CN101940916A

CN101940916A - 魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN101940916A
Application number: CN 200910158511
Authority: CN
Inventors: 张迎庆
Original assignee: Hubei University of Technology
Current assignee: Hubei University of Technology
Priority date: 2009-07-03
Filing date: 2009-07-03
Publication date: 2011-01-12
Anticipated expiration: 2029-07-03
Also published as: CN101940916B

Abstract

本发明提供一种蛋白质分子印迹膜，能够选择性识别结合模板蛋白质分子，是以魔芋葡甘聚糖为主要基质，其制备方法是将魔芋葡甘聚糖充分溶胀后，加交联剂或与其它高分子共混，中和后加入模板蛋白质分子，充分混合后流涎成膜，干燥脱水形成模板蛋白质的分子印迹，加洗脱液充分洗脱模板蛋白质分子后制成魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜。本发明所得蛋白质分子印迹膜，可作为生物分离模拟亲和膜应用于蛋白质分离纯化，尤其是基因工程蛋白质产品的分离纯化，生物传感检测中的敏感膜部件以模拟抗体识别相应抗原等。

Description

魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白质分子印迹技术，尤其涉及魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜及其制备方法和分离检测蛋白质的应用。

背景技术

分子印迹技术是一种人工合成具有分子识别功能的介质的新技术。印迹分子与合适的功能单体及交联剂混合使之相互作用并将其聚合，再用适当的方法将印迹的分子去除，得到的聚合物即为分子印迹聚合物。印迹分子去除后留下的孔穴与印迹分子的形状、大小、电荷分布具有互补性，因而这种聚合物具有选择性识别印迹分子的功能。分子印迹以其良好的专一性和卓越的分子识别能力，成功地应用于高效液相色谱(HPLC)、毛细管电泳色谱(CEC)和薄层色谱(TLC)的固定相、固相萃取(SPE)、药物分离、膜分离等领域。分子印迹技术在各种小分子化合物的运用中取得成功后，现研究的重点和热点逐渐转移到蛋白质等生物大分子的印迹上。以蛋白质为模板的分子印迹聚合物可以作为抗体、酶或其他天然生物大分子的替代物、细胞支架材料、药物控释材料等，将分子印迹的应用领域进一步拓展到蛋白质的分离、生物传感、免疫测定、模拟酶催化、模拟抗体、蛋白质药物的控制释放，以及调节医疗器械表面的生物相容性等生物技术和医学领域。

就蛋白质分子印迹方法而言，目前的研究报道较多，主要有：蛋白质包埋法、表面印迹法和抗原表位法等。由于蛋白质分子体积大，包埋法常存在模板分子难以去除的问题；表面印迹法通过在聚合物如预制的硅石(二氧化硅)等表面上接枝或覆盖蛋白质印迹的聚合物，能部分解决上述问题；也有利用金属螯合法，用结合有金属离子的载体螯合蛋白质的印迹方法。此方法的缺陷是蛋白质表面必须有暴露的氨基酸残基，如组氨酸的咪唑基，半胱氨酸的巯基，色氨酸的吲哚基等，从而使其应用受到限制。另一种平板表面印迹法是将蛋白质吸附在亲水的、分子级平坦的云母表面，然后将一个二糖类分子薄层覆盖在吸附的蛋白质上。一经干燥，该糖层便通过大量的氢键与蛋白质络合。随后将一个平坦的含氟聚合物薄膜通过发光放电等离子体与糖分子交联而沉积。接着去除云母并溶解蛋白质，最终形成一种多糖覆盖的、具有蛋白质形状的纳米凹坑。该方法表现出较好的选择性识别效果，但方法较为复杂。抗原表位法以代表蛋白质结构中小的暴露片断的短肽作为模板进行印迹，则所合成的印迹聚合物通过识别所印迹的短肽，来识别整个蛋白质分子，短肽价廉易得，这一方法为高效合成对蛋白质具有高选择性的吸附剂和受体拓宽了思路，但只适用于暴露的片断结构非常清楚的蛋白质的模板印迹和暴露的片断结构不同的蛋白质的分离，对尚不清楚暴露结构的蛋白质显然是无能为力的。从方便蛋白质分子的洗脱和结合入手，分子印迹技术由三维走向二维，各种分子印迹膜以及纳米线应运而生，其中以印迹膜制备方便受到广泛青睐。

近年来蛋白质分子印迹聚合物材料的研究报道也在不断增加。基于蛋白质的生物活性和空间构象等特性，聚合中的单体、交联剂、引发方式以及识别体系均需要适应其生物大分子的性质。目前采用的单体主要有丙烯酸、丙烯酰胺、甲基丙烯酸、硅烷醇等，其中以丙烯酰胺为功能单体的蛋白质印迹聚合物选择性最优。近年来用生物亲和性好的生物分子作为功能单体的研究受到人们的广泛重视。有壳聚糖及经化学修饰的壳聚糖制备血红蛋白、牛血清白蛋白分子印迹聚合物；以及将环糊精分子印迹聚合物用于促进蛋白质正确折叠。

总体来讲，人们一直在致力于开发一些生物亲和性好且分子结构适宜的蛋白质印迹材料，探索简单方便的合成方法，以期获得印迹效果卓越的蛋白质分子印迹聚合物。然而由于蛋白质是一种具有复杂空间结构和生物活性的天然生物高分子，其模板印迹难度很大，构建对蛋白质具有分子识别特性的生物材料体系，无疑是一种挑战。主要有以下几个问题限制了分子印迹技术在蛋白质中的运用：一是蛋白质为生物大分子结构复杂且易失活，对聚合中的单体、交联剂、引发方式以及识别体系有特殊要求；二是蛋白质为非刚性的生物大分子，作为模板在分子印迹聚合物中很难产生确定的识别位点，需要印迹材料兼有适宜的刚性和柔性，能与蛋白质分子柔性对接；三是庞大的蛋白质模板难以进出聚合物网络；四是由于蛋白质分子上带有电荷或非极性基团，易发生较严重的非特异性吸附，影响选择性识别效果；五是由于蛋白质为水溶性的，需要实现蛋白质等分子的水相中聚合及水相中的识别，而目前大多数的分子印迹聚合物是在有机相中聚合得到的。由于上述几点，目前大多的印迹材料和方法无法很好地实现蛋白质分子印迹。目前报道的绝大多数蛋白质分子印迹聚合物仍然采用传统小分子印迹聚合物基质材料或类似材料，均存在一些能与蛋白质产生较强相互作用的基团，非特异性吸附是影响其识别性能的关键共性问题。

在传统的小分子印迹中，中性多糖因具较少的结合基团，印迹效果差，一般不被采用，而在蛋白质分子印迹中，由于蛋白质大分子印迹与小分子印迹方法和机理上存在很大差异，却因其仅与蛋白质产生较弱的氢键相互作用，具有较低的非特异性吸附成为其优点。

魔芋葡甘聚糖(Konjac Glucomannan，KGM)是天南星科中魔芋(Amorphophallus Konjac)植物块茎所富含的储备性多糖，具有优良的凝胶功能和成膜特性，易修饰，在食品、药物辅料、化妆品、化工涂料、石油等领域日益应用广泛。首先，魔芋葡甘聚糖作为一种中性多糖，其多羟基结构可以提供大量氢键结合位点，这种弱的相互作用可最大限度避免对荷电的蛋白质分子的非特异性吸附，而这正是壳聚糖这类带电荷多糖运用于蛋白质分子印迹聚合物材料中存在的最大问题。同时，其链分子具有适宜的结晶区和无定形区比例，属半柔顺性分子，可望能够对非刚性的蛋白质生物大分子柔性对接。而其他天然多糖如纤维素结构中结晶区排列致密，琼脂糖则结构过于疏松；再者，它具有天然植物多糖的优良生物亲和性，对蛋白质分子的活性影响较小；另外，优异的成膜性能是魔芋葡甘聚糖及其衍生物的特性之一，已报道有多种魔芋葡甘聚糖基质膜，被广泛应用于食品保鲜、可降解塑料、高强度可食性薄膜等领域。同时，该多糖价格相对便宜，来源丰富，提取方便，各种改性修饰方法成熟。

发明内容

为了解决上述问题，尤其是减少非特异性吸附这一蛋白质分子印迹关键共性问题，本发明的目的在于提供一种对模板蛋白质具有显著识别效果的分子印迹膜，还提供所述分子印迹膜的制备方法，以及在分离检测蛋白质领域中的应用。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种蛋白质分子印迹膜，能够选择性识别结合模板蛋白质分子，是以魔芋葡甘聚糖为主要基质，是按以下步骤制备得到的：

魔芋葡甘聚糖充分溶胀后，加交联剂或与其它高分子共混，并加入增塑剂，中和后加入模板蛋白质分子，充分混合后流涎成膜，干燥脱水形成模板蛋白质的分子印迹，加洗脱液充分洗脱模板蛋白质分子后制成魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜。

其中，所述交联剂包括环氧氯丙烷、戊二醛等；高分子溶液包括黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、明胶、大豆分离蛋白、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇等之中的一种或几种的混合物。

所述增塑剂包括甘油、山梨醇、聚乙二醇、硬脂酸等之中的一种或几种的混合物。

所述模板蛋白质分子包括：各种天然活性多肽、蛋白质及其修饰物；重组活性多肽、蛋白质及其修饰物等。

所述洗脱剂包括：2％～15％(w/v)SDS-2％～15％(v/v)HAc溶液或2％-30％(w/v)的NaCl溶液。

在充分利用魔芋葡甘聚糖自身链分子结构特性的基础上，通过交联剂选择和交联条件控制等方法构建适宜的魔芋葡甘聚糖凝胶网络，加入模板蛋白质分子，成膜，洗脱模板分子后，制备得到对模板蛋白质具有显著识别效果的分子印迹膜。

本发明还提供所述蛋白质分子印迹膜的制备方法，是通过如下方法制备：

(1)溶胀：魔芋精粉经30％～100％(v/v)乙醇充分洗涤后真空干燥，得到魔芋葡甘聚糖(KGM)；KGM加入0.15-2.0mol/L氢氧化钠溶液，搅拌，在40℃下溶胀，得到0.3～3％(w/v)的KGM的水溶胶。

(2)交联：向KGM水溶胶中加入交联剂或其它高分子溶液，并加入0.1％-5.0％(v/v)增塑剂，20℃-80℃下交联反应0.5-40h，中和至pH7-8，得到魔芋葡甘聚糖凝胶。

(3)载质：上述凝胶中加入凝胶体积1％～100％(v/v)的浓度为0.1～30mg/mL的模板蛋白溶液，该蛋白溶液由pH7.0～8.0磷酸盐缓冲液配制而成，内含1‰～5％(w/v)NaCl，室温搅拌，制备蛋白凝胶。

(4)流涎成膜：取全部或部分上述蛋白凝胶平铺于玻璃板上，自然或真空干燥脱水制备得到模板蛋白质的分子印迹膜。

(5)洗脱：加洗脱剂2％～15％(w/v)SDS-2％～15％(v/v)HAc溶液或2％-30％(w/v)的NaCl溶液于4℃下充分洗脱，然后反复冲洗，至洗脱液中无蛋白质检出，得到魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜(MIM)。

其中，所述交联剂可以为环氧氯丙烷、戊二醛等；所述高分子溶液可以为黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、明胶、大豆分离蛋白、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇等；所述增塑剂可以为甘油、山梨醇等；所述模板蛋白可以为天然活性多肽、蛋白质及其修饰物，以及重组活性多肽、蛋白质及其修饰物。例如各种多肽、蛋白质、激素、酶、抗原、抗体、细胞因子、疫苗、连接蛋白、融合蛋白、可溶性受体等。

本发明还提供所述魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜在分离检测蛋白质技术中的应用。例如，将洗脱后的蛋白质分子印迹膜取出，用去离子水洗去表面残留洗脱液和模板蛋白溶液，再用滤纸将表面的液体滤干，加入印迹用蛋白溶液中，封口，置4℃印迹2～32h。

本发明的魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜具有显著优点：(1)魔芋葡甘聚糖作为一种中性多糖，其多羟基结构既可以提供大量氢键结合位点，这种弱的相互作用又最大限度避免了对荷电的蛋白质分子的非特异性吸附，而这正是壳聚糖这类带电荷多糖运用于蛋白质分子印迹聚合物材料中存在的最大问题。(2)其链分子具有适宜的结晶区和无定形区比例，属半柔顺性分子，能够对非刚性的蛋白质生物大分子柔性对接，起到识别作用。而其他天然多糖如纤维素结构中结晶区排列致密，琼脂糖则结构过于疏松，均达不到好的印迹识别效果；(3)具有天然植物多糖的优良生物亲和性，对蛋白质分子的活性影响较小；(4)魔芋葡甘聚糖基质蛋白质分子印迹膜，蛋白质生物大分子的洗脱和结合均很方便。本发明所得蛋白质分子印迹膜，可作为生物分离模拟亲和膜应用于蛋白质分离纯化，尤其是基因工程蛋白质产品的分离纯化，生物传感检测中的敏感膜部件以模拟抗体识别相应抗原等。

附图说明

图1为本发明魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜的制备过程流程图；

图2为本发明魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜和空白膜洗脱前扫描电镜(SEM)图(×30倍)；

图3为本发明魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜和空白膜洗脱前扫描电镜图(×2000倍)；

图4为本发明魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜和空白膜洗脱后扫描电镜图(×30倍)；

图5为本发明魔芋葡甘聚糖分子印迹膜洗脱后扫描电镜图(×2000倍)。

具体实施方式

本发明魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜的制备流程如图1所示，具体的，包括如下步骤：

(1)溶胀：魔芋精粉经30％～100％(v/v)乙醇充分洗涤后真空干燥，得到魔芋葡甘聚糖(KGM)。KGM加入0.15-2.0mol/L氢氧化钠溶液，搅拌，在40℃下溶胀，得到0.3～3％(w/v)的KGM的水溶胶。

(2)交联：向KGM水溶胶中加入交联剂或其它高分子溶液，并加入0.1％-5.0％(v/v)的增塑剂，20℃-80℃下交联反应0.5-40h，中和至pH7-8，得到魔芋葡甘聚糖凝胶。

(4)流涎成膜：移取全部或部分上述蛋白凝胶平铺于玻璃板上，自然或真空干燥脱水制备得到模板蛋白质的分子印迹膜。

本发明魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜应用时，要将洗脱后的膜取出，用去离子水洗去表面残留洗脱液和模板蛋白溶液，再用滤纸将表面的液体滤干。然后配制一定浓度的模板蛋白质溶液，分别放入等量的印迹膜(MIM)和空白膜(NIM)，4℃吸附2～32h。所述空白膜是将与印迹膜等量的魔芋葡甘聚糖凝胶加入与印迹膜等量的缓冲液室温搅拌，制备空白凝胶，移取与印迹膜等量的空白凝胶平铺于玻璃板上，制备得到空白膜(NIM)。

利用紫外分光光度法，以印迹膜(MIM)与空白膜(NIM)对溶液中模板蛋白质的吸附量，来进行识别蛋白质分子的效果评价。所述紫外-可见分光光度计测定蛋白质含量包括如下步骤：

配制一系列不同浓度的模板蛋白标准溶液，用紫外-可见光分光光度计(UV)测定280nm处的吸光度，绘制蛋白质溶液的浓度-吸光度标准曲线。相同条件下测定待测蛋白质溶液的吸光度，与标准曲线相对照，即可得待测模板蛋白质溶液浓度。

模板蛋白分子印迹效果计算方法为：

①分别测得空白膜及蛋白膜印迹液吸光度值A₀及A；

②根据载质量计算出理论最大印迹量B；

③由标准曲线求出A₀、A对应的浓度C₀、C；

④印迹效率α＝实际印迹量/理论最大印迹量＝(C₀-C)×V/B。

以下通过实施例对本发明做详细的说明，但决不限制本发明。

实施例1

(1)魔芋葡甘聚糖牛血清白蛋白(BSA)分子印迹膜的制备

溶胀：魔芋精粉(购自武汉群益魔芋制品有限公司)经30％～100％(v/v)乙醇充分洗涤后真空干燥，得到魔芋葡甘聚糖(KGM)。KGM加入量为0.675g，加入100mL 0.25mol/L NaOH溶液，40℃下搅拌溶胀40min，得到KGM的水溶胶；

交联：向KGM水溶胶中加入2mL的环氧氯丙烷，并加入0.5mL甘油作为增塑剂和保湿剂，在40℃下搅拌，交联3h后调pH7-8；

载质：取50mL凝胶加入10mL 5mg/mL BSA溶液(pH7.0磷酸盐缓冲液，8‰NaCl)溶液室温搅拌1h制备蛋白凝胶，50mL凝胶加入10mL上述缓冲液室温搅拌1h制备空白凝胶；

流涎成膜：分别移取6mL空白与蛋白凝胶平铺与玻璃板上，制备魔芋葡甘聚糖牛血清白蛋白分子印迹膜(MIM)和空白膜(NIM)。膜制备好后，自然干燥。

洗脱：以30mL 5％(w/v)SDS-5％(v/v)HAc溶液为洗脱剂室温静置洗脱2h。将洗脱后的膜取出，用去离子水反复洗涤洗去表面残留洗脱液液和BSA溶液，然后反复冲洗，至洗脱液中无蛋白质检出。

印迹：用滤纸将表面的液体滤干，各加入30mL 0.4mg/mL BSA溶液，封口，置4℃静置印迹24h。

(2)魔芋葡甘聚糖牛血清白蛋白分子印迹膜对模板分子印迹效率评价

印迹效率结果见表1，结果表明，以牛血清白蛋白为模板蛋白的分子印迹膜对模板分子具有显著识别效果，其识别效率为α＝59.27％±3.53％(n＝6)。

表1牛血清白蛋白分子印迹膜印迹效率

(3)魔芋葡甘聚糖牛血清白蛋白分子印迹膜特异性识别评价

制备洗脱后牛血清白蛋白印迹膜和空白膜，分别加入30mL 0.4mg/mL的牛血清白蛋白溶液、木瓜蛋白酶溶液、中性蛋白酶溶液、胰蛋白溶液中，置4℃印迹24h，紫外可见光分光光度计测印迹后溶液吸光度值，然后根据各蛋白的标准曲线计算出浓度，每个不同的蛋白质做六组平行实验，计算六组的平均值即X±SD，并进行方差分析，计算P值。其中C₀表示空白膜印迹后印迹溶液浓度，C表示蛋白膜印迹后印迹溶液浓度，通过测定牛血清白蛋白分子印迹膜和空白膜对各种蛋白有吸附效果，从而进行牛血清白蛋白分子印迹膜的特异性识别效果研究，结果见表2。

表2牛血清白蛋白分子印迹膜的特异性识别效果

由上述结果可以看出，印迹后，除了牛血清白蛋白空白膜组印迹后印迹溶液平均浓度大于印迹膜组印迹后印迹溶液平均浓度，其余四种蛋白均为空白膜组印迹后印迹溶液平均浓度小于印迹膜组印迹后印迹溶液平均浓度。

对以30mL 0.4mg/mL牛血清白蛋白溶液为印迹液的组别进行方差分析，结果显示，空白膜组与印迹膜组有非常显著的差异(P＝3.98×10^-11＜0.01，n＝6)，按计算牛血清白蛋白印迹效果，为α＝61.73％±3.22％。表明与空白膜相比，印迹膜对模板蛋白BSA具有显著的选择性吸附效果。

木瓜蛋白酶溶液、中性蛋白酶及胰蛋白酶组均为空白膜组印迹后印迹溶液平均浓度小于印迹膜组印迹后印迹溶液平均浓度，表明牛血清白蛋白分子印迹膜对此木瓜蛋白酶溶液、中性蛋白酶及胰蛋白酶组均无选择性印迹效果，即对这三种蛋白无识别效果。

总之，结果显示，载有牛血清白蛋白的膜经洗脱后，将牛血清白蛋白洗脱下去而使膜上留下与牛血清白蛋白结构相似的孔穴，当以牛血清白蛋白为印迹溶液时，牛血清白蛋白结构与孔穴形状相同，可进入孔穴内，到达显著的印迹效果，而其他的蛋白质由于和牛血清白蛋白结构不同，不能进入孔穴形成印迹，因此没有印迹效果。

(4)牛血清蛋白分子印迹膜的扫描电镜(SEM)分析

制备的牛血清白蛋白印迹膜洗脱前和洗脱后自然晾干，分别用扫描电镜进行分析，如图2和图3所示。

图2和图3为魔芋葡甘聚糖分子印迹膜洗脱前扫描电镜图，二图的倍数分别为30倍和2000倍，从图2上可以看出有许多颗粒状的小点，并且印迹膜的颗粒明显比空白膜的大，放大这些物质至2000倍即得图3，该图可以看出，印迹膜为多孔膜状结构，孔径大小约为2～5μm。

图4和图5为魔芋葡甘聚糖分子印迹膜洗脱后扫描电镜图，可以看出其上的颗粒状的晶体物质明显比洗脱前，即图3少很多，将这些物质放大2000倍可以看到图5的空间结构，对于洗脱后的空白膜，由于膜本身经过洗脱后晾干，膜的刚性变强，但很脆，当放大至2000倍时，膜的结构破裂，不能扫描出空白膜洗脱后放大至2000倍的图，而洗脱后印迹膜与图3比较，表面孔状结构明显增加，且孔径大小增大至5～10μm，经分析为载质上去的蛋白质经洗脱剂洗脱后脱落，使孔径增大。

实施例2：

(1)魔芋葡甘聚糖木瓜蛋白酶分子印迹膜的制备

溶胀：魔芋精粉(购自武汉群益魔芋制品有限公司)经30％～100％(v/v)乙醇充分洗涤后真空干燥，得到魔芋葡甘聚糖(KGM)。魔芋葡甘聚糖(KGM)加入量为1.0g，加入100mL 0.25mol/L NaOH溶液，40℃下搅拌溶胀60min，得到KGM的水溶胶；

交联：向KGM水溶胶中加入6.0mL的戊二醛，并加入0.5mL甘油，在40℃下搅拌，交联4h后调pH7-8。

载质：移取30mL凝胶加入6mL pH8.0的磷酸缓冲溶液，搅拌1h，得到空白膜凝胶；剩下的凝胶中加入40mg/mL的木瓜蛋白酶溶液14mL，搅拌1h，得到含模板蛋白质的印迹聚合物。

流涎成膜：分别移取8mL空白与蛋白凝胶平铺于玻璃板上，制备魔芋葡甘聚糖木瓜蛋白酶分子印迹膜(MIM)和空白膜(NIM)。膜制备好后，自然晾干。

洗脱：以20％(w/v)NaCl溶液为洗脱剂于4℃恒温摇床中震荡洗脱24h。将洗脱后的膜取出，用去离子水反复冲洗，洗去表面残留洗脱液液和木瓜蛋白酶溶液，至洗脱液中无蛋白质检出。

印迹：用滤纸将表面的液体滤干，取4.0mg/mL的木瓜蛋白酶溶液各10mL，分别放入等量的印迹膜(MIM)和空白膜(NIM)，封口，置4℃静置印迹24h。

(2)魔芋葡甘聚糖木瓜蛋白酶分子印迹膜对模板分子印迹效率评价

印迹后，过滤取澄清液，利用紫外分光光度法，在280nm下，测定两溶液中的吸光度值，通过木瓜蛋白酶标准曲线，确定吸附后溶液中木瓜蛋白酶的浓度，计算得到印迹膜(MIM)与空白膜(NIM)对溶液中木瓜蛋白酶的吸附量，计算印迹效率。结果见表3。

表3木瓜蛋白酶分子印迹膜印迹效率

结果表明，以木瓜蛋白酶分子印迹膜对模板分子具有显著识别效果，其识别效率为α＝54.14％±4.99％(n＝6)。

实施例3

(1)魔芋葡甘聚糖胰蛋白酶分子印迹膜的制备

溶胀：魔芋精粉(购自武汉群益魔芋制品有限公司)经30％～100％(v/v)乙醇充分洗涤后真空干燥，得到魔芋葡甘聚糖(KGM)。魔芋葡甘聚糖(KGM)1.0g，加入100mL 0.25mol/L NaOH溶液，40℃下搅拌溶胀60min，得到KGM的水溶胶；取黄原胶(XG)1.0g，加入100mL去离子水，40℃下搅拌溶胀60min，得到XG的水溶胶；

混合：取30mL的KGM凝胶与15mL的XG凝胶混合，并加入0.5mL的山梨醇，在40℃下搅拌，交联4h后调pH7-8。再加入5mL磷酸缓冲溶液(pH7.0)，混合均匀得空白凝胶。

取30mL的KGM凝胶与15mL的XG凝胶混合，并加入0.5mL的山梨醇，在40℃下搅拌，交联4h后调pH7-8。再加入20mg/mL的胰蛋白酶溶液5mL，混合均匀得蛋白凝胶。

流涎成膜：分别移取6mL空白与蛋白凝胶平铺于玻璃板上，制备魔芋葡甘聚糖牛血清白蛋白分子印迹膜(MIM)和空白膜(NIM)。膜制备好后，自然干燥。

洗脱：以25％(w/v)NaCl溶液为洗脱剂于4℃恒温静态洗脱24h，然后反复冲洗，至洗脱液中无蛋白质检出，得到模板蛋白的分子印迹膜。

印迹：用滤纸将表面的液体滤干，取4.0mg/mL的胰蛋白酶溶液各10mL，分别放入等量的印迹膜(MIM)和空白膜(NIM)，封口，置4℃静置印迹24h。

(2)魔芋葡甘聚糖胰蛋白酶分子印迹膜对模板分子印迹效率评价

印迹后，过滤取澄清液，利用紫外分光光度法，在280nm下，测定两溶液中的吸光度值，通过胰酶标准曲线，确定吸附后溶液中胰蛋白酶的浓度，计算得到印迹膜(MIM)与空白膜(NIM)对溶液中胰蛋白酶的吸附量，计算印迹效率。结果见表4。

表4胰蛋白酶分子印迹膜印迹效率

结果表明，以胰蛋白酶分子印迹膜对模板分子具有显著识别效果，其识别效率为α＝42.30％±3.90％(n＝6)。

Claims

1.一种蛋白质分子印迹膜，能够选择性识别结合模板蛋白质分子，其特征在于：以魔芋葡甘聚糖为主要基质，是按以下步骤制备得到的：

魔芋葡甘聚糖充分溶胀后，加交联剂或与其它高分子共混，并加入增塑剂，中和后加入模板蛋白质分子，充分混合后流涎成膜，干燥脱水形成模板蛋白质的分子印迹，加洗脱剂充分洗脱模板蛋白质分子后制成魔芋葡甘聚糖蛋白质分子印迹膜。

2.根据权利要求1所述的蛋白质分子印迹膜，其特征在于所述交联剂包括环氧氯丙烷、戊二醛等；高分子溶液包括黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、明胶、大豆分离蛋白、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇等之中的一种或几种的混合物。

3.根据权利要求1所述的蛋白质分子印迹膜，其特征在于所述增塑剂包括甘油、山梨醇、聚乙二醇、硬脂酸等之中的一种或几种的混合物。

4.根据权利要求1所述的蛋白质分子印迹膜，其特征在于所述洗脱剂包括：2％～15％(w/v)SDS-2％～15％(v/v)HAc溶液或2％-30％(w/v)的NaCl溶液。

5.根据权利要求1所述的蛋白质分子印迹膜，其特征在于所述模板蛋白质分子包括：各种天然活性多肽、蛋白质及其修饰物；重组活性多肽、蛋白质及其修饰物等。

6.一种制备权利要求1所述的蛋白质分子印迹膜的方法，其特征在于按以下步骤制备：

A、溶胀：魔芋精粉经30％～100％(v/v)乙醇充分洗涤后真空干燥，得到魔芋葡甘聚糖(KGM)；KGM加入0.15-2.0mol/L氢氧化钠溶液，搅拌，在40℃下溶胀，得到0.3％～3％(w/v)的KGM的水溶胶；

B、交联：向KGM水溶胶中加入交联剂或其它高分子溶液，并加入0.1％-5.0％(v/v)的增塑剂，20℃-80℃下交联反应0.5-40h，中和至pH7-8，得到魔芋葡甘聚糖凝胶；

C、载质：上述凝胶中加入凝胶体积1％～100％(v/v)的浓度为0.1～30mg/mL的模板蛋白溶液，该蛋白溶液由pH7.0～8.0磷酸盐缓冲液配制而成，内含1‰～5％(w/v)NaCl，室温搅拌，制备蛋白凝胶；

D、流涎成膜：移取全部或部分上述蛋白凝胶平铺于玻璃板上，自然或真空干燥脱水制备得到模板蛋白质的分子印迹膜；

E、洗脱：加洗脱剂2％～15％(w/v)SDS-2％～15％(v/v)HAc溶液或2％-30％(w/v)的NaCl溶液于4℃下充分洗脱，然后反复冲洗，至洗脱液中无蛋白质检出，得到模板蛋白的分子印迹膜。

7.根据权利要求6所述的蛋白质分子印迹膜的制备方法，其特征在于所述交联剂可以为环氧氯丙烷、戊二醛等；所述高分子溶液可以为黄原胶、卡拉胶、海藻酸钠、明胶、大豆分离蛋白、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯醇、聚乙二醇等；所述增塑剂可以为甘油、山梨醇等；所述模板蛋白可以为天然活性多肽、蛋白质及其修饰物，以及重组活性多肽、蛋白质及其修饰物，例如各种多肽、蛋白质、激素、酶、抗原、抗体、细胞因子、疫苗、连接蛋白、融合蛋白、可溶性受体等。

8.权利要求1所述的蛋白质分子印迹膜在分离检测蛋白质领域的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，是将洗脱后的蛋白质分子印迹膜取出，用去离子水洗去表面残留洗脱液和模板蛋白溶液，再用滤纸将表面的液体滤干，加入印迹用蛋白溶液中，封口，置4℃印迹2～32h。