WO2009083621A1 - Procedimiento de producción y purificacion del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura - Google Patents

Procedimiento de producción y purificacion del factor derivado del epitelio pigmentado de la retina en un sistema de levadura Download PDF

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pedf
factor
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yeast
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Francisco SÁNCHEZ SÁNCHEZ
José Daniel AROCA AGUILAR
Isabel FARIÑAS GÓMEZ
Carmen RAMÍREZ CASTILLEJO
Julio ESCRIBANO MARTÍNEZ
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Universidad De Castilla-La Mancha
Universitat De Valencia, Estudi General
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the present invention is within the field of Molecular Biology and Biotechnology.
  • the invention relates to a method for producing and purifying the entire PEDF molecule (Factor Derived from the Pigmented Epithelium), and mutated and / or truncated versions of said molecule in the eukaryotic expression system of Pichia pastoris.
  • the present invention also has as its object the protection of the PEDF molecules themselves directly obtained by this process and their use in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • PEDF factor was initially purified from conditioned media of epithelial cells of the retina (Tombran-Tink, J. et al. 1991).
  • PEDF is a protein that was initially characterized as an inducer and regulator of cell differentiation, and it has been proposed that PEDF could regulate neuronal differentiation in the embryonic retina (Jablonski, M. et al., 1995). It has also been shown that PEDF exerts neurotrophic activity on all types of cells of neuronal origin, and also increases the survival of granular cells of the cerebellum in culture. It has also been described that this protein is one of the most potent anti-angiogenic factors (DoII, J.A. et al.,
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) to analyze its possible therapeutic effect in pathologies such as age-related macular degeneration, diabetic retinopathy, cancer, neurodegenerative diseases, etc.
  • the method also incorporates a final step of enzymatic digestion in order to eliminate the Glutathione S-transferase (GST) molecule, fused with the c-terminal end of PEDF to facilitate the purification of the PEDF factor. This last step further complicates the procedure for obtaining PEDF. Even so, the protein obtained in a prokaryotic organism is not sure that it is matured properly, and this can significantly affect the structure and activity of the protein obtained.
  • GST Glutathione S-transferase
  • the commercial PEDF protein is currently produced mainly in hamster kidney cell cultures. Due to the high cost, this production system, and the low levels of protein obtained, the present invention provides a new practical, fast, efficient and much cheaper alternative to produce the PEDF factor. Therefore, the present invention proposes a method or method of obtaining the PEDF factor in an expression system different from those described in the state of the art, based on the use of Pichia pastoris yeast.
  • the present invention provides a new method for producing the PEDF factor, a functional equivalent of the PEDF factor that contains single or multiple substitution (s), insertion (s) and / or deletion (s) in the sequence of Ia wild-type protein and / or chemically modified amino acid substitutions that do not affect the biological function, (as well as hyper- and hypophosphorylated versions corresponding to the sequences SEQ.ID.N.3, SEQ.ID.N.4, SEQ .ID.N.5 AND SEQ.ID.N.6 respectively), and / or
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) Truncated versions of PEDF in the eukaryotic expression system, preferably in yeasts and more specifically in Pichia pastor ⁇ s.
  • a very important aspect of the present invention is that the protein produced in the Pichia pastor ⁇ s system is totally soluble, is secreted to the culture medium, and can be obtained with a high degree of purity in a single chromatographic step, without the need to incorporate No stage of enzymatic digestion in the purification process.
  • this invention relates to a process for obtaining isolated or purified PEDF factor and / or a functional equivalent of the PEDF factor containing at least one substitution and / or an addition and / or an insertion and / or a deletion in the sequence of the wild-type protein and / or contains at least one substitution of chemically modified amino acids and / or truncated versions of PEDF in a yeast expression system
  • a. Obtain the PEDF cDNA by RT-PCR starting from total RNA obtained at least from retinal pigmented epithelium cells; b. Obtain mutant and / or truncated versions by PCR, using the complete form of PEDF as template DNA; C. Clone the constructions of stage a) and stage b), in a yeast expression vector; d. Transform and select the clones of the yeast with the different cloned constructs generated in stage c);
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) and. Inoculate, with the clones obtained in stage d), the yeast growth medium; F. Induce the complete and / or truncated PEDF factor in the yeast in yeast culture medium with methanol as inducer; g. Remove the cells from the culture by centrifugation; h. Change the culture medium in which the complete and / or truncated PEDF factor is present, to an appropriate binding buffer for affinity chromatography; i. Purify the complete and / or truncated PEDF factor, by affinity chromatography; j. Change the buffer of the complete and / or truncated purified PEDF factor to a buffer that allows its subsequent use in activity studies.
  • the present invention also relates to the process for obtaining isolated or purified PEDF factor and / or a functional equivalent of the PEDF factor that contains at least one substitution and / or an addition and / or an insertion and / or a deletion in the sequence of the Ia wild-type protein and / or contain at least one substitution of chemically modified amino acids and / or truncated versions of PEDF according to claim 1 in a yeast expression system, preferably in Pichia pastoris comprising the following steps: a. Obtain the PEDF cDNA by RT-PCR starting from total RNA obtained at least from retinal pigmented epithelium cells; b. Obtain mutant and / or truncated versions by PCR, using the complete form of PEDF as template DNA; C.
  • stage a) and stage b) into an expression vector of Pichia pastoris
  • stage d Transform and select the clones of the Pichia pastoris yeast with the different cloned constructs generated in stage c); and. Inoculate, with the clones obtained, the growth medium of Pichia pastoris
  • F Induce the complete or truncated PEDF factor in the yeast in the culture medium of Pichia pastoris with methanol as inducer;
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) g. Remove the cells from the culture by centrifugation; h. Change the culture medium in which the complete and / or truncated PEDF factor is present, to an appropriate binding buffer for affinity chromatography; i. Purify the complete and / or truncated PEDF factor, affinity chromatography; j. Change the buffer of the complete and / or truncated purified PEDF factor to a buffer that allows its subsequent use in activity studies.
  • the expression vector is pPICZ ⁇ A.
  • the culture medium is the BMGY medium.
  • the buffer that allows the subsequent use in activity study is PBS buffer.
  • the primers used are selected from the SEQ sequences. ID. N.7 and / or SEQ. ID. N.8 and / or any equivalent primer whose nucleotide sequence overlaps with the sequences SEQ.ID.N.7 and / or SEQ.ID.N.8.
  • the primers used are selected from the group formed by the SEQ sequences. ID. N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11, SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N. 15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21, I KNOW THAT. ID.
  • step b) the restriction sites used are EcoRI and Xbal.
  • GS-115 and X-33 strains have been used.
  • stage b) the induction of PEDF in Pichia pastoris is carried out at a temperature range between 25-30 s C.
  • step e SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) According to another important aspect in the present invention in step e) 2% of PMSF has been used.
  • the present invention refers to the product obtained directly from the process described in the present invention, in particular the isolated or purified PEDF factor comprising an amino acid sequence Ia which has at least 80% identity with the sequence SEQ.ID.N.1. over its entire length, to the isolated or purified PEDF factor comprising an amino acid sequence Ia which has at least 80% identity with the sequence SEQ.ID.N.2. over its entire length, to the isolated or purified PEDF factor comprising an amino acid sequence Ia which has at least 80% identity with the SEQ sequence. ID. N.3. over its entire length, to the isolated or purified PEDF factor comprising an amino acid sequence which has at least 80% identity with the sequence SEQ.ID.N.4.
  • the isolated or purified PEDF factor comprising an amino acid sequence Ia which has at least 80% identity with the sequence SEQ.ID.N.5. over its entire length, to the isolated or purified PEDF factor comprising an amino acid sequence Ia which has at least 80% identity with the sequence SEQ.ID.N.6. over its entire length ,.
  • the isolated or purified PEDF factor consisting of an amino acid sequence chosen from the group formed by the sequences SEQ.ID.N.1 to SEQ. ID. N.6, for its complementary sequences and / or for its equivalent functional sequences.
  • the third aspect of the present invention refers to the use of the PEDF factor in the preparation of a medicament, and to the use of the PEDF factor of sequences SEQ.ID.N.2, SEQ.ID.N.5 AND SEQ.ID.N .6 in the preparation of a composition that has PEDF antagonistic effect of SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.3 and SEQ.ID.N.4 and the use of a composition that inhibits cell differentiation, to the use of the PEDF factor in the preparation of a chemical composition that inhibits the effect of the sequences SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.2 and SEQ.ID.N.3., to the use of the PEDF factor in The preparation of a composition that inhibits the cell differentiation and the use of the PEDF factor in the preparation of a chemical composition that stimulates the cell differentiation containing the sequences SEQ.ID.N.1, SEQ.ID.N.3 and SEQ. ID.N.4.
  • the complete PEDF molecule (SEQ.ID.N.1) obtained according to the procedure described above increases the neuronal differentiation in stem cells.
  • a truncated PEDF molecule (SEQ.ID.N.2) is obtained, which, obtained according to the procedure described above, is capable of inhibiting the effects
  • Example 1 cloning of the PEDF factor and in a truncated form of the PEDF factor.
  • the PEDF cDNA (coding region) (obtained by RT-PCR) has been cloned into the pPICZ ⁇ A expression vector using the EcoRI and Xbal restriction sites. The absence of mutations has been confirmed by automatic DNA sequencing.
  • the generated constructs were used to transform different strains of P. pastoris, using the ⁇ asy select Pichia expression kit "(Invitrogen).
  • Example 2 Expression of the PEDF factor in Pichia pastoris.
  • Figure 2 shows the expression in Pichia pastoris of the clones selected for the expression of the complete and truncated PEDF form, and detection by western blot.
  • Example 3 purification of the proteins produced.
  • the recombinant proteins obtained by the above procedure have been purified by affinity chromatography.
  • Figure 3 shows the electrophoretic analysis of the different fractions obtained in the chromatography of the entire PEDF molecule.
  • the recombinant protein, both the complete and the truncated form, once purified, were quantified by the Bradford method, obtaining a concentration of approximately 30 ⁇ g of PEDF / ml of culture medium, and 20 ⁇ gr of C-terminal / ml of medium. of cultivation By electrophoresis it was estimated that the purity of the preparation obtained was close to 100%.
  • Figure 3 shows exactly the analysis by polyacrylamide gel electrophoresis (10%) in the presence of SDS, of the fractions obtained in the purification of recombinant complete PEDF by affinity chromatography.
  • the gel was stained with Comassie Blue. 1: fraction not retained; 2 and 3: washing fractions of the column; 4 and 5: elution fractions. Observe the absence of bands other than PEDF, which indicates the high purity of the PEDF protein obtained in fraction 5.
  • the purified proteins according to the described method are totally soluble. Therefore, the use of urea, or other solubilizing agents, that could interfere in the activity of the protein, or prevent its direct use in assays, and which would require the addition of additional steps for the elimination of these agents, is avoided.
  • the elution buffer was changed to PBS, using the ultrafiltration / dialysis system, in which the purified protein is completely soluble. Once in this buffer, the tests were carried out to analyze the activity of the protein obtained.
  • Example 4 Tests aimed at analyzing the activity of the entire PEDF molecule, produced according to the procedure described above, as a neuron differentiation enhancing molecule! of the stem cells, and the activity of the truncated (C-terminal) molecule of PEDF, as a molecule that inhibits neuron differentiation!
  • the differentiation protocol of these cells was carried out based on the differentiation protocols previously described for this cell type that consist of a period of time in culture with DMEM-F12 medium enriched with N2 supplement, to which 10 ng / ml is added of bFGF during the first two days of the culture, and 2% of FBS during the five following days of the culture. After the first two days, the medium in which the cells are grown was changed in all cases to DMEM-F12 containing N2 supplement and with 2% FBS for the next five days.
  • Figure 4 shows the count of neuronal cells or number of differentiated neurons, in which A is defined by the control assay, B is defined by an assay with PEDF and C is defined by the assay with the truncated C-terminal version , in which it is appreciated how test B increases the percentage of differentiated neurons and how the effect of the test on the truncated C-terminal version (C) is added decreases the number of differentiated neurons and therefore presents an antagonistic or inhibitory effect of the effects produced by PEDF.
  • D represents the neuronal differentiation in the control sample and in E it is clearly observed how the neuronal differentiation increases, when PEDF is added.
  • SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) culture and 20 ⁇ gr of C-terminal protein, constituting a practical solution to the current problem related to obtaining a small amount of soluble protein in a eukaryotic production system.

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Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir y purificar las moléculas de PEDF y versiones mutadas y/o truncadas de dicha molécula en un sistema de expresión de levadura. También tiene como objeto la protección de las propias moléculas de PEDF directamente obtenidas y el uso de las mismas en la preparación de composiciones farmacéuticas. El procedimiento comprende las etapas de obtener el cADN de PEDF al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina, obtener versiones mutantes y/o truncadas, clonar las construcciones en un vector de expresión de levadura, transformar y seleccionar los clones de la levadura, inocular, con los clones obtenidos, el medio de crecimiento de Ia levadura, inducir el factor PEDF completo o truncado en la levadura, eliminar las células del cultivo mediante centrifugación, cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, purificar y aislar.

Description

PROCEDIMIENTO DE PRODUCCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL FACTOR DERIVADO DEL EPITELIO PIGMENTADO DE LA RETINA EN UN SISTEMA DE LEVADURA
CAMPO DE LA INVENCIÓN: La presente invención está dentro del campo de Ia Biología Molecular y Ia Biotecnología. En particular, Ia invención se refiere a un procedimiento para producir y purificar Ia molécula completa de PEDF (Factor Derivado del Epitelio Pigmentado), y versiones mutadas y/o truncadas de dicha molécula en el sistema de expresión eucariota de Pichia pastoris. La presente invención también tiene como objeto Ia protección de las propias moléculas de PEDF directamente obtenidas mediante este procedimiento y el uso de las mismas en Ia preparación de composiciones farmacéuticas.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN:
El factor PEDF fue inicialmente purificado a partir de medios condicionados de células epiteliales de Ia retina (Tombran-Tink, J. et al. 1991). PEDF es una proteína que inicialmente fue caracterizada como un inductor y regulador de Ia diferenciación celular, y se ha propuesto que PEDF podría regular Ia diferenciación neuronal en Ia retina embrionaria (Jablonski, M. et al., 1995). También se ha comprobado que PEDF ejerce actividad neurotrófica sobre todo tipo de células de origen neuronal, y además, aumenta Ia supervivencia de células granulosas del cerebelo en cultivo. También se ha descrito que esta proteína es uno de los factores anti-angiogénicos más potentes (DoII, J.A. et al.,
2003) conocidos. Se han descrito en Ia molécula PEDF dos regiones:
1) Una región amino-terminal, actividad neurotrófica.
2) Una región carboxilo-terminal, con actividad anti-angiogénica.
El aislamiento de PEDF a partir de muestras (humor vitreo, por ejemplo, donde es abundante) es muy complicado debido a Ia dificultad de disponer de cantidad suficiente de tejido. Además, como se explicará a continuación, los procedimientos actuales de producción de esta proteína presentan importantes inconvenientes. Por ello, nuestro grupo de investigación consideró interesante expresar y purificar tanto Ia proteína completa como Ia región carboxilo de Ia misma, en Ia levadura Pichia pastoris, con el fin
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) de analizar su posible efecto terapéutico en patologías tales como degeneración macular asociada a Ia edad, retinopatía diabética, cáncer, enfermedades neurodegenerativas, etc.
La expresión y purificación del factor PEDF ha sido descrita con anterioridad en dos sistemas de producción diferentes:
1) por una parte, se ha descrito su producción en Ia bacteria Escheríchia coli (Becerra SP e\ al. 1993, JBC);
• USSN 07/952,796. A DNA Clones for the Expression of Pigment Epithelium Derived Growth Factor and Related Proteins.
• USSN 08/257,963. A Pigment Epithelium Derived Factor: Characterizations of Its Biológica! Activity and Sequences Encoding and Expressing the Protein.
• USSN 08/279, 979. A Retinal Pigmented Epithelium Derived Neurotrophic Factor.
• USSN 08/367,841. A Pigment Epithelium Derived Factor: Characterízation, Genomic Organization and Sequence of the PEDF Gene.
• USSN 08/377,710. A DNA Clones for the Expression of Pigment Epithelium Derived Factor and Related Proteins.
• USSN 08/520,373. A Retinal Pigmented Epithelium Derived Neurotrophic Factor.
Sin embargo, Ia expresión de PEDF en E.coli publicada por este grupo de investigación presenta graves problemas, tales como Ia no secreción de Ia proteína PEDF producida, y su no solubilidad (presencia en cuerpos de inclusión), Io que conlleva Ia incorporación de una serie de pasos en el procedimiento de purificación (por ejemplo, Ia desnaturalización de Ia proteína para su purificación, y su consiguiente paso de renaturalización) que hacen a éste mucho más tedioso, además de obtener Ia proteína en un estado conformacional que puede diferir de su estado normal. Por otra parte, el hecho de producir esta proteína en un organismo procariota, hace que modificaciones post-traduccionales descritas en esta proteína, y que son esenciales para su adecuada actividad (glicosilación, fosforilación), no sean realizadas o Io sean de manera incorrecta, obteniéndose por tanto una variante no "fisiológica" de Ia proteína. Recientemente ha sido publicado por otro grupo de investigación un procedimiento de producción de PEDF en E. coli (Zhang T et al. 2005, Biotechnology Letters) que solventa los problemas de falta de solubilidad y de secreción que presentaba el procedimiento descrito por Becerra et al. 1993. Este nuevo
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) método incorpora además un paso final de digestión enzimática con el fin de eliminar Ia molécula de Glutation S-transferasa (GST), fusionada con el extremo c-terminal de PEDF para facilitar Ia purificación del factor PEDF. Este último paso complica aún más el procedimiento de obtención de PEDF. Aún así, Ia proteína obtenida en un organismo procariota no es seguro que sea madurada de forma adecuada, y esto puede afectar de forma importante a Ia estructura y a Ia actividad de Ia proteína obtenida.
Por otra parte, en 1996 se describió Ia producción del factor PEDF en células eucariotas, concretamente, en cultivos de células de riñon de hámster (Stratikos E et al. 1996, Protein Science). La producción de PEDF en este tipo de células eucariotas, solventaba el importante problema de las modificaciones post-traduccionales, aunque incorporaba dos importantes inconvenientes al proceso de producción:
a) El cultivo de líneas celulares es mucho más caro (medios de cultivo y suplementos necesarios, como suero fetal) que el sistema de producción en organismos unicelulares como E.coli.
b) El nivel de producción de PEDF en cultivos celulares es más bajo, encareciendo con ello todo el sistema de producción.
La proteína comercial PEDF es producida en Ia actualidad principalmente en cultivos de células de riñon de hámster. Debido al elevado coste, este sistema de producción, y a los bajos niveles de proteína obtenida, Ia presente invención proporciona una nueva alternativa práctica, rápida, eficaz y mucho más económica para producir el factor PEDF. Por tanto, Ia presente invención propone un método o procedimiento de obtención del factor PEDF en un sistema de expresión diferente a los descritos en el estado de Ia técnica, fundamentado en Ia utilización de Ia levadura Pichia pastoris.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN:
La presente invención proporciona un nuevo procedimiento para producir el factor PEDF, un equivalente funcional del factor PEDF que contenga sustitución(es), adición(es), inserción(es) y/o deleción(es) únicas o múltiples en Ia secuencia de Ia proteína tipo salvaje y/o sustituciones de aminoácidos modificados químicamente que no afecten Ia función biológica, (así como versiones hiper- e hipo-fosforiladas que corresponden a las secuencias SEQ.ID.N.3, SEQ.ID.N.4, SEQ.ID.N.5 Y SEQ.ID.N.6 respectivamente), y/o
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) versiones truncadas de PEDF en el sistema de expresión eucariota, preferentemente en levaduras y más concretamente en Pichia pastorís.
De acuerdo con Ia problemática planteada en líneas anteriores, estudios recientes (Maik- Rachline G. and Seger R., Blood., Dec. 2005) han descrito Ia modificación post- traduccional de PEDF (fosforilación), y cómo esta fosforilación afecta a las diferentes actividades de esta proteína. Como ya se indicado anteriormente, el empleo de células eucariotas para Ia expresar el factor PEDF favorece Ia obtención de las diferentes formas fosforiladas (por Io tanto funcionales) del mismo.
Un aspecto muy importante de Ia presente invención es que Ia proteína producida en el sistema de Pichia pastorís es totalmente soluble, es secretada al medio de cultivo, y puede ser obtenida con un alto grado de pureza en un único paso cromatográfico, sin necesidad de incorporar ninguna etapa de digestión enzimática en el proceso de purificación.
La ventaja fundamental que presenta el procedimiento descrito en Ia presente invención respecto al resto de procedimientos ya descritos es conseguir un sistema de producción sencillo y de bajo coste, que puede ser utilizado a nivel industrial para Ia producción de PEDF.
Por Io tanto, según un primer aspecto importante, esta invención se refiere a un procedimiento para obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un equivalente funcional del factor PEDF que contenga al menos una sustitución y/o una adición y/o una inserción y/o una deleción en Ia secuencia de Ia proteína tipo salvaje y/o contenga al menos una sustitución de aminoácidos modificados químicamente y/o versiones truncadas de PEDF en un sistema de expresión de una levadura que comprende las siguientes etapas: a. Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina; b. Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como ADN molde Ia forma completa de PEDF; c. Clonar las construcciones de Ia etapa a) y de Ia etapa b), en un vector de expresión de levaduras; d. Transformar y seleccionar los clones de Ia levadura con las diferentes construcciones clonadas generadas en Ia etapa c);
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) e. Inocular, con los clones obtenidos en Ia etapa d), el medio de crecimiento de levadura; f. Inducir el factor PEDF completo y/o truncado en Ia levadura en medio de cultivo de levaduras con metanol como inductor; g. Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación; h. Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para Ia cromatografía de afinidad; i. Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, mediante cromatografía de afinidad; j. Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
La presente invención también se refiere al procedimiento para obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un equivalente funcional del factor PEDF que contenga al menos una sustitución y/o una adición y/o una inserción y/o una deleción en Ia secuencia de Ia proteína tipo salvaje y/o contenga al menos una sustitución de aminoácidos modificados químicamente y/o versiones truncadas de PEDF según reivindicación 1 en un sistema de expresión de una levadura, preferentemente en Pichia pastoris que comprende las siguientes etapas: a. Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina; b. Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como ADN molde Ia forma completa de PEDF; c. Clonar las construcciones de Ia etapa a) y de Ia etapa b), en un vector de expresión de Pichia pastoris; d. Transformar y seleccionar los clones de Ia levadura Pichia pastoris con las diferentes construcciones clonadas generadas en Ia etapa c); e. Inocular, con los clones obtenidos, el medio de crecimiento de Pichia pastoris; f. Inducir el factor PEDF completo o truncado en Ia levadura en medio de cultivo de Pichia pastoris con metanol como inductor;
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) g. Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación; h. Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para Ia cromatografía de afinidad; i. Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, cromatografía de afinidad; j. Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa c) el vector de expresión es pPICZαA. Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa e) el medio de cultivo es el medio BMGY.
Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa j) el tampón que permite el posterior empleo en estudio de actividad es tampón PBS.
Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa a) los cebadores empleados se seleccionan de Ia secuencias SEQ. ID. N.7 y/o SEQ. ID. N.8 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.7 y/o SEQ.ID.N.8.
Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa b) los cebadores empleados se seleccionan del grupo formado por Ia secuencias SEQ. ID. N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11 , SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21 , SEQ. ID. N.22 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11 , SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21 , SEQ.ID.N.22.
Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa b) los sitios de restricción utilizados son EcoRI y Xbal.
Según otro aspecto importante en Ia presente invención se han empleado unas cepas GS-115 y X-33. Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa b) Ia inducción de PEDF en Pichia pastoris se realiza a un intervalo de temperatura entre 25-30sC.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Según otro aspecto importante en Ia presente invención en Ia etapa e) se ha empleado un 2% de PMSF.
Según un segundo aspecto importante Ia presente invención se refiere al producto obtenido directamente a partir del procedimiento descrito en Ia presente invención en particular al factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.1. sobre toda su longitud, al factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.2. sobre toda su longitud, al factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ. ID. N.3. sobre toda su longitud, al factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos la cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.4. sobre toda su longitud, al factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.5. sobre toda su longitud, al factor PEDF aislado o purificado que comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.6. sobre toda su longitud,. Y de forma más específica al factor PEDF aislado o purificado que consiste en una secuencia aminoacídica escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ. ID. N.6, por sus secuencias complementarias y/o por sus secuencias equivalentes funcionales.
Según tercer aspecto de Ia presente invención se refiere al uso del factor PEDF en Ia preparación de un medicamento, y al uso del factor PEDF de secuencias SEQ.ID.N.2, SEQ.ID.N.5 Y SEQ.ID.N.6 en Ia preparación de una composición que tiene efecto antagonista de PEDF de SEQ.ID.N.1 , SEQ.ID.N.3 Y SEQ.ID.N.4 y al uso de una composición que inhibe Ia diferenciación celular, al uso del factor PEDF en Ia preparación de una composición química que inhibe el efecto de las secuencias SEQ.ID.N.1 , SEQ.ID.N.2 Y SEQ.ID.N.3., al uso del factor PEDF en Ia preparación de una composición que inhibe Ia diferenciación celular y al uso del factor PEDF en Ia preparación de una composición química que estimula Ia diferenciación celular que contiene las secuencias SEQ.ID.N.1 , SEQ.ID.N.3 Y SEQ.ID.N.4.
La molécula completa de PEDF (SEQ.ID.N.1) obtenida según el procedimiento anteriormente descrito incrementa Ia diferenciación neuronal en células madre.
Se obtiene de forma adicional una molécula truncada de PEDF (SEQ.ID.N.2), que, obtenida según el procedimiento anteriormente descrito, es capaz de inhibir los efectos
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) producidos por Ia molécula completa de PEDF. Por Io tanto el presente procedimiento proporciona dos productos relacionados, Ia molécula truncada de PEDF y el PEDF completo, guardando por tanto Ia presente invención un mismo concepto inventivo.
Ejemplos de realización. Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica.
Ejemplo 1: clonación del factor PEDF y de una forma truncada del factor PEDF.
Se ha clonado el cDNA (región codificante) de PEDF (obtenido mediante RT-PCR) en el vector de expresión pPICZαA utilizando los sitios de restricción EcoRI y Xbal. La ausencia de mutaciones ha sido confirmada mediante secuenciación automática de ADN.
También se ha clonado y producido una forma truncada, correspondiente al extremo carboxilo terminal (aminoácidos 195-400). Estas moléculas han sido diseñadas de forma que incorporan en su extremo C-terminal los epítopos c-myc e His6x, para facilitar su detección y purificación.
Las construcciones generadas fueron utilizadas para transformar diferentes cepas de P. pastoris, empleando para ello el kit Εasy select Pichia expresión kit" (Invitrogen).
Ejemplo 2: Expresión del factor PEDF en Pichia pastoris.
Se analizó Ia producción en dos cepas distintas, GS-115 y X-33, después de crecer un inoculo inicial de cada clon en BMGY durante 48 horas, y de inducir posteriormente Ia expresión durante 48 h en medio BMMY, utilizando metanol como agente inductor. Concluida Ia inducción, las células fueron separadas del medio de cultivo mediante centrifugación. La confirmación de Ia expresión de estas proteínas fue analizada mediante western blot de muestras del medio de cultivo, utilizando un anticuerpo anti- myc. En total se analizaron 5 clones de Ia cepa GS-115 y 4 de Ia cepa X-33. Se observaron diferencias importantes en el nivel de producción de Ia proteína recombinante entre los diferentes clones, como se muestra en Ia figura 1. Se seleccionó para Ia producción el clon 2 de Ia cepa X-33 por ser el que ofreció un mayor nivel de producción. En Ia figura 1 se puede observar Ia detección mediante western blot de PEDF en el medio de cultivo de distintos clones recombinantes de Pichia pastoris.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) En Ia figura 2 se muestra Ia expresión en Pichia pastoris de los clones seleccionados para Ia expresión de Ia forma completa y truncada PEDF, y detección mediante western blot.
Ejemplo 3: purificación de las proteínas producidas. Las proteínas recombinantes obtenidas por el procedimiento anterior, han sido purificadas mediante cromatografía de afinidad. La figura 3 muestra el análisis electroforético de las distintas fracciones obtenidas en Ia cromatografía de Ia molécula de PEDF completa. La proteína recombinante, tanto Ia forma completa como Ia truncada, una vez purificadas, fueron cuantificadas mediante el método Bradford, obteniéndose una concentración de aproximadamente 30 μgr de PEDF/ml de medio de cultivo, y 20 μgr de C-terminal/ml de medio de cultivo. Mediante electroforesis se estimó que Ia pureza de Ia preparación obtenida era cercana al 100%. La figura 3 muestra exactamente el análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida (10%) en presencia de SDS, de las fracciones obtenidas en Ia purificación de PEDF completa recombinante mediante cromatografía de afinidad. El gel fue teñido con Comassie Blue. 1 : fracción no retenida; 2 y 3: fracciones de lavado de Ia columna; 4 y 5: fracciones de elución. Observe Ia ausencia de bandas distintas a PEDF, Io que indica Ia elevada pureza de Ia proteína PEDF obtenida en Ia fracción 5.
Las proteínas purificadas según el método descrito (tanto Ia forma completa como Ia versión truncada) son totalmente solubles. Se evita por tanto el empleo de urea, o de otros agentes solubilizantes, que podrían interferir en Ia actividad de Ia proteína, o impedir su uso directo en ensayos, y que obligaría a añadir pasos adicionales para Ia eliminación de estos agentes.
Posteriormente se procedió al cambio del tampón de elución a PBS, empleando el sistema de ultrafiltración/diálisis, en el que Ia proteína purificada es totalmente soluble. Una vez en este tampón, se realizaron los ensayos para analizar Ia actividad de Ia proteína obtenida.
Ejemplo 4: Ensayos encaminados a analizar Ia actividad de Ia molécula completa de PEDF, producida según el procedimiento anteriormente descrito, como molécula potenciadora de Ia diferenciación neurona! de las células madre, v Ia actividad de Ia molécula truncada (C-terminal) de PEDF, como molécula inhibidora de Ia diferenciación neurona!.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) Se han llevado a cabo estudios para comprobar que Ia proteína PEDF obtenida según el procedimiento anteriormente descrito presenta actividad potenciadora de Ia diferenciación neuronal, además de su papel en supervivencia como factor neurotrófico, previamente descrito en Ia literatura, así como Ia actividad de Ia molécula truncada (C-terminal) de PEDF, como molécula inhibidora de Ia diferenciación neuronal. Para ello se cultivaron células madre neurales embrionarias derivadas de Ia pared del ventrículo lateral procedentes de embriones de ratón de estadio E14.5, en presencia y ausencia del factor PEDF, o de C-terminal, obtenidos según el procedimiento descrito anteriormente. El protocolo de diferenciación de estas células se llevó a cabo basándose en los protocolos de diferenciación previamente descritos para este tipo celular que constan de un periodo de tiempo en cultivo con medio DMEM-F12 enriquecido con N2 suplemento, al que se añade 10 ng/ml de bFGF durante los dos primeros días del cultivo, y 2% de FBS durante los cinco días siguientes del cultivo. Transcurridos los dos primeros días, el medio en el que se cultivan las células se cambio en todos los casos a DMEM-F12 conteniendo N2 supplement y con 2% de FBS durante los cinco días siguientes. Los resultados obtenidos, recogidos en Ia figura 4 (recuento de células tuj-1 positivas, es decir, neuronas, presentes en el cultivo) muestran que Ia proteína PEDF obtenida con el protocolo aquí expuesto es capaz de incrementar el número de neuronas presentes en el cultivó, indicando que Ia molécula obtenida es funcional para esta actividad (***: p<0.001). Por otra parte, estos resultados muestran que Ia molécula C-terminal de PEDF es capaz de inhibir el número de neuronas presentes en el cultivo, indicando que esta molécula presenta esta actividad (*: p<0.05). En Ia figura 4 se muestra el recuento de células neuronales o número de neuronas diferenciadas, en Ia que A viene definido por el ensayo control, B está definido por en ensayo con PEDF y C está definido por el ensayo con Ia versión truncada C- terminal, en el que se precia cómo el ensayo B aumenta el porcentaje de neuronas diferenciadas y cómo el efecto del ensayo en el se adiciona versión truncada C-terminal (C) disminuye el número de neuronas diferenciadas y por tanto presenta un efecto antagónico o inhibitorio de los efectos producidos por PEDF. También en Ia figura 4, D representa Ia diferenciación neuronal en Ia muestra control y en E se observa claramente cómo aumenta Ia diferenciación neuronal, cuando se adiciona PEDF.
Mediante este sistema de producción se obtiene de forma eficiente y rápida tanto Ia forma completa de PEDF recombinante, como de su región C-terminal (aminoácidos 191-400) en Ia levadura Pichia pastoris, y gracias a Ia metodología posteriormente empleada para Ia purificación de las proteínas recombinantes obtenidas (cromatografía de afinidad) se obtienen aproximadamente 30 μgr de proteína PEDF completa por mi de medio de
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) cultivo, y 20 μgr de proteína C-terminal, constituyendo una solución práctica a Ia problemática actual relativa a Ia obtención de poca cantidad de proteína soluble en un sistema eucariota de producción.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento para obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un equivalente funcional del factor PEDF que contenga al menos una sustitución y/o una adición y/o una inserción y/o una deleción en Ia secuencia de Ia proteína tipo salvaje y/o contenga al menos una sustitución de aminoácidos modificados químicamente y/o versiones truncadas de PEDF en un sistema de expresión de una levadura que comprende las siguientes etapas: a) Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina; b) Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como
ADN molde Ia forma completa de PEDF; c) Clonar las construcciones de Ia etapa a) y de Ia etapa b), en un vector de expresión de levaduras; d) Transformar y seleccionar los clones de Ia levadura con las diferentes construcciones clonadas generadas en Ia etapa c); e) Inocular, con los clones obtenidos en Ia etapa d), el medio de crecimiento de levadura; f) Inducir el factor PEDF completo y/o truncado en Ia levadura en medio de cultivo de levaduras con metanol como inductor; g) Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación; h) Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para Ia cromatografía de afinidad; i) Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, mediante cromatografía de afinidad; j) Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
2. Procedimiento para obtener factor PEDF aislado o purificado y/o un equivalente funcional del factor PEDF que contenga al menos una sustitución y/o una adición y/o una inserción y/o una deleción en Ia secuencia de Ia proteína tipo salvaje y/o contenga al menos una sustitución de aminoácidos modificados químicamente y/o
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) versiones truncadas de PEDF según reivindicación 1 en un sistema de expresión de una levadura, preferentemente en Pichia pastoris que comprende las siguientes etapas: a) Obtener el cADN de PEDF mediante RT-PCR partiendo de ARN total obtenido al menos a partir de células del epitelio pigmentado de retina; b) Obtener mediante PCR versiones mutantes y/o truncadas, empleando como ADN molde Ia forma completa de PEDF; c) Clonar las construcciones de Ia etapa a) y de Ia etapa b), en un vector de expresión de Pichia pastoris; d) Transformar y seleccionar los clones de Ia levadura Pichia pastoris con las diferentes construcciones clonadas generadas en Ia etapa c); e) Inocular, con los clones obtenidos, el medio de crecimiento de Pichia pastoris; f) Inducir el factor PEDF completo o truncado en Ia levadura en medio de cultivo de Pichia pastoris con metanol como inductor; g) Eliminar las células del cultivo mediante centrifugación; h) Cambiar el medio de cultivo en el que están presentes el factor PEDF completo y/o truncado, a un tampón de unión apropiado para Ia cromatografía de afinidad; i) Purificar el factor PEDF completo y/o truncado, cromatografía de afinidad; j) Cambiar el tampón del factor PEDF completo y/o truncado purificado a un tampón que permita su posterior empleo en estudios de actividad.
3. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 caracterizado porque en Ia etapa c) el vector de expresión es pPICZαA.
4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 caracterizado porque en Ia etapa e) el medio de cultivo es el medio BMGY.
5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado porque en Ia etapa j) el tampón que permite el posterior empleo en estudio de actividad es tampón PBS.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque en Ia etapa a) los cebadores empleados se seleccionan de Ia secuencias SEQ.ID.N.7 y/o
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26) SEQ. ID. N.8 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.7 y/o SEQ.ID.N.8.
7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 caracterizado porque en Ia etapa b) los cebadores empleados se seleccionan del grupo formado por Ia secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11 , SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13,
SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21 , SEQ.ID.N.22 y/o cualquier cebador equivalente cuya secuencia nucleotídica solape con las secuencias SEQ.ID.N.9, SEQ.ID.N.10, SEQ.ID.N.11 , SEQ.ID.N.12, SEQ.ID.N.13, SEQ.ID.N.14, SEQ.ID.N.15, SEQ.ID.N.16, SEQ.ID.N.17, SEQ.ID.N.18, SEQ.ID.N.19, SEQ.ID.N.20, SEQ.ID.N.21 , SEQ.ID.N.22.
8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 caracterizado porque en Ia etapa b) los sitios de restricción utilizados son EcoRI y Xbal.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 caracterizado porque se han empleado unas cepas GS-115 y X-33.
10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9 caracterizado porque en Ia etapa b) Ia inducción de PEDF en Pichia pastoris se realiza a un intervalo de temperatura entre 25-30QC.
11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10 caracterizado porque en Ia etapa e) se ha empleado un 2% de PMSF.
12. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ. ID. N.1. sobre toda su longitud.
13. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.2. sobre toda su longitud.
14. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.3. sobre toda su longitud.
15. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.4. sobre toda su longitud.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
16. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.5. sobre toda su longitud.
17. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque comprende una secuencia de aminoácidos Ia cual tiene al menos un 80% de identidad con Ia secuencia SEQ.ID.N.6. sobre toda su longitud.
18. Factor PEDF aislado o purificado obtenido por el procedimiento de reivindicación 1 caracterizado porque consiste en una secuencia aminoacídica escogida del grupo formado por las secuencias SEQ.ID.N.1 a SEQ.ID.N.6, por sus secuencias complementarias y/o por sus secuencias equivalentes funcionales.
19. Uso del factor PEDF según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 18 en Ia preparación de un medicamento.
20. Uso del factor PEDF según reivindicación 13, 16 y 17 en Ia preparación de una composición química que inhibe el efecto de las secuencias SEQ. ID. N.1 , SEQ.ID.N.2 Y SEQ.ID.N.3.
21. Uso del factor PEDF según reivindicación 20 en Ia preparación de una composición que inhibe Ia diferenciación celular.
22. Uso del factor PEDF según reivindicación 12, 14 y 15 en Ia preparación de una composición química que estimula Ia diferenciación celular.
HOJA DE SUSTITUCIÓN (REGLA 26)
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WO2006054278A2 (en) * 2004-11-16 2006-05-26 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Variants of pigment epithelium derived factor and uses thereof

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