操作可以使用MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)进行，所述MCCS在组合的第一和第二MCCS中包括至少一个储存器(例如，断流水箱)或最多1、2、3、4或5个储存器(例如，断流水箱)。例如，可用于实现此单元操作的储存器(例如，断流水箱)可各自具有以下体积，例如，约1mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(包括端值)；约5mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约20mL或约10mL(包括端值)；约10mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL或约20mL(包括端值)；约20mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL或约40mL(包括端值)；约40mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL或约60mL(包括端值)；约60mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL或约80mL(包括端值)；约80mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL或约100mL(包括端值)；约100mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL或约120mL(包括端值)；约120mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL、约160mL或约140mL(包括端值)；约140mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL、约180mL或约160mL(包括端值)；约160mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL、约200mL或约180mL(包括端值)；约180mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL、约220mL或约200mL(包括端值)；约200mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL、约240mL或约220mL(包括端值)；约220mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL、约260mL或约240mL(包括端值)；约240mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL、约280mL或约260mL(包括端值)；约260mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL、约300mL或约280mL(包括端值)；约280mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL、约350mL或约300mL(包括端值)；约300mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL、约400mL或约350mL(包括端值)；约350mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL、约500mL或约400mL(包括端值)；约400mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL、约600mL或约500mL(包括端值)；约500mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL、约800mL或约600mL(包括端值)；约600mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L、约900mL或约800mL(包括端值)；约800mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L、约1L或约900mL(包括端值)；约900mL～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约5L或约1L(包括端值)；约1L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L或约5L(包括端值)；约5L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L或约10L(包括端值)；约10L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L、约40L或约20L(包括端值)；约20L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L、约60L或约40L(包括端值)；约40L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约80L或约60L(包括端值)；约60L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L或约80L(包括端值)；约80L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L或约100L(包括端值)；约100L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L或约200L(包括端值)；约200L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L或约300L(包括端值)；约300L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L或约400L(包括端值)；约400L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L或约500L(包括端值)；约500L～约10,000L，约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L、约700L或约600L(包括端值)；约600L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L、约800L或约700L(包括端值)；约700L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L、约900L或约800L(包括端值)；约800L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L、约1,000L或约900L(包括端值)；约900L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L、约2,000L或约1,000L(包括端值)；约1,000L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L、约3,000L或约2,000L(包括端值)；约2,000L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L、约4,000L或约3,000L(包括端值)；约3,000L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L、约5,000L或约4,000L(包括端值)；约4,000L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L、约6,000L或约5,000L(包括端值)；约5,000L～约10,000L、约9,000L、约8,000L、约7,000L或约6,000L(包括端值)；约6,000L～约10,000L、约9,000L、约8,000L或约7,000L(包括端值)；约7,000L～约10,000L、约9,000L或约8,000L(包括端值)；约8,000L～约10,000L或约9,000L(包括端值)；或约9,000L～约10,000L(包括端值)。
在本文所述的过程中使用的储存器(例如，断流水箱)可具有例如约1mL～约10,000L(包括端值)的容量，(或本文所述的该体积范围的任何子范围)。在流体进入第一MCCS之前(在本文所述的任何过程中)用于保持流体的一个或多个储存器中的任一个(例如断流水箱)可以具有以下容量：例如，1mL～第一MCCS的第一柱的装载体积的约100％(包括端值)，约1％～第一MCCS的第一柱的装载体积的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％或约5％(包括端值)。在流体进入第二MCCS之前(并且在流体离开第一MCCS之后)用于保持流体的一个或多个储存器中的任一个(例如，断流水箱)可具有以下容量：例如，1mL～第二MCCS的第一柱的装载体积的约100％(包括端值)，例如，约1mL～第二MCCS的第一柱的转载体积的约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、或约5％(包括端值)。
一个或多个储存器(例如，一个或多个断流水箱)可各自保持含有重组治疗性蛋白质的流体至少10分钟(例如，至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、至少14小时、至少16小时、至少18小时、至少20小时、至少22小时、至少24小时、至少26小时、至少28小时、至少30小时、至少32小时、至少34小时、至少36小时、至少38小时、至少40小时、至少42小时、至少44小时、至少46小时或至少48小时)。在其他实例中，一个或多个储存器(例如，一个或多个断流水箱)仅保持治疗性蛋白质以下的总时间段，例如，约5分钟至小于约48小时(包括端值)，例如，约5分钟～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时或约30分钟，包括端值；约30分钟～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1小时，包括端值；约1小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时或约2小时，包括端值；约2小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时或约3小时，包括端值；约3小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时或约4小时，包括端值；约4小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时或约5小时，包括端值；约5小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时或约6小时，包括端值；约6小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时或约7小时，包括端值；约7小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时或约8小时，包括端值；约8小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时或约9小时，包括端值；约9小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时或约10小时，包括端值；约10小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时或约12小时，包括端值；约12小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时或约14小时，包括端值；约14小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时、约18小时或约16小时，包括端值；约16小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时、约20小时或约18小时，包括端值；约18小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时、约22小时或约20小时，包括端值；约20小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时、约24小时或约22小时，包括端值；约22小时～约48小时，约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时、约26小时或约24小时，包括端值；约24小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时、约28小时或约26小时，包括端值；约26小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时、约30小时或约28小时，包括端值；约28小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时、约32小时或约30小时，包括端值；约30小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时、约34小时或约32小时，包括端值；约32小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时、约36小时或约34小时，包括端值；约34小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时、约38小时或约36小时，包括端值；约36小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时、约40小时或约38小时，包括端值；约38小时～约48小时、约46小时、约44小时、约42小时或约40小时，包括端值；约40小时～约48小时、约46小时、约44小时或约42小时，包括端值；约42小时～约48小时、约46小时或约44小时，包括端值；约44小时～约48小时或约46小时，包括端值；约46小时～约48小时，包括端值。
一个或多个储存器(例如，一个或多个断流水箱)可用于保持和冷藏(例如，在低于25℃、低于15℃或低于10℃的温度)含有重组治疗性蛋白质的流体。储存器可具有任何形状，包括圆柱形、椭圆柱形或近似矩形的密封且不可渗透的袋。
过滤含有重组治疗性蛋白质的流体的单元操作可以使用MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)进行，所述MCCS包括例如过滤器，或包含分子筛树脂的色谱柱或色谱膜。如本领域已知的，多种亚微米过滤器(例如，孔径小于1μm、小于0.5μm、小于0.3μm、约0.2μm、小于0.2μm、小于100nm、小于80nm、小于60nm、小于40nm、小于20nm或小于10nm的过滤器)在本领域中可获得，其能够除去任何沉淀的材料和/或细胞(例如，沉淀的、未折叠的蛋白质；沉淀的、不想要的宿主细胞蛋白质；沉淀的脂质；细菌；酵母细胞；真菌细胞；分枝杆菌；和/或哺乳动物细胞)。已知孔径为约0.2μm或小于0.2μm的过滤器可有效地从含有重组治疗性蛋白质的流体中除去细菌。如本领域已知的，含有分子筛树脂的色谱柱或色谱膜也可用于MCCS(例如，第一和/或第二MCCS)中以进行过滤含有重组治疗性蛋白质的流体的单元操作。
可以使用包括并利用缓冲液调节储存器(例如，管线内缓冲液调节储存器)进行调节含有重组治疗性蛋白质的流体的离子浓度和/或pH的单元操作，缓冲液调节储存器将新的缓冲溶液添加到含有重组治疗性蛋白质的流体中(例如，在单个MCCS中的多个柱之间，或倒数第二个MCCS中(例如，第一MCCS)的最后一个柱之后且使含有重组治疗性蛋白质的流体进料至下一个MCCS的第一柱(例如，第二MCCS)之前)。如本领域可以理解的，管线内缓冲液调节储存器可以是任何大小(例如，大于100mL)并且可以含有任何缓冲溶液(例如，具有以下一个或多个性质的缓冲溶液：与含有重组治疗性蛋白质的流体相比增加或降低的pH、与含有重组治疗性蛋白质的流体相比增加或降低的离子(例如，盐)浓度和/或与重组治疗性蛋白质竞争结合至MCCS(例如，第一个或第二个MCCS)的至少一个色谱柱或至少一个色谱膜中的树脂的药剂的浓度增加或降低。在其他实例中，可以使用尺寸排阻色谱法和逆流透析进行调节流体的离子浓度和/或pH的单元操作(参见，例如，Kurnik et al.,Biotechnol.Bioeng.45(2):149-157,1995；和Klutz et al.,J.Biotechnol.213:120-130,2015)。
第一和/或第二MCCS可以进行两个或更多个单元操作。例如，第一和/或第二MCCS可各自进行至少以下的单元操作：捕获重组治疗性蛋白质并且灭活存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的病毒；捕获重组治疗性蛋白质、灭活存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的病毒并且调节含有重组治疗性蛋白质的流体的离子浓度和/或pH；纯化重组治疗蛋白并且抛光重组治疗性蛋白质；纯化重组治疗性蛋白质、抛光重组治疗性蛋白质并且过滤含有重组治疗性蛋白质的流体或从含有重组治疗性蛋白质的流体中除去沉淀物和/或特定物质；和纯化重组治疗性蛋白质、抛光重组治疗性蛋白质、过滤含有重组治疗性蛋白质的流体或从含有重组治疗性蛋白质的流体中除去沉淀物和/或特定物质、并且调节含有重组治疗性蛋白质的液体的离子浓度和/或pH。
捕获重组治疗性蛋白质
本方法包括使用第一MCCS捕获重组治疗性蛋白质的步骤。如本领域可以理解的，含有重组治疗性蛋白质的液体培养基可以使用多种不同方法连续进料到第一MCCS上。例如，液体培养基可以被主动泵入第一MCCS，或者液体培养基可以使用重力进料到第一MCCS中。液体培养基可以在其进料至第一MCCS中之前储存在储存器(例如，存储罐)中，或者液体培养基可以从含有细胞(例如，将重组治疗性蛋白质分泌至培养基中的哺乳动物细胞)培养物的生物反应器被主动泵到第一MCCS中。
液体培养基可以以下流速进料(装载)到第一MCCS中，例如，约0.2mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟、约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟、约5mL/分钟或约2mL/分钟(包括端值)；约0.5mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟、约5mL/分钟或约2mL/分钟(包括端值)；约1mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟、约5mL/分钟或约2mL/分钟(包括端值)；约2mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟、约10mL/分钟或约5mL/分钟(包括端值)；约5mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟、约15mL/分钟或约10mL/分钟(包括端值)；10mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟、约20mL/分钟或约15mL/分钟(包括端值)；约15mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟、约25mL/分钟或约20mL/分钟(包括端值)；约20mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟、约30mL/分钟或约25mL/分钟(包括端值)；约25mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400mL/分钟、约350mL/分钟、约300mL/分钟、约250mL/分钟、约200mL/分钟、约150mL/分钟、约100mL/分钟、约95mL/分钟，约90mL/分钟、约85mL/分钟、约80mL/分钟、约75mL/分钟、约70mL/分钟、约65mL/分钟、约60mL/分钟、约55mL/分钟、约50mL/分钟、约45mL/分钟、约40mL/分钟、约35mL/分钟或约30mL/分钟(包括端值)；约30mL/分钟至约100L/分钟、约95L/分钟、约90L/分钟、约85L/分钟、约80L/分钟、约75L/分钟、约70L/分钟、约65L/分钟、约60L/分钟、约55L/分钟、约50L/分钟、约45L/分钟、约40L/分钟、约35L/分钟、约30L/分钟、约25L/分钟、约20L/分钟、约15L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约950mL/分钟、约900mL/分钟、约850mL/分钟、约800mL/分钟、约750mL/分钟、约700mL/分钟、约650mL/分钟、约600mL/分钟、约550mL/分钟、约500mL/分钟、约450mL/分钟、约400m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一些实例进一步包括在液体培养基进料到第一MCCS之前过滤液体培养基的任选步骤。本文所述的过滤液体培养基或含有重组治疗性蛋白质的流体的任何示例性方法，或本领域已知的任何过滤方法，可用于在含有重组治疗性蛋白质的液体培养基进料至第一个MCCS之前过滤含有重组治疗性蛋白质的液体培养基。
在本文所述的方法中，使用第一MCCS进行从液体培养基中捕获重组治疗性蛋白质。如本领域可以理解的，为了实现重组治疗性蛋白质的捕获，第一MCCS中的至少一个色谱柱或至少一个色谱膜必须含有利用捕获机制的树脂(例如，本文所述的任何示例性捕获机制)，或含有能够进行阳离子交换、阴离子交换或分子筛色谱的树脂。例如，如果重组治疗性蛋白质是抗体或抗体片段，则捕获系统可以是蛋白A结合捕获机制或抗原结合捕获机制(其中捕获抗原被重组治疗性抗体或抗体片段特异性识别)。如果重组治疗性蛋白质是酶，那么捕获机制可以使用特异性结合酶的抗体或抗体片段以捕获重组治疗性酶，使用酶的底物以捕获重组治疗性酶，使用酶的辅因子以捕获重组治疗性酶，或者，如果重组治疗性酶含有标签、蛋白质、金属螯合物，那么使用特异性结合重组治疗性酶中存在的标签的抗体(或抗体片段)。本文描述了可用于捕获重组治疗性蛋白质的非限制性树脂，并且可用于捕获重组治疗性蛋白质的另外的树脂是本领域已知的。利用蛋白A结合捕获机制的树脂的一个非限制性实例是MabSelect SuRe树脂(GE Healthcare，Piscataway，NJ)。
本文描述了可用于捕获重组治疗性蛋白质的第一MCCS中存在的一个或多个色谱柱或一个或多个色谱膜的示例性非限制性的尺寸和形状。进料(装载)到第一MCCS中的液体培养基可以含有，例如，约0.05mg/mL至约100mg/mL重组治疗性蛋白质(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL、约0.1mg/mL至约80mg/mL、约0.1mg/mL至约70mg/mL、约0.1mg/mL至约60mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约40mg/mL、约0.1mg/mL至约30mg/mL、约0.1mg/mL至约20mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约0.1mg/mL至约15mg/mL、约0.5mg/mL至约15mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL或约0.5mg/mL至约10mg/mL重组治疗性蛋白质)。重组治疗性蛋白质与用于进行捕获的单位操作的树脂结合所需的平均时间可以是，例如，约1秒至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟、约1分钟、约30秒、约20秒、约10秒或约5秒(包括端值)；约5秒至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟、约1分钟、约30秒、约20秒或约10秒(包括端值)；约10秒至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟、约1分钟、约30秒或约20秒(包括端值)；约20秒至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟、约1分钟或约30秒(包括端值)；约30秒至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟、约2分钟或约1分钟(包括端值)；约1分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟、约3分钟或约2分钟(包括端值)；约2分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟、约4分钟或约3分钟(包括端值)；约3分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟、约5分钟或约4分钟(包括端值)；约4分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟、约6分钟或约5分钟(包括端值)；约5分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟、约8分钟或约6分钟(包括端值)；约6分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟、约10分钟或约8分钟(包括端值)；约8分钟至约60分钟、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟、约12分钟或约10分钟(包括端值)；约10分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟、约14分钟或约12分钟(包括端值)；约12分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟、约16分钟或约14分钟(包括端值)；约14分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟、约18分钟或约16分钟(包括端值)；约16分钟至约60分钟、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟、约20分钟或约18分钟(包括端值)；约18分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟、约25分钟或约20分钟(包括端值)；约20分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟、约30分钟或约25分钟(包括端值)；约25分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟、约35分钟或约30分钟(包括端值)；约30分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟、约40分钟或约35分钟(包括端值)；约35分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟、约45分钟或约40分钟(包括端值)；约40分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟、约50分钟或约45分钟(包括端值)；约45分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时、约55分钟或约50分钟(包括端值)；约50分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时或约55分钟(包括端值)；约55分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1小时或约60分钟(包括端值)；约60分钟至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1小时(包括端值)；约1小时至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约3小时或约2小时(包括端值)；约2小时至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时或约3小时(包括端值)；约3小时至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时或约4小时(包括端值)；约4小时至约24小时、约20小时、约16小时、约12小时或约8小时(包括端值)；约8小时至约24小时、约20小时、约16小时或约12小时(包括端值)；约12小时至约24小时、约20小时或约16小时(包括端值)；约16小时至约24小时或约20小时(包括端值)；或约20小时至约24小时(包括端值)。
如本领域可以理解的，为了使用第一MCCS中存在的一个或多个色谱柱或一个或多个色谱膜捕获重组治疗性蛋白质，必须进行装载、洗涤、洗脱和再生第一MCCS中存在的一个或多个色谱柱或一个或多个色谱膜的相继色谱步骤。为本文所述的每个连续色谱步骤分配的任何示例性流速、缓冲液体积和/或时间长度可用于这些不同连续色谱步骤中的一个或多个(例如，装载、洗涤，洗脱和再生第一MCCS中存在的用于捕获重组治疗性蛋白质的色谱柱或色谱膜的一个或多个连续色谱步骤)。下文提供了可用于捕获第一MCCS中的一个或多个色谱柱和/或一个或多个色谱膜(例如，第一PCC系统)的每个相继色谱步骤被分配的非限制性的流速、缓冲液体积和/或时间长度。另外，下文描述了可在第一MCCS中使用的示例性缓冲液洗脱缓冲液。
包含含有可以进行捕获的单元操作的树脂(例如，本文所述的可以用于捕获的任何示例性树脂)的至少一个色谱柱和/或色谱膜的第一MCCS可以使用上述任何装载流速(进料速率)装载含有重组治疗性蛋白质的液体培养基。在一些实例中，含有可以进行捕获的单元操作的树脂的单一色谱柱或单一色谱膜在以下时间内装载，例如，约10分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟、约70分钟、约60分钟、约50分钟、约40分钟、约30分钟、约20分钟或约15分钟(包括端值)；约15分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟、约70分钟、约60分钟、约50分钟、约40分钟、约30分钟或约20分钟(包括端值)；约20分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟、约70分钟、约60分钟、约50分钟、约40分钟或约30分钟(包括端值)；约30分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟、约70分钟、约60分钟、约50分钟或约40分钟(包括端值)；约40分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟、约70分钟、约60分钟或约50分钟(包括端值)；约50分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟、约70分钟或约60分钟(包括端值)；约60分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟、约80分钟或约70分钟(包括端值)；约70分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟、约90分钟或约80分钟(包括端值)；约80分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟、约100分钟或约90分钟(包括端值)；约90分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约110分钟或约100分钟(包括端值)；约100分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时或约110分钟(包括端值)；约110分钟至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时、约3小时或约2小时(包括端值)；约2小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4小时或约3小时(包括端值)；约3小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时或约4小时(包括端值)；约4小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时、约6小时或约5小时(包括端值)；约5小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约7小时或约6小时(包括端值)；约6小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时或约7小时(包括端值)；约7小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时或约8小时(包括端值)；约8小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时或约12小时(包括端值)；约12小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时或约16小时(包括端值)；约16小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时或约20小时(包括端值)；约20小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时或约24小时(包括端值)；约24小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时或约28小时(包括端值)；约28小时至约48小时、约44小时、约40小时、约36小时或约32小时(包括端值)；约32小时至约48小时、约44小时、约40小时或约36小时(包括端值)；约36小时至约48小时、约44小时或约40小时(包括端值)；约40小时至约48小时或约44小时(包括端值)或约44小时至约48小时(包括端值)。在一些实例中，其中第一MCCS包括至少两个含有能够进行连续捕获的单元操作的树脂的色谱柱，两个连续色谱柱装载所需的时间是，例如，约50分钟～约180分钟(例如，约60分钟～约180分钟、约70分钟～约180分钟、约80分钟～约180分钟、约90分钟～约180分钟、约100分钟～约180分钟、约110分钟～150分钟和约125分钟～约145分钟)。
在将重组治疗性蛋白质装载到第一MCCS中的至少一个含有能够进行捕获的单位操作的树脂的色谱柱或色谱膜上之后，至少一个色谱柱或色谱膜用至少一种洗涤缓冲液洗涤。如本领域可以理解的，至少一种(例如，两种、三种或四种)洗涤缓冲液意指从至少一个色谱柱或色谱膜洗脱不是重组治疗性蛋白质的所有蛋白质，而不干扰重组治疗性蛋白质与树脂的相互作用。
洗涤缓冲液可以以下流速穿过至少一个色谱柱或色谱膜，例如，约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文描述的该流速范围的任何子范围)。使用的洗涤缓冲液的体积(例如，当使用多于一种洗涤缓冲液时使用的洗涤缓冲液的合并总体积)可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV、约4X CV或约3X CV(包括端值)；约2X CV至约30X CV、约28XCV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV或约4X CV(包括端值)；约3X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18XCV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7XCV或约5X CV(包括端值)；约4X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9XCV、约8X CV、约7X CV或约6X CV(包括端值)；约5X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11XCV、约10X CV、约9X CV、约8X CV或约7X CV(包括端值)；约6X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV、约9X CV或约8X CV(包括端值)；约7X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV或约9X CV(包括端值)；约8X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11XCV或约10X CV(包括端值)；约9CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV或约11X CV(包括端值)；约10XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV或约12X CV(包括端值)；约11X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV或约13X CV(包括端值)；约12XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV或约14X CV(包括端值)；约14X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV或约16X CV(包括端值)；约16X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV或约18X CV(包括端值)；约18X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV或约20X CV(包括端值)；约20X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV或约22X CV(包括端值)；约22X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV或约24X CV(包括端值)；约24X CV至约30X CV、约28X CV或约26X CV(包括端值)；约26X CV至约30X CV或约28X CV(包括端值)；或约28X CV至约30X CV(包括端值)。
洗涤的总时间可以是，例如，约2分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约50分钟、约40分钟、约30分钟、约20分钟、约10分钟或约5分钟(包括端值)；约5分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约50分钟、约40分钟、约30分钟、约20分钟或约10分钟(inclusive)；约10分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约50分钟、约40分钟、约30分钟或约20分钟(包括端值)；约20分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约50分钟、约40分钟或约30分钟(包括端值)；约30分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约50分钟或约40分钟(包括端值)；约40分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时、约1小时或约50分钟(包括端值)；约50分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时、约1.5小时或约1小时(包括端值)；约1小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时、约2小时或约1.5小时(包括端值)；约1.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时、约2.5小时或约2小时(包括端值)；约2小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时、约3小时或约2.5小时(包括端值)；约2.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时、约3.5小时或约3小时(包括端值)；约3小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时、约4小时或约3.5小时(包括端值)；约3.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时、约4.5小时或约4小时(包括端值)；约4小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时或约4.5小时(包括端值)；约4.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时或约5小时(包括端值)；约5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时或约6小时(包括端值)；约6小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时、约8小时或约7小时(包括端值)；约7小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约9小时或约8小时(包括端值)；约8小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时或约9小时(包括端值)；约9小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时或约10小时(包括端值)；约10小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时或约12小时(包括端值)；约12小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时或约14小时(包括端值)；约14小时至约24小时，约22小时、约20小时、约18小时或约16小时(包括端值)；约16小时至约24小时、约22小时、约20小时或约18小时(包括端值)；约18小时至约24小时、约22小时或约20小时(包括端值)；约20小时至约24小时或约22小时(包括端值)；或约22小时至约24小时(包括端值)。
洗涤在第一MCCS中的含有能够进行捕获的单位操作的树脂的至少一个色谱膜或色谱膜之后，通过使洗脱缓冲液通过第一MCCS中含有能够进行捕获的单位操作的树脂的至少一个色谱柱或色谱膜，而从至少一个色谱柱或色谱膜洗脱重组治疗性蛋白质。洗脱缓冲液可以以约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)的流速(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)通过含有能够进行捕获的单元操作的树脂的至少一个色谱柱或色谱膜。用于从至少一个含有能够进行纯化的单位操作的树脂的色谱柱或色谱膜中的每一个洗脱重组治疗性蛋白质的洗脱缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV、约4X CV或约3X CV(包括端值)；约2X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV或约4X CV(包括端值)；约3X CV至约30X CV、约28X CV、约26XCV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约5X CV(包括端值)；约4X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13XCV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约6X CV(包括端值)；约5XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV或约7X CV(包括端值)；约6X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV或约8X CV(包括端值)；约7X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV或约9X CV(包括端值)；约8XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV或约10X CV(包括端值)；约9CV至约30X CV、约28XCV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV或约11X CV(包括端值)；约10X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV或约12X CV(包括端值)；约11XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV或约13X CV(包括端值)；约12X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV或约14X CV(包括端值)；约14X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV或约16X CV(包括端值)；约16XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV或约18X CV(包括端值)；约18X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV或约20X CV(包括端值)；约20X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV或约22X CV(包括端值)；约22XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV或约24X CV(包括端值)；约24X CV至约30X CV、约28XCV或约26X CV(包括端值)；约26X CV至约30X CV或约28X CV(包括端值)；或约28X CV至约30X CV(包括端值)。
洗脱的总时间可以是，例如，约2分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约40分钟、约30分钟、约20分钟、约10分钟或约5分钟，包括端值；约5分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约40分钟、约30分钟、约20分钟或约10分钟，包括端值；约10分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约40分钟、约30分钟或约20分钟，包括端值；约20分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约40分钟或约30分钟，包括端值；约30分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时或约40分钟，包括端值；约40分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时、约1.25小时或约1小时，包括端值；约1小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.5小时或约1.25小时，包括端值；约1.25小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时或约1.5小时，包括端值；约1.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时、约2.0小时或约1.5小时，包括端值；约1.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时、约2.5小时或约2.0小时，包括端值；约2.0小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时、约5小时或约2.5小时，包括端值；约2.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约7.5小时或约5小时，包括端值；约5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时或约7.5小时，包括端值；约7.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时或约10小时，包括端值；约10小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时或约12小时，包括端值；约12小时至约24小时，约22小时、约20小时、约18小时、约16小时或约14小时，包括端值；约14小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时或约16小时，包括端值；约16小时至约24小时，约22小时、约20小时或约18小时，包括端值；约18小时至约24小时、约22小时或约20小时，包括端值；约20小时至约24小时或约22小时，包括端值；或约22小时至约24小时，包括端值。可在这些方法中使用的洗脱缓冲液的非限制性实例将取决于捕获机制和/或治疗性蛋白质。例如，洗脱缓冲液可含有不同浓度的盐(例如，增加的盐浓度)、不同的pH(例如，增加或减少的盐浓度)、或与重组治疗性蛋白质竞争结合能够进行捕获的单元操作的树脂的分子。用于本文所述的每个示例性捕获机制的这样的洗脱缓冲液的实例是本领域公知的。
从第一MCCS中的含有能够进行捕获的单位操作的树脂的至少一个色谱柱或色谱膜中洗脱重组治疗性蛋白质之后，并且在下一个体积的液体培养基可以装载到至少一个色谱柱或色谱膜上之前，必须使用再生缓冲液平衡至少一个色谱柱或色谱膜。再生缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)的流速通过含有能够进行捕获的单元操作的树脂的至少一个色谱柱或色谱膜。用于平衡含有能够进行捕获的单元操作的树脂的至少一个色谱柱或色谱膜的再生缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9XCV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV、约4X CV或约3X CV(包括端值)；约2X CV至约30XCV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV或约4X CV(包括端值)；约3X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20XCV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约5X CV(包括端值)；约4X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24XCV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约6X CV(包括端值)；约5X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV或约7X CV(包括端值)；约6X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13XCV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV或约8X CV(包括端值)；约7X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13XCV、约12X CV、约11X CV、约10X CV或约9X CV(包括端值)；约8X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV或约10X CV(包括端值)；约9CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV或约11X CV(包括端值)；约10X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV或约12X CV(包括端值)；约11X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV或约13X CV(包括端值)；约12X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV或约14X CV(包括端值)；约14X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV或约16X CV(包括端值)；约16X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV或约18X CV(包括端值)；约18X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV或约20X CV(包括端值)；约20X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV或约22X CV(包括端值)；约22X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV或约24X CV(包括端值)；约24X CV至约30X CV、约28X CV或约26X CV(包括端值)；约26X CV至约30X CV或约28X CV(包括端值)；或约28X CV至约30X CV(包括端值)。
在本文所述的一些过程中，第一MCCS包括储存器，该储存器在低pH(例如，pH低于4.6、低于4.4、低于4.2、低于4.0、低于3.8、低于3.6、低于3.4、低于3.2或低于3.0)下保持含有重组治疗性蛋白质的流体例如约1分钟至3.0小时(例如，约1小时)，并且使含有重组治疗性蛋白质的流体中存在的病毒失活。可用于进行灭活病毒的单元操作的储存器的实例是搅拌瓶(例如，500-mL搅拌瓶，例如具有程序化搅拌板的500-mL搅拌瓶)，其能够在使含有重组治疗性蛋白质的流体进料至第二MCCS之前保持含有重组治疗性蛋白质的流体例如约1分钟至1.5小时。用于进行灭活病毒的单元操作的储存器可以是具有程序化搅拌板的500-mL搅拌瓶(例如，程序化为混合(例如，周期性地混合)储存器内的流体(例如每4小时一次)的搅拌板)。可用于进行灭活病毒的单元操作的储存器的另一个实例是塑料袋(例如，500-mL塑料袋)，其能够在使含有重组治疗性蛋白质的流体进料至第二MCCS之前保持含有重组治疗性蛋白质的流体例如约1分钟至1.5小时。在一些实例中，含有重组治疗性蛋白质的流体当使其进料至用于进行病毒灭活的单元操作的储存器中时可已经具有低pH(例如，pH低于4.6、低于4.4、低于4.2、低于4.0、低于3.8、低于3.6、低于3.4、低于3.2或低于3.0)。还可以使用管式反应器进行病毒灭活(例如，如Klutz et al.,Chemical EngineeringProcessing:Process Intensification 102:88-101,2016b；Klutz et al.,ChemicalEngineering Research Design 95:22-33,2015中所述的)或卷流逆变器(参见，例如，Klutz et al.,Chemical Engineering Research Design 95:22-33,2015；和Klutz etal.,Chemical Engineering Processing:Process Intensification 102:88-101,2016b)。如本领域技术人员可以理解的，可以使用多种其他手段来进行灭活病毒的单元操作。例如，含有重组治疗性蛋白质的流体的UV照射(例如，使用UV-C光)也可用于进行灭活病毒的单元操作(参见，例如，Lorenz et al.,Biotechnol.Prog.25(2):476-482,2009；Caillet-Fauquet et al.,J.Virol.Methods 118(2):131-139,2004；Gunn et al.,U.S.Patent No.6,586,172,2003；Kaiser et al.,U.S.Patent 7,695,675,2002；Bae etal.,Kor.J.Microbiol.Biotechnol.4:377-382,2009；Li et al.,Biologicals 33(2):101-110,2005；和Wang et al.,Vox Sang.86(4):230-238,2004)。本文描述了可用于进行灭活存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的病毒的单元操作的储存器的非限制性实例。
第一MCCS可以包括含有四个色谱柱的PCCS，其中四个色谱柱中的至少三个进行从液体培养基捕获重组治疗性蛋白质的单元操作(例如，使用包括含有能够进行捕获的单元操作的树脂的至少一个色谱柱的任何一个的第一MCCS(例如，本文所述那些的任何一个)。在这些实例中，PCC的第四柱可以执行使含有重组治疗性蛋白质的流体中的病毒灭活的单元操作(例如，本文所述的任何示例性柱，其可用于实现含有重组治疗性蛋白质的流体的病毒灭活)。
含有重组治疗性蛋白质的流体从第一MCCS(例如，第一PCC系统)连续洗脱，并连续进料到第二MCCS中。回收的重组治疗性蛋白质在第一MCCS(例如，第一PCC系统)的洗脱液中的百分比可以是，例如，至少70％、至少72％、至少74％、至少76％、至少78％、至少80％、至少82％、至少84％、至少86％、至少88％、至少90％、至少92％、至少94％、至少96％或至少98％。可以使用本领域已知的多种方法(例如，铺设管道)将来自第一MCCS(例如，第一PCC系统)的洗脱液进料到第二MCCS(例如，第二PCC系统)中。第一MCCS(例如，第一PCC系统)的洗脱液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)的流速(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)进料到第二MCCS(例如，第二PCC系统)中。
本文描述的一些过程可以进一步包括在使来自第一MCCS(例如，第一PCC系统)的洗脱液进料到第二MCCS(例如，第二PCC系统)之前调节其离子浓度和/或pH的步骤。如本文所述的，来自第一MCCS(例如，第一PCC系统)的洗脱液的离子浓度和/或pH可以通过向该洗脱液添加缓冲液(例如，通过使用管线内缓冲液调节储存器)来调节(在使其进料到第二MCCS之前)。缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)的流速(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)添加到来自第一MCCS的洗脱液中。
本文所述的过程可进一步包括在使来自第一MCCS的洗脱液进料到第二MCCS中之前保持或储存(并且还任选地冷藏)来自第一MCCS的洗脱液的步骤。如本文所述的，该保持或储存步骤可使用本文所述的任何储存器(例如，备用罐)来进行。
本文所述的过程还可包括在将洗脱液进料到第二MCCS中之前过滤来自第一MCCS的洗脱液的步骤。本文所述的任何示例性过滤器或过滤方法可用于在将洗脱液进料到第二MCCS中之前过滤来自第一MCCS的洗脱液。
抛光和纯化重组治疗性蛋白质
本文描述的过程包括使用第二MCCS纯化和抛光重组治疗性蛋白质的步骤，其中来自MCC2的洗脱液是治疗性蛋白质药物。第二MCCS可包括可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个(例如，2、3或4个)色谱柱或色谱膜，和可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个(例如，2、3或4个)色谱柱或色谱膜。
可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜可含有利用捕获机制(例如，本文所述的或本领域已知的任何捕获机制)的树脂，或可用于进行阴离子交换、阳离子交换或分子筛色谱的树脂。可用于执行抛光重组治疗性蛋白质的操作单元的至少一个色谱柱或色谱膜可含有可用于进行阴离子交换、阳离子交换或分子筛色谱的树脂(例如，本文所述的或本领域已知的用于进行阴离子交换、阳离子交换或分子筛色谱的任何示例性树脂)。
可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的尺寸、形状和体积，和/或可以用于进行抛光重组膜的单元操作的至少一个色谱膜的大小和形状，可以是本文所述的色谱柱或色谱膜的示例性尺寸、形状和体积的任何组合。如本领域技术人员可以理解的，纯化或抛光重组治疗性蛋白质的步骤可以例如包括装载、洗涤、洗脱和平衡用于进行纯化或抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的步骤。一般地，从用于进行纯化的单位操作的色谱柱或色谱膜中流出的洗脱缓冲液含有重组治疗性蛋白质。一般地，从用于进行抛光的单元操作的色谱柱或色谱膜中流出的装载和/或洗涤缓冲液含有重组治疗性蛋白质。
例如，可以用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的大小可以具有以下的体积，例如，约2.0mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL、约10mL或约5.0mL(包括端值)；约5.0mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL、约15mL或约10mL(包括端值)；约10mL to 200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL、约20mL或约15mL(包括端值)；约15mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL、约25mL或约20mL(包括端值)；约20mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL、约30mL或约25mL(包括端值)；约25mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL、约35mL或约30mL(包括端值)；约30mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL、约40mL或约35mL(包括端值)；约35mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL、约45mL或约40mL(包括端值)；约40mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL、约50mL或约45mL(包括端值)；约45mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL、约55mL或约50mL(包括端值)；约50mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL、约60mL或约55mL(包括端值)；约55mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL、约65mL或约60mL(包括端值)；约60mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL、约70mL或约65mL(包括端值)；约65mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL、约75mL或约70mL(包括端值)；约70mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL、约80mL或约75mL(包括端值)；约75mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL、约800mL、约750mL、约700mL、约650mL、约600mL、约550mL、约500mL、约450mL、约400mL、约350mL、约300mL、约250mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约95mL、约90mL、约85mL或约80mL(包括端值)；约80mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约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约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL、约850mL或约800mL(包括端值)；约800mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL、约900mL或约850mL(包括端值)；约850mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L、约950mL或约900mL(包括端值)；约900mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L、约1L或约950mL(包括端值)；约950mL至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L、约5L或约1L(包括端值)；约1L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L、约10L或约5L(包括端值)；约5L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L、约15L或约10L(包括端值)；约10L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L、约20L或约15L(包括端值)；约15L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L、约25L或约20L(包括端值)；约20L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L、约30L或约25L(包括端值)；约25L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L、约35L或约30L(包括端值)；约30L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L、约40L或约35L(包括端值)；约35L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L、约45L或约40L(包括端值)；约40L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L、约50L或约45L(包括端值)；约45L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L、约55L或约50L(包括端值)；约50L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L、约60L或约55L(包括端值)；约55L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L、约65L或约60L(包括端值)；约60L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L、约70L或约65L(包括端值)；约65L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L、约75L或约70L(包括端值)；约70L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L、约80L或约75L(包括端值)；约75L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L、约85L或约80L(包括端值)；约80L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L、约90L或约85L(包括端值)；约85L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约95L或约90L(包括端值)；约90L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L或约95L(包括端值)；约95L至200L、约180L、约160L、约140L、约120L或约100L(包括端值)；约100L至200L、约180L、约160L、约140L或约120L(包括端值)；约120L至200L、约180L、约160L或约140L(包括端值)；约140L至200L、约180L或约160L(包括端值)；约160L至约200L或约180L(包括端值)；或约180L至约200L(包括端值)。
含有重组治疗性蛋白质的流体装载到可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜上时，其流速可以是，例如，约0.1mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟、约3mL/分钟、约2mL/分钟、约1mL/分钟或约0.5mL/分钟(包括端值)；约0.5mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟、约3mL/分钟、约2mL/分钟或约1mL/分钟(包括端值)；约1mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟、约3mL/分钟或约2mL/分钟(包括端值)；约2mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟或约3mL/分钟(包括端值)；约3mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟或约4mL/分钟(包括端值)；约4mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟或约6mL/分钟(包括端值)；约6mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟或约8.0mL/分钟(包括端值)；约8mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟或约10.0mL/分钟(包括端值)；约10mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约25mL/分钟或约12.5mL/分钟(包括端值)；约12.5mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟或约25mL/分钟(包括端值)；约25mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟或约100mL/分钟(包括端值)；约100mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟或约200mL/分钟(包括端值)；约200mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟或约400mL/分钟(包括端值)；约400mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟或约600mL/分钟(包括端值)；约600mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟或约800mL/分钟(包括端值)；约800mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟或约1L/分钟(包括端值)；约1L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟或约5L/分钟(包括端值)；约5L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟或约10L/分钟(包括端值)；约10L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟或约20L/分钟(包括端值)；约20L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟或约40L/分钟(包括端值)；约40L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟或约60L/分钟(包括端值)；约60L/分钟至100L/分钟或约80L/分钟(包括端值)；或约80L/分钟至约100L/分钟(包括端值)。
装载到可以用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜上的流体中的重组治疗性蛋白质的浓度可以是，例如，约0.05mg/mL至约100mg/mL重组蛋白质(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL、约0.1mg/mL至约80mg/mL、约0.1mg/mL至约70mg/mL、约0.1mg/mL至约60mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约40mg/mL、约0.1mg/mL至约30mg/mL、约0.1mg/mL至约20mg/mL、0.5mg/mL至约20mg/mL、约0.1mg/mL至约15mg/mL、约0.5mg/mL至约15mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL或约0.5mg/mL至约10mg/mL重组治疗性蛋白质)。用于进行纯化的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜中的树脂可以是可用于进行阴离子交换或阳离子交换色谱的树脂。用于进行纯化的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜中的树脂可以是阳离子交换树脂(例如，Capto-S树脂，GE Healthcare LifeSciences，Piscataway，NJ)。
在将重组治疗性蛋白质装载到第二MCCS中的可以用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜上之后，用至少一种洗涤缓冲液洗涤至少一个色谱柱或色谱膜。如本领域可以理解的，至少一种(例如，2、3或4种)洗涤缓冲液意图从至少一个色谱柱或色谱膜洗脱不是重组治疗性蛋白质的所有蛋白质，而不干扰重组治疗性蛋白质与树脂的相互作用或以其他方式洗脱重组治疗性蛋白质。
洗涤缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)的流速通过至少一个色谱柱或色谱膜。使用的洗涤缓冲液的体积(例如，当使用多于一种洗涤缓冲液时使用的洗涤缓冲液的合并总体积)可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18XCV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7XCV、约6X CV、约5X CV、约4X CV或约3X CV(包括端值)；约2X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV或约4X CV(包括端值)；约3X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约5X CV(包括端值)；约4X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9XCV、约8X CV、约7X CV或约6X CV(包括端值)；约5X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11XCV、约10X CV、约9X CV、约8X CV或约7X CV(包括端值)；约6X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV、约9X CV或约8X CV(包括端值)；约7X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV或约9X CV(包括端值)；约8X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11XCV或约10X CV(包括端值)；约9CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV或约11X CV(包括端值)；约10XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV或约12X CV(包括端值)；约11X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV或约13X CV(包括端值)；约12XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV或约14X CV(包括端值)；约14X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV或约16X CV(包括端值)；约16X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV或约18X CV(包括端值)；约18X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV或约20X CV(包括端值)；约20X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV或约22X CV(包括端值)；约22X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV或约24X CV(包括端值)；约24X CV至约30X CV、约28X CV或约26X CV(包括端值)；约26X CV至约30X CV或约28X CV(包括端值)；或约28X CV至约30X CV(包括端值)。洗涤的总时间可以是，例如，约2分钟至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟、约20分钟、约10分钟或约5分钟(包括端值)；约5分钟至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟、约20分钟或约10分钟(包括端值)；约10分钟至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟或约20分钟(包括端值)；约20分钟至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时或约30分钟(包括端值)；约30分钟至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时、约1.25小时或约1小时(包括端值)；约1小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时、约1.5小时或约1.25小时(包括端值)；约1.25小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时、约2.0小时或约1.5小时(包括端值)；约1.5小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时、约2.5小时或约2.0小时(包括端值)；约2.0小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约4小时或约2.5小时(包括端值)；约2.5小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时或约4小时(包括端值)；约4小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时或约8小时(包括端值)；约8小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时或约12小时(包括端值)；约12小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时或约16小时(包括端值)；约16小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时或约20小时(包括端值)；约20小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时或约24小时(包括端值)；约24小时至约48小时、约40小时、约36小时、约32小时或约28小时(包括端值)；约28小时至约48小时、约40小时、约36小时或约32小时(包括端值)；约32小时至约48小时、约40小时或约36小时(包括端值)；约36小时至约48小时或约40小时(包括端值)；或约40小时至约48小时(包括端值)。
在洗涤第二MCCS中的可以用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜之后，通过使洗脱缓冲液通过第二MCCS中的可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜，而从至少一个色谱柱或色谱膜洗脱重组治疗性蛋白质。洗脱缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文描述的该流速范围的任何子范围)的流速通过可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜。用于从可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜中的每个中洗脱重组治疗性蛋白质的洗脱缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV、约4X CV或约3X CV(包括端值)；约2X CV至约30X CV、约28XCV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV或约4X CV(包括端值)；约3X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18XCV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7XCV或约5X CV(包括端值)；约4X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9XCV、约8X CV、约7X CV或约6X CV(包括端值)；约5X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11XCV、约10X CV、约9X CV、约8X CV或约7X CV(包括端值)；约6X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV、约9X CV或约8X CV(包括端值)；约7X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12XCV、约11X CV、约10X CV或约9X CV(包括端值)；约8X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11XCV或约10X CV(包括端值)；约9CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV或约11X CV(包括端值)；约10XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV或约12X CV(包括端值)；约11X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV或约13X CV(包括端值)；约12XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV或约14X CV(包括端值)；约14X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV或约16X CV(包括端值)；约16X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV或约18X CV(包括端值)；约18X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV或约20X CV(包括端值)；约20X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV或约22X CV(包括端值)；约22X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV或约24X CV(包括端值)；约24X CV至约30X CV、约28X CV或约26X CV(包括端值)；约26X CV至约30X CV或约28X CV(包括端值)；或约28X CV至约30X CV(包括端值)。洗脱的总时间可以是，例如，约2分钟至约3小时(例如，约2分钟至约2.5小时、约2分钟至约2.0小时、约2分钟至约1.5小时、约2分钟至约1.5小时、约2分钟至约1.25小时、约2分钟至约1.25小时、约2分钟至约1小时、约2分钟至约40分钟、约10分钟至约40分钟、约20分钟至约40分钟或约30分钟至1.0小时)。可在这些方法中使用的洗脱缓冲液的非限制性实例取决于树脂和/或治疗性蛋白质。例如，洗脱缓冲液可含有不同浓度的盐(例如，增加的盐浓度)、不同的pH(例如，增加或减少的盐浓度)或将与重组治疗性蛋白质竞争结合树脂的分子。用于本文所述的每个示例性捕获机制的这样的洗脱缓冲液的实例是本领域公知的。
从第二MCCS中的可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜洗脱重组治疗性蛋白质后，并且在下一体积的含有重组治疗性蛋白质的流体装载到至少一个色谱柱或色谱膜上之前，必须使用再生缓冲液平衡至少一个色谱柱或色谱膜。再生缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文描述的该流速范围的任何子范围)的流速通过可以用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜。用于平衡含有可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的树脂的至少一个色谱柱或色谱膜的再生缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约30XCV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV、约4X CV或约3X CV(包括端值)；约2X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22XCV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV、约6X CV、约5X CV或约4X CV(包括端值)；约3X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13XCV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约5X CV(包括端值)；约4XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV、约7X CV或约6X CV(包括端值)；约5X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV、约8X CV或约7X CV(包括端值)；约6X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV、约9X CV或约8X CV(包括端值)；约7X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV、约10X CV或约9XCV(包括端值)；约8X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV、约11X CV或约10X CV(包括端值)；约9CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV、约12X CV或约11X CV(包括端值)；约10X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV、约13X CV或约12XCV(包括端值)；约11X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV、约14X CV或约13X CV(包括端值)；约12X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV、约16X CV或约14X CV(包括端值)；约14XCV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV、约18X CV或约16X CV(包括端值)；约16X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV、约20X CV或约18X CV(包括端值)；约18X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV、约24X CV、约22X CV或约20X CV(包括端值)；约20X CV至约30X CV，约28X CV、约26X CV、约24X CV或约22X CV(包括端值)；约22X CV至约30X CV、约28X CV、约26X CV或约24X CV(包括端值)；约24X CV至约30X CV、约28X CV或约26X CV(包括端值)；约26X CV至约30X CV或约28X CV(包括端值)；或约28X CV至约30X CV(包括端值)。在可用于进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的洗脱液中的重组治疗性蛋白质的浓度可以是，例如，约0.05mg/mL至约100mg/mL重组治疗性蛋白质(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL、约0.1mg/mL至约80mg/mL、约0.1mg/mL至约70mg/mL、约0.1mg/mL至约60mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约40mg/mL、约2.5mg/mL至约7.5mg/mL、约0.1mg/mL至约30mg/mL、约0.1mg/mL至约20mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约0.1mg/mL至约15mg/mL、约0.5mg/mL至约15mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL、约0.5mg/mL至约10mg/mL、约10mg/mL至约200mg/mL、约10mg/mL至约150mg/mL、约10mg/mL至约100mg/mL、约10mg/mL至约50mg/mL、约50mg/mL至约200mg/mL、约50mg/mL至约150mg/mL、约50mg/mL至约100mg/mL、约100mg/mL至约200mg/mL、约100mg/mL至约150mg/mL或约150mg/mL至约200mg/mL重组治疗性蛋白质)。
可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜可含有可用于进行阳离子交换、阴离子交换或分子筛色谱的树脂。如本领域可以理解的，使用在第二MCCS中的可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜抛光重组治疗性蛋白质可包括例如以下步骤：装载、追捕(chase)和再生用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个可色谱柱或色谱膜。例如，当使用装载、追捕和再生的步骤进行抛光时，重组治疗性蛋白质不结合第二MCCS中的用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜中的树脂，在装载和追捕步骤中从至少一个色谱柱或色谱膜洗脱重组治疗性蛋白质，并且再生步骤用于在将含有重组治疗性蛋白质的另外的流体装载到至少一个色谱柱或色谱膜上之前从至少一个色谱柱或色谱膜中除去任何杂质。下面描述了在每个装载、追捕和再生步骤中使用的示例性流速和缓冲液体积。
可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的尺寸、形状和体积，和/或可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱膜的尺寸和形状可以是本文所述的色谱柱或色谱膜的示例性尺寸、形状和体积的任何组合。例如，可以用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的尺寸可以具有以下体积，例如，约0.5mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约30mL、约20mL、约10mL、约5mL或约2.5mL(包括端值)；约2.5mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约30mL、约20mL、约10mL或约5mL(包括端值)；约5mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约30mL、约20mL或约10mL(包括端值)；约10mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL、约30mL或约20mL(包括端值)；约20mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL、约40mL或约30mL(包括端值)；约30mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL、约60mL或约40mL(包括端值)；约40mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL、约80mL或约60mL(包括端值)；约60mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL、约100mL或约80mL(包括端值)；约80mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL、约140mL、约120mL或约100mL(包括端值)；约100mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL、约160mL或约140mL(包括端值)；约140mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL、约180mL或约160mL(包括端值)；约160mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约200mL或约180mL(包括端值)；约180mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL或约200mL(包括端值)；约200mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL、约600mL或约400mL(包括端值)；约400mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L、约800mL或约600mL(包括端值)；约600mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L、约1L或约800mL(包括端值)；约800mL至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L、约10L或约1L(包括端值)；约1L至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L、约20L或约10L(包括端值)；约10L至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L、约40L或约20L(包括端值)；约20L至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L、约60L或约40L(包括端值)；约40L至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L、约80L或约60L(包括端值)；约60L至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L、约100L或约80L(包括端值)；约80L至约200L、约180L、约160L、约140L、约120L或约100L(包括端值)；约100L至约200L、约180L、约160L、约140L或约120L(包括端值)；约120L至约200L、约180L、约160L或约140L(包括端值)；约140L至约200L、约180L或约160L(包括端值)；约160L至约200L或约180L(包括端值)；或约180L至约200L(包括端值)。含有重组治疗性蛋白质的流体装载到至少一个可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的色谱柱或色谱膜上的流速可以是，例如，约0.1mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟、约3mL/分钟、约2mL/分钟、约1mL/分钟、约0.5mL/分钟或约0.2mL/分钟(包括端值)；约0.2mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟、约3mL/分钟、约2mL/分钟或约1mL/分钟(包括端值)；约1mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟、约3mL/分钟或约2mL/分钟(包括端值)；约2mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟、约4mL/分钟或约3mL/分钟(包括端值)；约3mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟、约6mL/分钟或约4mL/分钟(包括端值)；约4mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟、约8.0mL/分钟或约6mL/分钟(包括端值)；约6mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟、约10.0mL/分钟或约8.0mL/分钟(包括端值)；约8mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟、约12.5mL/分钟或约10.0mL/分钟(包括端值)；约10mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟、约25mL/分钟或约12.5mL/分钟(包括端值)；约12.5mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟、约50mL/分钟或约25mL/分钟(包括端值)；约25mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟、约100mL/分钟或约50mL/分钟(包括端值)；约50mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟、约200mL/分钟或约100mL/分钟(包括端值)；约100mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟、约400mL/分钟或约200mL/分钟(包括端值)；约200mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟、约600mL/分钟或约400mL/分钟(包括端值)；约400mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟、约800mL/分钟或约600mL/分钟(包括端值)；约600mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟、约1L/分钟或约800mL/分钟(包括端值)；约800mL/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟、约5L/分钟或约1L/分钟(包括端值)；约1L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟、约10L/分钟或约5L/分钟(包括端值)；约5L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟、约20L/分钟或约10L/分钟(包括端值)；约10L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟、约40L/分钟或约20L/分钟(包括端值)；约20L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟、约60L/分钟或约40L/分钟(包括端值)；约40L/分钟至约100L/分钟、约80L/分钟或约60L/分钟(包括端值)；约60L/分钟至约100L/分钟或约80L/分钟(包括端值)；或约80L/分钟至约100L/分钟(包括端值)。含有装载到可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜上的重组治疗性蛋白质的流体的总体积可以是，例如，约1.0mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约75mL、约50mL、约25mL、约10mL或约5mL(包括端值)；约5mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约75mL、约50mL、约25mL或约10mL(包括端值)；约10mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约75mL、约50mL或约25mL(包括端值)；约25mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL、约75mL或约50mL(包括端值)；约50mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL、约100mL或约75mL(包括端值)；约75mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL、约125mL或约100mL(包括端值)；约100mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL、约150mL或约125mL(包括端值)；约125mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL、约175mL或约150mL(包括端值)；约150mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL、约200mL或约175mL(包括端值)；约175mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL、约225mL或约200mL(包括端值)；约200mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL、约250mL或约225mL(包括端值)；约225mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL、约400mL或约250mL(包括端值)；约250mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL、约600mL或约400mL(包括端值)；约400mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L、约800mL或约600mL(包括端值)；约600mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L、约1L或约800mL(包括端值)；约800mL至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L、约5L或约1L(包括端值)；约1L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L、约10L或约5L(包括端值)；约5L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L、约25L或约10L(包括端值)；约10L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L、约50L或约25L(包括端值)；约25L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L、约100L或约50L(包括端值)；约50L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L、约200L或约100L(包括端值)；约100L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L、约400L、约300L或约200L(包括端值)；约200L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L、约500L或约400L(包括端值)；约400L至约1,000L、约900L、约800L、约700L、约600L或约500L(包括端值)；约500L至约1,000L、约900L、约800L、约700L或约600L(包括端值)；约600L至约1,000L、约900L、约800L或约700L(包括端值)；约700L至约1,000L、约900L或约800L(包括端值)；约800L至约1,000L或约900L(包括端值)；或约900L至约1,000L(包括端值)。用于进行抛光的至少一个色谱柱或色谱膜中的树脂可以是阴离子交换树脂或阳离子交换树脂。用于进行抛光的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜中的树脂可以是阳离子交换树脂(例如，树脂,Sartorius,Goettingen,Germany)。
在装载步骤之后，第二MCCS中可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜，进行追捕步骤(例如，追捕缓冲液通过至少一个色谱膜或色谱膜以收集基本上不与至少一个色谱柱或色谱膜结合的重组治疗性蛋白质。在这些实例中，追捕缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文描述的该流速范围的任何子范围)的流速通过至少一个色谱柱或色谱膜。使用的追捕缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约100X CV(例如，约1X CV至约90X CV、约1X CV至约80X CV、约1X CV至约70X CV、约1X CV至约60X CV、约1X至约50X CV、约1X CV至约40X CV、约1X CV至约30XCV、约1X CV至约20X CV、约1X CV至约15X CV、约5X CV至约20X CV、约5X CV至约30X CV、约1X CV至约14X CV、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11X CV、约4X CV至约11X CV、约2.5X CV至约5.0X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10X CV)。追捕的总时间可以是，例如，约1分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟、约20分钟、约10分钟、约5分钟或约2分钟(包括端值)；约2分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟、约20分钟、约10分钟或约5分钟(包括端值)；约5分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟、约20分钟或约10分钟(包括端值)；约10分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时、约30分钟或约20分钟(包括端值)；约20分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1.25小时、约1小时或约30分钟(包括端值)；约30分钟至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1.25小时或约1小时(包括端值)；约1小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时或约1.25小时(包括端值)；约1.25小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1.5小时(包括端值)；约1.5小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时、约3小时或约2小时(包括端值)；约2小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时、约4小时或约3小时(包括端值)；约3小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时、约6小时或约4小时(包括端值)；约4小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时、约8小时或约6小时(包括端值)；约6小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时、约10小时或约8小时(包括端值)；约8小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时、约12小时或约10小时(包括端值)；约10小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时、约14小时或约12小时(包括端值)；约12小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时、约16小时或约14小时(包括端值)；约14小时至约24小时、约22小时、约20小时、约18小时或约16小时(包括端值)；约16小时至约24小时、约22小时、约20小时或约18小时(包括端值)；约18小时至约24小时、约22小时或约20小时(包括端值)；约20小时至约24小时至约22小时(包括端值)；或约22小时至约24小时(包括端值)。在装载步骤和追踪步骤中在通过柱的洗脱液中存在的治疗性重组蛋白质的合并浓度可以是，例如，约0.1mg/mL至约100mg/mL重组蛋白质(例如，约0.1mg/mL至约90mg/mL、约0.1mg/mL至约80mg/mL、约0.1mg/mL至约70mg/mL、约0.1mg/mL至约60mg/mL、约0.1mg/mL至约50mg/mL、约0.1mg/mL至约40mg/mL、约2.5mg/mL至约7.5mg/mL、约0.1mg/mL至约30mg/mL、约0.1mg/mL至约20mg/mL、约0.5mg/mL至约20mg/mL、约0.1mg/mL至约15mg/mL、约0.5mg/mL至约15mg/mL、约0.1mg/mL至约10mg/mL、约0.5mg/mL至约10mg/mL或约1mg/mL至约5mg/mL重组治疗性蛋白质)。
在追踪步骤之后并且在下一体积的含有重组治疗性蛋白质的流体可以装载到可以用于进行抛光的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜上之前，至少一个色谱柱或色谱膜必须使用再生缓冲液再生。再生缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端值)(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)的流速通过可以用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜。用于再生可用于进行抛光的单元操作的至少一个色谱柱或色谱膜的再生缓冲液的体积可以是，例如，约1X柱体积(CV)至约500X CV(例如，约1X CV至约450X CV、约1X CV至约400X CV、约1X CV至约350X CV、约1X CV至约300X CV、约1X CV至约250X CV、约1X CV至约200X CV、约1X CV至约150X CV、约1X CV至约100X CV、约1X CV至约90X CV、约1X CV至约80X CV、约1X CV至约70X CV、约1X CV至约60XCV、约1X至约50X CV、约1X CV至约40X CV、约1X CV至约30X CV、约1X CV至约20X CV、约1XCV至约15X CV、约5X CV至约20X CV、约5X CV至约30X CV、约1X CV至约14X CV、约1X CV至约13X CV、约1X CV至约12X CV、约1X CV至约11X CV、约2X CV至约11X CV、约3X CV至约11XCV、约4X CV至约11X CV、约2.5X CV至约5.0X CV、约5X CV至约11X CV或约5X CV至约10XCV)。
在其他实例中，用于进行抛光单元操作的一个或多个色谱柱和/或色谱膜含有选择性结合或保留存在于含有重组治疗性蛋白质的流体中的杂质的树脂，并且，一旦达到或基本接近达到一个或多个柱和/或膜中树脂的结合能力，则不用再生一个或多个柱和/或膜，而是替换一个或多个柱和/或膜(例如，用基本相似的柱和/或膜替换)。
在这些过程的一些实例中，第二MCCS包括含有三个色谱柱和一个色谱膜的PCCS，例如，其中PCCS中的三个色谱柱进行纯化重组治疗性蛋白质的单元操作(例如，使用可用于进行纯化蛋白质的单元操作的至少一个色谱柱)，并且PCCS中的色谱膜进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作。在这些实例中，PCCS中的可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的色谱膜可以是本文所述的可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的任何示例性色谱膜。本文所述的任何柱转换方法可用于确定何时可转换该实例中PCCS中的前三个色谱柱和色谱膜。
该实例的一些实施方案可以进一步包括在使洗脱液进料到PCCS中的色谱膜之前调节来自PCCS中的三个色谱柱的洗脱液的离子浓度和/或pH的步骤。如本文所述的，通过向PCCS中的三个色谱柱的洗脱液中添加缓冲液(例如，通过使用管线内缓冲液调节储存器)(在该实例中，在使其进料至PCCS中的色谱膜之前)，可以调节来自PCCS中的三个色谱柱的洗脱液的离子浓度和/或pH。缓冲液可以以例如约0.2mL/分钟至约100L/分钟(包括端点)(例如，本文所述的该流速范围的任何子范围)的流速添加到洗脱液中。
这些实例可以进一步包括在使洗脱液进料到色谱膜(可以用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的色谱膜)中之前保持或存储来自PCCS中的三个色谱柱的洗脱液的步骤。如本文所述的，该保持或储存步骤可使用本文所述的任何储存器(例如，备用罐)来进行。
这些实例还可包括过滤来自示例性PCCS系统中的色谱膜的洗脱液(可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的色谱膜的洗脱液)的步骤。本文所述的任何示例性过滤器或过滤方法可用于过滤来自该示例性PCCS中的色谱膜的洗脱液(可用于进行抛光重组治疗性蛋白质的单元操作的色谱膜的洗脱液)。
如本领域技术人员可以理解的，可以使用本文所述的任何过程从第二MCCS周期性地洗脱治疗性蛋白质药物。例如，本文描述的任何过程可以洗脱治疗性蛋白质药物持续以下的时间，例如，约30秒～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约30分钟、约20分钟、约10分钟、约5分钟或约1分钟(包括端值)；约1分钟～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约30分钟、约20分钟、约10分钟和约5分钟(包括端值)；约5分钟～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约30分钟、约20分钟或约10分钟(包括端值)；约10分钟～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1小时、约30分钟或约20分钟(包括端值)；约20分钟～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时、约1小时或约30分钟(包括端值)；约30分钟～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时、约1.5小时或约1小时(包括端值)；约1小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时、约2小时或约1.5小时(包括端值)；约1.5小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时、约3小时或约2小时(包括端值)；约2小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时、约4小时或约3小时(包括端值)；约3小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时、约5小时或约4小时(包括端值)；约4小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时、约8小时或约5小时(包括端值)；约5小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时、约12小时或约8小时(包括端值)；约8小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时、约16小时或约12小时(包括端值)；约12小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时、约20小时或约16小时(包括端值)；约16小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时、约24小时或约20小时(包括端值)；约20小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时、约28小时或约24小时(包括端值)；约24小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时、约32小时或约28小时(包括端值)；约28小时～约48小时、约44小时、约40小时、约36小时或约32小时(包括端值)；约32小时～约48小时、约44小时、约40小时或约36小时(包括端值)；约36小时～约48小时、约44小时或约40小时(包括端值)；约40小时～约48小时或约44小时(包括端值)；或约44小时～约48小时(包括端值)，其取决于，例如，在第一和第二MCCS中使用的色谱柱和/或色谱膜。
培养方法
本文所述的一些过程还包括培养在含有液体培养基的生物反应器(例如，灌注或补料分批生物反应器)中分泌重组治疗性蛋白质的细胞(例如，重组哺乳动物细胞)的步骤，其中从灌注生物反应器中连续或周期性地移出基本上没有细胞(例如，哺乳动物细胞)的一定体积的液体培养基，并使其进料到第一多柱色谱系统(MCC1)中。生物反应器可具有以下的体积，例如，约1L至约10,000L(例如，约1L至约50L、约50L至约500L、约500L至约1000L、约500L至约5000L、约500L至约10,000L、约5000L至约10,000L、约1L至约10,000L、约1L至约8,000L、约1L至约6,000L、约1L至约5,000L、约100L至约5,000L、约10L至约100L、约10L至约4,000L、约10L至约3,000L、约10L至约2,000L或约10L至约1,000L)。存在于生物反应器中的液体培养基的量可以是，例如，约0.5L至约5,000L(例如，约0.5L至约25L、约25L至约250L、约250L至约500L、约250L至约2500L、约250L至约5,000L、约2500L至约5,000L、约0.5L至约5,000L、约0.5L至约4,000L、约0.5L至约3,000L、约0.5L至约2,500L、约50L至约2,500L、约5L至约50L、约5L至约2,000L、约5L至约1,500L、约5L至约1,000L或约5L至约500L)。可以例如使用补料分批生物反应器或灌注生物反应器进行培养细胞。培养细胞(例如，培养哺乳动物细胞)的非限制性实例和不同方面在下文中描述，并且可以以任何组合使用。
细胞
在本文描述的一些过程中培养的细胞可以是细菌(例如，革兰氏阴性细菌)、酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或Arxulaadeninivorans)或哺乳动物细胞。哺乳动物细胞可以是悬浮生长的细胞或贴壁细胞。可以在本文描述的任何过程中培养的哺乳动物细胞的非限制性实例包括：中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，CHO DG44细胞或CHO-K1s细胞)、Sp2.0、骨髓瘤细胞(例如，NS/0)、B细胞、杂交瘤细胞、T细胞、人胚肾(HEK)细胞(例如，HEK 293E和HEK 293F)、非洲绿猴肾上皮细胞(Vero)细胞和Madin-Darby犬(克卡犬，Cocker Spaniel)肾上皮细胞(MDCK)细胞。在培养贴壁细胞的一些实例中，培养物还可含有多个微载体(例如，含有一个或多个孔的微载体)。可以在本文所述的任何过程中培养的另外的哺乳动物细胞是本领域已知的。
哺乳动物细胞可含有编码重组治疗性蛋白质的重组核酸(例如，稳定整合在哺乳动物细胞基因组中的核酸)。以下描述了编码示例性重组治疗性蛋白质(可使用本文所述方法产生的重组治疗性蛋白质)的重组核酸的非限制性实例。在一些情况下，在生物反应器(例如，本文所述的任何生物反应器)中培养的哺乳动物细胞源自较大的培养物。
可以使用分子生物学和分子遗传学中的多种已知方法将编码重组治疗性蛋白质的核酸引入哺乳动物细胞中。非限制性实例包括转染(例如，脂质转染)、转导(例如，慢病毒、腺病毒或逆转录病毒感染)和电穿孔。在一些情况下，编码重组治疗性蛋白质的核酸未稳定整合到哺乳动物细胞的染色体中(瞬时转染)，而在其他情况下，核酸是整合的。替代性地或另外地，编码重组治疗性蛋白质的核酸可存在于质粒和/或哺乳动物人工染色体(例如，人的人工染色体)中。替代性地或另外地，可使用病毒载体(例如，慢病毒、逆转录病毒或腺病毒载体)将核酸引入细胞中。核酸可以与启动子序列(例如，强启动子，诸如β-肌动蛋白启动子和CMV启动子，或诱导型启动子)可操作地连接。如果需要，含有核酸的载体也可含有选择性标记(例如，赋予哺乳动物细胞潮霉素、嘌呤霉素或新霉素抗性的基因)。
在一些情况下，重组治疗性蛋白质是分泌蛋白质，并由哺乳动物细胞释放到细胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中。例如，编码可溶性重组治疗性蛋白质的核酸序列可含有编码重组治疗性蛋白质的N-或C-末端的分泌信号肽的序列，其被哺乳动物细胞中存在的酶切割，随后释放到细胞外培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)中。
培养基
液体培养基在本领域中是已知的。液体培养基(例如，第一和/或第二组织培养基)可以补充有哺乳动物血清(例如，胎牛血清和牛血清)和/或生长激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子)。或者或另外，液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可以是化学成分确定的液体培养基，没有动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基或含血清的液体培养基。化学成分确定的液体培养基、无动物来源组分的液体培养基、无血清液体培养基和含血清的液体培养基的非限制性实例是可商购的。
液体培养基通常含有能量来源(例如，碳水化合物，诸如葡萄糖)，必需氨基酸(例如，二十种氨基酸加上半胱氨酸的基本组合)、维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物、游离脂肪酸和/或微量元素。如果需要，液体培养基(例如，第一和/或第二液体培养基)可以补充有，例如，哺乳动物激素或生长因子(例如，胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐和缓冲液(例如，钙、镁和磷酸盐)、核苷和碱基(例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤)，蛋白质和组织水解产物，和/或这些添加物的任何组合。
可用于在本文所述的任何方法中培养细胞(例如，哺乳动物细胞)的多种不同的液体培养基是本领域已知的。也可用于本发明过程的培养基组分包括但不限于化学成分确定的(CD)水解产物，例如，CD蛋白胨、CD多肽(两个或更多个氨基酸)和CD生长因子。液体组织培养基和培养基组分的另外的实例是本领域已知的。
技术人员将理解的是，本文所述的第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基或不同培养基。
示例性生物反应器的另外的特征
本文所述的任何生物反应器的内表面可具有至少一层涂层(例如，至少一层明胶、胶原、聚-L-鸟氨酸、聚苯乙烯和层粘连蛋白的涂层)，并且如本领域中已知的，可具有用于将O2、CO2和N2喷射到液体培养基中的一个或多个端口，以及用于搅拌液体培养基的搅拌机构。生物反应器可以在受控的湿润气氛中(例如，在大于20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的湿度，或100％的湿度)中温育细胞培养物。生物反应器还可以装配有能够从生物反应器中移出一定体积的液体培养基的机械装置，并且任选地，装配有在机械装置内的在液体培养基移出生物反应器(例如，ATF系统)的过程中从液体培养基中移除细胞的过滤器。
温度
培养哺乳动物细胞的步骤可以在约31℃至约40℃的温度进行。技术人员将理解，可以在培养步骤期间的特定时间点(例如，基于每小时或每天)改变温度。例如，在生物反应器初始接种细胞(例如，哺乳动物细胞)之后，可以在大约一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十四天、十五天、十六天、十七天、十八天、十九天或大约二十天或更长时间改变或移动温度。例如，温度可以向上移动(例如，变化高达或约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19，或高达或约为20℃)。例如，温度可以向下移动(例如，变化高达或约为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或高达或约为20℃)。
CO2
本文所述的培养步骤可进一步包括将生物反应器中的液体培养基暴露于含有至多或约15％CO2(例如，至多或约14％CO2、12％CO2、10％CO2、8％CO2、6％CO2、5％CO2、4％CO2、3％CO2、2％CO2，或最多或约1％CO2)的气氛。
灌注生物反应器
可以使用灌注生物反应器进行本文所述的培养步骤。在灌注生物反应器中培养细胞(例如，哺乳动物细胞)包括从生物反应器中移出第一体积的第一液体培养基(例如，包含任何浓度的哺乳动物细胞，例如，基本上没有细胞的第一体积的第一液体培养基)，并向第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基。移出和添加可以同时或顺序进行，或者两者组合进行。此外，可以连续地进行移出和添加(例如，以在任何给定时间段内(例如，在24小时时间段内，在约1小时至约24小时的增量时间段内，或在超过24小时的增量时间段内)或周期性地(例如，每三天一次，每隔一天一次，每天一次，一天两次，一天三次，一天四次或一天五次)移出和替换生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至800％(例如，1％～700％、1％～600％、1％～500％、1％～400％、1％～350％、1％～300％、1％～250％、1％～100％、100％～200％、5％～150％、10％～50％、15％～40％、8％～80％和4％～30％)的体积的速率)，或其任何组合。在周期性地进行的情况下，(例如，在约24小时时间段内，在约1小时至约24小时的增量时间段内，或在大于24小时的增量时间段内)移出或替换的体积可以是，例如，生物反应器的体积或第一液体培养基体积的0.1％至800％(例如，1％～700％、1％～600％、1％～500％、1％～400％、1％～300％、1％～200％、1％～100％、100％～200％、5％～150％、10％～50％、15％～40％、8％～80％、4％～30％)。在某些情况下，移出的第一体积的第一液体培养基和添加的第二体积的第二液体培养基在整个或部分培养期间可以在每24小时时间段(或，可替代地，约1小时至约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)内保持大致相同。如本领域已知的，移出第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以变化。移出第一体积的第一液体培养基的速率(体积/单位时间)和添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/单位时间)可以大致相同或者可以是不同的。
或者，在培养期间，移出和添加的体积可以在每24小时时间段(或，替代性地，在1小时～约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)内改变(例如，逐渐增加)。例如，培养期间内的每24小时时间段(或者，替代性地，在1小时～约24小时的增量时间段或大于24小时的增量时间段)内，移出的第一液体培养基的体积和添加的第二液体培养基的体积在培养期间内可以从生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.5％至约20％的体积增加(例如，逐渐地或通过交错增量)到生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。
技术人员将理解的是，第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基。在其他情况下，第一液体培养基和第二液体培养基可以是不同的。
可以移出第一体积的第一液体培养基，例如通过可以从生物反应器中移出第一体积的第一液体培养基(例如，第一体积的基本上没有来自生物反应器的细胞的第一液体培养基)的机械系统移出。替代性地，或另外地，第一体积的第一液体培养基可以通过第一体积的第一液体培养基的渗出或重力流动通过具有排除细胞(例如，哺乳动物细胞)的截留分子量的无菌膜来移出。
第二体积的第二液体培养基可以以自动方式例如通过灌注泵添加到第一液体培养基中。
在一些情况下，移出第一体积的第一液体培养基(例如，第一体积的基本上没有哺乳动物细胞的第一液体培养基)并向第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基不会在用哺乳动物细胞接种生物反应器的至少1小时内(例如，2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后)发生。
补料分批生物反应器
可以使用补料分批生物反应器进行本文所述的培养步骤。在补料分批生物反应器中培养细胞包括，在大部分培养期间内，向第一液体培养基中添加(例如，周期性地或连续添加)第二体积的第二液体培养基。第二液体培养基的添加可以连续(例如，以在任何给定时间段内(例如，在24小时时间段内，在约1小时至约24小时的增量时间段内，或超过24小时的增量时间段内)添加生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％至300％(例如，1％～250％、1％～100％、100％～200％、5％～150％、10％～50％、15％～40％、8％～80％和4％～30％)的体积的速率)或周期性地(例如，每三天一次、隔天一次、每天一次、一天两次、一天三次、一天四次或一天五次)进行，或者其任何组合。在周期性执行的情况下，添加的体积(例如，在约24小时的时间段内，在约1小时至约24小时的增量时间段内，或在大于24小时的增量时间段内)可以是，例如，生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.1％～300％(例如，1％～200％、1％～100％、100％～200％、5％～150％、10％～50％、15％～40％、8％～80％和4％～30％)。在一些情况下，在整个或部分培养期间，添加的第二体积的第二液体培养基可以在每24小时的期间段(或者，替代性地，约1小时至约24小时的增量时间段，或大于24小时的增量时间段)内保持大致相同。如本领域已知的，添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/时间单位)可在整个或部分培养期间内变化。例如，在培养期间，添加的第二液体培养基的体积可以在每24小时的时间段(或者，替代性地，1小时至约24小时的增量时间段，或大于24小时的增量时间段)内改变(例如，逐渐增加)。例如，在培养期间内，每24小时时间段(或者，替代性地，约1小时至约24小时的增量时间段，或大于24小时的增量时间段)内添加的第二液体培养基的体积可以从生物反应器体积或第一液体培养基体积的0.5％至约20％增加(例如，逐渐地或通过交错增量)到生物反应器体积或第一液体培养基体积的约25％至约150％。添加第二体积的第二液体培养基的速率(体积/时间单位)在整个或部分培养期间内可以是大约相同的。
技术人员将理解的是，第一液体培养基和第二液体培养基可以是相同类型的培养基。在其他情况下，第一液体培养基和第二液体培养基可以是不同的。第二液体培养基的体积可以以自动方式例如通过灌注泵添加到第一液体培养基中。
在一些情况下，向第一液体培养基中添加第二体积的第二液体培养基在用哺乳动物细胞接种生物反应器至少1小时内(例如，2小时内、3小时内、4小时内、5小时内、6小时内、7小时内、8小时内、9小时内、10小时内、12小时内、14小时内、16小时内、18小时内、24小时内、36小时内、48小时内、72小时内、96小时内或96小时后)不发生。补料分批培养中的细胞培养基通常在培养期结束时收获并用于本文所述的任何过程中，然而，补料分批培养中的细胞培养基也可在培养期的一个或多个时间点收获并用于本文所述的任何过程中。
技术人员将理解，可以以任何组合使用任何多种培养参数(例如，容器、体积、替换培养物体积的速率或频率、搅拌频率、温度、培养基和CO2浓度)来进行这些方法。此外，本文描述的或本领域已知的任何哺乳动物细胞可用于产生重组蛋白。
单元操作的另外的实例
处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法的一些实例可以进一步包括进行一个或多个另外的单元操作(例如，捕获重组治疗性蛋白质、纯化重组治疗性蛋白质、抛光重组治疗性蛋白质、病毒灭活、病毒过滤、调节含有重组治疗性蛋白质的流体的离子浓度和/或pH、过滤含有重组治疗性蛋白质的流体、沉淀和絮凝、双水相萃取、冻干和结晶中的一个或多个)。用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的过程的一些实例可以进一步包括一个或多个另外的单元操作，例如沉淀和絮凝、双水相萃取、冻干和结晶中的一个或多个。
沉淀和絮凝
在一些实例中，本文所述的过程和方法进一步包括进行沉淀和/或絮凝的单元操作。用于进行沉淀的方法在例如McNerney et al.,PDADMAC Flocculation of ChineseHamster Ovary Cells:Enabling a Centrifuge-Less Harvest Process for MonoclonalAntibodies,in MAbs,vol.2,Taylor&Francis,pp.413-427,2015,Roush et al.,Biotechnol.Prog.24(3):488-495,2008；Liu et al.,Recovery and PurificationProcess Development for Monoclonal Antibody Production,in MAbs,vol.5,Taylor&Francis,pp.480-499,2010；Tscheliessnig et al.,J.Biotechnol.188:17-28,2014；Sommer et al.,Process Biochem.49(11):2001-2009,2014；Brodsky et al.,Biotechnol.Bioeng.109(10):2589-2598,2012；Lydersen et al.,Ann.NY Acad.Sci.745(1):222-231,1994；和Ito et al.,J.Chromatogr.B 878(2):154-164,2010中描述。沉淀方法可以通过改变如溶液的pH和/或电导率(盐溶或盐析)的因素，或通过添加沉淀剂(例如乙醇、硫酸铵、聚乙二醇(PEG)、辛酸和二价离子)来实现。进行絮凝的方法在例如Riske etal.,J.Biotechnol.128(4):813-823,2007；Kang et al.,Biotechnol.Bioeng.110(11):2928-2937,2013；Singh et al.,Biotechnol.Bioeng.113(4):698-716,2015；Gagnon etal.,J.Chromatogr.A 1221:57-70,2012；Buchacher et al.,Biotechnol.J.1(2):148-163,2006；Watt et al.,Vox Sang.18(1):42-61,1970；Bell et al.,The formation ofprotein precipitates and their centrifugal recovery,in Downstream Processing,Springer,pp.1-72,1983；Chang et al.,Biotechnol.Bioeng.31(8):841-846,1988；Itoet al.,J.Chromatogr.B 878(2):154-164,2010；Hammerschmidt et al.,Biotechnol.J.10(8):1196-1205,2015；Hammerschmidt et al.,Process Biochem.51(2):325-332,2016；Hammerschmidt et al.,Biotechnol.J.9(6):766-775,2014；和Warikoo etal.,Biotechnol.J.10(8):1101-1102,2015)中描述。絮凝依赖于絮凝剂，例如聚电解质，其引起分散的颗粒粘附成较大尺寸的簇，导致平均粒度分布的增加。然后可以通过过滤、沉降或离心收集絮凝物。
连续双水相萃取
在一些实例中，本文所述的过程和方法进一步包括进行双水相萃取的单元操作，例如，如在Azevedo et al.,Sep.Purif.Technol.65(1):14-21,2009；Gomes et al.,Sep.Purif.Technol.65(1):22-30,2009；Kumar et al.,Biotechnol.Bioeng.75(5):570-580,2001；Mashayekhi et al.,Biotechnol.Bioeng.102(6):1613-1623,2009；Rosa etal.,J.Chromatogr.A 1217(16):2296-2305,2010；Haraguchi et al.,Fluid PhaseEquilibria 215(1):1-15,2004；Hart et al.,Nat.Biotechnol.12(11):1113-1117,1994；和Azevedo et al.,Trends Biotechnol.27(4):240-247,2009b)中描述的。
双水相萃取依赖于形成两个不混溶的水相，使得重组治疗性蛋白质分配到一个相中，而杂质分配到另一个相中。有机溶剂混合物不适合，因为蛋白质可以在有机相中变性。因此，用于重组治疗性蛋白质的双水相萃取通常用高于临界浓度的溶解在水中的聚合物-聚合物或聚合物-盐进行(Azevedo et al.,Trends Biotechnol.27(4):240-247,2009)。聚合物(诸如PEG、聚乙烯醇、葡聚糖和淀粉)以及缓冲盐(诸如磷酸盐、硫酸盐和柠檬酸盐)，已经用于产生两相。为了提高重组治疗性蛋白质对特定相的特异性，相形成组分的官能化也是可能的(Ruiz-Ruiz et al.,J.Chromatogr.A 1244:1-13,2012)。
在双水相系统和常规有机-水系统中相萃取的机理是相似的；因此，化学工业中使用的大多数标准萃取设备可用于双水相萃取(Kula and Selber,Encyclopedia ofBioprocess Technology,2002,和Vázquez-Villegas et al.,Sep.Purif.Technol.141:263-268,2015)。可以使用合适的柱接触器、喷雾柱、旋转盘接触器或混合沉降器单元进行双水相萃取(Rosa et al.,J.Chromatogr.B 880:148-156,2012；Muendges et al.,Biotechnol.Prog.31(4):925-936,2015；和Espitia-Saloma et al.,FoodBioprod.Process 92(2):101-112,2014)。使用多级双水相萃取装置诸如多板柱接触器和混合器-沉降器配置可以通过提高回收率和/或纯度克服单级萃取的限制(Espitia-Salomaet al.,Biotechnol.J.11(5):708-716,2016,和Rosa et al.,J.Biotechnol.139(4):306-313,2009)。已经成功地评价了多级双水相萃取纯化mAb(Muendges et al.,Biotechnol.Prog.31(4):925-936,2015；Rosa et al.,Biotechnol.J.8(3):352-362,2013；Rosa et al.,J.Biotechnol.139(4):306-313,2009；Eggersgluess et al.,Chemical Engineering&Technology 37(4):675-682,2014)。连续ATPE装置提供了一种有前途的用于单克隆抗体的下游加工的非色谱替代品；允许在一个单元中同时澄清、浓缩和部分纯化。在工业规模上应用ATPE的关注问题之一与过程中所需的聚合物和盐的高消耗有关，因此也与它们对水处理的影响有关(Espitia-Saloma et al.,Biotechnol.J.11(5):708-716,2016)。
冻干
在一些实例中，本文所述的过程和方法还包括进行冻干(例如，连续冻干)的单元操作。进行连续冻干的方法在De Meyer et al.,Int.J.Pharm.496(1):75-85,2015；Weisselberg,美国专利8,528,225,2013；和Rey et al.,Glimpses into the Realm ofFreeze-Drying:Classical Issues and New Ventures,in Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products,Informa Healthcare,London,UK,pp.1-28,2010中描述。
结晶
在一些实例中，本文所述的过程和方法进一步包括进行结晶(例如，连续结晶)的单元操作。进行结晶的方法在例如Peters et al.,Protein Expression Purif.39(1):43-53,2005；Schmidt et al.,Eng.Life Sci.5(3):273-276,2005；Hekmat,BioprocessBiosystems Eng.38(7):1209-1231,2015；Basu et al.,Expert Opin.Biol.Ther.4(3):301-317,2004；Hekmat,Bioprocess Biosystems Eng.38(7):1209-1231,2015；Power etal.,Chem.Eng.Sci.133:125-139,2015；Lawton et al.,Organic Process ResearchDevelopment 13(6):1357-1363,2009；Wong et al.,Crystal Growth Design 12(11):5701-5707,2012；Li et al.,Organic Process Research Development 20(2):510-516,2015；Poechlauer et al.,Organic Process Research Development 16(10):1586-1590,2012；Mascia et al.,Angewandte Chemie International Edition 52(47):12359-12363,2013；Furuta et al.,Chem.Eng.Process 102:210-218,2016；Power et al.,Chem.Eng.Sci.133:125-139,2015；和Neugebauer et al.,Crystal Growth Design 15(3):1089-1095,2015)中描述。可以使用混合悬浮混合产物去除反应器(MSMPR)、平推流反应器(PFR)和连续振荡折流结晶器(COBC)进行连续结晶(参见，例如，Su et al.,ChemicalEngineering Processing:Process Intensification 89:41-53,2015)。
示例性的色谱类型
可在本方法和过程中(例如，在本文所述的方法和过程中进行的单元操作中)使用的示例性色谱类型包括连续横流色谱法(例如，连续环形色谱法和连续径流色谱法)、连续逆流色谱法(例如，模拟移动床色谱法、周期性逆流色谱法、连续逆流切向色谱法和多柱逆流溶剂梯度纯化法)和流通色谱法(例如，膨胀床色谱法)。
在横流色谱法中，树脂床垂直于床内液体流动的方向移动。在连续横流系统中，在轴向和圆周方向上发生稳态分离，这与仅在轴向方向上发生分离的传统分批系统形成对比(Bridges and Barker,Continuous Cross-Current Chromatographic Refiners,Ganetsos等(编辑),Preparative and Production Scale Chromatography,第61卷,Marcel Dekker,Inc.,New York,NY,pp.113-126,1992)。横流色谱法的非限制性实例是连续环形色谱法和连续径流色谱法。
连续环形色谱法允许使用色谱基质的旋转环形床连续分离多组分混合物。进行连续环形色谱的方法在例如Martin,Discussions of the Faraday Society 7:332-336,1949；Giddings,Anal.Chem.34(3):314-319,1962；Fox et al.,J.Chromatogr.A 43:48-54,1969；Fox,J.Chromatogr.A 43:55-60,1969；和Nicholas and Fox,J.Chromatogr.A43:61-65,1969；Giovannini and Freitag,Biotechnol.Bioeng.73(6):522-529,2001；Bloomingburg and Carta,Chem.Eng.J.55(1-2):B19-B27,1994；Takahashi and Goto,Separation Sci.Technol.26(1):1-13,1991；和Vogel et al.,Biotechnol.Bioeng.80(5):559-568,2002中描述。连续环形色谱法通常使用常规吸附剂床，其填充在形成环的两个同心圆筒之间。环形床围绕其垂直轴缓慢旋转。待分离的进料混合物通过移动吸附床顶部的固定喷嘴连续引入。在最简单的等度色谱法的情况中，旋转环充满洗脱缓冲液，洗脱缓冲液沿进料方向(逆流)流动。随着时间的推移，进料的不同组分在轴向上分离并从固定入口点到环形床底部形成螺旋带。在床的底部保持几个固定的出口，在此处连续回收分离的组分。每个组分带从进料点的角位移(即螺旋带的斜率)取决于流速、环的旋转速度和固定相的组分亲和力。
连续径流色谱法与连续环形色谱法类似地操作，除了进料和所有必需的缓冲液在径向方向上(在水平方向上从周边向内或从中心向外)而不是轴向(沿着轴线)流动。径流柱的有效床高度是内圆筒和外圆筒之间的距离，而横截面积与管的表面积相关。短的床深度和大的柱横截面积使得能够在高流速下进行分离，同时保持低压降(Besselink et al.,J.Chromatogr.A 1271(1):105-114,2013)。连续径流色谱法的另外的方面在例如Cabanneet al.,J.Chromatogr.B 845(2):191-199,2007；Kinna et al.,Biotechnol.Bioeng.113(1):130-140,2016；Weaver et al.,BioPharm 3(7):25-28,1990；Sun et al.,Biomed.Chromatogr.14(7):478-482,2000；Tharakan and Belizaire,J.Chromatogr.A702(1):191-196,1995；Gu et al.,Chem.Eng.Sci.46(5):1279-1288,1991；Huang et al.,Chem.Eng.J.38(3):179-186,1988；Kinna et al.,Biotechnol.Bioeng.113(1):130-140,2016；和Lay et al.,Food Bioprod.Process.84(1):78-83,2006中描述。
连续逆流色谱的非限制性实例包括模拟移动床色谱、周期性逆流色谱、连续逆流切向色谱和多柱逆流溶剂梯度纯化。
与分批色谱相比，逆流色谱法允许待使用的固定相更有效地提高生产率并降低溶剂/缓冲液消耗。通过使固相吸附剂(色谱树脂)在与液相流相反的方向上旋转，可以获得液-固逆流运动。这可以通过在与液体流动相反的方向上物理旋转固体吸附剂/柱(真正的移动床)或通过以周期性或半连续方式使用精细的柱和阀门移动来模拟固相的连续移动(模拟移动床)来实现。
模拟移动床色谱法利用流动方案，该流程方案利用液相和固相的连续和逆流运动而非吸附剂的实际移动。代替传统的分批色谱中使用的大型填充床；SMB色谱系统的特征在于连接多个较小的填充床。模拟的逆流流动通过位于柱之间的复杂阀系统进行，使得在液体流动方向上周期性地从柱至柱转换入口和出口位置。使用模拟移动床色谱法的方法在例如Jungbauer et al.,Trends Biotechnol.31(8):479-492,2013；Low et al.,J.Chromatogr.B 848(1):48-63,2007；Xie et al.,Biotechnol.Bioprocess Eng.6(6):363-375,2001；Imamoglu,Simulated Moving Bed Chromatography(SMB)for Applicationin Bioseparation,in Modern Advances in Chromatography,Springer,pp.211-231,2002；Mun et al.,Ind.Eng.Chem.Res.42(9):1977-1993,2003；Rajendran et al.,J.Chromatogr.A 1216(4):709-738,2009；Gottschlich and Kashe,J.Chromatogr.A 765(2):201-206,1997；Keβler et al.,J.Chromatogr.A 1176(1):69-78,2007；etal.,J.Chromatogr.A 1307:99-110,2013；Rodrigues,Simulated Moving BedTechnology:Principles,Design,and Process Applications,Butterworth-Heinemann,2015；和Aniceto et al.,Separation Purification Reviews 44(1):41-73,2015中描述。
逆流色谱的另一个实例是周期性逆流色谱法。本文描述了用于进行逆流色谱的示例性方法。用于进行逆流色谱的另外的方法在例如Mahajan et al.,J.Chromatogr.A1227:154-162,2012；Warikoo et al.,Biotechnol.Bioeng.109(12):3018-3029,2012；和Godawat et al.,Biotechnol.J.7(12):1496-1508,2012中描述。
连续逆流切向色谱是一种逆流色谱，其中树脂(以浆液的形式)流过一系列静态混合器和中空纤维膜组件，而不是将树脂颗粒填充在固定床柱中。微孔中空纤维膜保留大树脂颗粒，同时让所有溶解的种类(蛋白质和缓冲组分)穿过膜并进入渗透物。用于结合、洗涤、洗脱、汽提和平衡步骤的缓冲液以多级构型逆流流动至树脂浆液。进行连续逆流切向色谱法的方法在例如Dutta et al.,Biotechnol.Prog.32(2):430-439,2016；Shinkazh etal.,美国专利7,988,859,2011；Napadensky et al.,Separation Science Technology 48(9):1289-1297,2013；和Dutta et al.,J.Biotechnol.213:54-64,2015中描述。
多柱逆流溶剂梯度纯化是一种多柱色谱过程，其能够使用线性梯度进行三组分级分的高分辨率分离。用于进行多柱逆流溶剂梯度纯化的方法在Aumann and Morbidelli,Biotechnol.Bioeng.98(5):1043-1055,2007；Müller-Spath et al.,Biotechnol.Bioeng.100(6):1166-1177,2008；和Aumann and Morbidelli,Biotechnol.Bioeng.99(3):728-733,2008中描述。
流通色谱法的一个例子是膨胀床色谱法。膨胀床色谱法(EBC)利用流化色谱吸附剂床，其允许直接从未加工的(例如，含颗粒的)原料纯化所需蛋白质(Chase,TrendsBiotechnol.12(8):296-303,1994；Fluidized Bed Absorption as a PrimaryRecovery Step in Protein Purification,在New Enzymes for Organic Synthesis中,Springer,pp.185-230,1997；Anspach et al.,J.Chromatogr.A 865(1):129-144,1999；和Gagnon,J.Chromatogr.A 1221:57-70,2012)。与传统色谱柱相比，膨胀床色谱设置的主要区别在于顶部流动适配器被适当地定位，使得允许床在液体流动方向上向上膨胀。进行膨胀床色谱法的方法在例如Kinna et al.,Biotechnol.Bioeng.113(1):130-140,2016；Farid,J.Chromatogr.B 848(1):8-18,2007；Chhatre et al.,Bioprocess BiosystemsEng.30(1):1-11,2007；Lin et al.,J.Chromatogr.A 1304:78-84,2013；Zhao et al.,Chinese J.Chem.Eng.17(4):678-687,2009；Smith et al.,J.Chromatogr.A 968(1):121-128,2002；Feuser et al.,Process Biochem.34(2):159-165,1999；Ozyurt et al.,J.Chromatogr.A 944(1):203-210,2002；Anspach et al.,J.Chromatogr.A 865(1):129-144,1999；Owen and Chase,J.Chromatogr.A 757(1):41-49,1997；和Owen and Chase,Chem.Eng.Sci.54(17):3765-3781,1999中描述。
示例性的优点
本文所述的过程可导致治疗性蛋白质药物中存在的重组治疗性蛋白质的体积生产率显著增加。例如，本文描述的过程可以导致存在于治疗性蛋白质药物中的重组治疗性蛋白质的体积生产率至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍和10倍的增加。可以使用本领域已知的多种方法评估重组治疗性蛋白质的生物活性，并且其将取决于特定重组治疗性蛋白质的活性。例如，可以通过测量重组治疗性抗体与其特定表位结合的亲和力(例如，使用Biocore或竞争性酶联免疫吸附测定)来确定作为免疫球蛋白的重组治疗性蛋白质(例如，抗体或抗体片段)的生物活性。重组治疗性蛋白质可以是酶(例如，重组半乳糖苷酶，例如重组α-半乳糖苷酶)，并且可以通过测量重组治疗性酶的活性来确定生物活性(例如，通过测量可检测底物浓度的降低或可检测产物浓度的增加(例如，使用分光光度法或光发射)确定重组治疗性酶的催化速率常数)。例如，可以通过测量神经酰胺三己糖苷(globotriasylceramide，GL-3)或半乳糖二糖基神经酰胺(galabiosylceramide)水平的降低，或神经酰胺二己糖苷或半乳糖水平的增加来检测重组治疗性半乳糖苷酶的生物活性。
本文所述的过程可导致重组治疗性蛋白质的回收百分比增加(例如，液体培养基中存在的重组治疗性蛋白质在治疗性蛋白质药物中的产率百分比增加)。例如，本发明的过程可导致重组治疗性蛋白质的产率百分比大于约70％、大于约80％、大于约82％、大于约84％、大于约86％、大于约88％、大于约90％，大于约92％、大于约94％、大于约96％、或大于约98％。本发明的过程可以产生约80％至约90％、约82％至约90％、约84％至约90％、约84％至约88％、约84％至约94％、约82％至约92％，或约85％至约95％的产率百分比。
存在于治疗性蛋白质药物中的重组治疗性蛋白质的浓度可以大于约1.0mg/mL、大于约1.5mg/mL、大于约2.0mg/mL、大于约2.5mg/mL、大于约3.0mg/mL、大于约3.5mg/mL、大于约4.0mg/mL、大于约4.5mg/mL、大于约5.0mg/mL、大于约5.5mg/mL、大于约6.0mg/mL、大于约6.5mg/mL、大于约7.0mg/mL、大于约7.5mg/mL、大于约8.0mg/mL、大于约8.5mg/mL、大于约9.0mg/mL、大于约10.0mg/mL、大于约12.5mg/mL或大于约15.0mg/mL。
本文所述的方法可导致治疗性蛋白质药物中重组治疗性蛋白质的净产率在至少约5天、至少约10天、至少约15天、至少约20天、至少约25天、至少约30天、至少约35天、至少约40天、至少约45天、至少约50天、至少约55天、至少约60天、至少约65天、至少约70天、至少约75天、至少约80天、至少约85天、至少约90天、至少约95天、至少约100天、至少约110天、至少约120天、至少约130天、至少约140天、至少约150天、至少约160天、至少约170天、至少约180天、至少约190天、至少约200天、至少约210天、至少约220天、至少约230天、至少约240天、至少约250天、至少约260天、至少约270天、至少约280天、至少约290天、至少约300天、至少约310天、至少约320天、至少约330天、至少约340天、至少约350天或至少约365天的连续时间内为至少约5g/天、至少约6g/天、至少约7g/天、至少约8g/天、至少约9g/天、至少约10g/天、至少约11g/天、至少约12g/天、至少约13g/天、至少约14g/天、至少约15g/天、至少约16g/天、至少约17g/天、至少约18g/天、至少约19g/天、至少约20g/天、至少约25g/天、至少约30g/天、至少约35g/天或至少约40g/天。
本文提供的过程可以显著提高比生产率。例如，重组蛋白质药物中达到的比生产率比使用不同过程(例如，批量纯化过程或没有整合和/或连续的过程)达到的比生产率高至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍，30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍，150倍、160倍、170倍、180倍、190倍或200倍。通过本发明的过程达到的重组蛋白质药物的生产率可以是至少10,000单位/L、至少15,000单位/L、至少约20,000单位/L、至少约25,000单位/L、至少约30,000单位/L、至少约35,000单位/L或至少约40,000单位/L(在第一和/或第二液体培养基中)。通过本发明的方法达到的重组蛋白质药物的生产率可以是至少1g/L、至少1.5g/L、至少2.0g/L、至少2.5g/L、至少3.0g/L、至少4.0g/L、至少4.5g/L或至少5.0g/L。
本文所述的过程还提供了从液体培养基中时间有效地产生治疗性药物。例如，将含有治疗性蛋白质的流体(例如，液体培养基)进料到第一MCCS中并从第二MCCS的出口洗脱治疗性蛋白质药物(含有治疗性蛋白质)之间经过的时间是，例如，约4小时至约48小时，包括端值，例如，约4小时至约40小时、约4小时至约35小时、约4小时至约30小时、约4小时至约28小时、约4小时和约26小时、约4小时至约24小时、约4小时至约22小时、约4小时至约20小时、约4小时至约18小时、约4小时至约16小时、约4小时至约14小时、约4小时至约12小时、约6小时至约12小时、约8小时至约12小时、约6小时至约20小时、约6小时至18小时、约6小时至约14小时、约8小时至约16小时、约8小时至约14小时，约8小时至约12小时，约10小时至20小时，约10小时至18小时、约10小时至16小时、约10小时至14小时、约12小时至约14小时、约10小时至约40小时、约10小时至约35小时、约10小时至约30小时、约10小时至约25小时、约15小时至约40小时、约15小时至约35小时、约15小时至约30小时、约20小时至约40小时、约20小时至约35小时或约20小时至约30小时，包括端值。在其他实例中，将含有治疗性蛋白质的流体(例如，液体培养基)进料到第一MCCS中并从第二MCCS的出口洗脱治疗性蛋白质药物(含有治疗性蛋白质)之间经过的时间是，例如，大于约4小时且小于约40小时，包括端值，例如，大于4小时且小于约39小时，约38小时、约37小时、约36小时、约35小时、约34小时、约33小时、约32小时、约31小时、约30小时、约29小时、约28小时、约27小时、约26小时、约25小时、约24小时、约23小时、约22小时、约21小时、约20小时、约19小时、约18小时、约17小时、约16小时、约15小时、约14小时、约13小时、约12小时、约11小时、约10小时、约9小时、约8小时、约7小时、约6小时、约5小时或约4.5小时(包括端值)。
在以下实施例中进一步描述本发明，这些实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。
实施例
实施例1：使用回路系统进行超滤/渗滤的性能
建立超滤/渗滤回路系统以连续浓缩和缓冲交换包含重组双特异性抗体的流体。首先在蛋白A柱上纯化重组双特异性抗体，然后将浓度为24g/L的洗脱液用于超滤/渗滤回路系统。该回路系统包括具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单元，以及在第一和第二入口之间流体连通的导管，包括用于使流体流入或流出系统或流入和流出系统的端口。含有重组双特异性抗体的流体连续地流过回路系统，并且丢弃不包含重组双特异性抗体的滤液(参见图5中的“渗透物”)，持续第一段时间。在第一段时间内，在导管内保持恒定体积的流体。
在该步骤之后，将渗滤介质通过至少一个端口连续地流入回路系统，并且丢弃不包含重组双特异性抗体的滤液，持续第二段时间(图6)。在第一段时间内，在导管内保持恒定体积的流体。该过程中该回路系统的质量流在图5和图6中描绘。
然后从回路系统收集在第二段时间结束时在回路系统中的包含重组双特异性蛋白质的流体。该过程产生96％的重组双特异性抗体回收。来自使用包括切向流过滤单元的示例性回路系统的实验数据显示在图7-9中。
实施例2:用回路系统进行病毒过滤的性能
然后构建包括切向流病毒过滤单元的回路系统，以提供从包含重组双特异性抗体的流体中连续除去病毒，所述包含重组双特异性抗体的流体是从包括实施例1中所述的包括切向流过滤单元的回路系统回收的。切向流病毒过滤单元中的过滤器的孔径约为20nm，从而提供细小病毒除去。
使浓缩和缓冲液交换的从实施例1中描述的回路系统中移出的包含重组双特异性抗体的流体进料到如图10所示的包括切向流病毒过滤单元的第二回路系统中。(包括切向流病毒过滤单元的回路系统的另一个实例示于图11。)流体连续流过第二回路系统，并从切向流病毒过滤单元回收包含重组双特异性抗体的流体(参见图10中的“无病毒”VF产物)。存在于流入回路系统的流体中的任何病毒颗粒保留在回路系统内，并且从切向流病毒过滤单元收集包含重组双特异性抗体的流体。该回路系统运行约24小时，并且在这段时间内没有观察到通量衰减或压强增加(参见图12)。
实施例3.使用包括TFVF单元的回路系统进行病毒清除的性能
在使用鼠细小病毒(MMV)的若干个实验中测试了包括TFVF单元的回路系统的病毒清除能力。除非下文另有说明，否则使用包含5mg/mL的重组人抗体的测试流体进行过滤，所述重组人抗体掺入0.5％病毒材料以产生约6log的最终MMV滴度。经测试的TFVF单元包括3cm2PlanovaTMBioEX过滤器或10cm2PlanovaTM20N或PlanovaTMBioEX过滤器。
设计实验以测试当测试流体流过TFVF单元后测试系统中的TFVF单元保留的MMV病毒的量。对于该实验，将渗余物收集在单独的压力容器中而不是流回主进料容器中，从而允许测定渗余物中的病毒滴度。具有包括10cm2PlanovaTM20N过滤器的TFVF单元的系统在12psi下操作，流速在1～2mL/min变化。如图13中所示，通过线性拟合滤液重量，流速对45.6LMH的过滤器通量率没有影响，这意味着可以独立地调节流速以最大化膜寿命。在实验结束时，发现滤液占测试流体体积的28％，而测试流体体积的72％收集在渗余物收集容器中。滤液的病毒滴度低于检测限度，而渗余物滴度高于起始测试流体的滴度。病毒的质量平衡表明，当系统运行时，大部分病毒不被TFVF单元中的过滤器捕获，而是流过以在渗余物中浓缩。
测试包括含有10cm2PlanovaTM20N过滤器的TFVF单元的回路系统的病毒清除率持续22小时的时间段，同时在6.6psi下操作，再循环速率为2mL/min(图14)。在系统中添加初始负载579mL的测试流体并接着运行(5.95log滴度)，在系统停止收集样品之前产生510mL滤液。在没有任何通量衰减的情况下实现510L/m2的负载，通过过滤器的通量保持恒定的23.0LMH。虽然在运行期间的任何点都没有发现过滤器通量衰减，但是发现渗余物容器中剩余的69mL在实验完成时明显浑浊。滤液的病毒滴度低于检测限度(<0.83log)，而渗余物滴度为6.48log，比测试流体中的滴度高0.53log。该结果表示在装载/渗余物容器中3.4倍浓度的病毒。总病毒负载量的约一半不被过滤器捕获，而是继续再循环，这减少了过滤器的捕获负担并防止通量衰减。
包括含有3cm2或10cm2PlanovaTMBioEX过滤器的TFVF单元的回路系统的病毒清除，在20psi下运行29小时，循环速率分别为1mL/min或3mL/min，周期性地重新进料新鲜流体(分别见图15和16)。使用具有3cm2过滤器的TFVF单元进行的实验被设计为复制以下场景：将高滴度的大剂量病毒引入系统(例如，通过外部污染)并随后用无病毒材料稀释。向该系统中添加～400mL有6.13log病毒的测试流体的初始推注物(bolus)，并过滤20小时。来自过滤的前20小时的滤液中的病毒滴度低于检测限度(<1.09log)。过滤约20小时后，添加～400mL无病毒抗体溶液的新推注物。将该材料再过滤9小时，滤液中的病毒滴度低于检测限度。图15显示了使用包括含有3cm2PlanovaTMBioEX过滤器的TFVF的回路系统的压强和质量概况。在最初的20小时内，通量保持恒定的42.8LMH，但在重新进料后降至新的恒定的36.4LMH的比率。过滤器的总生产量(throughput)为1190L/m2。
使用包括含有10cm2PlanovaTMBioEX过滤器的TFVF单元的回路系统进行的实验被设计为复制以下场景：将低滴度病毒流连续引入系统(例如，从污染的缓冲液)。将最初的病毒掺入材料(MMV滴度为6.13log)1:30稀释为新鲜的重组抗体溶液中以产生稀释的原料。稀释原料的病毒滴度为4.66log。将该稀释原料过滤通过系统持续29小时，定期添加新鲜的稀释原料以保持工作体积在最小阈值以上。测定前20小时和接下来的9小时的滤液的病毒滴度，并且两个样品的滤液的病毒滴度低于检测限度(<0.83log)。图16显示了实验的压强和质量概况。在最初的20小时内，通量保持恒定的39.4LMH，但在进料后降低到新的34.5LMH的比率。过滤器的总生产量为1120L/m2。
这些结果表明，通过进行使用连续再循环的病毒过滤通过减少被捕获的病毒的堵塞来延长膜的使用寿命。调节渗透速率(经由系统压力)和再循环速率(经由泵速度)的能力独立地允许过程优化以将单个过滤器的操作延长至多天。
其他实施方案
应该理解，虽然已经结合本发明的详细描述描述了本发明，但是前面的描述意图说明而不是限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优点和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (72)

1.一种处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，所述方法包括：
(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流过滤(TFF)单元，和(ii)所述第一和第二入口之间流体连通的导管，所述回路系统包括用于使流体流入或流出所述系统或流入和流出所述系统的至少一个端口，
其中配置所述系统使得流体可流过所述导管和所述TFF单元，并且可以从所述TFF单元收集不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；
(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第一段时间；
(c)通过所述至少一个端口中的一个，使渗滤介质连续地流入所述回路系统，并且丢弃不包含所述重组治疗性蛋白FF质的滤液，持续第二段时间；和
(d)在所述第一和第二段时间之后，通过所述至少一个端口中的一个，收集存在于所述回路系统中的包含所述重组治疗性蛋白质的流体。
2.权利要求1的方法，其中步骤(b)包括使所述流体以约0.1mL/分钟至约100L/分钟的速率连续地流入所述回路系统。
3.权利要求2的方法，其中步骤(b)包括使所述流体以约0.5mL/分钟至约200mL/分钟的速率连续地流入所述回路系统。
4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述第一段时间为约0.1分钟至约12小时。
5.权利要求4的方法，其中所述第一段时间为约10分钟至约4小时。
6.权利要求1-5中任一项的方法，其中步骤(b)中所述流体流入所述回路系统单向地发生。
7.权利要求1-6中任一项的方法，其中步骤(c)包括使所述渗滤介质以约0.1mL/分钟至约100L/分钟的速率连续地流入所述回路系统。
8.权利要求7的方法，其中步骤(c)包括使所述渗滤介质以约0.5mL/分钟至约200mL/分钟的速率连续地流入所述回路系统。
9.权利要求1-8中任一项的方法，其中所述第二段时间为约5分钟至约12小时。
10.权利要求9的方法，其中所述第二段时间为约10分钟至约4小时。
11.权利要求1-10中任一项的方法，其中步骤(c)中所述渗滤介质流入所述回路系统单向地发生。
12.权利要求1-11中任一项的方法，其中所述导管具有约5mm至约5cm的内径。
13.权利要求12的方法，其中所述导管具有约10mm至约3cm的内径。
14.权利要求1-13中任一项的方法，其中所述TFF单元包含一个或多个具有约0.1cm2至约50cm2的表面积的切向过滤器。
15.权利要求14的方法，其中所述TFF单元包含一个或多个具有约0.5cm2至约20cm2的表面积的切向过滤器。
16.权利要求1-15中任一项的方法，其中回路系统进一步包含设置在所述导管中的泵。
17.权利要求16的方法，其中所述泵是蠕动泵。
18.权利要求1-17中任一项的方法，其进一步包括：
(e)提供第二回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流病毒过滤(TFVF)单元，和(ii)所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，所述第二回路系统包括用于使流体流入或流出所述第二系统或流入和流出所述第二系统的至少一个端口，
其中配置所述第二系统使得流体可流过所述导管和所述TFVF单元，并且可以从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；和
(f)使用在所述系统的端口和所述第二系统的端口之间流体连通的连接导管使步骤(d)的收集的流体流入所述第二系统，并且从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续第三段时间。
19.权利要求18的方法，其中步骤(f)包括使所述流体以约0.1mL/分钟至约100L/分钟的速率流入所述第二系统。
20.权利要求19的方法，其中步骤(f)包括使所述流体以约0.5mL/分钟至约200mL/分钟的速率流入所述第二系统。
21.权利要求18-20中任一项的方法，其中所述第三段时间为约0.1分钟至约12小时。
22.权利要求21的方法，其中所述第三段时间为约10分钟至约2小时。
23.权利要求18-22中任一项的方法，其中步骤(f)中所述流体流入所述第二系统单向地发生。
24.权利要求18-23中任一项的方法，其中所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管具有约5mm至约5cm的内径。
25.权利要求24的方法，其中所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管具有约10mm至约3cm的内径。
26.权利要求18-25中任一项的方法，其中所述TFVF单元包含一个或多个具有约0.1cm2至约100m2的表面积的切向病毒过滤器。
27.权利要求26的方法，其中所述TFVF单元包含一个或多个具有约0.5cm2至约200cm2的表面积的切向病毒过滤器。
28.权利要求18-27中任一项的方法，其中所述连接导管具有约5mm至约10cm的内径。
29.权利要求28的方法，其中所述连接导管具有约10mm至约5cm的内径。
30.权利要求18-29中任一项的方法，其中第二系统进一步包括设置在所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管中的泵。
31.权利要求30的方法，其中设置在所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管中的泵是蠕动泵。
32.一种处理包含重组治疗性蛋白质的流体的方法，所述方法包括：
(a)提供一种回路系统，其包括(i)具有第一和第二入口的切向流病毒过滤(TFVF)单元，和(ii)所述TFVF单元的第一和第二入口之间流体连通的导管，所述回路系统包括用于使流体流入或流出所述系统或者流入和流出所述系统的至少一个端口，
其中配置所述系统使得流体可流过所述导管和所述TFVF单元，并且可以从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液；
(b)通过所述至少一个端口中的一个，使包含重组治疗性蛋白质的流体连续地流入所述回路系统，并且从所述TFVF单元收集包含所述重组治疗性蛋白质的滤液，持续一段时间。
33.权利要求32的方法，其中步骤(b)包括使所述流体以约0.1mL/分钟至约100L/分钟的速率连续地流入所述系统。
34.权利要求33的方法，其中步骤(b)包括使所述流体以约0.5mL/分钟至约200mL/分钟的速率连续地流入所述系统。
35.权利要求32-34中任一项的方法，其中所述一段时间为约5分钟至约12小时。
36.权利要求35的方法，其中所述一段时间为约10分钟至约3小时。
37.权利要求32-36中任一项的方法，其中步骤(b)中所述流体流入所述系统单向地发生。
38.权利要求32-37中任一项的方法，其中所述导管具有约5mm至约5cm的内径。
39.权利要求38的方法，其中所述导管具有约10mm至约3cm的内径。
40.权利要求32-39中任一项的方法，其中所述TFVF单元包含一个或多个具有约0.1cm2至约100m2的表面积的切向病毒过滤器。
41.权利要求40的方法，其中所述TFVF单元包含一个或多个具有约0.5cm2至约200cm2的表面积的切向病毒过滤器。
42.权利要求32-41中任一项的方法，其中系统进一步包含设置在所述导管中的泵。
43.权利要求42的方法，其中所述设置在所述导管中的泵是蠕动泵。
44.一种用于制备治疗性蛋白质药物的整合且连续的方法，所述方法包括：
(a)提供基本上没有细胞的包含重组治疗性蛋白质的液体培养基，其中使所述液体培养基进料至第一多柱色谱系统(MCCS1)中；
(b)使用所述MCCS1捕获所述液体培养基中的所述重组治疗性蛋白质，其中使含有所述重组治疗性蛋白质的MCCS1的洗脱液连续进料至第二多柱色谱系统(MCCS2)；
(c)使用所述MCCS2纯化和抛光所述重组治疗性蛋白质，其中来自所述MCCS2的洗脱液是包含所述重组治疗性蛋白质的流体；
(d)使用权利要求1-43中任一项所述的方法处理所述包含所述重组治疗性蛋白质的流体，
其中所述过程被整合并从所述液体培养基连续运行至包含所述重组治疗性蛋白质的收集的流体或滤液，其中所述收集的流体或滤液是所述治疗性蛋白质药物。
45.权利要求44的方法，其中所述MCCS1进行至少两个不同单元操作。
46.权利要求45的方法，其中所述MCCS1进行捕获所述重组治疗性蛋白质的单元操作和灭活病毒的单元操作。
47.权利要求44-46中任一项的方法，其中所述MCCS1或MCCS2的使用或所述MCCS1和MCCS2的使用涉及柱转换。
48.权利要求44-47中任一项的方法，其中所述MCCS1和/或MCCS2利用至少两个色谱柱。
49.权利要求44-47中任一项的方法，其中所述MCCS1和/或MCCS2利用至少两个色谱膜。
50.权利要求44-47中任一项的方法，其中所述MCCS1和/或MCCS2利用至少一个色谱柱和至少一个色谱膜。
51.权利要求44-50中任一项的方法，其中所述MCCS1是第一周期性逆流色谱系统(PCCS1)。
52.权利要求51的方法，其中所述PCCS1包含四柱PCCS。
53.权利要求52的方法，其中所述四柱PCCS中的四个柱中的三个进行从所述液体培养基中捕获所述重组治疗性蛋白质的单元操作。
54.权利要求53的方法，其中所述捕获使用亲和色谱、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱或分子筛色谱进行。
55.权利要求54的方法，其中所述亲和色谱用选自下组的捕获机制进行：蛋白A结合捕获机制、底物结合捕获机制、抗体或抗体片段结合捕获机制、适体结合捕获机制和辅因子结合捕获机制。
56.权利要求55的方法，其中所述亲和色谱用蛋白A结合捕获机制进行，并且所述重组治疗性蛋白质是抗体或抗体片段。
57.权利要求53-56中任一项的方法，其中使来自所述四柱PCCS中的四个柱中的三个的含有所述重组治疗性蛋白质的洗脱液进料至所述四柱PCCS的第四柱。
58.权利要求57的方法，其中所述四柱PCCS的第四柱通过使所述含有重组治疗性蛋白质的洗脱液保持在低pH用于病毒灭活来进行灭活病毒的单元操作。
59.权利要求58的方法，其中所述四柱PCCS的第四柱使含有所述重组蛋白质的洗脱液保持在低pH用于病毒灭活持续约10分钟至约1.5小时的一段时间。
60.权利要求58的方法，其中所述MCCS2是第二周期性逆流色谱系统(PCCS2)。
61.权利要求60的方法，其进一步包括在使来自所述四柱PCCS的第四柱的洗脱液进料至所述PCCS2之前，使用管线内缓冲液调节储存器调节来自所述四柱PCCS的第4柱的洗脱液的pH。
62.权利要求61的方法，其中所述PCCS2包含三个色谱柱和一个色谱膜。
63.权利要求62的方法，其中所述PCCS2的三个色谱柱通过阳离子或阴离子交换色谱进行纯化来自所述PCCS1的洗脱液的重组治疗性蛋白质的单元操作。
64.权利要求63的方法，其中使来自所述PCCS2的三个色谱柱的洗脱液进料至所述PCCS2的色谱膜。
65.权利要求64的方法，其中所述PCCS2的色谱膜通过阳离子或阴离子交换色谱进行抛光存在于来自所述PCCS2中的三个色谱柱的洗脱液中的所述重组治疗性蛋白质的单元操作。
66.权利要求65的方法，其中所述PCCS2中的色谱膜通过阳离子交换色谱进行抛光的单元操作。
67.权利要求66的方法，其中所述色谱膜的流出物和洗涤物包含所述重组治疗性蛋白质。
68.权利要求57的方法，其进一步包括使来自所述PCCS2中的三个柱的洗脱液进料至所述PCCS2中的色谱膜之前，使用管线内缓冲液调节而调节来自所述PCCS2中的三个柱的洗脱液的离子浓度。
69.权利要求60的方法，其进一步包括使用所述PCCS1和所述PCCS2之间的断流水箱。
70.权利要求60的方法，其进一步包括在使来自所述PCCS1的洗脱液进料至所述PCCS2之前，过滤来自所述PCCS1的洗脱液。
71.权利要求44-70中任一项的方法，其进一步包括将所述治疗性蛋白质药物配制成药物组合物。
72.权利要求44-55和57-71中任一项的方法，其中所述重组治疗性蛋白质是抗体或抗体片段、酶、经工程改造的蛋白质或免疫原性蛋白质或蛋白质片段。
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