CN107413312A - 一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜及制备方法 - Google Patents

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CN107413312A CN201710585333.9A CN201710585333A CN107413312A CN 107413312 A CN107413312 A CN 107413312A CN 201710585333 A CN201710585333 A CN 201710585333A CN 107413312 A CN107413312 A CN 107413312A
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Abstract

本发明公开了一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜及制备方法，包括如下步骤：(1)将表面带有羟基的膜依次用第一种有机溶剂和去离子水洗涤，干燥；(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在第二种有机溶剂中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和催化剂，在25‑60℃下搅拌10‑120min；取出；(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在第三种有机溶剂中，依次加入带有端巯基的含氮杂环配体，NaOH水溶液，三乙胺，在惰性气氛下，25‑100℃下搅拌1‑24h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；本发明操作过程简单、耗时短、条件温和，制备的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜可以高效纯化抗体。

Description

一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜及制备方法。
背景技术
随着人口的迅速增长和经济的繁荣发展，生物医药产业在人类生产和生活中发挥的作用与日俱增，是人类赖以生存的产业。而生物分离纯化过程中，由于产物的特殊性、多样性、复杂性、易变性以及产品要求的严格性，导致其纯化成本占整个生物产品加工过程的90％。
层析分离技术以其条件温和、设备简单、操作便捷以及分离机制多样化等优点被广泛的应用于蛋白类产品的高效分离纯化过程中。应用于抗体分离的层析较多，其中以Protein A亲和层析为典型代表，但是Protein A亲和层析存在介质成本较高、载量较低、再生困难、洗脱条件苛刻和配基易于脱落等缺点，因此，寻找可以替代Protein A亲和层析的新技术，成为目前研究的热点方向。
疏水电荷诱导层析(HCIC)作为一种新型的生物分离技术，与传统的层析技术相比，具有高选择性、高载量和高效率等优势，并且可以通过改变介质的带电性来实现静电排斥协助的洗脱过程，可以避免蛋白质的聚集、沉淀和结构以及活性变化。通常HCIC层析介质是在亲水性基质表面接枝含氮杂环配基，达到疏水与静电作用兼具的效果。表面带有羟基的介质基质是最为广泛的选择之一，目前通常使用原子自由基聚合(ATRP)的方法对其接枝改性，反应过程条件苛刻，步骤繁琐、耗时长并且反应效率较低。因此，寻求更加简便快捷高效的接枝配体方法成为混合模式蛋白吸附膜制备的关键。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种条件温和，耗时短，操作简便的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜。
本发明的技术方案概述如下：
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将表面带有羟基的膜依次用第一种有机溶剂和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在第二种有机溶剂中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和催化剂，在25-60℃下搅拌10-120min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:(1-100)，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与催化剂的摩尔比为1-100:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为200-5000；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在第三种有机溶剂中，依次加入带有端巯基的含氮杂环配体，1M-10MNaOH水溶液，三乙胺，在惰性气氛下，25-100℃下搅拌1-24h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、带有端巯基的含氮杂环配体、1M-10MNaOH水溶液的质量比为(0.1-10):1:(0.1-5)，所述带有端巯基的含氮杂环配体与三乙胺的摩尔比为1:1。
表面带有羟基的膜为孔径0.1-10微米的再生纤维素膜、孔径0.1-10微米的玻璃纤维膜、孔径为0.1-10微米的羟基修饰的醋酸纤维素膜或孔径为0.1-10微米的羟基修饰的硝酸纤维素膜。
第一种有机溶剂为乙醇、甲醇或丙酮。
第二种有机溶剂为乙醚、甲醇、乙醇、丙酮或二甲基亚砜。
催化剂为三氟化硼乙醚或四氟硼酸铜。
第三种有机溶剂为甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或二甲基亚砜。
带有端巯基的含氮杂环配体为2-巯基苯并咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基吡啶或4-巯基吡啶。
上述方法制备的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜。
本发明的优点：
本发明操作过程简单、耗时短、条件温和，制备的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜可以高效纯化抗体。
附图说明
图1为再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的傅里叶变换红外光谱图。
图2为再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的水接触角结果图。
图3为再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的膜表面电势图。
图4为再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的牛血清蛋白和人免疫球蛋白静态吸附对比图。
图5为用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的人免疫球蛋白的动态吸附结果图。
具体实施方式
本发明通过两步反应分别接枝聚乙二醇二缩水甘油醚和端巯基的含氮杂环配体，制备用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜。
以下具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述。
实施例1
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径0.45微米的再生纤维素膜依次用乙醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在乙醚中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和三氟化硼乙醚，在25℃下搅拌60min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:10，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与三氟化硼乙醚的摩尔比为100:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为750；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在甲醇中，依次加入2-巯基苯并咪唑，5M NaOH水溶液，三乙胺，在氮气气氛下，80℃下搅拌12h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、2-巯基苯并咪唑、5M NaOH水溶液的质量比为0.1:1:0.1，2-巯基苯并咪唑与三乙胺的摩尔比为1:1。
图1是实施例1的为再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的傅里叶变换红外光谱图。其中a为再生纤维素膜，b为接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜(步骤(2)获得的膜)，c为实施例1制备的膜。从图1中可以看出，和再生纤维素膜相比，接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜在1090cm-1处出现-C-O-C-的伸缩振动峰，说明聚乙二醇二缩水甘油醚接枝在膜表面。而最终制得的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜在1550cm-1和700-590cm-1出现芳香基团和-S-C-的吸收峰，说明2-巯基苯并咪唑进一步接枝在膜表面。
图2是本实施例的再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的水接触角结果图。其中a为再生纤维素膜，b为接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜(步骤(2)获得的膜)，c为实施例1制备的膜。从图2中可以看出，再生纤维素膜的水接触角是28度，具有较好的亲水性。接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜的水接触角为25度，仍然具有较好的亲水性。而最终制得的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的水接触角上升到72度，亲水性有了明显的下降。
图3是本实施例的再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的膜表面电势图。其中a为再生纤维素膜，b为接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜(步骤(2)获得的膜)，c为实施例1制备的膜。从图3中可以看出，再生纤维素膜在所有pH条件下都带有负电荷，与之相比，接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜表面负电荷有一定减少，而最终制得的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的等电点pI＝4-5之间，这与2-巯基苯并咪唑的pKa值接近。
图4是本实施例的再生纤维素膜和用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的牛血清蛋白和人免疫球蛋白静态吸附对比图。其中a为再生纤维素膜，b为接枝聚乙二醇二缩水甘油醚后的膜(步骤(2)获得的膜)，c为实施例1制备的膜。从图4中可以看出，再生纤维素膜和接枝聚乙二醇而缩水甘油醚后的膜，由于有较强的亲水性，对牛血清蛋白和人免疫球蛋白的吸附量都很低。而最终制得的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜，在pH＝2.5和4的时候对牛血清蛋白有较高的吸附量，在pH＝4和7的条件下对人免疫球蛋白有较高的吸附量。因此，可以确定最终制得的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜纯化人免疫球蛋白的上样和洗脱条件分别为pH＝7和pH＝2.5。
图5是本实施例的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的人免疫球蛋白的动态吸附结果图。其中上样条件为1克/升的人免疫球蛋白，pH＝7；冲洗条件为25毫摩尔/升的磷酸盐缓冲溶液，pH＝7；洗脱条件为25毫摩尔/升的磷酸盐缓冲溶液，pH＝2.5。从图5中可以看出，在pH＝7时进行上样，在pH＝2.5时进行洗脱，图中出现了非常尖锐的洗脱峰，混合模式蛋白吸附膜具有较为优秀的抗体吸附效果。
实施例2
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径10微米的玻璃纤维膜依次用甲醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在甲醇中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和四氟硼酸铜，在60℃下搅拌10min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与四氟硼酸铜的摩尔比为1:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为200；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在甲醇中，依次加入2-巯基-1-甲基咪唑，10M NaOH水溶液，三乙胺，在氦气气氛下，100℃下搅拌1h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、2-巯基-1-甲基咪唑、10M NaOH水溶液的质量比为10:1:0.1，2-巯基-1-甲基咪唑与三乙胺的摩尔比为1:1。
实施例3
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径10微米的羟基修饰的醋酸纤维素膜依次用丙酮和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在乙醇中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和三氟化硼乙醚，在25℃下搅拌120min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:100，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与三氟化硼乙醚的摩尔比为50:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为5000；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在乙醚中，依次加入2-巯基吡啶，1M NaOH水溶液，三乙胺，在氦气气氛下，25℃下搅拌24h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、2-巯基吡啶、1M NaOH水溶液的质量比为1:1:5，2-巯基吡啶与三乙胺的摩尔比为1:1。
实验证明，用0.5g孔径0.1微米的羟基修饰的醋酸纤维素膜替代本实施例的孔径10微米的羟基修饰的醋酸纤维素膜，其它同本实施例，制备出相应的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜。
实施例4
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径0.1微米的羟基修饰的硝酸纤维素膜依次用甲醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在丙酮中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和四氟硼酸铜，在40℃下搅拌100min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:50，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与四氟硼酸铜的摩尔比为50:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为1200；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在丙酮中，依次加入4-巯基吡啶，3M NaOH水溶液，三乙胺，在氮气气氛下，40℃下搅拌12h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、4-巯基吡啶、3M NaOH水溶液的质量比为0.5:1:0.5，4-巯基吡啶与三乙胺的摩尔比为1:1。
实施例5
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径0.1微米的再生纤维素膜依次用甲醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在乙醚中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和三氟化硼乙醚，在25℃下搅拌60min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:10，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与三氟化硼乙醚的摩尔比为100:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为3750；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在乙醇中，依次加入2-巯基苯并咪唑，7M NaOH水溶液，三乙胺，在氮气气氛下，80℃下搅拌12h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、2-巯基苯并咪唑、7M NaOH水溶液的质量比为0.1:1:0.1，2-巯基苯并咪唑与三乙胺的摩尔比为1:1。
实施例6
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径10微米的再生纤维素膜依次用甲醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在二甲基亚砜中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和四氟硼酸铜，在40℃下搅拌100min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:50，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与四氟硼酸铜的摩尔比为50:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为1200；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在二甲基亚砜中，依次加入4-巯基吡啶，3M NaOH水溶液，三乙胺，在氮气气氛下，40℃下搅拌12h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、4-巯基吡啶、3M NaOH水溶液的质量比为0.5:1:0.5，4-巯基吡啶与三乙胺的摩尔比为1:1。
实施例7
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径0.1微米的玻璃纤维膜依次用甲醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在甲醇中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和四氟硼酸铜，在60℃下搅拌10min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与四氟硼酸铜的摩尔比为1:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为4200；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在甲醇中，依次加入2-巯基-1-甲基咪唑，10M NaOH水溶液，三乙胺，在氦气气氛下，100℃下搅拌1h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、2-巯基-1-甲基咪唑、10M NaOH水溶液的质量比为10:1:0.1，2-巯基-1-甲基咪唑与三乙胺的摩尔比为1:1。
实施例8
一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，包括如下步骤：
(1)将0.5g孔径10微米的羟基修饰的硝酸纤维素膜依次用甲醇和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在乙醇中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和三氟化硼乙醚，在25℃下搅拌120min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:100，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与三氟化硼乙醚的摩尔比为50:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为500；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在乙醚中，依次加入2-巯基吡啶，1M NaOH水溶液，三乙胺，在氮气气氛下，25℃下搅拌24h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、2-巯基吡啶、1M NaOH水溶液的质量比为1:1:5，2-巯基吡啶与三乙胺的摩尔比为1:1。
以下利用以下几种方法对各实施例得到的膜进行性能测试。
1.静态蛋白吸附测试
(1)配制25mmol/L的PBS溶液，用0.1mol/L的HCl调节pH值分别至2.5和7。
(2)利用调节好pH的PBS溶液配制2mg/mL的BSA(牛血清白蛋白)或IgG(人免疫球蛋白)溶液。
(3)将用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜(大小为1×1cm)放入10mL的玻璃瓶中，分别加入BSA或IgG溶液1mL，在25℃、转速100rpm的条件下振荡20h。
(4)用BCA法测试蛋白质溶液的浓度。
(5)吸附容量(Q*)的定义为：单位体积的膜表面吸附蛋白质的质量，其单位为mg/mL，公式如下：
其中C0是蛋白质溶液的初始浓度，mg/mL；Cv是蛋白质溶液的剩余浓度，mg/mL；V液是蛋白质溶液的体积，mL；V膜是混合模式蛋白吸附膜的体积，mL。
2.动态蛋白吸附测试
使用AKTA prime plus色谱系统可以测量用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的动态吸附容量。用20mL的Buffer B(pH＝7，PBS)在280nm下直至UV检测基线跑平，将用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜修剪成直径为12mm的圆片，用Buffer B润湿后，将装了2片膜(穿透曲线测定中用5张膜)的CIM膜色谱柱接入仪器，Buffer B(pH＝7，PBS)和Buffer E(pH＝2.5，PBS)分别用于上样及洗脱。将流速设定为1mL/min，临界压力设定为1MPa。用BufferB贯穿CIM膜色谱柱，直至UV检测基线跑平，然后注入5mL上样溶液(1mg IgG/mL，Buffer B)。上样结束后，用Buffer E(pH＝2.5,PBS)进行脱附。所有数据均由Unicorn 5.11software记录。
根据物料平衡计算膜对蛋白的吸附容量，公式如下：
其中C0是初始蛋白浓度蛋白质溶液的初始浓度，mg/mL；Cv是膜床体积，mL；Vdead是死体积，mL；Vbreak是蛋白穿透体积，mL。
表1
和再生纤维素膜相比，用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的亲水性显著下降，膜表面的蛋白质吸附明显增加，且在动态吸附过程中，膜对人免疫球蛋白的动态吸附量高达90mg/ml以上，具有很好的抗体吸附性能；从表面电势的结果可以看出，膜表面的等电点在4-5之间，与所接枝的配体pKa值相符。表1列出了实施例1-8的静态蛋白吸附测试、动态抗体吸附测试。结果表明，用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜具有较好的抗体吸附效果，并且表现出了良好的抗体纯化性能。

Claims (8)

1.一种用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜的制备方法，其特征是包括如下步骤：
(1)将表面带有羟基的膜依次用第一种有机溶剂和去离子水洗涤，干燥；
(2)将步骤(1)获得的膜浸泡在第二种有机溶剂中，加入聚乙二醇二缩水甘油醚和催化剂，在25-60℃下搅拌10-120min；取出；所述步骤(1)获得的膜与聚乙二醇二缩水甘油醚的质量比为1:(1-100)，所述聚乙二醇二缩水甘油醚与催化剂的摩尔比为1-100:1，所述聚乙二醇二缩水甘油醚的重均分子量为200-5000；
(3)将步骤(2)获得的膜浸泡在第三种有机溶剂中，依次加入带有端巯基的含氮杂环配体，1M-10MNaOH水溶液，三乙胺，在惰性气氛下，25-100℃下搅拌1-24h；去离子水洗涤，得到用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜；所述步骤(2)获得的膜、带有端巯基的含氮杂环配体、1M-10MNaOH水溶液的质量比为(0.1-10):1:(0.1-5)，所述带有端巯基的含氮杂环配体与三乙胺的摩尔比为1:1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述表面带有羟基的膜为孔径0.1-10微米的再生纤维素膜、孔径0.1-10微米的玻璃纤维膜、孔径为0.1-10微米的羟基修饰的醋酸纤维素膜或孔径为0.1-10微米的羟基修饰的硝酸纤维素膜。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述第一种有机溶剂为乙醇、甲醇或丙酮。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述第二种有机溶剂为乙醚、甲醇、乙醇、丙酮或二甲基亚砜。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述催化剂为三氟化硼乙醚或四氟硼酸铜。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述第三种有机溶剂为甲醇、乙醚、乙醇、丙酮或二甲基亚砜。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述带有端巯基的含氮杂环配体为2-巯基苯并咪唑、2-巯基-1-甲基咪唑、2-巯基吡啶或4-巯基吡啶。
8.权利要求1-7之一的方法制备的用于抗体纯化的混合模式蛋白吸附膜。
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