WO2021172203A1 - 生体分子精製用製品 - Google Patents

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正克 西八條
拓馬 末岡
妃佐子 八浦
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株式会社カネカ
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    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D36/00—Filter circuits or combinations of filters with other separating devices
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/02—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor with moving adsorbents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/12—Apparatus for enzymology or microbiology with sterilisation, filtration or dialysis means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/26—Inoculator or sampler

Definitions

  • the present inventors have conducted intensive studies to solve the above problems.
  • the culture solution and the cells or cells are discharged by discharging the culture solution containing the target biomolecule after putting the cell culture solution or the like together with the adsorbent and / or the flocculant into the container having the discharge port provided with the filter.
  • the present invention has been completed by finding that it can be separated from crushed substances and a part of impurities contained in the culture solution can be easily and efficiently removed.
  • the present invention will be shown.
  • a resin that adsorbs impurities without adsorbing the target biomolecule can be appropriately selected, but ribosomal RNA is used for the lysine-immobilized resin and nucleic acid-binding protein is used for the heparin-immobilized resin. Can be removed. Further, an antibody-immobilized resin in which an antibody that binds to a specific impurity is immobilized can also be used.
  • the pore size of the filter was aggregated by the impurities and / or the flocculant adsorbed by the adsorbent in consideration of the diameter of the impurities adsorbed by the adsorbent and / or the impurities aggregated by the flocculant and the diameter of the target biomolecule. It is preferable to adjust so that the diameter of the impurity does not permeate and the target biomolecule can pass through. For example, it is considered that the smaller the diameter of the adsorbent, the larger the specific surface area and the higher the adsorption performance, but if the diameter is small, secondary agglutination may occur, and it is considered difficult to make the average particle size less than 5 ⁇ m.
  • the pore diameter of the filter is preferably 5 ⁇ m or less. On the other hand, by setting the pore size of the filter to 0.1 ⁇ m or more, viruses and general proteins can be sufficiently passed through.
  • the pore diameter is preferably 0.2 ⁇ m or more. If there is a catalog value, the pore diameter of the filter may be referred to the catalog value, and if there is no catalog value, the average pore diameter estimated from the Garley air permeability can be used.
  • the material of the filter may be appropriately selected according to the impurities to be captured, the target biomolecule to be passed, and the like.
  • a sulfone resin such as polyether sulfone; a polyolefin resin such as polyethylene and polypropylene; nylon and the like.
  • Polyester-based resins; celluloses such as regenerated cellulose and cellulose acetate; fluororesins such as polytetrafluoroethylene and polyvinylidene difluoride; ceramics such as alumina and titania can be mentioned.
  • a stirring means that does not use a stirring blade or a stirrer is also suitable.
  • a method of generating a stirring flow in the liquid to be treated inside the container by rotating / counter-rotating There is also a method in which arbitrary two places (for example, the lower part and the upper part) of the container are connected in advance by piping, and the liquid to be treated is taken in and out by a pump such as a tubing pump to circulate and mix.
  • the air inside the container may not be discharged and the liquid to be treated may not be introduced efficiently.
  • the exhaust port is not particularly limited as long as it can discharge air, but for example, its diameter can be 0.1 mm or more and 5 cm or less.
  • the exhaust port may be a simple hole provided in the upper part of the container, but it is preferable that a member such as a lid for suppressing the leakage of the introduced liquid to be treated is installed. Further, when a pipe is attached to the exhaust port, a valve for suppressing leakage of the liquid to be treated may be installed in the pipe.
  • Growth factors include, for example, epithelial growth factor (EGF), insulin-like growth factor (IGF), transforming growth factor (TGF), nerve growth factor (NGF), brain-derived neurotrophic factor (BDNF), and vascular endothelial cell proliferation.
  • Factor VEGF
  • G-CSF Granulocyte Colony Stimulator
  • GM-CSF Granulocyte Macrophage Colony Stimulator
  • PDGF Platelet-Derived Growth Factor
  • EPO Erythropoetin
  • TPO Thrombopoetin
  • FGF Fibroblast Proliferation Factors
  • HGF hepatocellular growth factor
  • the introduced liquid to be treated is mixed with the adsorbent and / or the flocculant.
  • the mixing means in addition to stirring the mixture of both by the above-mentioned stirring means, a relatively small container may be shaken manually, or a flexible container may be deformed.
  • the mixing conditions may be adjusted as appropriate.
  • the temperature at the time of mixing may be room temperature, and specifically, it can be 0 ° C. or higher and 40 ° C. or lower.
  • the temperature is preferably 1 ° C. or higher, more preferably 10 ° C. or higher or 15 ° C. or higher, more preferably 30 ° C. or lower, and even more preferably 25 ° C. or lower.
  • the contact time can be 1 second or more and 10 hours or less, preferably 10 minutes or more, and more preferably 30 minutes or more.
  • Example 1 Crude purification of virus (1) Preparation of adeno-associated virus (AAV) -producing cells
  • AAV vector preparation kit for creating an AAV2 plasmid expressing VENUS GenBank: ACQ43955.1
  • AAVpro (R) Helper Free System manufactured by Takara Bio Co., Ltd.
  • Cultured HEK293 cells were transfected with a plasmid prepared using a transfection reagent (“Polyethylenimine MAX” manufactured by Polysciences, MW: 40,000) to produce AAV. After completion of the culture, the cells were detached and the cell culture solution was collected.
  • AAV concentration was quantified using an AAV titration quantification kit (“AAVpro (R) Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2” manufactured by Takara Bio Co., Ltd.), and the total protein concentration was determined by bovine serum albumin ("AAVpro (R) Titration Kit (for Real Time PCR) Ver.2”).
  • BSA was used as a standard and quantified using a protein colorimetric assay reagent (“Pierce 660 nm Protein Assay Reagent” manufactured by Thermo Fisher Scientific).
  • the mixed solution was filtered through a filter made of polyether sulfone (“Nalgene Rapid-Flow Swel Disposable Filter Units” manufactured by Thermo Scientific, pore size: 0.2 ⁇ m), and the obtained filtrate was used as a primary filtrate.
  • Dulbeccoline-buffered physiological saline manufactured by Sigma-Aldrich, 59 mL, hereinafter abbreviated as "PBS" was added to the remaining filtration residue and filtered, and the obtained filtrate was used as a secondary filtrate.
  • the primary filtrate and the secondary filtrate were mixed, and this was used as the pretreatment liquid 1, and the amount of AAV and the total amount of protein were quantified under the same conditions as described above. Similarly, the amount of AAV and the total amount of protein were quantified for the nucleic acid decomposition treatment solution.
  • Table 1 The results are shown in Table 1.
  • Comparative Example 1 Crude purification of virus using a depth filter and an ultrafiltration membrane 20 mM Tris + 120 mM NaCl aqueous solution (pH 8.0) with a depth filter (“Supracap 50 capsule with V100P” manufactured by PALL, effective filtration area: 22 cm 2 , pore size: 1 to 3 ⁇ m) was rinsed. Next, the nucleic acid decomposition treatment liquid (592 g) obtained in Example 1 (2) was filtered through the depth filter, and the obtained filtrate was recovered as a primary filtrate.
  • a 20 mM Tris + 120 mM NaCl + 0.005% Tween 20 + 1 mM MgCl 2 aqueous solution (pH 8.1) was used as a dialysate in an amount of about 8 times that of the concentrated solution, and the buffer was replaced by continuous water addition. After dialysis was completed, the post-dialysis fluid in the system was collected. The system was also washed with dialysate and the wash was collected.
  • Comparative Example 2 Virus Purification by Affinity Chromatization
  • the nucleic acid decomposition treatment liquid obtained in Example 1 (2) was centrifuged, and the supernatant was filtered through a polyether sulfone filter ("Nalgene Rapid-Flow System Disposable Filter Units" Thermo Scientific Co., Ltd. Manufactured, pore size: 0.2 ⁇ m).
  • This was used as a clarification solution without pretreatment.
  • the amount of the solution having an AAV amount of 1 ⁇ 10 12 vg was separated, 9 times the amount of the equilibration buffer was mixed, and the mixture was filtered using a filter.
  • the obtained filtrate was subjected to affinity chromatography under the following conditions to purify AAV.
  • AAV in the eluate was quantified by quantitative PCR, and the recovery rate with respect to the loaded AAV amount was calculated. Further, for comparison, the amount of the liquid having an AAV amount of 1 ⁇ 1012 vg was also separated from the pretreatment liquid 1 of Example 1 and the pretreatment liquid 2 of Comparative Example 1, and the equilibrium was 9 times the amount.
  • the filtrate obtained by mixing the conversion buffer and filtering with a filter was also subjected to the same affinity chromatography, and the amount of AAV was quantified to calculate the AAV recovery rate. The results are shown in Table 3.
  • the amount of AAV, the amount of protein, and the amount of DNA were quantified in the same manner without treating the nucleic acid decomposition treatment solution treated with endonuclease 50 U / mL with basic magnesium carbonate.
  • the AAV recovery rate of each treatment liquid was calculated when the amount of AAV in the control was 100%.
  • the protein removal rate and the DNA removal rate of each treatment solution were calculated when each removal rate was set to 0%. The results are shown in Table 4, FIG. 6, and FIG.

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Abstract

本発明は、標的生体分子を細胞培養液または体液から簡便かつ効率的に精製することができる容器、および当該容器を用いる標的生体分子の精製方法を提供することを目的とする。本発明に係る細胞培養液または体液から標的生体分子を精製するための容器は、注入口、フィルター、および排出口を有し、不純物を吸着する吸着剤、および／または、不純物を凝集する凝集剤を含み、上記フィルターは、吸着剤により吸着された不純物、および／または、凝集剤により凝集した不純物を捕捉するためのものであることを特徴とする。

Description

生体分子精製用製品
　本発明は、標的生体分子を細胞培養液または体液から簡便かつ効率的に精製することができる容器、および当該容器を用いる標的生体分子の精製方法に関するものである。
　有用生体分子である抗体は、かつてマウスを抗原で免疫し、その脾細胞などの抗体産生細胞と骨髄腫細胞とを細胞融合させることで自律増殖能を持たせたハイブリドーマを作製し、目的の抗原特異性をもつ融合細胞のみをスクリーニングして培養し、その分泌物からモノクローナル抗体として作製されていた。しかし、この方法で作製された抗体には、ヒト生体内で抗原認識されてしまうという問題があった。一方、目的の抗体をコードする遺伝子を含むプラスミドによる形質転換法が実用化されて以来、抗体は主に形質転換法で作製されている。形質転換法であれば、ヒト抗体を直接作製できる他、抗体の中でも抗原認識や細胞障害活性などに必要な部位のみからなる抗体様分子の作製も可能である。
　その他、有効な薬剤の少ないウイルスは、その基礎研究やワクチンの作製のため、標的ウイルスを細胞に感染させ、増加させることが行われている。ウイルスやプラスミドは、ベクターとしても有用である。また、生体内の重要な情報伝達物質であるホルモンとしては、インスリンなどペプチドであるものがあり、形質転換法で作製される場合がある。
　細胞培養中、一般的に細胞は、フラスコ内の液体培地で振とう培養される。しかし振とう培養では、培養中の波の作用により細胞が損傷するおそれがあることから、特許文献１～３には、培養装置において装置を密閉しつつ内部を攪拌する機構が開示されている。しかし特許文献１～３には、培養後、細胞などと培養液とをいかに分離するかについては記載されていない。
　上記の通り重要な生体分子の中には形質転換法で作製されるものがあるが、形質転換法には、培養細胞や培養液から標的生体分子の精製に手間がかかるという問題がある。具体的には、形質転換細胞の培養後、細胞を破砕したり界面活性剤により溶解した後、濾過により細胞片を除去し、濾液に含まれる標的生体分子をアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等のクロマトグラフィーにより精製する。
　特許文献４には、細胞を含む液体の導入口、液体導出口、細胞を沈降させるための流路と、沈降流路の下部の細胞導出口を含む細胞分離装置が開示されている。
国際公開第２００５／１０４７０６号パンフレット 国際公開第２００６／１１６１３９号パンフレット 国際公開第２０１３／０４０１６１号パンフレット 実開平２－１３１８９８号公報
　上述したように、有用な生体分子を生産する細胞を培養する装置や、細胞と培養液を分離する装置は知られている。
　ここで、有用生体分子を含む培養液などを細胞やその破砕物などから分離してから有用生体分子を精製するためのクロマトグラフィーに至る前に、不純物の一部を除去できれば、クロマトグラフィーの負荷を低減でき、より効率的な精製が可能になる。
　そこで本発明は、標的生体分子を細胞培養液または体液から簡便かつ効率的に精製することができる容器、および当該容器を用いる標的生体分子の精製方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を重ねた。その結果、特にフィルターを備えた排出口を有する容器内に吸着剤および／または凝集剤と共に細胞培養液などを入れた後に標的生体分子を含む培養液を排出することにより、培養液と細胞や細胞破砕物などとを分離できると共に、培養液中に含まれる不純物の一部を簡便かつ効率的に除去できることを見出して、本発明を完成した。
　以下、本発明を示す。
　［１］　細胞培養液または体液から標的生体分子を精製するための容器であって、
　注入口、フィルター、および排出口を有し、
　不純物を吸着する吸着剤、および／または、不純物を凝集する凝集剤を含み、
　上記フィルターは、吸着剤により吸着された不純物、および／または、凝集剤により凝集した不純物を捕捉するためのものであることを特徴とする精製用容器。
　［２］　上記吸着剤および／または上記凝集剤が、水不溶性無機化合物、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、親水性相互作用樹脂、アフィニティー樹脂、および活性炭から選択される１種以上である上記［１］に記載の精製用容器。
　［３］　上記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される１種以上である上記［２］に記載の精製用容器。
　［４］　上記不純物が、細胞、細胞破砕物、細胞溶解物、核酸、および核酸結合性タンパク質から選択される１種以上である上記［１］～［３］のいずれかに記載の精製用容器。
　［５］　上記標的生体分子が、ウイルス、ウイルス様粒子、ワクチン、抗体、抗体様分子、抗体結合性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、および血漿タンパク質から選択される１種以上である上記［１］～［４］のいずれかに記載の精製用容器。
　［６］　上記フィルターの孔径が０．１μｍ以上、１００μｍ以下である上記［１］～［５］のいずれかに記載の精製用容器。
　［７］　更に、上記細胞培養液または体液ならびに上記吸着剤および／または上記凝集剤の攪拌手段を有する上記［１］～［６］のいずれかに記載の精製用容器。
　［８］　上記細胞培養液または体液から上記標的生体分子を精製するための方法であって、
　上記［１］～［７］のいずれかに記載の精製用容器の上記注入口から上記細胞培養液または体液を導入する工程、および、
　上記細胞培養液または体液と上記吸着剤および／または上記凝集剤を接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
　［９］　細胞培養液または体液から標的生体分子を精製するための方法であって、
　注入口、フィルター、および排出口を有し、不純物を吸着する吸着剤、および／または、不純物を凝集する凝集剤を含む精製用容器に、上記注入口から上記細胞培養液または体液を導入することにより、上記細胞培養液または体液と上記吸着剤および／または上記凝集剤を接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
　［１０］　上記排出口を閉じた状態で上記注入口から上記細胞培養液または体液を導入する上記［９］に記載の方法。
　［１１］　上記精製用容器が更に攪拌手段を有し、攪拌により上記細胞培養液または体液と上記吸着剤および／または上記凝集剤との接触を促進する上記［９］または［１０］に記載の方法。
　［１２］　更に、上記排出口を開け、上記細胞培養液または体液を上記精製用容器から排出すると共に、上記吸着剤および／または上記凝集剤を上記フィルターにより捕捉する工程を含む上記［１０］に記載の方法。
　［１３］　上記吸着剤および／または上記凝集剤が、水不溶性無機化合物、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、親水性相互作用樹脂、アフィニティー樹脂、および活性炭から選択される１種以上である上記［９］～［１２］のいずれかに記載の方法。
　［１４］　上記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される１種以上である上記［１３］に記載の方法。
　［１５］　上記不純物が、細胞、細胞破砕物、細胞溶解物、核酸、および核酸結合性タンパク質から選択される１種以上である上記［９］～［１４］のいずれかに記載の方法。
　［１６］　上記標的生体分子が、ウイルス、ウイルス様粒子、ワクチン、抗体、抗体様分子、抗体結合性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、および血漿タンパク質から選択される１種以上である上記［９］～［１５］のいずれかに記載の方法。
　［１７］　上記フィルターの孔径が０．１μｍ以上、１００μｍ以下である上記［９］～［１６］のいずれかに記載の方法。
　［１８］　細胞培養液または体液から標的生体分子を精製するための容器の使用であって、
　上記容器が、注入口、フィルター、および排出口を有し、
　上記容器が、不純物を吸着する吸着剤、および／または、不純物を凝集する凝集剤を含み、
　上記フィルターは、吸着剤により吸着された不純物、および／または、凝集剤により凝集した不純物を捕捉するためのものである使用。
　［１９］　上記吸着剤および／または上記凝集剤が、水不溶性無機化合物、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、親水性相互作用樹脂、アフィニティー樹脂、および活性炭から選択される１種以上である上記［１８］に記載の使用。
　［２０］　上記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される１種以上である上記［１９］に記載の使用。
　［２１］　上記不純物が、細胞、細胞破砕物、細胞溶解物、核酸、および核酸結合性タンパク質から選択される１種以上である上記［１８］～［２０］のいずれかに記載の使用。
　［２２］　上記標的生体分子が、ウイルス、ウイルス様粒子、ワクチン、抗体、抗体様分子、抗体結合性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、および血漿タンパク質から選択される１種以上である上記［１８］～［２１］のいずれかに記載の使用。
　［２３］　上記フィルターの孔径が０．１μｍ以上、１００μｍ以下である上記［１８］～［２２］のいずれかに記載の使用。
　［２４］　更に、上記細胞培養液または体液ならびに上記吸着剤および／または上記凝集剤の攪拌手段を有する上記［１８］～［２３］のいずれかに記載の使用。
　本発明に係る生体分子精製用容器に、例えば標的生体分子を生産した細胞またはその破砕液などを培養液ごと導入した後に、培養液を排出すれば、培養液中に含まれる不純物が選択的に吸着剤に吸着されるか或いは凝集剤により凝集するため、標的生体分子を含む培養液を細胞や不純物などから非常に簡便に分離することができる。よって本発明は、形質転換法などにより製造された標的生体分子の細胞培養液などからの精製を効率化できるものとして、産業上極めて有用である。
図１は、本発明に係る容器の一態様を示す模式図である。 図２は、本発明に係る容器の一態様を示す模式図である。 図３は、本発明に係る容器の一態様を示す模式図である。 図４は、本発明に係る容器の一態様を示す模式図である。 図５は、市販の塩基性炭酸マグネシウムの粒子径分布の測定結果を示すグラフである。 図６は、アデノ随伴ウイルス培養液を、様々な核酸分解酵素濃度と、様々な塩基性炭酸マグネシウムの添加量と時間で処理した場合の、アデノ随伴ウイルス回収率、不純物タンパク質除去率、および不純物ＤＮＡ除去率を示すグラフである。 図７は、アデノ随伴ウイルス培養液を塩基性炭酸マグネシウムで様々な時間で処理した場合の不純物タンパク質除去率を示すグラフである。
　本発明に係る精製用容器は、細胞培養液または体液から標的生体分子を精製するためのものである。以下、本発明容器に導入する細胞培養液または体液を「被処理液」という場合がある。
　本発明に係る精製用容器の材質は、導入した被処理液が漏出しないものであれば特に制限されないが、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリアミド、ポリエステル等の樹脂；ステンレス、アルミニウム等の金属；ガラス、セラミックス等の無機物；樹脂含浸ガラス繊維、樹脂含浸炭素繊維などの複合体などが挙げられる。これらの材質を単独で用いることも可能であるが、容器への標的生体分子の非特異吸着の抑制や、材質からの溶出物や漏出物の抑制を目的に、多層化されたものを利用してもよい。
　容器が可撓性のものであれば、被処理液を導入する前の容器の体積を低減でき、運搬が容易になり、また、被処理液を導入した後では、攪拌操作なしでも容器を変形させて被処理液と吸着剤および／または凝集剤との接触を促進することが可能になる。一方、金属製など非可撓性の容器は、標的生体分子の大量生産に用い得る大型容器に適している。
　容器の形状も適宜選択すればよいが、円筒形、円錐形、直方体など、底面を有し自立可能なものが好ましい。可撓性の容器であっても、底面を有する形状であれば被処理液を導入することにより自立可能である。また、特に比較的小型の可撓性容器の場合、各辺が密閉されているいわゆるバッグ形状であってもよい。なお、容器が可撓性のものである場合、例えば被処理液を導入する際などに容器の形状を維持したり、容器を屹立させておく等のため、また、内部に被処理液が充填された状態の重さや圧力を支持して容器の形状を維持するために、外殻容器や支持架台を利用してもよい。かかる支持体や外殻容器の材質としては、ステンレス等の金属や、ポリエチレンやポリプロピレン等の樹脂が挙げられる。また、これら外殻容器や支持架台は、容器内部の被処理液の温度を調整するための熱媒や冷媒を循環させるための管を備えるものであってもよい。
　本発明の容器はバイオ医薬品の主剤などの製造に利用することができるため、吸着剤および／または凝集剤を含み、容器内部が使用前に無菌状態であることが好ましい。容器内部の無菌環境を作るために、容器自体や吸着剤および／または凝集剤などを、それぞれに適した任意の方法で滅菌することが可能である。滅菌法としては、例えば、加熱、化学的処理、ガンマ線、紫外線、エチレンオキシドガスなどを用いる方法が挙げられる。また、滅菌法に適した容器の材質を選択することができる。
　容器の容積は適宜調整すればよいが、例えば１０ｍＬ以上、５０００Ｌ以下にすることができる。当該容積が１０ｍＬ以上、１０Ｌ以下であれば、実験室レベルでの標的生体分子の粗精製に適している。また、当該容積が１０Ｌ以上であれば、標的生体分子の大量生産にも適用でき、５０００Ｌ以下であれば、大量生産で被処理液の量が大量であっても、容器内で被処理液を良好に攪拌することができる。なお、バッグ形状の容器の容積は、その内部に挿入できる水の最大容積に相当する。
　本発明に係る精製用容器は、被処理液を容器内に導入するための注入口を上部に有する。注入口は、被処理液を容器内に導入できるものであれば特に制限されず、その大きさは実施規模などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、その直径を１ｍｍ以上、５ｃｍ以下とすることができる。
　注入口は、容器の上部に設けられた単なる孔であってもよいが、被処理液を注入し易くする部材が設置されていてもよいし、また、例えば被処理液を一時的に保存するタンクや培養槽などから被処理液を導入するための管が取り付けられていてもよい。かかる部材や管の素材は、容器の素材と同一であってもよいし、異なっていてもよい。また、容器内への被処理液の注入後、その漏出を阻害するために、注入口には蓋を設けたり、注入口に繋がる管にバルブを設けてもよい。
　注入口には、標的生体分子は通過できるが、細胞や細胞片など比較的大きい不純物の容器内への導入を阻害する予備フィルターを設けてもよい。かかる予備フィルターの孔径は、例えば、１００μｍ以上、５ｍｍ以下とすることができる。
　本発明に係る容器は、下部に、吸着剤および／または凝集剤で処理した後の液体を排出するための排出口を有する。排出口は、処理済み液を容器から排出できるものであれば特に制限されず、その大きさは実施規模などに応じて適宜調整すればよいが、例えば、その直径を１ｍｍ以上、５ｃｍ以下とすることができる。本開示において「処理」とは、本発明に係る容器に被処理液を導入し、吸着剤および／または凝集剤と接触させた後、排出することをいう。
　排出口は、注入口と同じく容器の下部に設けられた単なる孔であってもよいが、処理済み液を排出し易くする部材が設置されていてもよいし、また、例えば処理済み液を本発明容器から他のデバイス等へ移送するための管が取り付けられていてもよい。かかる部材や管の素材は、容器の素材と同一であってもよいし、異なっていてもよい。また、容器内への被処理液の注入後、その漏出を阻害するために、排出口には蓋を設けたり、排出口に繋がる管にバルブを設けてもよい。
　本発明に係る容器内には、不純物を吸着する吸着剤、および／または、不純物を凝集する凝集剤が含まれる。その結果、細胞培養液または体液中の不純物が吸着または凝集されて不純物の量および濃度が低減され、細胞培養液または体液中の標的生体分子が精製される。
　吸着剤は、標的生体分子を吸着しないか或いはほとんど吸着せず、且つ被処理液に含まれる不純物の少なくとも一部を吸着できるものであれば特に制限されない。例えば、被処理液の主要な溶媒である水に対して不溶性を示す無機化合物が挙げられる。水不溶性無機化合物は、抗体、抗体様分子、ウイルスを吸着しないか或いはほとんど吸着しない一方で、ＤＮＡや、ヒストン等のＤＮＡ結合性タンパク質など分子量が比較的大きいタンパク質を吸着できると考えられる。なお、本開示において水不溶性とは、無機化合物の粉末を精製水に入れ、２０±５℃で５分ごとに強く３０秒間振り混ぜるとき、３０分以内に溶ける度合をいい、具体的には無機化合物１ｇを溶かすに要する精製水の量が１００ｍＬ以上であることをいう。当該精製水量としては、１０００ｍＬ以上が好ましい。
　吸着剤として用い得る水不溶性無機化合物としては、例えば、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含む水不溶性無機化合物を挙げることができ、マグネシウム、カルシウム、およびアルミニウムから選択される１以上の元素を含む不溶性炭酸塩、不溶性硫酸塩、不溶性リン酸塩、酸化物などが好ましく、具体的には炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、リン酸マグネシウム、および酸化アルミニウムから選択される１以上が挙げられ、水不溶性マグネシウム塩がより好ましい。例えば、水酸化マグネシウムと炭酸マグネシウムの混合物である塩基性炭酸マグネシウムが好適に用いられる。但し、リン酸カルシウムなど、リン酸マグネシウムを除くリン酸塩は、水溶性が比較的高かったり、抗体、抗体様分子やウイルスを吸着してしまうおそれがあり得るため、好ましくない。
　本発明で用い得る吸着剤としては、水不溶性無機化合物の他、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、親水性相互作用樹脂、およびアフィニティー樹脂も利用することができる。特に、分離しやすい分子サイズと不純物を十分に吸着可能な表面積を有している点で、クロマトグラフィー担体用の樹脂が好適である。陰イオン交換樹脂は、中性条件で負電荷を帯びる等電点の低い宿主細胞由来タンパク質やＤＮＡを吸着するのに適している。また、陽イオン交換樹脂は、中性条件で正電荷を帯びる等電点の高い宿主細胞由来タンパク質の吸着に適している。疎水性相互作用樹脂や親水性相互作用樹脂、活性炭は、標的生体分子と不純物との疎水性度や親水性度の差を利用して不純物を吸着するのに適している。なお、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、親水性相互作用樹脂、または活性炭を使用する場合、標的生体分子も吸着体に吸着する可能性があるが、処理液のｐＨや塩濃度を調整することで、標的生体分子の吸着を回避する条件を設定することが可能である。また、アフィニティー樹脂としては、標的生体分子を吸着せずに、不純物を吸着する樹脂を適宜選択することができるが、リジン固定化樹脂ではリボソームＲＮＡを、ヘパリン固定化樹脂では核酸結合性タンパク質をそれぞれ除去することができる。また、特定の不純物に結合する抗体を固定化した抗体固定化樹脂も使用することができる。
　吸着剤の大きさは適宜調整すればよいが、例えば、平均粒子径を０．１μｍ以上、１０００μｍ以下とすることができる。当該平均粒子径が１０００μｍ以下であれば、吸着剤の比表面積は十分に大きく、不純物をより効率的に吸着することができ、また、０．１μｍ以上であれば、粉砕のために過剰なエネルギーが必要無い。本発明に係る容器での処理液への混入を抑制する観点からは、上記平均粒子径としては１μｍ以上が好ましい。なお、本開示において平均粒子径は、レーザー回折式粒度分布測定装置により測定するものとし、平均粒子径の基準としては、体積基準、重量基準、数基準などがあるが、体積基準が好ましい。
　凝集剤は、被処理液に含まれる不純物に作用して、その水溶性を低下させて析出させたり、または集合させて沈殿させるものであれば特に制限されない。但し、不純物を凝集させつつ吸着するものや、不純物を吸着しているのか凝集させているのか明確でないが不純物濃度を低下させていることが実験的に明らかであるものなど、吸着剤であるか凝集剤であるか明確でないものもあり、吸着剤と凝集剤との相違は必ずしも明確ではない。本発明では、その機構はともかくとして、導入された被処理液に比べて処理済み液体における不純物濃度を低下できるものであれば、吸着剤および／または凝集剤として用いることができる。
　本発明で用い得る凝集剤としては、例えば、負電荷を有する細胞由来のＤＮＡやリン脂質を効率的に凝集沈殿させるため、水溶性のカチオンポリマーを好適に挙げることができる。カチオンポリマーとしては特に、ポリアミンが好ましい。ポリアミンとしては、例えば、ポリアリルアミン、ポリ（ジアリルジメチル－塩化アンモニウム）、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン、ポリリジン、エチレンジアミン、１，２－プロパンジアミン、１，６－ヘキサメチレンジアミン、ピペラジン、２，５－ジメチルピペラジン、イソホロンジアミン、４，４’－ジシクロヘキシルメタンジアミン、１，４－シクロヘキサンジアミン等のジアミン類；ジエチレントリアミン、ジプロピレントリアミン、トリエチレンテトラミン等のポリアミン類；ヒドラジン、Ｎ，Ｎ’－ジメチルヒドラジン、１，６－ヘキサメチレンビスヒドラジン等のヒドラジン類；コハク酸ジヒドラジド、アジピン酸ジヒドラジド、グルタル酸ジヒドラジド、セバシン酸ジヒドラジド、イソフタル酸ジヒドラジド等のジヒドラジド類などが挙げられる。これらは、１種を単独で使用してもよく、２種以上を併用してもよい。これらの中でも、バイオプロセス用として市販されており、容易に入手可能である点から、ポリアリルアミンおよび／またはポリ（ジアリルジメチル－塩化アンモニウム）を含むものが好ましい。なお、不純物に巻き込まれて、標的生体分子が凝集沈殿する場合には、被処理液のｐＨや塩濃度を調整することで、標的生体分子の凝集沈殿を回避する条件を設定することが可能である。
　吸着剤と凝集剤の使用量は、容器の内容積などにより調整すればよいが、例えば、容器の内容積に対して５ｖ／ｖ％以上、５０ｖ／ｖ％以下とすることができる。また、被処理液１００ｍＬに対して０．１ｇ以上、２０ｇ以下の吸着剤および／または凝集剤を用いることができる。当該割合としては、１５ｇ／１００ｍＬ以下が好ましい。また、被処理液に対して０．１質量％以上、２０質量％以下の吸着剤および／または凝集剤を用いることができ、当該割合としては１質量％以上、１５質量％以下が好ましい。
　本発明に係る容器は、不純物が吸着された吸着剤および／または不純物と凝集剤を含む凝集体を捕捉し、結果として、吸着剤により吸着された不純物および／または凝集剤により凝集した不純物を捕捉し、その漏出を抑制するためのフィルターを含む。フィルターは、容器内への被処理液の導入前には、不純物が吸着する前の吸着剤および／または固形の凝集剤の容器からの漏出を抑制するための機能も有する。
　フィルターは、例えば図１と図４に模式的に示す通り、容器１内において注入口２と排出口４とを隔離する位置に設置することができる。或いは、図２に模式的に示す通り、排出口４に繋がる管中にフィルター３を設置し、排出口を通過した処理済み液を濾過してもよい。また、図３に模式的に示す通り、袋状に成形したフィルター内に吸着剤および／または凝集剤５を入れ、容器１内に入れてもよい。この場合には、被処理液を容器内に導入する前に、注入口に繋がる管や注入口に設置した予備フィルターにより、細胞や細胞片など比較的大きい不純物を除去することが好ましい。
　フィルターの孔径は、吸着剤により吸着された不純物および／または凝集剤により凝集した不純物の径や、標的生体分子の径を考慮して、吸着剤により吸着された不純物および／または凝集剤により凝集した不純物の径が透過せず、且つ標的生体分子が通過できるよう調整することが好ましい。例えば吸着剤は、小径であるほど比表面積が大きく吸着性能が高いと考えられるが、径が小さいと二次凝集することがあり、その平均粒子径を５μｍ未満にすることは難しいと考えられるため、フィルターの孔径は５μｍ以下にすることが好ましい。一方、フィルターの孔径を０．１μｍ以上にすることにより、ウイルスや一般的なタンパク質を十分に通過させることができ得る。当該孔径としては、０．２μｍ以上が好ましい。なお、フィルターの孔径は、カタログ値があればカタログ値を参照すればよいし、カタログ値が無い場合には、ガーレー通気度からの推定平均孔径とすることができる。
　フィルターの材質は、捕捉すべき不純物や通過すべき標的生体分子などに応じて適宜選択すればよいが、例えば、ポリエーテルスルホン等のスルホン系樹脂；ポリエチレン、ポリプロピレン等のポリオレフィン系樹脂；ナイロン等のポリエステル系樹脂；再生セルロース、酢酸セルロース等のセルロース類；ポリテトラフルオロエチレン、ポリビニリデンジフルオリド等のフッ素樹脂類；アルミナ、チタニア等のセラミック類などが挙げられる。
　本発明に係る容器は、被処理液ならびに吸着剤および／または凝集剤の攪拌手段を有し、被処理液の容器内への導入後、被処理液と吸着剤および／または凝集剤との接触を促進し、吸着剤への不純物の吸着や凝集剤による不純物の凝集を促進することが好ましい。
　攪拌手段としては、図１と図４に示す通り、外部から回転または上下動させることができる攪拌翼６－１を挙げることができる。この場合、１以上の攪拌翼を一方の端部に有する軸はハブ部を備え、ハブ部は当該軸と共に回転または上下動することができ、容器には当該ハブ部と密着して導入した被処理液の漏出を抑制すると共にハブ部の回転または上下動を許容するケーシング部を設けることが好ましい。攪拌翼の回転または上下動は、手動で行ってもよいし、モーター等を用いて機械的に行ってもよい。
　また、攪拌手段としては、図２と図３に示す通り、容器内に挿入した攪拌子６－２を挙げることができる。かかる攪拌子は、マグネチックスターラー等の外部デバイスを用いて外部から回転させることができる。
　一方、攪拌翼を用いた攪拌では、高いせん断応力が発生し、目的物にストレスがかかる場合があり、攪拌子では摺動部で目的物、容器、吸着体に物理的なダメージが加わる可能性がある。そのため、攪拌翼や攪拌子を使用しない攪拌手段も好適である。具体的には、容器を載せた架台を機械的にシーソーのように上下させて、容器内部の被処理液に波を発生させる手法や、容器を外殻容器に納め、外殻容器を水平方向に回転／反回転させることで、容器内部の被処理液に攪拌流を発生する手法がある。また、容器の任意の２か所（例えば、下部と上部）をあらかじめ配管で接続し、チュービングポンプ等のポンプで被処理液を出し入れすることにより循環混合する手法もある。
　その他、小型の容器であれば、容器内への被処理液の導入後、人力で振とうしたり或いは可撓性容器の場合には変形させる等して、被処理液と吸着剤および／または凝集剤とを攪拌することも可能である。
　排出口を閉鎖して注入口から被処理液を導入する場合、容器内部の空気を排出できず、被処理液を効率的に導入できないことがある。その様な場合、容器の上部に排気口を設け、被処理液の導入時などに容器内部の空気を排出できるようにすることが好ましい。排気口は、空気を排出できるものであれば特に制限されないが、例えば、その直径を０．１ｍｍ以上、５ｃｍ以下とすることができる。
　排気口は、容器の上部に設けられた単なる孔であってもよいが、蓋など、導入された被処理液の漏出を抑制するための部材が設置されていることが好ましい。また、排気口に管が取り付けられている場合には、当該管に被処理液の漏出を抑制するためのバルブが設置されていてもよい。
　本発明容器に被処理液を導入し、吸着剤および／または凝集剤と接触させた後に本発明容器から排出することにより、被処理液に含まれる標的生体分子を精製することができる。本開示において「精製」とは、本発明容器内で処理する前の被処理液に含まれる不純物の量に比べて、本発明容器内で処理した後の処理済み液に含まれる不純物の量が低減され、本発明容器内での処理前後で、被処理液における不純物に対する標的生体分子の相対量比が増加することをいう。
　具体的には、先ず、標的生体分子と不純物を含む被処理液を注入口から導入する。この際、本発明容器の排出口を閉じた状態で、被処理液を注入口から導入することが好ましい。標的生体分子としては、例えば、ウイルス、ウイルス様粒子、ワクチン、抗体、抗体様分子、抗体結合性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、および血漿タンパク質が挙げられる。
　「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡがタンパク質からなるカプシドで被覆された構造を有し、自己増殖能を有さない複合体をいう。例えば、ノンエンベロープウイルスとしては、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ヒトパピローマウイルス、ロタウイルス、コクサッキーウイルス、サポウイルス、ノロウイルス、ポリオウイルス、エコーウイルス、コロナウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ライノウイルス、アストロウイルス等が挙げられる。アデノ随伴ウイルスは、ＡＡＶ－１、ＡＡＶ－２、ＡＡＶ－３、ＡＡＶ－４、ＡＡＶ－５、ＡＡＶ－６、ＡＡＶ－７、ＡＡＶ－８、ＡＡＶ－９、ＡＡＶ－１０、ＡＡＶ－１１、ＡＡＶ－１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５およびＡＡＶ－１６からなる群より選択されるＡＡＶカプシド血清型を有する。エンベロープウイルスとしては、レトロウイルス、レンチウイルス、センダイウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、麻疹ウイルス、バキュロウイルス、インフルエンザウイルス等が挙げられる。
　「ウイルス様粒子」は、主にカプシドを構成するウイルス外殻タンパク質の全部または一部であり、核酸を含まないため感染の懸念が無い一方で、免疫反応を惹起するためワクチンの有効成分として用いることができる。また、ウイルス様粒子に合成核酸を導入したり、ウイルス様粒子を分解・再構築することで生理活性物質などを封入する等して、ドラッグデリバリーシステムとして利用することも可能である。
　「ワクチン」は、ウイルスや細菌などの病原体の不活性体や一部構造であり、核酸を含まないため感染の懸念が無い一方で、免疫反応を惹起するためワクチンの有効成分として用いることができる。例えばウイルスワクチンとしては、カプシドを構成するウイルス外殻タンパク質の全部または一部を利用することができる。
　本開示において「抗体様分子」とは、特に抗原認識や免疫反応の媒介などの機能を示す抗体断片をいい、「抗体または抗体様分子」としては、特に限定されず、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、Ｆｃ融合タンパク質、バイスペシフィック抗体、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）などが挙げられる。本発明においては、これら抗体または抗体様分子として、免疫グロブリン、Ｆｃ部を有するＦｃ融合タンパク質などのＦｃ含有タンパク質であってもよく、上記Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｃ、重鎖（Ｈ鎖）、軽鎖（Ｌ鎖）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃ（Ｆｖ）2、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、一本鎖抗体、重鎖抗体、多価抗体、バイスペシフィック抗体、Ｄｉａｂｏｄｙ、抗体様分子標的ペプチド（マイクロ抗体）といった低分子化抗体であっても、いずれも好ましく対象とすることができる。
　抗体結合性タンパク質は、抗体に特異的な結合能をもつタンパク質であれば特に限定されず、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、Ｆｃγ受容体及びそれらの機能性変異体が挙げられる。
　「ホルモン」、「サイトカイン」、「成長因子」とは、特定の細胞で生産、分泌され、別の細胞の特異的受容体に高親和性結合することで、微量でも分化、運動、分泌、取り込み、増殖などを誘導する分子であり、本発明では特に、タンパク質で構成されたものを示す。ホルモンとしては、例えば、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、プロラクチン、レプチン、カルシトニンが挙げられる。サイトカインとしては、例えば、インターロイキン、インターフェロン（ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる。成長因子としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）が挙げられる。
　「酵素」とは、生体の細胞内で生産され、生体内の化学変化に対して特異的触媒作用のあるタンパク質をいい、極めて微量で作用し、また、著しく特異的な触媒であり、一般に基質のある特定の基の特定の変化のみを触媒する。酵素としては、例えば、リパーゼ、プロテアーゼ、ステロイド合成酵素、キナーゼ、フォスファターゼ、キシラナーゼ、エステラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、酸化酵素、還元酵素、セルラーゼ、アロマターゼ、コラゲナーゼ、トランスグルタミナーゼ、グリコシダーゼおよびキチナーゼが挙げられる。
　「血漿タンパク質」とは、血漿中に溶解しているタンパク質をいい、例えば、トロンビン、血清アルブミン、ＶＩＩ因子、ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、Ｘ因子、組織プラスミノゲン活性化因子が挙げられる。
　本発明に係る容器で処理すべき被処理液としては、例えば、上記標的生体分子を製造する形質転換細胞の培養液、その細胞破砕液、界面活性剤などによる細胞溶解液、遠心分離や濾過などにより得られる培養上清、その抽出物などが挙げられる。本発明では、これら細胞培養液、および培養液の処理液をまとめて細胞培養液という。また、被処理液は、標的生体分子を含む体液であってもよい。体液は、動物の体内にあって、組織間や体腔内、もしくは全身に広がった管や循環系の中を満たしている液体、或いは細胞により生産されて体内外に分泌・排泄される液体をいう。例えば、ウイルスを含む体液は、ウイルス株を鶏卵の尿膜腔内に接種して培養した後、分離した漿尿液であってもよい。
　被処理液に含まれる不純物としては、細胞、細胞の破砕や溶解による細胞片、ＤＮＡ、ＤＮＡ結合性タンパク質などが挙げられる。細胞や細胞片は、比較的大きいため、上記の予備フィルターにより除去することができる。また、ヒストン等のＤＮＡ結合性タンパク質などは上記の表的生体分子に比べて比較的大きく、吸着剤に吸着され易かったり、或いは凝集剤により凝集され易かったりする。
　次に、本発明容器内で、導入された被処理液と吸着剤および／または凝集剤とを混合する。混合手段としては、上記攪拌手段で両者の混合物を攪拌することのほか、比較的小型の容器の場合には人力で振とうしたり、可撓性容器の場合には変形させてもよい。
　混合条件は適宜調整すればよい。例えば、混合時の温度は常温でよく、具体的には０℃以上、４０℃以下とすることができる。当該温度としては、１℃以上が好ましく、１０℃以上または１５℃以上がより好ましく、また、３０℃以下が好ましく、２５℃以下がより好ましい。また、接触時間としては、１秒間以上、１０時間以下とすることができ、１０分間以上が好ましく、３０分間以上がより好ましい。
　被処理液と吸着剤および／または凝集剤とを混合して被処理液に含まれる不純物の少なくとも一部を吸着剤に吸着させるか、又は凝集剤により凝集させた後、処理済み液を排出口から排出する。この際、細胞や細胞片など比較的大きな物質や、吸着剤や凝集体は、フィルターにより処理済み液から分離される。その結果、標的生体分子の量は変わらないか或いはほとんど変わらない一方で、不純物は吸着剤に吸着されるか又は凝集剤により凝集するため、標的生体分子は精製される。但し、上記工程で不純物を完全に除去することは難しいため、処理済み液をアフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー等に付すことにより、標的生体分子を更に精製することが好ましい。
　本願は、２０２０年２月２８日に出願された日本国特許出願第２０２０－３２５１３号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０２０年２月２８日に出願された日本国特許出願第２０２０－３２５１３号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
　以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、本発明の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。また、本実施例で用いる試薬については、特に明記しない限り、市販品を用いた。
　実施例１：　ウイルスの粗精製
　（１）アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産生細胞の調製
　蛍光タンパク質ＧＦＰの改変体であるＶＥＮＵＳ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＱ４３９５５．１）を発現するＡＡＶ２作製用プラスミドを、ＡＡＶベクター作製キット（「ＡＡＶｐｒｏ(R)　Ｈｅｌｐｅｒ　Ｆｒｅｅ　Ｓｙｓｔｅｍ」タカラバイオ社製）を用いて作製した。
　培養したＨＥＫ２９３細胞に、トランスフェクション試薬（「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ　ＭＡＸ」Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ社製，ＭＷ：４０，０００）を用いて作製したプラスミドをトランスフェクションし、ＡＡＶを産生させた。培養終了後、細胞を剥離し、細胞培養液を回収した。
　（２）核酸分解処理液の調製
　上記（１）で得たＡＡＶ培養液に、０．１ｖ／ｖ％になるように界面活性剤（「Ｔｒｉｔｏｎ(R)　Ｘ－１００」）を添加し、氷中で２０分間撹拌し、細胞溶解した。得られた細胞溶解液に、７．５ｖ／ｖ％の１Ｍ　塩化マグネシウム水溶液と、０．１ｖ／ｖ％のエンドヌクレアーゼ（カネカ社製）を添加し、３７℃で３０分間静置し、細胞由来核酸を分解した。これを核酸分解後処理液とし、ＡＡＶ量と総タンパク質量を定量した。結果を表１に示す。なお、ＡＡＶ濃度は、ＡＡＶ力価定量用キット（「ＡＡＶｐｒｏ(R)　Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（ｆｏｒ　Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ）Ｖｅｒ．２」タカラバイオ社製）を用いて定量し、総タンパク質濃度は、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を標準品として、タンパク質比色アッセイ試薬（「Ｐｉｅｒｃｅ　６６０ｎｍ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａｓｓａｙ　Ｒｅａｇｅｎｔ」Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて定量した。
　（３）水不溶性マグネシウム化合物による不純物除去
　外径１２．７ｃｍ×全高２３．５ｃｍの円筒状ポリエチレン製容器に、軽質塩基性炭酸マグネシウム（和光純薬工業社製，５９ｇ）と攪拌子を加えた。更に、上記（２）で得た核酸分解処理液（５９０ｇ）を加え、室温で１時間攪拌した。なお、核酸分解処理液に対する軽質塩基性炭酸マグネシウムの割合は１０ｗ／ｗ％となる。
　次いで、上記混合液を、ポリエーテルスルホン製フィルター（「Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ」Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，孔径：０．２μｍ）で濾過し、得られた濾液を１次濾液とした。残った濾過残渣にダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，５９ｍＬ，以下、「ＰＢＳ」と略記する）を添加して濾過し、得られた濾液を２次濾液とした。１次濾液と２次濾液を混合し、これを前処理後液１とし、上記と同様の条件でＡＡＶ量と総タンパク質量を定量した。また、核酸分解処理液についても同様にＡＡＶ量と総タンパク質量を定量した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示される結果の通り、処理前後でＡＡＶ量の低下は認められなかった。一方、総タンパク質量は顕著に低下しており、本手法により、細胞由来の不純物タンパク質が簡便に除去できることが確認できた。
　また、０．２μｍのフィルターにより、目的物であるＡＡＶから、細胞溶解物のみならず、おそらく不純物タンパク質を吸着した塩基性炭酸マグネシウム粒子も分離できることが確認できた。
　比較例１：　デプスフィルターと限外ろ過膜を用いるウイルスの粗精製
　２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋１２０ｍＭ　ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０）でデプスフィルター（「Ｓｕｐｒａｃａｐ　５０　ｃａｐｓｕｌｅ　ｗｉｔｈ　Ｖ１００Ｐ」ＰＡＬＬ社製，有効濾過面積：２２ｃｍ2，孔径：１～３μｍ）をリンスした。次いで、実施例１（２）で得た核酸分解処理液（５９２ｇ）を当該デプスフィルターで濾過し、得られた濾液を一次濾液として回収した。更に、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋１２０ｍＭ　ＮａＣｌ水溶液（ｐＨ８．０，５０ｍＬ）をデプスフィルターに送液し、得られた濾液を２次濾液として回収した。得られた１次濾液と２次濾液を混合し、これを清澄化液とした。
　ポンプシステム（「ＡＫＴＡ　ｆｌｕｘ　Ｓ」ＧＥヘルスケア社製）と限外ろ過膜（「Ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ－Ｓｃｒｅｅｎ　Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ　Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ　ｗｉｔｈ　Ｏｍｅｇａｔｍ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ：　Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ」ＰＡＬＬ社製，膜面積：０．０２ｍ2，公称分画分子量：３００Ｋ）を用いて、上記清澄化液（６４７ｍＬ）を約５０ｍＬまで濃縮した。濃縮液の液量を維持したまま、透析液として、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ＋１２０ｍＭ　ＮａＣｌ＋０．００５％　Ｔｗｅｅｎ２０＋１ｍＭ　ＭｇＣｌ2水溶液（ｐＨ８．１）を濃縮液に対して約８倍量用いて、連続加水により、バッファー交換した。透析終了後、システム内の透析後液を回収した。また、システムを透析液で洗浄し、洗浄液を回収した。
　透析後液と洗浄液を混合し、ポリエーテルスルホン製フィルター（「Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ」Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，孔径：０．２μｍ）で濾過し、これを前処理後液２とした。実施例１（１）と同様にして、前処理後液２のＡＡＶ量と総タンパク質量を定量した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示される結果の通り、デプスフィルターによる濾過前後では、ＡＡＶ量は変化がないものの、総タンパク質濃度の低下も顕著ではなく、不純物タンパク質の大部分が残存していた。
　限外濾過膜による処理前後では、総タンパク質濃度は顕著に低下しており、不純物タンパク質が除去できている一方で、ＡＡＶ量の低下も認められた。透過液にもＡＡＶが認められたことから、限外濾過膜の孔径が大きく、ＡＡＶが透過したと推測された。
　以上の結果より、デプスフィルターと限外濾過膜による粗精製では、処理は多段階で操作が煩雑であるのみでなく、総タンパク質量は低減できるものの、ＡＡＶ回収率まで低くなるリスクがあることが分かった。
　比較例２：　アフィニティクロマトグラフィーによるウイルス精製
　実施例１（２）で得た核酸分解処理液を遠心分離し、上清をポリエーテルスルホン製フィルター（「Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ」Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，孔径：０．２μｍ）で濾過した。これを前処理なし清澄化液とした。この前処理なし清澄化液から、ＡＡＶ量が１×１０12ｖｇになる液量を分取し、その９倍量の平衡化バッファーを混合し、フィルターを使って濾過した。
　得られた濾液を下記条件のアフィニティクロマトグラフィーに付し、ＡＡＶを精製した。溶出液中のＡＡＶを定量ＰＣＲで定量し、負荷したＡＡＶ量に対する回収率を算出した。また、比較のために、実施例１の前処理後液１と、比較例１の前処理後液２からもＡＡＶ量が１×１０12ｖｇになる液量を分取し、その９倍量の平衡化バッファーを混合し、フィルターで濾過して得た濾液も同アフィニティクロマトグラフィーに付し、ＡＡＶ量を定量してＡＡＶ回収率を算出した。結果を表３に示す。
　＜クロマトグラフィー条件＞
　　カラム：　Ｔｒｉｃｒｏｎ５／５０（ＧＥヘルスケア社製）
　　担体：　ＰＯＲＯＳ　ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔＡＡＶＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製），１ｍＬ
　　流速：　０．５ｍＬ／ｍｉｎ
　　平衡化ｂｕｆｆｅｒ：　２０ｍＭ　トリスヒドロキシメチルアミノメタン－塩酸ｂｕｆｆｅｒ，０．５Ｍ　塩化ナトリウム（ｐＨ８．０）
　　溶出ｂｕｆｆｅｒ：　０．１Ｍ　クエンｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ２．１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３の結果より、デプスフィルターや限外ろ過で得られた前処理後液（比較例１）や前処理なしの清澄化液（比較例２）に比べて、本実施例による前処理で得られた清澄化液は後段のアフィニティークロマト精製での回収率が高くなることが分かった。
　実施例２：　不純物除去資材の粒子径分布測定
　実施例１（３）で用いた軽質塩基性炭酸マグネシウムを水に懸濁し、粒子径分布測定装置（「Ｐａｒｔｉｃａ　ＬＡ－９６０」堀場製作所社製）を用いて、粒子径分布を湿式法にて評価した。結果を図５に示す。
　その結果、メジアン径７．９μｍであり、体積基準１０％径は５．２μｍであった。即ち、孔径５μｍ以下のフィルターを用いれば、上記塩基性炭酸マグネシウムは９０％以上分離できると考えられた。実施例１では孔径０．２μｍのフィルターでＡＡＶが透過しており、０．２～５μｍのフィルターを用いることで、塩基性炭酸マグネシウム粒子とＡＡＶを分離することが可能である。
　実施例３：　水不溶性マグネシウム化合物を用いた処理条件の評価
　水不溶性マグネシウム化合物を用いたＡＡＶ培養液の処理条件、具体的には、添加量、処理時間、および核酸分解酵素濃度について、表４に示す条件で処理し、ＡＡＶ回収率、タンパク質除去率、およびＤＮＡ除去率を評価した。
　実施例１（１）で得たＡＡＶ培養液に、０．１ｖ／ｖ％になるように界面活性剤（「Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００」）を添加し、氷中で２０分間撹拌し、細胞を溶解した。得られた細胞溶解液に、７．５ｖ／ｖ％の１Ｍ塩化マグネシウム水溶液と、終濃度が５０Ｕ/ｍＬ、５Ｕ/ｍＬ、または０．５Ｕ/ｍＬとなるようにエンドヌクレアーゼ（カネカ社製）を添加し、３７℃で３０分間静置し、細胞由来核酸を分解した。これを核酸分解後処理液とした。各核酸分解処理液２０ｍＬに対して、１０ｗ／ｖ％、５ｗ／ｖ％、または１ｗ／ｖ％となるように軽質塩基性炭酸マグネシウム（和光純薬工業社製）を添加し、室温で１分間、１０分間、または６０分間振とう攪拌した。この処理液を、ポリエーテルスルホン製フィルター（「Ｎａｌｇｅｎｅ　Ｒａｐｉｄ－Ｆｌｏｗ　Ｓｔｅｒｉｌｅ　Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｕｎｉｔｓ」Ｔｈｅｒｍｏ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製，孔径：０．２μｍ）で濾過した。以下、得られた濾液を１次濾液という。残った濾過残渣に、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製，以下、「ＰＢＳ」と略記する）２ｍＬを添加して濾過した。以下、得られた濾液を２次濾液という。１次濾液と２次濾液を混合した。以下、得られた混合液を前処理後液３という。前処理後液３のＡＡＶ量と総タンパク質量を、実施例１（２）と同様の条件で定量した。
　また、Ｊ．Ｐｈｒａｍａ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌ．（２０１４），１００，１４５－１４９に記載の方法を参考にして、前処理後液３中のＨＥＫ２９３細胞由来の残存ＤＮＡを定量した。具体的には、プライマー１：ＧＡＧＧＣＧＧＧＣＧＧＡＴＣＡ（配列番号１）、プライマー２：ＣＣＣＧＧＣＴＡＡＴＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＴＴＡＧＴＡＧ（配列番号２）、およびリアルタイムＰＣＲ用試薬セット（「Ｐｏｗｅｒ　ＳＹＢＲTM　Ｇｒｅｅｎ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ」Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を使用し、リアルタイムＰＣＲシステム（「ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３」Ｌｉｆｅ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で解析した。ヒト由来ＤＮＡの標準品として、Ｈｕｍａｎ　Ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社製）を使用して検量線を作成し、ＤＮＡ量を定量した。
　また、対照として、エンドヌクレアーゼ５０Ｕ／ｍＬで処理した核酸分解処理液を塩基性炭酸マグネシウムで処理せず同様にＡＡＶ量、タンパク質量、およびＤＮＡ量を定量した。また、対照のＡＡＶ量を１００％とした場合の各処理液のＡＡＶ回収率を算出した。更に、対照のタンパク質量とＤＮＡ量について、各除去率を０％とした場合の各処理液のタンパク質除去率とＤＮＡ除去率を算出した。結果を表４、図６、および図７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＤＮＡ除去率については、いずれの条件でも８４％以上の除去率が示され、添加量、処理時間および核酸分解酵素濃度は、各条件の最低水準でも、効率的にＤＮＡが除去できることが分かった。また、タンパク質濃度は、図７に示す通り、塩基性炭酸マグネシウム添加量が多いほど、タンパク質除去率が高くなる傾向が見られた。よってタンパク質を効率よく除去するためには、添加量が多い方が好ましいといえる。
　１：　容器
　２：　注入口
　３：　フィルター
　４：　排出口
　５：　吸着剤および／または凝集剤
　６－１：　攪拌翼，　６－２：　攪拌子
　７：　排気口

Claims (8)

  1. 　細胞培養液または体液から標的生体分子を精製するための容器であって、
    　注入口、フィルター、および排出口を有し、
    　不純物を吸着する吸着剤、および／または、不純物を凝集する凝集剤を含み、
    　上記フィルターは、吸着剤により吸着された不純物、および／または、凝集剤により凝集した不純物を捕捉するためのものであることを特徴とする精製用容器。
  2. 　上記吸着剤および／または上記凝集剤が、水不溶性無機化合物、イオン交換樹脂、疎水性相互作用樹脂、親水性相互作用樹脂、アフィニティー樹脂、および活性炭から選択される１種以上である請求項１に記載の精製用容器。
  3. 　上記水不溶性無機化合物が、炭酸マグネシウム、水酸化マグネシウム、酸化マグネシウム、硫酸カルシウム、および酸化アルミニウムから選択される１種以上である請求項２に記載の精製用容器。
  4. 　上記不純物が、細胞、細胞破砕物、細胞溶解物、核酸、および核酸結合性タンパク質から選択される１種以上である請求項１～３のいずれかに記載の精製用容器。
  5. 　上記標的生体分子が、ウイルス、ウイルス様粒子、ワクチン、抗体、抗体様分子、抗体結合性タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、および血漿タンパク質から選択される１種以上である請求項１～４のいずれかに記載の精製用容器。
  6. 　上記フィルターの孔径が０．１μｍ以上、１００μｍ以下である請求項１～５のいずれかに記載の精製用容器。
  7. 　更に、上記細胞培養液または体液ならびに上記吸着剤および／または上記凝集剤の攪拌手段を有する請求項１～６のいずれかに記載の精製用容器。
  8. 　上記細胞培養液または体液から上記標的生体分子を精製するための方法であって、
    　請求項１～７のいずれかに記載の精製用容器の上記注入口から上記細胞培養液または体液を導入する工程、および、
    　上記細胞培養液または体液と上記吸着剤および／または上記凝集剤を接触させる工程を含むことを特徴とする方法。
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