JPH09505466A - ヒト免疫不全ウイルスに対する合成ヒトモノクローナル中和抗体 - Google Patents
ヒト免疫不全ウイルスに対する合成ヒトモノクローナル中和抗体Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は合成ヒトモノクローナル抗体を記載し、該抗体はヒト免疫不全ウイルス(HIV)と免疫反応し、かつこれを中和する。本発明の該合成ヒトモノクローナル抗体は、gp120 に対して高い結合アフィニティーおよび中和能力を示す。同様に、該モノクローナル抗体を使用した免疫療法および診断法、並びに該モノクローナル抗体を製造する細胞系をも開示する。
Description
【発明の詳細な説明】
ヒト免疫不全ウイルスに対する合成ヒトモノクローナル中和抗体発明の分野
本発明は、一般に免疫学分野、具体的にはヒト免疫不全ウイルス(HIV)に
結合し、これを中和する合成ヒト単クローン性(モノクローナル)抗体に関する
。背景
1.HIV免疫療法
HIVは、後天性免疫不全症候群(AIDS,エイズ)の原因体であるがゆえ
に、集中的に研究されている。免疫療法は、HIV感染およびHIV誘発疾患の
予防または治療に対するいくつかのアプローチの1つである。特に、受動免疫療
法での中和抗体の使用は、本発明にとって最も重要である。
HIVと免疫的に反応する多クローン性(ポリクローナル)抗体を含むヒト血
清を用いたHIV−1感染者の受動免疫付与が報告されている。例えば、ジャク
ソンらの論文(Jacksonら、Lancet,9月号17:647-652(1988))、カーパスらの論
文(Karpasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87:7613-7616(1990))を参照され
たい。
多くのグループが、分離HIVをインビトロで中和するヒトモノクローナル抗
体の調製について報告した。報告された抗体は、典型的にはHIVの糖蛋白gp
160または関連糖蛋白gp120もしくはgp41上のエピトープに対して免
疫特異性を有する。例えば以下の論文を参照のこと;Karwowskaら、Aids Resear
ch & Human Retroviruses,8:1099-1106(1992); Takedaら、J.Clin.Invest.,
89:1952-1957(1992); Tilleyら、Aids Research & Human Retroviruses,8:461-
467(1992); Lamanら、J.Virol.,66:1823-1831(1992); Thaliら、J.Virol.,6
5:6188-6193(1991); Hoら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:8948-8952(1991);
D'Souza ら、AIDS,5:1061-1070(1991); Tilley ら、Res.Virol.,142:247-259
(1991); Brolidenら、Immunol.,73:371-376(1991); Matourら、J.Immunol.,1
46:4325-4332(1991); Gorny ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:3238-3242
(1991)。HIV感染の病理および、抗HIV抗体による受動免疫の使用を含む治
療態様についての現時点での概論に関しては、レビーの論文(Levy,Microbiol.
Rev.,57:183-289(1993))を参照されたい。
これまでのところ、報告されたヒトモノクローナル抗体のいずれも、受動免疫
付与療法での有効性が示されていない。さらに、モノクローナル抗体として、そ
れらの各々はすべて、HIVエンベロープの表面糖蛋白(gp120またはgp
160)上の個々のエピトープ、またはgp120のV3ループ、またはエンベ
ロープのトランスメンブレン糖蛋白(gp41)と反応する。有効な中和抗体と
免疫学的に反応するエピトープは同定されていない。
顕著なHIV中和活性をもつヒトモノクローナル抗体調製物の開発の要請は依
然として存在する。さらに、HIVgp120上の別の多様な中和エピトープと
免疫的に反応するモノクローナル抗体に対する要請がある。受動免疫付与に際し
て投与患者はその投与抗体に対して免疫反応を生じ、それによって特定の治療抗
体を不活化するので、別の(新規な)エピトープ特異性が必要とされる。
さらに、そのエンベロープの糖蛋白構造に変異を生じ、したがって感染者の免
疫系との反応性に変化を生じる、多くの証拠によって示されたこのHIVの能力
は種々の“野外分離株”をもたらし、これらは、個々の研究室のHIV株と免疫
的に反応する個々の抗体調製物の有用性を損なう。現時点で存在する抗体調製物
の野外分離株に対する有効性は、研究室株に対するものより弱い(Moore ら、Pe
rspectives in Drug Discovery & Design,1:235-250(1993))。さらに、多数の
HIV株を有効に中和することを示したヒトモノクローナル抗体は未だ報告され
ていない。したがって、多数の異なるHIV株を中和する能力を有するヒトモノ
クローナル抗体の要請は依然として続いている。
2.組み合わせファージミドライブラリーで生成された
ヒトモノクローナル抗体
糸状ファージディスプレーベクター(ファージミドと呼ばれる)の使用が、多
様で新規な免疫特異性を有するモノクローナル抗体の大型ライブラリーの効率の
よい調製を可能にすることは、繰り返し示されてきた。この技術は、糸状ファー
ジ複製の組み立て工程時に遺伝子産物と遺伝子を連結する手段として糸状ファー
ジコート蛋白の膜アンカードメインを利用し、これは、組み合わせライブラリー
での抗体のクローニングおよび発現のために用いられてきた(Kangら、Proc.Na
tl.Acad.Sci.USA,88:4363-4366(1991))。抗体の組み合わせライブラリーは
、cpVIII膜アンカー(Kangら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:4363-43
66(1991))およびcpIII膜アンカー(Barbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A,88:7978-7982(1991))の両方を用いて作製された。
糸状ファージをベースにした組み合わせ抗体ライブラリーの多様性は、重鎖お
よび軽鎖遺伝子をシャフリングすることにより(Kangら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,88:11120-11123(1991))、このライブラリーのクローン化重鎖遺伝子の
CDR3領域を変化させることにより(Barbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA
,89:4457-4461(1992))、さらにエラー多発性ポリメラーゼ鎖伸長反応(polyme
rase chain reaction,PCR)によってこのライブラリーにランダム変異を導
入することによって(Gramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(199
2))高めることができる。
糸状ファージディスプレーベクターはまた、B型肝炎ウイルス(HBV)また
はHIV抗原と免疫的に反応するヒトモノクローナル抗体を製造するために用い
られた。例えば以下の論文をそれぞれについて参照のこと;Zebedee ら、Proc.
Natl.Acad.Sci.USA,89:3175-3179(1992); Burtonら、Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,88:10134-10137(1991)。ファージベクターの使用によってバクテリオフ
ァージの表面に出現したヒトモノクローナル抗体(この場合、この抗体はHIV
−1抗原、gp120およびgp41に対して特異的である)は、組み合わせラ
イブラリーのスクリーニングによって作製された。得られた抗体はHIVと免疫
反応性を有し、HIVを中和することが分かった(以下の文献を参照のこと:Ba
rbasら、J.Mol.Biol.,230:812-823(1993); Williamsonら、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA,90:4141-4145(1993); Burtonら、Chem.Immunol.,56:112-126(199
3); Barbasら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:9339-9343(1992))。
上記のファージディスプレー由来抗HIV抗体はHIV感染を中和することが
示されたが、一方、スクリーニングされた抗体は、免疫された宿主または感染宿
主の免疫レパートリーの代表である。しかしながら、抗原に対するその親和性で
インビトロで分離された重鎖と軽鎖のペアリングは、インビボでは必ずしもペア
を形成しない。ファージディスプレー系は重鎖と軽鎖の固有のペアリングを可能
にするが、多くの場合、親和性選別はおおよそのペアリングを回復させる(Burto
nら、Noture,359:782-783(1992))。そのような被免疫源または自然感染による
免疫プライミングはいくつかの抗原に対する有用な抗体ライブラリーを提供する
が、一方、何時でもそのようなライブラリーを入手することが可能とは限らない
。抗HIV−1中和抗体は、HIV−1陽性ドナーから調製したファージライブ
ラリーのスクリーニングによって得られたが、得られた抗体は、その重鎖と軽鎖
のアミノ酸残基配列のために特異性と親和性に限界がある。
糸状ファージをベースにした組み合わせ抗体ライブラリーの多様性は、しかし
ながら、最初のライブラリースクリーニングで得られる重鎖および軽鎖遺伝子を
シャフリングすることによって高めることができる(Kangら、Proc.Natl.Acad
.Sci.USA,88:11120-11123(1991))。別のアプローチは、エラー多発性ポリメ
ラーゼ鎖伸長反応(PCR)によって重鎖および軽鎖遺伝子にランダム変異を導
入することである(Gramら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:3576-3580(1991)
)。蛋白の変異誘発は、蛋白の機能を変化させるために、さらにある場合には結
合特異性を変えるために利用されてきた。典型的には、この変異誘発は位置特異
的であり、したがって蛋白内に誘発される変異の体系的な選択に左右される骨の
折れる作業である。例えばコーリーの論文を参照されたい(Coreyら、J.Amer.
Chem.Soc.,114:1784-1790(1992)):この論文では、ラットのトリプシンは位
置特異的変異誘発によって修飾された)。もっと最近では、リーヒマンら(Riec
hmann ら、Biochem.,32:8848-8855(1993))は、位置特異的変異誘発およびファ
ージディスプレー技術をランダム化ライブラリーのスクリーニングの前に使用し
、ハプテン2−フェニルオキザゾル−5−オンに対して特異的な一本鎖Fabフ
ラグメントの親和性を高めることを記載した。
抗体の構造および機能の潜在的能力のより広範囲な見本を得るための好ましい
アプローチは、ファージディスプレーの内容で半合成抗体を調製することである
。これらの分子では、ライブラリーのスクリーニングによって得られるクローン
化重鎖または軽鎖遺伝子の1つまたは2つ以上の相補性決定領域が変化し、新規
な
可変ドメインのアミノ酸残基配列を生じる(Barbasら、Proc.Natl.Acad.Sci
.USA,89:4457-4461(1992))。
特定のドナーからクローン化された抗体と異なり、半合成抗体はどのような配
列のどのような大きさのCDRも含むことができる、したがって新規な特異性と
親和性をもつ抗体を得る可能性が高まる。発明の簡単な説明
以前に性状が明らかにされた抗体と比較して強化された親和性、特異性および
中和能をもつ、HIV−1糖蛋白に対して特異的な合成Fab異種二量体を発見
した。この新規な合成HIV−1特異的Fab異種二量体は、組換え体Fab抗
体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子の相補性決定領域(CDR)にランダム変
異を誘発する合成方法を用いて、HIVに結合してこれを中和する抗体を製造す
ることによって得られる。
ランダム変異を起こさせた中和抗体は、HIV特にHIV糖蛋白gp120上
の新規なエピトープを明らかにし、したがって、非ランダム化組み合わせライブ
ラリーで選別された抗体と比較して、より強いエピトープ結合親和性を示す新規
な免疫療法用ヒトモノクローナル抗体の利用性を増進させた。
本発明は、非ランダム化組み合わせライブラリーから選別された抗体よりさら
に効率よくHIVを中和する合成ヒトモノクローナル抗体を提供する。また、モ
ノクローナル抗体の抗原結合ドメインに強化中和機能を付与し、さらに、HIV
に特異的に結合してこれを中和する他の抗体を同定するために免疫原として用い
ることができるアミノ酸配列を提供する。本発明の合成モノクローナル抗体は、
HIV誘発疾患の診断および免疫療法用試薬として特に有用である。
本発明のモノクローナル抗体の主要な利点は、それら抗体はヒトのポリヌクレ
オチド配列によってコードされる(すなわちそれらはヒトの抗体である)という
事実に起因する。したがって、HIV誘発疾患の診断および免疫療法のために本
発明のモノクローナル抗体をインビボで使用することは、受動的態様で投与され
る抗体に対する重大な宿主免疫反応に関する問題(これは、外来性またはキメラ
型派生物のモノクローナル抗体が用いられる場合に遭遇する共通の問題である)
を大きく減少させる。
本発明のヒトモノクローナル抗体の別の主要な利点は、この抗体は標的抗原に
対して顕著に強化された免疫親和性を有するということであり、このことは、こ
の抗体を診断のためにも治療のためにも特別に効力のあるものにする。
ある実施例では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)と免疫的に反応
し、これを中和することができる合成ヒトモノクローナル抗体を目的とする。合
成モノクローナル抗体は、100ナノグラム(ng)/ml未満の抗体濃度で、
インビトロウイルス感染性アッセーにおいてHIV感染力価を50%減少させる
能力を有する。好ましい実施例では、モノクローナル抗体は、20ng/ml未
満、好ましくは10ng/ml未満の濃度で感染力価を50%減少させる。
好ましい合成モノクローナル抗体はFabフラグメントである。より好ましい
ものは、HIV糖蛋白、特にHIV糖蛋白gp120と免疫的に反応する合成モ
ノクローナル抗体分子である。
本発明はまた、多数の異なるHIV株に対して強化された、または改善された
ウイルス中和能を示す、すなわちウイルス株中和能の幅が広くなったヒトモノク
ローナル抗体およびその調製方法も開示する。したがって、好ましいヒトモノク
ローナル抗体は、前もって選択した第一のHIV株を上記のように中和する能力
を有し、さらに、10マイクログラム(μg)/mlの抗体濃度でインビトロウ
イルス感染性アッセーで第二のHIV野外株の感染性力価を50%減少させる能
力を有する。多数のHIV株を中和することにより、本抗体は、株間交差反応性
および多株中和能を明らかにする。
好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列番号:2、3、4および5から
成る群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノ
クローナル抗体の結合特異性を有する。別の好ましい合成ヒトモノクローナル抗
体は、配列番号:6の軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基を含むモノク
ローナル抗体の結合特異性を有する。
好ましい実施例では、本発明は、約1×10-8Mまたはそれ未満、好ましくは
約1×10-9Mから約1×10-10M、より好ましくは約1×10-10Mから約1
×10-11M、最も好ましくは約1×10-11Mから約1×10-12Mの解離定数
(Kd)でHIV糖蛋白gp120と免疫的に反応するような中和抗体を開
示する。
上記の高親和性結合特異性を有する好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列
番号:1、2、3、4、5、54、55、56、57、58、59、89、90
、91および92並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる重鎖免疫グロ
ブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含む。さらに、上記の高親和性結合特異性
を有する好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号:6、69、70、73
、75、76、77、79、80、82、83、84、85、86、87および
88並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる軽鎖免疫グロブリン可変領
域のアミノ酸残基配列を含む。特に好ましいものは、該モノクローナル抗体が、
対として配列番号:2:6、3:6、4:6、5:6、3:69、3:70、3
:73、3:75、3:76、3:77、3:79、3:80、3:82、3:
83、3:84、3:85、3:86、3:87、54:6、55:6、56:
6、57:6、58:6、59:6、89:6、89:88、90:86、90
:88、91:6、91:88および92:88並びにその保存的置換体から成
る群から選ばれる重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を
有するモノクローナル抗体の結合特異性を有する、ヒトモノクローナル抗体であ
る。
本発明の目的はまた、予め選択した1つまたは2つ以上の免疫グロブリン重鎖
、好ましくは相補性決定領域(CDR)に変異を連続的に誘発し、続いてHIV
と強力に免疫的に反応しこれを中和する抗体を選別するランダム変異誘発法を用
いて合成抗HIVモノクローナル抗体を製造する方法である。
別の実施例では、本発明の合成ヒトモノクローナル抗体の重鎖または軽鎖免疫
グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列部分をコードするポリヌクレオチド配列
が開示される。また本発明の目的とすることは、このポリヌクレオチドを含むD
NA発現ベクター並びに、このベクターおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞
である。
本発明はまたヒト免疫不全ウイルス(HIV)を検出する方法を目的とするが
、この方法は、HIVを含むと思われるサンプルを診断的に有効量の本発明の合
成モノクローナル抗体と接触させ、この合成モノクローナル抗体がこのサンプル
と
免疫的に反応するか否かを決定することを含む。この方法はインビトロまたはイ
ンビボで実施でき、免疫反応生成物の存在を検出するための種々の方法が含まれ
る。
別の実施例では、本発明は、ヒト免疫不全ウイルス疾患に対する受動免疫療法
を患者に提供する方法を開示するが、この方法は、患者に免疫療法的に有効な量
の本発明の合成モノクローナル抗体を投与することを含む。投与は、予防的に非
経口投与によって実施することができる。1種または2種以上の異なる合成ヒト
モノクローナル抗体を含む医薬組成物が、本発明の治療方法で使用するために開
示される。図面の簡単な説明
本明細書の一部分を構成する図面は下記の通りである:
図1は、gp120に結合するヒトFabの可変重鎖(VH)ドメインのアミ
ノ酸残基配列を示す。このFab異種二量体が発現されるDNAクローンに対応
するそのFabの名称は、左手の欄に示されている。このFab(MT4、3b
1、3b3、3b4および3b9)はそれぞれ配列番号:1−5に割り当てられ
、配列表に掲げた通りである。FabMT4は、患者MTから作製したプラスミ
ドライブラリーから選ばれた最初のクローンから発現された。このライブラリー
は、実施例1Aで述べるようにgp120に対してスクリーニングされた。合成
ヒトHIV−1中和Fab(3b1、3b3、3b4および3b9)は、実施例
1(特に実施例1Bおよび1E)で述べるように、重鎖のCDR1およびCDR
3をランダム化して得られるFabである。左から右に表示した各Fabの配列
決定領域はフレームワーク領域1(FR1)、相補性決定領域1(CDR1)、
フレームワーク領域2(FR2)、相補性決定領域2(CDR2)、フレームワ
ーク領域3(FR3)、相補性決定領域3(CDR3)、およびフレームワーク
領域4(FR4)である。
図2は、gp120に結合するFabの可変カッパ軽鎖(VK)ドメインのア
ミノ酸残基配列を示す。このFab異種二量体の名称は左手の欄に示されている
。FabMT4の軽鎖は配列番号:6に割り当てられており、配列表に表示した
通りである。FabMT4は、患者MTから作製したプラスミドライブラリーか
ら
選ばれた最初のクローンから発現された。このライブラリーは、実施例1Aで述
べるようにgp120に対してスクリーニングされた。さらに、MT4の軽鎖は
図1で述べた合成Fabの作製時にランダム化されなかったので、MT4の軽鎖
のアミノ酸配列は、実施例1で述べるようにFabの3b1、3b3、3b4お
よび3b9の各々に存在する。
図3は、本発明の合成Fab(3b1、3b3、3b4および3b9)の結合
親和性とHIV−1MN株由来gp120に対する中和能との相関性を示すグラ
フである。結合親和性(Ka M-1)は、指数値E+として示したようにX軸に
、中和能(Neut50、IC50 M-1)に関してはY軸にプロットした。中和のデー
タのためにはグラフではIC50値(中和力価ではなく)が記入されている。この
グラフを作製するための結合親和性データは、実施例1Hの表1で欄の見出しKa
(M-1)の下に示されている。中和データは、実施例1Hの表3で欄の見出し
IC50(M-1)の下に示されている。各Fabについてのデータはグラフに表示
されている。結合親和性と中和能との間の関係は、最高の結合親和性と中和能を
示すFabの3b3について実施例1Hで述べるように比較的直線状である。そ
の重鎖内にランダム化されたCDR1およびCDR3をもつ本発明の4種の合成
Fabの全てが、最初のクローンMT4より強化された結合親和性と中和能を示
した。
図4は、最初のクローンpMT4の重鎖可変ドメインの5’から3’方向で表
示したヌクレオチドのコード鎖を示している。この配列は配列番号:7にも示さ
れている。対応するコードされた重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は図1に
示されている。このpTM4ヌクレオチド配列は、CDR1に対応する残基82
−96の領域で本発明にしたがいランダム化され、さらに別の変異誘発で残基2
92−303で、続いてCDR3の304−318の領域でランダム化された。
残基の位置は、星印を付けた10残基毎に数字で示されている。
図5は、gp120に結合するヒトFabの可変重鎖(VH)ドメインのアミ
ノ酸残基配列を示している。実験Aでは、CDR1はアミノ酸残基31−35に
亙ってランダム化される。CDR1ランダム化ライブラリーは、実施例1Aおよ
び実施例1Dで述べるようにgp120に対してスクリーニングされた。実験A
の12種の選択されたFabのヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸残基3
1−35は、相補性決定領域1(CDR1)として右から左に表示されている。
この12種のFabを、この欄の上から下へそれぞれ配列番号:14−25と呼
び、配列表に示されている。他のFabがそれから派生したMT4のCDR1配
列は配列番号:8と呼ぶ。このCDR1ランダム化ライブラリーは、実施例1B
および1Eで述べるように相補性決定領域3(CDR3)でさらにランダム化さ
れた。ランダム化CDR1およびCDR3ライブラリーから選別された8種のF
abのCDR1およびCDR3の推定アミノ酸配列は、実験Bで与えられる。こ
のFabがそれから発現されるDNAクローンに対応するFab異種二量体の名
称は、右側の欄に示されている。FabのMT4、3b1、3b3、3b4およ
び3b9の完全なVH可変ドメインの配列はそれぞれ配列番号:1−5に割り当
てられ、配列表に示されている。Fabの3b1、3b2、3b3、3b4、3
b6、3b7、3b8および3b9のCDR1はそれぞれ配列番号:26−33
に割り当てられ、配列表に示されている。FabMT4は、患者MTから作製さ
れたプラスミドライブラリーから選別された最初のクローンから発現される。そ
れから他のFabが派生したMT4のCDR3の配列は配列番号:34と呼ばれ
る。左から右に示した各Fabのこの配列決定領域は、CDR3のアミノ酸残基
96−99である。このFab3b1、3b2、3b3、3b4、3b6、3b
7、3b8および3b9のCDR3は、それぞれ配列番号:35−42に割り当
てられ、配列表に示されている。
図6は、実施例2で述べるように、ファージミドFabディスプレー発現ベク
ター(pComb3H)の重鎖および軽鎖の発現制御領域の模式図である。
図7Aおよび7Bは、ファージミドMT4−3(pMT4−3)の重鎖CDR
1の変異誘発に由来するgp120特異的ヒトFabの可変重鎖(VH)ドメイ
ンのアミノ酸残基配列を示す。それからFabが発現されるDNAクローンに対
応するH4H1シリーズのFab異種二量体の名称は、左側の欄に示されている
。鋳型のFabMT4の重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図1の説明で
述べたように指示領域の下に示されている。鋳型Fabと同一である派生Fab
のアミノ酸残基配列の部分は、省略記号(〃)で表示される。各派生Fabの変
異
誘発CDRは表示されている。変異誘発重鎖CDR1をもつ各派生Fabの完全
な可変ドメインは、割り当てられた識別番号に対応して配列表に示されている。
このFabは実施例2の記載にしたがって得られた。
図8は、実施例2で述べるようにpPho−TT発現ベクターの制限地図を示
す。破傷風毒素(TT)誘導Fabの重鎖および軽鎖可変ドメインをコードする
ヌクレオチド配列を含むpPho−TT発現ベクターの完全なヌクレオチドのコ
ード配列が5’から3’の向きで、配列番号:51として配列表に示されている
。このベクターおよび、抗TTFabを置き換えて本発明の可溶性Fabを発現
させるためのその使用については、実施例2に述べられている。
図9AおよびBは、ファージミド3b3(p3b3)の重鎖CDR3の変異誘
発に由来するgp120特異的ヒトFabの可変重鎖(VH)ドメインのアミノ
酸残基配列を示す。それからFabが発現されるDNAクローンに対応するM5
56シリーズのFab異種二量体の名称は、図9Aの左側の欄に示されている。
鋳型のFab3b3の重鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図1の説明で述
べたように指示領域の下に示されている。鋳型Fabと同一である派生Fabの
アミノ酸残基配列の部分は、省略記号(〃)で表示される。各派生Fabの変異
誘発CDRは表示されている。変異誘発重鎖CDR3をもつ各派生Fabの完全
な可変ドメインは、割り当てられた識別番号に対応して配列表に示されている。
このFabは実施例2の記載にしたがって得られた。
図10は、最初のクローンpMT4−3の軽鎖可変ドメインのヌクレオチドの
コード鎖を5’から3’の向きで示す。この配列はまた配列番号:62として示
されている。対応するコードされた軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は図2
に示されている(配列番号:6)。
図11Aおよび11Bは、図2に示したpMT4−3(配列番号:6)によっ
てコードされる軽鎖と同じである、ファージミド3b3(p3b3)の軽鎖のC
DR1を変異誘発して得られたgp120特異的ヒトFabの可変カッパ軽鎖(
VK)ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Fabがそれから発現されるDNA
クローンに対応するこのA−DシリーズのFab異種二量体の名称は、図11A
の左側の欄に示されている。鋳型Fab3b3の軽鎖可変ドメインのアミノ酸残
基配列は、図1の説明で述べたように表示された領域の下に示されている。鋳型
Fabと同一である派生Fabのアミノ酸残基部分は省略記号(〃)で表示され
る。各派生Fabの変異誘発CDRは表示されている。変異誘発軽鎖CDR1を
もつ各派生Fabの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号で配列表に
示されている。このFabは実施例2の記載にしたがって得られた。
図12Aおよび12Bは、図2に示したpMT4−3(配列番号:6)のそれ
と同じ軽鎖である、ファージミド3b3(p3b3)の軽鎖のCDR3を変異誘
発して得られたgp120特異的ヒトFabの可変カッパ軽鎖(VK)ドメイン
のアミノ酸残基配列を示す。Fabがそれから発現されるDNAクローンに対応
する、このH4L3シリーズのFab異種二量体の名称は、図12Aの左側の欄
に示されている。鋳型Fab3b3の軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、
図1の説明で述べたように表示された領域の下に示されている。鋳型Fabと同
一である派生Fabのアミノ酸残基部分は省略記号(〃)で表示される。各派生
Fabの変異誘発CDRは表示されている。変異誘発軽鎖CDR3をもつ各派生
Fabの完全な可変ドメインは、割り当てられた識別番号で配列表に示されてい
る。このFabは実施例2の記載にしたがって得られた。
図13Aおよび13Bは、図11A、11B、13Aおよび13Bで示した先
にCDR1を変異誘発しさらに選別したFabD(配列番号:70)をコードす
るファージミドDの軽鎖CDR3を変異誘発して得たgp120特異的ヒトFa
bの可変カッパ軽鎖(VK)ドメインのアミノ酸残基配列を示す。Fabがそれ
から発現されるDNAクローンに対応する、このQAシリーズのFab異種二量
体の名称は、図13Aの左側の欄に示されている。鋳型FabDの軽鎖可変ドメ
インのアミノ酸残基配列は、図1の説明で述べたように表示された領域の下に示
されている。鋳型Fabと同一である派生Fabのアミノ酸残基部分は省略記号
(〃)で表示される。各派生Fabの変異誘発CDRは表示されている。変異誘
発軽鎖CDR3をもつ各派生Fabの完全な可変ドメインは、割り当てられた識
別番号で配列表に示されている。このFabは実施例3の記載にしたがって得ら
れた。
図14Aおよび14Bは、L42と呼ばれるgp120特異的ヒト複合軽鎖の
可変カッパ軽鎖(VK)ドメインのアミノ酸残基配列を示す。L42軽鎖をコー
ドするためのL42ファージミドは、ファージミドD(図11A、11B、13
Aおよび13Bで示したFabDをコードする)のSacI/KpnIフラグメ
ントをファージミドH4L3−2(図12Aおよび12Bに示したFabH4L
3−2をコードする)のKpnI/XbaIフラグメントに連結して得られた。
L42複合軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、図1の説明で述べたように
表示された領域の下、および配列番号:88として配列表に示されている。L4
2軽鎖は実施例3の記載にしたがって得られた。
図15Aおよび15Bは、H31、H33、H101およびH103と呼ばれ
るgp120特異的ヒト複合重鎖の可変重鎖(VH)ドメインのアミノ酸残基配
列を示す。この複合物は実施例3で述べるように調製された。各複合重鎖可変ド
メインのアミノ酸残基配列は、図1の説明で述べたように表示された領域の下、
および該当配列番号内に示されている。H31として示したものと同一である複
合重鎖可変ドメイン領域のアミノ酸残基部分は、省略記号(〃)で表示される。
変異誘発CDR1およびCDR3は、各々の重鎖複合体について別々に表示され
ている。発明の詳細な説明
A.定義
アミノ酸残基: そのペプチド結合における化学的消化(加水分解)により形
成されるアミノ酸。本明細書に記載されるアミノ酸残基は、好ましくは“L”型
異性体である。しかしながら、当該ポリペプチドが所望の機能的特性を保持する
かぎり、“D”型異性形の残基もいずれのL−アミノ酸残基とも置換可能である
。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を指す。COO
Hは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシ基を指す。標準
的なポリペプチド命名法(J.Biol.Chem.,243:3552-59(1969)に記載され、37
CFR §1.822(b)(2)で採用された)にしたがい、アミノ酸残基の略語を下記の対
応表に示す。
本明細書に提示した全てのアミノ酸残基配列式は、アミノ末端からカルボキシ
末端の通常の向きで左から右の方向性を有することは留意されたい。さらに、“
アミノ酸残基”という用語は、対応表に掲げたアミノ酸、並びに修飾および例外
的アミノ酸(例えば37 CFR 1.822(b)(4)に挙げられたもの、および参照により本
明細書に含まれるもの)を含む広い定義を有する。さらに、アミノ酸残基配列の
最初または最後の棒線は、1つまたは2つ以上のアミノ酸残基をもつ別の配列へ
のペプチド結合、またはアミノ末端基(例えばNH2またはアセチル)もしくは
カルボキシ末端基(例えばCOOH)への共有結合を示すことに留意されたい。
組換え体DNA(rDNA)分子: 2つのDNAセグメントを機能できるよ
うに連結することによって生成されるDNA分子。したがって、組換え体DNA
分子は、天然には通常結合した状態では見出されない、少なくとも2つのヌクレ
オチド配列を含むハイブリッド分子である。共通の生物学的起源をもたない(す
なわち発生的に異なる)rDNA分子は、“異種”であると言う。
ベクター: DNAセグメント(例えば遺伝子またはポリヌクレオチド)が機
能的に連結され、その結果この添付されたセグメントの複製が起こる、細胞内で
自律的に複製できるrDNA分子。1つまたは2つ以上のポリペプチドをコード
する遺伝子の発現を誘導することができるベクターは、本明細書では“発現ベク
ター”と呼ばれる。特に重要なベクターは、mRNAから逆転写酵素を用いて生
成されるcDNA(相補的DNA)のクローニングを可能にする。
レセプター: レセプターは、特異的に(任意ではなく)別の分子に結合する
ことができる分子、例えば蛋白、糖蛋白などである。
抗体: 抗体という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の
免疫学的に活性な部分(すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子)を
指すために本明細書では用いられる。代表的な抗体分子は、完全な免疫グロブリ
ン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の部分
(当該技術分野でFab、Fab’、F(ab’)およびF(v)として知られ
るような部分を含む)である。
抗体結合部位: 抗体結合部位とは、抗原と特異的に結合(免疫的に反応する
重鎖および軽鎖可変領域並びに超可変領域を含む抗体分子の構造部分である。“
免疫的に反応する”ということは、抗原性決定基含有分子と抗体結合部位を含む
分子(例えば完全な抗体分子またはその部分)との間の特異的結合を意味する。
モノクローナル抗体: モノクローナル抗体とは、特定のエピトープと免疫的
に反応することができる、ただ1種の抗体結合部位を含む抗体分子の集団を指す
。したがって、モノクローナル抗体は、典型的にはそれが免疫的に反応するエピ
トープに対してただ1つの結合親和性を示す。それゆえ、モノクローナル抗体は
複数の抗体結合部位をもつ抗体分子を含み、この抗体結合部位の各々は、異なる
エピトープに対して免疫的に特異性を有する可能性がある(例えば二特異性モノ
クローナル抗体)。歴史的にはモノクローナル抗体は、クローンとして純粋な免
疫グロブリン分泌細胞株の永久分裂能付与によって製造されたが、モノクローナ
ル抗体として純粋な抗体分子集団はまた、本発明の方法によっても調製すること
ができる。
合成モノクローナル抗体: “合成”という用語は、“合成モノクローナル抗
体”という組み合わせで用いられる場合は、この抗体は天然には分離されないが
、本明細書に記載されているようにむしろ、クローン化ヒト免疫グロブリン遺伝
子の重鎖および軽鎖可変領域の変異誘発の産物であることを意味する。これによ
って本明細書に開示されているように、免疫特異性、免疫親和性およびHIV中
和活性を付与する特徴的なアミノ酸残基配列を有する人工的抗体が生成される。
融合ポリペプチド: 少なくとも2つのポリペプチド、およびこの2つのポリ
ペプチドを機能的に連結して1つの連続したポリペプチドとする連結配列を含む
ポリペプチド。融合ポリペプチドにおいて連結されたこの2つのポリペプチドは
、典型的には2つの別個の起源に由来し、したがって、融合ポリペプチドは、天
然には通常連結した状態では見出されない2つの連結されたポリペプチドを含む
。
上流: DNA転写の方向と反対の方向で、したがって非コード鎖では5’か
ら3’に向かい、またmRNAでは3’から5’に向かう方向。
下流: 配列の転写または読み取りの方向に向かうDNA配列、すなわちDN
Aの非コード鎖では3’−から5’−、RNA転写物では5’−から3’−に向
かう。
シストロン: アミノ酸残基配列をコードするDNA分子内のヌクレオチド配
列で、上流および下流のDNA発現制御成分を含む。
リーダーポリペプチド: ポリペプチドのアミノ末端にある長さの短いアミノ
酸で、ポリペプチドに内膜を通過させ、または内膜を通過するようにポリペプチ
ドを誘導し、それによって細胞質膜の間隙、おそらくは細胞質膜間隙の外へ最終
的にポリペプチドを分泌させる。リーダー配列ポリペプチドは、ポリペプチドが
活性をもつ前に通常は除去される。
読み枠: 翻訳に用いられる連続したヌクレオチドトリプレット(コドン)の
特定の配列。読み枠は翻訳開始コドンの位置に左右される。
B.合成ヒトモノクローナル抗体
本発明は、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対して特異的で、これを中和す
る合成ヒトモノクローナル抗体に関する。本発明の好ましい実施例では、HIV
蛋白、好ましくはHIV糖蛋白のgp120またはgp160のエピトープポリ
ペプチド配列に結合することができるヒトモノクローナル抗体が開示される。
この合成モノクローナル抗体は、それらはヒトに由来するが、組換え体技術に
よって修飾され、それによって標的抗原に対して強い免疫反応親和性を示す合成
生成物が得られるという点において通常とは異なる。さらに、この合成モノクロ
ーナル抗体は、HIVを中和する強力な能力を有する。HIVを中和するこの能
力は、本明細書で開示するような典型的なインビトロ感染性アッセーで測定した
ときの、HIV懸濁液の感染力価を減少させるために必要な抗体分子の濃度とし
て表される。本発明の合成モノクローナル抗体は、インビトロウイルス感染性ア
ッセーではアッセー培養液1mlにつき100ng未満、好ましくは20ng未
満、より好ましくは10ng未満の抗体濃度でHIV感染力価を50%減少させ
る能力を有する。
本明細書に開示する代表的で好ましい合成モノクローナル抗体は、5−20n
g/mlで有効で、したがってHIVをインビトロおよびインビボで抑制するた
めに適している。
特定のアミノ酸配列を有する抗体もまた開示されるが、この配列は、特定のエ
ピトープに結合し、さらにHIVにこれらの抗体が結合するときウイルスを中和
する能力を抗体に付与する。請求の範囲にいう特異性を有するヒトモノクローナ
ル抗体、および同様な特異性を有する同様なヒトモノクローナル抗体は、HIV
誘発疾患の診断および免疫療法において有用である。
“HIV誘発疾患”という用語は、直接または間接的にHIVによって引き起
こされる一切の疾患を指す。HIV誘発疾患の例は、後天性免疫不全症候群(A
IDS)および、HIV感染によって引き起こされる一般にエイズに付随する多
数の症状である。
したがって、本発明の目的の1つは、HIV中和部位と反応する合成ヒトモノ
クローナル抗体、およびそのような抗体を産生する細胞株である。本発明のモノ
クローナル抗体を産生する細胞株の分離は、さらに本明細書に極めて詳細に開示
されている。本明細書に開示したファージミドベクターライブラリーの方法並び
に、対象となっているモノクローナル抗体の基本的な免疫反応および中和パター
ンを決定することを可能にする通常のスクリーニング技術を用いて、そのような
細胞株の分離は達成できる。したがって、もし被験ヒトモノクローナル抗体がH
IVに結合し、これを中和した場合は、この被験ヒトモノクローナル抗体と本発
明の細胞株によって産生されたヒトモノクローナル抗体は同等であると考えられ
る。
あるヒトモノクローナル抗体が、本発明のモノクローナル抗体のHIV結合を
妨げるか否かを確認することによって、前者が本発明のモノクローナル抗体と同
じ(すなわち同等な)特異性を有するどうかを、過度の実験を行うことなく決定
することもまた可能である。固相gp120抗原に結合させる標準的な競合アッ
セーで本発明のヒトモノクローナル抗体の結合の減少によって示されるように、
被験ヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体と競合する場
合には、この2種のモノクローナル抗体は、同じまたは密接に関連するエピトー
プと結合するという蓋然性が高い。
あるヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を
有するか否かを決定するまた別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、
通常当該抗体と反応するHIVとともに予め保温し、続いて被験ヒトモノクロー
ナル抗体を加えて、この被験ヒトモノクローナル抗体のHIV結合能が抑制され
るか否かを決定するものである。被験ヒトモノクローナル抗体が抑制された場合
は、おそらく当該被験抗体は、本発明のヒトモノクローナル抗体と同じまたは機
能的に同等なエピトープ特異性を有するであろう。本発明のヒトモノクローナル
抗体のスクリーニングはまた、HIV中和アッセーを用い、モノクローナル抗体
がHIVを中和するか否かを調べることによって実施できる。
ウイルス感染の1つまたは2つ以上の段階でHIVを中和することができる能
力は、本発明のヒトモノクローナル抗体の望ましい品質である。ウイルスの中和
は、種々のインビトロおよびインビボの方法によって測定できる。本明細書で開
示される中和能を測定する代表的な方法は、HIV誘発合胞体形成の抑制を測定
するインビトロアッセー、およびHIV感染細胞からのコアp24抗原の産出抑
制を測定するアッセーである。
本明細書に示すように、本発明のヒトモノクローナル抗体の免疫特異性は、H
IVの血清型および/または株間で共有されるエピトープに対するものでもよく
、またエピトープによっては単一のHIV株に特異的であってもよい。したがっ
て、好ましいヒトモノクローナル抗体は、HIV−1、HIV−2または両方と
免疫反応性をもつものでもよく、さらにHIV−1の株、IIIB、MN、RF
、SF−2、Z2、Z6、CDC4、ELIおよび同様な株の1つまたは2つ以
上と免疫的に反応するものでもよい。
特に好ましい実施例では、本方法によって製造された、各々がHIVの多くの
株、特に野外株を中和する能力を示す多数のヒトモノクローナル抗体が開示され
る。本明細書に開示されるように重鎖および/または軽鎖遺伝子のCDR領域の
連続的ランダム化によって、幾つかの異なるHIV野外株を中和することができ
る多数の抗体種が製造された。
したがって、本発明はまた、予め選択された第一のヒト免疫不全ウイルス(H
IV)(例えば実験室株MNまたはIIIB)と免疫反応し、これを中和するこ
とができ、さらに1つまたは2つ以上の他の(第二の)HIV株、特に野外株と
免疫反応しこれを中和することができるヒトモノクローナル抗体を含む。実施例
の示すところによれば、この抗体は、第一のHIV株のインビトロウイルス感染
アッセーでは100ng/ml未満の抗体濃度でHIV感染力価を50%減少さ
せる能力を有し、さらに第二のHIV野外株の感染力価を同じインビトロウイル
ス感染アッセーで約10μg/ml未満の抗体濃度で50%減少させる能力があ
る。より好ましい実施例では特定のウイルス株の場合、感染力価を50%減少さ
せる能力は、もっと低い抗体濃度、例えは1μg/ml以下、好ましくは100
ng/ml以下で示される。
抗体の免疫特異性、そのHIV中和能、および当該抗体がエピトープに対して
示す抗体に付随する親和性は、当該抗体が免疫的に反応するエピトープによって
決まる。このエピトープ特異性は、少なくとも部分的には、この抗体の免疫グロ
ブリンの重鎖の可変領域のアミノ酸残基配列によって、さらに部分的には軽鎖可
変領域のアミノ酸残基配列によって決まる。好ましいヒトモノクローナル抗体は
糖蛋白gp120と免疫的に反応する。
本発明の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号:2、3、4および5
並びにその保存的置換体から成る配列群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領
域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。
本発明の別の好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号:6およびその保
存的置換体の軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を有するモノクロ
ーナル抗体の結合特異性をもつ。
既知の組み合わせライブラリーのシャフリング法およびスクリーニング法を用
いて、HIV中和モノクローナル抗体として機能する新規な重鎖および軽鎖ペア
を同定することができる。特に、本発明にしたがって、HIV中和ヒトモノクロ
ーナル抗体に由来する既知の重鎖を軽鎖のライブラリーとシャフリングして、機
能的な抗体を形成する新規なH:Lペアを同定することができる。同様に、HI
V中和ヒトモノクローナル抗体に由来する既知軽鎖を重鎖ライブラリーとシャフ
リングし、機能的な抗体を形成する新規なH:Lペアを本発明にしたがって同定
することができる。
特に好ましいヒトモノクローナル抗体は、配列番号:2:6、3:6、4:6
および5:6並びにその保存的置換体から成る群から選ばれるペア(H:L)を
形成した重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を有するモ
ノクローナル抗体の免疫反応(結合)特異性を有するものである。コロンをもつ
2つの配列番号、例えば2:6の名称は、それぞれ重鎖および軽鎖の、それぞれ
配列番号:2および配列番号:6に示されるアミノ酸残基配列によって形成され
たH:Lペアの意味を含む。
特に好ましいものは、配列番号:2、3、4または5に示された重鎖配列を有
し、さらに本明細書で述べるように1993年10月19日にATCCに寄託さ
れたpMT4発現ベクターによってコードされる抗体分子MT4に存在する配列
を含むモノクローナル抗体の結合特異性をもつヒトモノクローナル抗体である。
“結合特異性をもつ”とは、同じまたは類似の免疫反応特性および中和特性をを
示し、さらにHIV抗原との結合について競合する同等なモノクローナル抗体を
意味する。
好ましい実施例では、本抗体の免疫親和性は極めて強く、したがって治療的利
用において高い有効性を提供し、さらに診断的利用では低いバックグラウンドと
高い特異性を提供する。この実施例では、上記に述べた中和能に加え、本合成ヒ
トモノクローナル抗体は、約1×10-8Mまたはそれ未満の解離定数(Kd)で
HIVと免疫的に反応する。すなわち、10-8Mより大きい親和性を有する抗体
が特に好ましい。本合成方法によって、Kdとして表した場合10-9から10-12
Mの範囲の親和性をもつ多数のモノクローナル抗体が産出される。
軽鎖または重鎖可変領域またはその両方の配列が、本発明の方法によって修飾
されるかぎり、本発明の好ましい抗体は、好ましい重鎖、軽鎖またはその両方を
含むことができる。したがって、好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列
番号:1、3、54、55、56、57、58、59、89、90、91および
92並びその保存的置換体から成る群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域
のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。さらに、
好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、配列番号:6、69、70、73、7
5、76、77、79、80、82、83、84、85、86、87および88
並びその保存的置換体から成る群から選ばれる軽鎖免疫グロブリン可変領域のア
ミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する。
特に好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、約1×10-9Mから約1×10-10
Mの解離定数を有する。この実施例では、特別に好ましい抗体は、配列番号
:3:6、3:69、3:70、3:73、3:75、3:76、3:77、3
:79、3:80、3:82、3:83、3:84、3:87、54:6、55
:6、56:6、57:6、58:6、59:6、90:88、91:6、91
:88および92:88並びにその保存的置換体から成る群から選ばれる、重鎖
および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列のペアを有するモノクロ
ーナル抗体の結合特異性をもつ。
さらにより好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、約1×10-10Mから約
1×10-11Mの解離定数を有する。この実施例では、特別に好ましい抗体は、
配列番号:3:85、3:86、89:6および90:86並びにその保存的置
換体から成る群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ
酸残基配列のペアを有するモノクローナル抗体の結合特異性をもつ。
より好ましい合成ヒトモノクローナル抗体は、約1×10-11Mから約1×1
0-12Mの解離定数を有する。この実施例では、特別に好ましい抗体は、配列番
号:89:88で示されるものおよびその保存的置換体がペアとなった重鎖およ
び軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列のペアを有するモノクローナ
ル抗体の結合特異性をもつ。特に好ましいものは、ATCC承認番号69691
に含まれるプラスミドpPHO−H31/L42−1によって産生されるモノク
ローナル抗体の結合特異性を有する。
上記の免疫親和性を有する代表的な抗体は実施例で述べる。
本明細書で用いられる“保存的変形”という用語は、別の生物学的に類似する
残基によるアミノ酸残基の置換を指す。保存的変形の例は、1つの疎水性残基(
例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニン)を別のものの代わり
に置換すること、または1つの極性残基を別のものの代わりに置換すること、例
えばリジンの代わりにアルギニン、アスパラギン酸の代わりにグルタミン酸、ま
たはアスパラギンの代わりにグルタミンを置換することなどを含む。“保存的変
形”という用語はまた、置換ポリペプチドがHIVを中和するということを条件
として、未置換親アミノ酸の代わりにアミノ酸を置換することも含む。同様に、
本発明の別の好ましい具体例は、上記の重鎖および/または軽鎖ポリペプチドを
コードするポリヌクレオチド、およびこれらポリヌクレオチド配列に相補的なポ
リヌクレオチド配列に関する。相補的なポリヌクレオチド配列は、厳格なハイブ
リダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチド配列にハイブリダイズする
配列を含む。
本発明のヒトモノクローナル抗体を用いることによって、抗イディオタイプ抗
体を製造することが可能になった。この抗体を用いて、ヒトモノクローナル抗体
をスクリーニングし、それが本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ結合特異性
を有するか否かを同定することができ、さらにまた、このイディオタイプ抗体を
能動的な免疫付与に用いることもできる(Herlynら、Science,232:100(1986))
。そのような抗イディオタイプ抗体は、周知のハイブリドーマ技術を用いて製造
することができる(Kohlerら、Nature,256:495(1975))。抗イディオタイプ抗体
は、対象となっている細胞株によって産生されるヒトモノクローナル抗体上に存
在する固有の決定基を認識する抗体である。これらの決定基は抗体の超可変領域
に位置する。与えられたエピトープと結合するのはこの領域で、したがって、抗
体の特異性をもたらす。抗イディオタイプ抗体は、対象となっているモノクロー
ナル抗体で動物を免疫することによって調製できる。免疫された動物は、免疫に
用いた抗体のイディオタイプ決定基を認識し、これと反応して、これらイディオ
タイプ決定基に対する抗体を生じる。免疫動物の抗イディオタイプ抗体(これは
、第二の動物を免疫するために用いられた、細胞株によって産生された本発明の
ヒトモノクローナル抗体に対して特異的である)を用いることによって、免疫に
用いたハイブリドーマの抗体と同じイディオタイプをもつ他のクローンを同定す
ることが可能になった。2種の細胞株のヒトモノクローナル抗体間のイディオタ
イプの同一性は、それらが同じエピトープ決定基を認識するという点に関して同
じであるということを明らかにする。したがって、抗イディオタイプ抗体を用い
ることによって、同じエピトープ特異性を有する、他のハイブリドーマが発現す
るモノクローナル抗体を同定することが可能である。
また、抗イディオタイプ技術を用いて、エピトープを模倣するモノクローナル
抗体を製造することも可能である。例えば、第一のモノクローナル抗体に対して
作製された抗イディオタイプモノクローナル抗体は、第一のモノクローナル抗体
が結合するエピトープの“外形”である超可変領域の結合ドメインを有するであ
ろう。したがって、抗イディタイプモノクローナル抗体は免疫に用いることが可
能である。なぜならば、この抗イディオタイプモノクローナル抗体の結合ドメイ
ンは抗原として効果的に作用するからである。
好ましい本発明の実施例では、本発明のヒトモノクローナル抗体に由来するF
abフラグメントを含む短縮免疫グロブリン分子が含まれる。Fcレセプターを
欠くこのFabフラグメントは可溶性で、血清半減期に関して治療的に利点をも
たらし、さらに可溶性Fabフラグメントを用いる場合には診断的利点を与える
。可溶性Fabフラグメントの調製は、免疫学分野では一般に知られており、種
々の方法によって達成できる。可溶性Fabフラグメントを製造する好ましい方
法は本明細書で開示される。
ヒトモノクローナル抗体は、特にヒトの治療に用いられるかぎり、ネズミのモ
ノクローナル抗体に較べて際立った利点を提供する。特に、ヒトモノクローナル
抗体は、“外来”抗原のように迅速に血液循環から排除されず、外来抗原および
外来抗体と同じ態様で免疫系を活性化させることはない。
本発明はまた、本方法によって産生される本発明のモノクローナル抗体を1実
施例で示す。
C.免疫的治療方法と組成物
本発明の合成ヒトモノクローナル抗体は、明らかにされた標的抗原に対するそ
の中和活性と強い免疫親和性のゆえに、HIV疾患の免疫療法として用いること
ができる。本発明のモノクローナル抗体と合わせて本明細書で用いられる“免疫
治療として”または“免疫療法”という用語は、治療のための投与と同様予防の
ための投与も示す。したがってこのモノクローナル抗体は、HIV誘発疾患の可
能性および/または重篤性を減少させるためにハイリスク患者に投与でき、さら
に、すでに活発なHIV感染を示している患者またはHIV感染の危険性がある
患者にも投与できる。
1.治療用組成物
本発明は、したがって、本明細書に開示する治療方法を実施するために有用な
治療用組成物を目的とする。本発明の治療用組成物は、生理学的に許容できる担
体を、当該担体中に活性成分として溶解または懸濁させた本明細書で開示する少
なくとも1種のヒトモノクローナル抗体とともに含む。好ましい実施例では、こ
の治療用組成物は、患者に治療目的で投与したとき(特に記載がない場合のよう
に、免疫反応を誘発する目的でないときは)免疫反応を誘発しない。
本明細書で用いられるように、“医薬的に許容可能”または“生理学的に許容
できる”という用語は、それらが組成物、担体、希釈液および試薬について言う
場合は互換的に用いられ、さらに、それら物質が望ましくない生理学的影響(例
えば吐き気、めまい、むかつきなど)を生じることなく患者に投与できることを
示している。
溶解または懸濁された活性成分を含む医薬組成物の調製は、当該技術分野では
よく理解されている。典型的には、そのような組成物は、滅菌された注射可能な
溶液または懸濁液で水性または非水性の何れかとして調製されるが、溶液もしく
は懸濁液に適し、使用前に液状になる個体形状もまた調製できる。
活性成分は、医薬的に許容でき、当該活性成分と適合する賦形剤と、本明細書
に開示する治療方法で使用するために適した量で混合される。適切な賦形剤は、
例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびその組み
合わせなどである。さらに所望される場合には、当該組成物は、少量の補助物質
、例えば湿潤剤もしくは乳化剤、pH緩衝剤など、活性成分の有効性を高めるも
のを含むことができる。
本発明の治療用組成物は、医薬的に許容できる成分の塩を含むことができる。
医薬的に許容可能な塩には酸付加塩(ポリペプチドの遊離アミノ基ともに形成さ
れる)が含まれるが、これらは、無機酸(例えば塩酸または燐酸)または有機酸
(例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸など)を用いて形成される。遊離カルボキシ
ル基とともに形成される塩もまた、無機塩基(例えば水酸化ナトリウム、カリウ
ム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄)および有機塩基(例えばイ
ソプロピルアミン、トリメチルアミン、2−エチルアミノエタノール、ヒスチジ
ン、プロカインなど)から得ることができる。
生理学的に許容できる担体は当該分野で周知である。液状担体の例は、活性成
分と水以外に物質を含まない滅菌水、または緩衝液、例えば生理的pH値でリン
酸ナトリウムを含む滅菌水、食塩水または両方を含む滅菌水(例えば燐酸緩衝食
塩水)である。さらにまた、水性担体は、例えは塩化ナトリウム、塩化カリウム
、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の
溶
質同様に1種以上の緩衝塩を含むことができる。
液状組成物はまた水の他に、または水を排除して液相を含むことができる、そ
のような付加液相の例は、グリセリン、植物油(例えば綿実油)、有機エステル
(例えばオレイン酸エチル)および水中油滴乳濁液である。
治療用組成物は、本発明のHIV中和ヒトモノクローナル抗体を、典型的には
全治療用組成物の重量に対して少なくとも0.1重量%の量で含む。重量%は、
全組成物に対する抗体の重量による比率である。したがって、例えば0.1重量
%は、全組成物100グラム当たり0.1グラムの抗体である。
2.治療方法
本発明のヒトモノクローナル抗体の明らかなHIV中和能に基づき、HIVを
インビトロまたはインビボで中和する方法が提供される。この方法は、HIVを
含むと考えられるサンプルを、治療的に有効量の本発明のヒトモノクローナル抗
体を含む組成物と接触させることを含む。好ましい治療的有効量は、本明細書に
開示したインビトロアッセーで測定したとき、感染性を50%、好ましくは90
%、より好ましくは99%減少させるために十分な量である。
インビボでの薬剤使用では、本方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を含
む生理学的に許容できる組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。し
たがって、本発明は、免疫療法として有効量の本発明のヒトモノクローナル抗体
を患者に投与することを含む、ヒトのHIV疾患に対する受動的免疫療法を実施
例で開示する。
本受動的免疫治療方法を実施するための代表的な患者は、エイズまたはHIV
によって引き起こされたと考えられる関連症状を含むHIV誘発疾患の徴候を示
している全ての患者、およびHIV感染の危険性がある(すなわち感染防止のた
めの予防的処置)全ての人間である。HIV感染の危険性がある患者には、HI
V感染妊婦の乳児、HIVを含むことが分かった輸液を受けた者、HIV汚染針
を使用した者、HIV感染者との感染の危険性の高い性交渉を行った者、および
同様な危険性のある状況が含まれる。
ある実施例では、この受動免疫の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体を
1種以上含む組成物を投与することを含む。これらの抗体は、受動免疫治療の有
効性を高めるために好ましくは非競合エピトープに対する抗体、またはHIVの
異なる血清型もしくは株に対する抗体である。
治療的に(免疫療法的に)有効量のヒトモノクローナル抗体は、所望の効果を
達成するように、すなわちサンプル中または患者に存在するHIVを中和するよ
うに、したがってサンプル中または患者の検出可能なHIV量を減少させるよう
計算された予め決定された量である。インビボの治療の場合、有効量は、患者に
認められるHIV誘発疾患に付随する1つまたは2つ以上の徴候の改善、または
HIV抗原の血清学的減少によって測定できる。
したがって、本発明のモノクローナル抗体の投与のための投与量範囲は、HI
V疾患の徴候が軽減し、または感染の可能性が減少する所望の効果をもたらすた
めに十分多いものである。投与量は、副作用(例えば過粘稠度症候群、肺水腫、
うっ血性心不全など)を生じるほど多くてはいけない。一般に、投与量は、患者
の年令、状態、性別および症状の程度によって左右され、当該技術分野で習熟し
た者によって決定される。
投与量は、個々の医師が合併症の有無にしたがって調整できる。
本発明の抗体の治療的に有効な量は、典型的には、生理学的に許容できる組成
物として投与されたとき、約0.1μg/mlから約100μg/ml、好まし
くは約1μg/mlから約5μg/ml、通常は約5μg/mlの血漿濃度を達
成するために十分な抗体量である。別の表現をすれば、投与量は、約0.1mg
/kgから約300mg/kg、好ましくは約0.2mg/kgから約200m
g/kg、最も好ましくは約0.5mg/kgから約20mg/kgで変動可能
で、1日1回もしくは2回以上で1日または数日間の投与である。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、注射または時間をかけた緩徐な輸液によ
って非経口的に投与できる。HIV感染は典型的には全身的であり、したがって
、治療用組成物の静脈注射が最も頻繁な処置であるが、標的組織が感染性HIV
を含む可能性が高い場合は他の組織または薬剤送達手段も考えられる。したがっ
て、本発明のヒトモノクローナル抗体は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、髄腔
内、経皮的に投与でき、さらに蠕動性手段によって送り込むことができる。
本発明のヒトモノクローナル抗体を含む治療用組成物は、通常は静脈内に、例
えば一回分の単位投与量の注射として投与できる。本発明の治療用組成物に関し
て用いられる場合は、“単位投与量”という用語は、患者に対して一定量の投薬
として適切な物理的に限定された単位量を指し、各単位量は、必要な希釈剤(す
なわち担体または賦形剤)とともに所望の治療効果を生じるように計算した予め
定められた量の活性物質を含む。
この組成物は投与製剤に適合した態様で、さらに治療的に有効な量で投与され
る。投与されるべき量は、治療されるべき患者、活性成分を利用する患者の身体
機構の能力、および所望される治療効果の程度に左右される。投与に必要な活性
成分の正確な量は、臨床医の判断に依存し、各個人に固有である。しかしながら
、全身投与のための適切な投与範囲は本明細書に開示されるが、それは投与経路
に依存する。適切な投与方法はまた様々であるが、典型的な方法は、最初の投与
から1時間または2時間以上の間隔で続いて注射または他の投与が反復される。
また別には、インビボ治療のために特定された範囲で血中濃度を維持するために
十分な連続静脈内輸液も考えられる。
有効量のモノクローナル抗体投与の補助として、患者の血中のモノクローナル
抗体を検出する診断方法が、投与された治療用組成物の消長を調べるために有用
である。
本発明はまた、HIV疾患の免疫治療に用いられる、本発明のモノクローナル
抗体を含む医薬または医薬組成物を調製する方法に関する。
D.診断用アッセー方法
本発明はまた、サンプル(例えば生物学的液体または組織サンプル)中のHI
Vの存在、および好ましくは量を決定する種々のアッセー方法を目的とする。こ
れらの方法は、サンプル中のHIVの量と直接または間接的な関連を有する免疫
反応生成物を形成させるために、免疫化学試薬として本発明のヒトモノクローナ
ル抗体を用いる。
本発明の免疫化学試薬を用いてインビトロまたはインビボで免疫反応生成物(
その量は体サンプル中に存在するHIVの量と相関する)を形成させる、化学的
な臨床診断方法が多数知られていることは、当業者には理解されるところであろ
う。したがって、代表的なアッセー方法は本明細書で開示されるが、一方、本
発明はそれに限られるものではない。
種々の混成および非混成プロトコール(競合的または非競合的)が、本発明の
アッセー方法を実施するために用いられる。本発明のモノクローナル抗体を利用
することができる免疫アッセータイプの例は、直接または間接形式の競合おとび
非競合免疫アッセーである。そのような免疫アッセーの例は、放射性免疫アッセ
ー(RIA)およびサンドイッチ(免疫計量)アッセーである。本発明のモノク
ローナル抗体を用いた抗原の検出は、進行、逆行または同時検出式の、生理学的
サンプルの免疫組織化学的アッセーを含む免疫アッセーを用いて実施できる。当
業者には、他の免疫アッセー様式を見出すことができるであろうし、また多くの
実験を実施することなく容易にそれらを判別することも可能であろう。
本発明のモノクローナル抗体は多くの異なる担体に結合させることが可能で、
HIVの存在を検出するために利用することができる。周知の担体の例には、ガ
ラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン
、アミラーゼ、天然および修飾セルロース、ポリアクリルアミド、アガロース並
びに磁鉄鉱が含まれる。担体の性状は、当該発明の目的により可溶性でも不溶性
でもよい。当業者には、モノクローナル抗体を結合させる他の適切な担体も見出
すことができるであろうし、また多くの実験を実施することなく容易にそれらを
判別することも可能であろう。
当業者の知る種々の異なる標識および標識方法が存在する。本発明で用いるこ
とができる標識の種類の例には、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド
金属、化学発光化合物および生物発光化合物が含まれる。当業者には、本発明の
モノクローナル抗体に結合させるその他の適切な標識を見出すことができるであ
ろうし、また通常の実験を用いて容易にそれらを確認することも可能であろう。
さらに、本発明のモノクローナル抗体へのこれら標識の結合は、当業者にとって
一般的な標準的技術を用いて実施することができる。
本発明の目的のためには、HIVは、それが生物学的液体および組織に存在す
る場合は、本発明のモノクローナル抗体によって検出できる。検出可能量のHI
Vを含むいずれのサンプルも使用可能である。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液
、血液、血清などの液体でもよく、また組織や糞便などの固形物もしくは半固形
物
でもよい。また別に、組織学的診断で一般的に用いられる固形組織でもよい。
より高い感度が得られる別の標識技術は、抗体を低分子ハプテンに共役させる
ことから成る。これらのハプテンは、続いて第二の反応手段によって特異的に検
出できる。例えば、ビオチン(これはアビジンと反応する)、ジニトロフェノー
ル、ピリドキサールまたはフルオレセイン(これは特異的な抗ハプテン抗体と反
応する)のようなハプテンを用いることが一般的である。
本発明のモノクローナル抗体はインビトロの使用に適している。例えば、上記
で述べたようにサンプル中のHIVを検出するために、これら抗体を液相で利用
することができるか、または固相担体に結合させることができる免疫アッセーで
の使用が適している。これら免疫アッセーのモノクローナル抗体は、インビトロ
で使用するために検出可能なように種々の方法で標識できる。
抗原をインビボで検出するために本発明のヒトモノクローナル抗体を用いる場
合、検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体は、診断的に有効な投
与量で与えられる。“診断的に有効な”という用語は、検出できるように標識さ
れたヒトモノクローナル抗体が、当該抗体がそれに対して特性を有するHIV抗
原部位の検出を可能にするために十分な量で投与されることを意味する。
検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体の投与濃度は、バックグ
ラウンドに比較してHIVへの結合が検出可能なように十分なものでなければな
らない。さらに、検出できるように標識されたモノクローナル抗体は、最良の標
的/バックグラウンドシグナル比をもたらすように迅速に循環系から排除される
ことが望ましい。
一般に、検出できるように標識されたヒトモノクローナル抗体のインビトロ診
断用投与量は、個々人の年令、性別および症状の程度にしたがって変動するであ
ろう。ヒトモノクローナル抗体の投与量は、約0.01mg/m2から約500m
g/m2、好ましくは約0.1mg/m2から約200mg/m2、最も好ましくは
約0.1mg/m2から約10mg/m2で変動する。そのような投与量は、例え
ば複数注射が行われるか否か、さらに組織および当業者に既知の他の因子に左右
されて変動することがある。
診断のためのインビボ画像化については、利用可能な検出装置の種類は、与え
られる放射性同位元素を選択する場合の主要な因子である。選択される放射性同
位元素は、与えられた装置の種類が検出可能な崩壊型をもたなければならない。
インビボ診断のために放射性同位元素を選択する場合のまた別の重要な因子は、
放射性同位元素の半減期が、標的取り込みが最大の時になお検出できるほど十分
に長くなければならず、しかも患者にとって有害な放射線が最小になるように、
十分短くなければならないということである。理想的には、インビボ画像化のた
めに用いられる放射性同位元素は、粒子放出を欠くが、通常のγ線カメラで容易
に検出できる大量の光量子を140−250KeVの範囲で生じる。
インビボ診断では、放射性同位元素は、直接または介在官能基を用いて間接的
に免疫グロブリンに結合させることができる。金属性イオンとして存在する放射
性同位元素に結合させるためにしばしば用いられる介在官能基は、二官能基性キ
レート剤、例えばジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)およびエチレンジア
ミン四酢酸(EDTA)および類似の分子である。本発明のモノクローナル抗体
に結合させることができる典型的な金属性イオンの例は、111In、97Ru、67
Ga、68Ga、72As、89Zrおよび201Tlである。
インビボ診断のために、例えば磁気共鳴画像化(MRI)または電子スピン共
鳴(ESR)の場合は、本発明のモノクローナル抗体はまた常磁性同位元素で標
識できる。一般に、診断用画像を可視化する通常のいずれの方法も利用すること
ができる。通常は、γ線および陽電子放出放射性同位元素がカメラ画像化用に、
常磁性同位元素がMRI用に用いられる。そのような技術に特に有用な元素には
、157Gd、55Mn、162Dy、52Crおよび56Feが含まれる。
本発明のヒトモノクローナル抗体は、HIV疾患の治療過程をモニターするた
めにインビトロおよびインビボで用いることができる。したがって、例えば、H
IV感染細胞の数の増減、または体内もしくは種々の体液に存在するHIVの濃
度の変化を測定することによって、HIV疾患を改善することを目的とした特定
の治療方法が有効か否かを決定することが可能であろう。
E.診断系
本発明はまた、本明細書に開示する診断方法にしたがってサンプル中のHIV
の存在を調べるために、診断系(好ましくはキット形態)を開示する。診断系は
、
少なくとも1回のアッセーを実施するために十分な量の本題のヒトモノクローナ
ル抗体を別個に包装した試薬として含む。
別の実施例では、診断系は、例えば治療的に投与された抗体の消長をモニター
するために、体液中の抗HIVモノクローナル抗体の存在を調べることを目的と
する。この診断系には、少なくとも1回のアッセーを実施するために十分な量の
コントロール試薬としての本題の抗体、および好ましくは予め選択された量のH
IV抗原が各々別個に包装された免疫化学試薬として含まれる。
典型的には包装された試薬の使用説明もまた含まれる。
“使用説明”は、典型的には試薬の濃度、または少なくとも1種類のアッセー
方法の指標、例えば混合される試薬とサンプルの相対量、試薬/サンプルの混合
物の維持時間、温度、緩衝液の条件などを説明する重要な表現を含む。
体液中のHIVを検出する実施例では、本発明の診断系は、本発明のヒトモノ
クローナル抗体を含む免疫複合体の形成を知らせることができる標識または表示
手段を含むことができる。
ここで使用される語“複合体”は、特異的結合反応たとえば抗体- 抗原反応の
生成物に関する。例としての複合体は免疫反応生成物である。
ここで使用されるように、これらの様々な文法的形における用語“標識物”お
よび“指示手段”は、複合体の存在を示すための検出可能なシグナルの生成に直
接または間接的のいずれかで関係する一つの原子および分子である。標識物また
は指示手段のいずれも、発現したたんぱく質、ポリペプチド、または本発明の抗
体もしくはモノクロナール抗体組成物の一部である抗体分子と結合しているかま
たは含まれているか、または別々に使用され、そしてこれらの原子もしくは分子
は単独でまたは別の薬剤と共に使用されうる。このような標識物はそれ自体臨床
的診断化学でよく知られており、そしてこれらが他の点では新しいたんぱく質方
法および/またはシステムで利用される限りにおいてのみ、本発明の一部を構成
する。
標識手段は、これらを変性することなく抗体または抗原と化学的に結合して有
用な免疫蛍光トレーサーである蛍光クロム(染料)を形成する蛍光標識剤である
。好適な蛍光標識剤は蛍光クロムたとえばフルオレセインイソシアネート(FIC)
、
フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、5-ジメチルアミン- 1-ナフタレンス
ルホニルクロリド(DANSC)、テトラメチルローダミンイソチオシアネート(TRITC)
、リスサミン、ローダミン8200 スルホニルクロリド(RB 200 SC)などである。
免疫フルオレセイン分析技術の記載は、デルカ(DeLuca)、“Immunofluorescence
Analysis”、Antibody As a Tool,マルシャロニスら(Marchalonis et al.)編
、ジョン ウィリー アンド サンズ社(John Wiley & Sons,Ltd.)、p.189-231
(1982)に見られ、これはここに参考として編入される。
好ましい実施態様において、指示群は、酵素たとえばホースラディッシュペル
オキシダーゼ(HRP)、グルコースオキシダーゼ等である。基本的指示群が酵素た
とえばHRP またはグルコースオキシダーゼであるような場合、レセプターリガン
ド複合体(免疫反応物)が形成されている事実を視覚化するために他の試薬が必
要である。HRP に対するこのような他の試薬は、過酸化水素および酸化染料前駆
体たとえばジアミノベンジジンである。グルコースオキシダーゼとともに有効な
別の試薬は、2,2'- アミノ- ジ-(3- エチル- ベンゾチアゾリン- G-スルホン酸
)(ABTS)である。
放射性元素もまた有用な標識剤であり、ここに説明的に使用される。例として
の放射性標識剤は、γ線を放出する放射性元素である。これ自身でたとえば124I
、125I、128I、132Iおよび51Crのようなγ線を出す元素は、γ線放出- 放射性元
素指示基の一群を表す。特に好ましいのは125Iである。有用な標識手段の別の群
は、たとえばそれ自身で陽電子を放出する11C 、18F 、15O および13N のような
元素である。このようにして放出された陽電子は、動物の体に存在する電子に遭
遇するとγ線を作る。β線エミッターもまた有用である。
標識物の結合、すなわちポリペプチドおよびたんぱく質の標識化は当該技術に
おいてよく知られている。たとえば、ハイブリドーマにより作られた抗体分子は
、培養基中で成分として提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝による取り
込みにより標識化されうる。たとえば、ガルフリーら(Galfre et al.)、Meth.E
nzymol.,73:3-46(1981)を参照せよ。活性化官能基を介したたんぱく質結合また
はカップリングの技術は特に利用可能である。たとえば、アウラミスら(Auramea
s et al.)、Scand.J.Immunol.,Vol.8(別冊)、7:7-23(1978),ロッドウェ
ルら(Rodwell et al.)、Biotech.,3:889-894(1984)および米国特許第4,493,795号
を参照せよ。
診断システムはまた、好ましくは別の包装体として、特異的結合剤を含むこと
もできる。“特異的結合剤”は、本発明の試薬種またはこのような種を含む複合
体と選択的に結合しうるがしかしこれ自体は本発明のポリペプチドまたは抗体分
子組成物ではない分子本体である。特異的結合剤の例は、第二の抗体分子、これ
らの補体たんぱく質またはフラグメント、S.aureusたんぱく質A などである。好
ましくは、特異的結合剤は、試薬種が複合体の一部として存在する場合この種と
結合する。
好ましい実施態様において、特異的結合剤は標識化される。しかしながら、診
断システムが標識化されていない特異的結合剤を含む場合、この特異的結合剤は
一般に増幅手段または試薬として使用される。これらの実施態様において、標識
化特異的結合剤は増幅手段が試薬種含有複合体と結合している場合増幅手段と特
異的に結合することができる。
本発明の診断キットは、血管性体液サンプルたとえば血液、血清または血漿に
おいて本発明のAPC 阻害剤の量を検出するための“ELISA”フォーマットに使用
される。“ELISA”は、固相に結合した抗体または抗原および酵素- 抗原または
酵素- 抗体結合体を使用してサンプルに存在する抗原を検出し計量する酵素結合
イムノソルベントアッセイに関するものである。ELISA 技術の記載は、1982年に
カリフォルニア州、ロスアルトス(Los Altos)のランゲ メディカル パブリケ
ーションズ(Lange Medical Publications)により刊行されたディ.ピィ.サイ
テスら(D.P.Sites et al.)によるBasic and Clinical Immunology、第4 版、22
章および米国特許第3,654,090 号、同第3,850,752 号および同第4,016,043 号に
記載されており、これらはすべて参考としてここに編入される。
すなわち、幾つかの実施態様において、本発明のヒトモノクロナール抗体は、
固体マトリックスに固定されて対象となる診断システムにおいて包装体を含む固
体支持体を形成することができる。
試薬は一般に水性基剤からの吸着により固体支持体へ固定されるがしかし当業
者が熟知しているたんぱく質およびポリペプチドへ適用可能な固定の他のやり方
を行うこともできる。
有用な固体マトリックスもまた当該技術で良く知られている。このようなマト
リックスは、水不溶性であり、ファルマシア ファイン ケミカルズ(Pharmacia
Fine Chemicals)(ニュージャージー州、ピスキカタウェイ(Piscataway))によ
り登録商標セファデックス(SEPHADEX)として市販されている架橋したデキスト
ラン;寒天;イリノイ州、ノースシカゴ(North Chicago,IL)のアボット ラボラ
トリーズ(Abbott Laboratories)から入手可能な直径約1 ミクロンから約5mm の
ポリスチレンビーズからなるビーズ;ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリ
アクリルアミド、ニトロセルロース- またはナイロン系不織布たとえばシート、
ストリップもしくはパッドレス;またはたとえばポリスチレンもしくはポリ塩化
ビニルで作られたチューブ、プレートもしくは微量滴定板の凹部などである。
ここに記載したいずれかの診断システムの試薬種、標識化された特異的結合剤
または増幅試薬は、溶液において分散液または実質的に乾燥粉末として、たとえ
ば凍結乾燥形で提供される。指示手段が酵素の場合、酵素の基質もまたシステム
の別の包装体として提供される。固体支持体たとえば前記した微量滴定板および
一つ以上の緩衝剤もまたこの診断分析システムにおいて別の包装体として含まれ
うる。
診断システムと関連してここで検討した包装材料は、診断システムに通常利用
されるものである。
用語“包装”とは、固体マトリックスまたは材料で、たとえばガラス、プラス
チック(たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリカーボネート)、
紙、ホイルなど、決まった範囲内で診断試薬たとえば本発明のモノクロナール抗
体を保持しうるものに関する。すなわち、たとえば包装は瓶、バイアル、プラス
チックおよびプラスチック- ホイル積層容器(envelope)もしくは意図する診断
試薬を含むために使用される同様な容器であるかまたはこれは意図する診断試薬
の微量を操作により固定するすなわち検出すべき抗体またはポリペプチドが免疫
学的に結合しうるように連結した微量滴定板凹部でもよい。
本発明の分析に使用される物質は、キットの製造に実際に適する。このような
キットは、たとえば厳重に密閉されたバイアル、チューブ等の容器一つ以上に受
け取るために細分化された担体手段であって、容器手段の各々は方法に使用され
る別々の要素の一つを含む。たとえば、容器手段の一つは、検出可能に標識化さ
れたまたはされうる本発明のヒトモノクロナール抗体を含む。キットはまた診断
方法を行うために使用される他の前記免疫化学的試薬のいずれかを含んでもよい
。
F. 合成HIV ヒトモノクロナール中和抗体を作る方法
本発明は、新規合成HIV ヒトモノクロナール中和抗体を作る方法を記載するも
のである。この方法は一般に、様々な供給源から作られることができ、そして天
然ライブラリー、変性ライブラリー、HIV 特異的免疫反応を示すヒトドナーから
直接作られるライブラリーを含む抗体分子の組み合わせライブラリーの使用に基
づく。
組み合わせライブラリーの製造および操作方法は文献に広い範囲で記載されて
おり、ここで詳細に検討はしないが、ただし本発明独自の実施態様を作りそして
使用するために必要な特徴については例外である。しかしながら、この方法は一
般に、ライブラリーの抗体種をクローニングしそして発現するための糸状ファー
ジ(ファージミド(phagemid))表面発現ベクターシステムの使用を含む。組み合わ
せライブラリーを作るための様々なファージミドクローニングシステムが他に記
載されている。たとえば、ファージミドにおける組み合わせ抗体ライブラリーの
製造については、次のものを参照せよ:カンら(Kang e tal.)、Proc.Natl.
Acad.Sci.,USA,88:4363-4366(1991);バルバスら(Barbas et al.)、Proc.N
atl.Acad.Sci.,USA,88:7978-7982(1991);ゼベディら(Zebedee et al.)、Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3175-3179(1992); カンら、Proc.Natl.Acad.S
ci.,USA,88:11120-11123(1991); バルバスら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA
,89:4457-4461(1992); およびグラムら(Gram et al.)、Proc.Natl.Acad.
Sci.,USA,89:3576−3580(1992); その記載は参考としてここに編入される。
一つの実施態様において、方法は、HIV 感染ドナーからのドナー免疫細胞メッ
センジャーRNA を用いてヒトモノクロナール抗体のファージミドライブラリーを
最初に作ることを含む。ドナーは、AIDSの兆候を示してもよいが、しかし好まし
い実施態様ではドナーは兆候を示さず、したがって得られるライブラリーは実質
的にHIV 中和ヒトモノクロナール抗体のより高い値を含む。
他の実施態様において、ドナーは、HIV に対する免疫反応に関して純粋であり
、すなわちドナーはHIV に感染していない。これに代わって、出発ライブラリー
は合成であるかまたは他の抗原に対する免疫反応を有するドナーから導いてもよ
い。
ヒトモノクロナール抗体のファージミドライブラリーを作る方法は、一般に、
(1)ライブラリーに対する供給源としてヒト免疫グロブリン遺伝子を使用してベ
クターをクローニングすることにおいて別々にH およびL 鎖コード遺伝子を作り
、(2)H およびL 鎖コード遺伝子ライブラリーを、ヘテロ二量体抗体分子を発現
し構成することのできる一つのジシストロン発現ベクターと組み合わせ、(3)糸
状ファージ粒子の表面において構成したヘテロ二量体抗体分子を発現し、(4)予
め選択した抗原に対するファージ粒子のパンニング(panning)のような免疫親
和技術を用いて表面に発現したファージ粒子を単離し、これにより予め選択した
抗原と免疫反応する抗体分子を形成する粒状H およびL 鎖コード遺伝子を含むフ
ァージミドの一つ以上の種を単離することを含む。
ここに記載した例として、得られるファージミドライブラリーを操作して、ラ
イブラリーのモノクロナール抗体の免疫特異性を増加および/または変更し、“
合成”抗体と言われる本発明の別の好ましいヒトモノクロナール抗体を作り、次
いで同定する。なぜなら、これはヒトから直接得られないが、しかし合成操作に
従ってヒト抗体から誘導されるからである。これに代わり、特定の予め選択され
たモノクロナール抗体を操作してここに別に記載したように優れた性質を有する
合成抗体を得ることができる。
たとえば、重(H)鎖および軽(L)鎖免疫グロブリン分子コード遺伝子は、ランダ
ムに混合(shuffled)され、組み立てた免疫グロブリン分子において新しい HL対
を作りだす。さらに、H およびL 鎖コード遺伝子のいずれかまたは両方は、免疫
グロブリンポリペプチドの可変領域の一つ(またはそれ以上)の相補的測定領域
(CDR)において突然変異誘発され、次いで好ましい免疫反応および中和化能力に
ついてスクリーニングする。
一つの実施態様において、H およびL 鎖を、ここに記載した“二型(binary)”
システムとして言及される、別々のモノシストロン発現ベクターへクローニング
することができる。この方法において、上記(2)工程は、H およびL 鎖コード遺
伝子の組み合わせが二つの二型プラスミドを表面受入れ可能な抗体ヘテロ二量体
分子を有するファージミドの発現および組立のために一つの宿主細胞へ導入する
ことにより生じる点で異なる。
本発明方法において、抗体分子はモノクロナールてあり、なぜならクローニン
グ方法は抗体製造細胞列のクローン的に純粋な種の組成を可能にするからである
。更に、モノクロナール抗体は、H およびL 鎖コード遺伝子がヒト免疫グロブリ
ン産生免疫細胞たとえば脾臓、胸線、骨髄等から得られるものから誘導されるの
で、ヒトからである。
HIV ヒトモノクロナール中和抗体を作る方法はまた、予め選択されたHIV 抗原
と免疫反応する得られる抗体ライブラリーが中和能力を測定するためにここに記
載されている分析の一つ以上においてHIV を中和するための能力を有する抗体種
の存在についてスクリーニングすることが必要である。すなわち、HIV 抗原と結
合する抗体分子、好ましくはgp160,gp120,gp160 のV3ループ領域、またはgp120
のCD4結合部位の好ましいライブラリーを最初に作り、次いでここに記載したよ
うにHIV 中和抗体の存在についてスクリーニングする。
別のライブラリーは、別のHIV-免疫反応性およびヒトモノクロナール中和抗体
について混合ライブラリーからスクリーニングすることができる。
本発明の別の特徴として、抗体分子のH およびL 鎖コード遺伝子のヌクレオチ
ドおよび相当するアミノ酸残基配列が核酸配列決定により測定される。主なアミ
ノ酸残基配列の情報は抗体分子のエピトープ反応性について重要な情報を提供す
る。
本発明の合成ヒトモノクロナール抗体は、モノクロナール抗体の重鎖および軽
鎖をコードするポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列を変えることにより作
られる。たとえば、特定部位突然変異誘発により、発現ベクターのヌクレオチド
配列を変え、これにより得られた発現アミノ酸残基の配列において変化をもたら
すことができる。すなわち、たとえば配列番号:2のアミノ酸残基配列を、相当
する核酸の突然変異を介して配列番号:3のアミノ酸残基へ転化することができ
る。同様に、公知ポリヌクレオチドをランダム突然変異によりこれをランダムに
変え、変えたポリヌクレオチドを発現システムヘ再導入しそして続いてHIV 中和
活性についてのH:L 対の生成物をスクリーニングする。
特定部位およびランダム突然変異誘発方法は、ポリヌクレオチド技術でよく知
られており、対象ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を変えるための方法とし
て制限するものではない。
免疫親和性により分離された抗体におけるファージ粒子の存在のために、一つ
の実施態様は、ファージミドベクターを含む宿主大腸菌細胞により可溶性Fab フ
ラグメントが分泌されるように免疫グロブリンコード遺伝子を切り取るために得
られるクローン化遺伝子の操作に関連する。すなわち、得られる操作したクロー
ン化免疫グロブリン遺伝子は可溶性Fab を産生し、これは、エピトープ結合研究
についてELISA 分析において、公知の抗- HIV 抗体分子との競合分析において、
およびHIV 中和分析において直ちに特性決定される。可溶化Fab は比較および特
性決定研究のために再生産可能なそして比較可能な抗体調製を提供する。
可溶性Fab の調製は、一般に、免疫学的技術において記載され、そして実施例
において記載したように実施されうるか、またはブルトンら(Burton et al.)、P
roc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:10134−10137(1991)に記載されているように行
われる。
さらに、よく知られているように、Fab をさらに処理して、Fcを定義するポリ
ペプチド配列を再度付け加えることにより機能的 Fc 領域を含む抗体分子全体を
直ちに作ることができる。1.抗- HIV モノクロナール抗体を発現するためのファージ表示発現ベクターおよ びポリヌクレオチド
本発明のヒトモノクロナール抗体の調製は、一実施態様において、ここで記載
した組み合わせ抗体ライブラリーーを調製するために使用されるベクターをクロ
ーニングしそして発現することによる。クローニングした免疫グロブリンの大き
いおよび小さい鎖遺伝子はラムダベクター、ファージミドベクターおよびプラス
ミドベクターの間でここに記載した方法の様々な段階にて混ぜることができる。
ファージミドベクターは、構成した糸状ファージ粒子の表面に発現される融合
たんぱく質を作る。ファージ表示(display)ベクターを使用すると、発現した表
示たんぱく質の非常に大きな集団をスクリーニングしこれにより所望の結合反応
をコードする一つ以上の特定クローンの位置を突き止める手段を提供することに
より特に有利である。ファージ表示を使用すると、本発明の複数の種が迅速で再
現性良く分離される。たとえば、四個の抗体が本発明の一つの実施例で産生され
た。
ファージ表示ベクターの使用は、ファージミドに基づく抗体分子の組み合わせ
ライブラリーのすでに記載した使用から導かれる。組み合わせライブラリーーの
産生および操作方法は文献において非常に広範囲に記載されており、ここで詳細
には検討しないが、ただし本発明独自の実施態様を作り使用するために必要な特
徴は除く。しかしながら、方法は一般に、ライブラリーの抗体種をクローニング
し発現するための糸状ファージ(ファージミド)表面発現ベクターシステムの使
用を含む。組み合わせライブラリーを作るための様々なファージミドクローニン
グシステムは他にも記載されている。たとえば、ファージミドにおける組み合わ
せ抗体ライブラリーの調製は、以下の文献に記載されたようなものである:カン
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:4363-4366(1991);バルバスら、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,88:7978−7982(1991); ゼベディら、Proc.Natl.Acad.Sci
.,USA,89:3175−3179(1992); カンら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,88:11
120−11123(1991);バルバスら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:4457−4461
(1992); およびグラムら、Proc.Natl.Acad.Sci.,USA,89:3576−3580(1992
); これらの記載は参考としてここに編入される。
本発明のファージミドベクターは、アミノからカルボキシ末端の方向に向かっ
て、(1)原核生物分泌シグナルドメイン、(2)免疫グロブリンの大きいまたは小さ
い鎖可変領域を定義する非相同ポリペプチド、および(3)糸状ファージ膜アンカ
ードメインを含む融合ポリペプチドをコードしそして発現しうるヌクレオチド配
列を含む組み換え体DNA(rDNA)である。ベクターは融合ポリペプチド、好ましく
は原核生物対照配列を発現するDNA 発現対照配列を含む。
糸状ファージ膜アンカーは好ましくは、糸状ファージ粒子のマトリックスと結
合することのできるcpIII またはcpVIIIコートたんぱく質のドメインであり、こ
れによりファージ表面上に融合ポリペプチドを組み込む。
ベクターに対する好ましい膜アンカーは、糸状ファージMl3,fl,fdおよび同等
の糸状ファージから得られうる。好ましい膜アンカードメインは、遺伝子III お
よび遺伝子VIIIによりコードされるコートたんぱく質において見出される。糸状
ファージ膜たんぱく質の膜アンカードメインは、好ましくはコートたんぱく質の
カルボキシ末端領域の一部であり 脂質二重層膜にまたがる疎水性アミノ酸残基
の領域および膜の細胞質面で通常見出され膜から延びる帯電アミノ酸残基の領域
を含む。
ファージflにおいて、遺伝子VIIIコートたんぱく質の膜間領域は残基Trp-26か
らLys-40 までを含み、細胞質領域は41から52のカルボキシ- 末端11残基を含む(
オーカワら(Ohkawa et al.),J.Biol.Chem.,256:9951-9958,1981)。例と
しての膜アンカーは、cpVIIIの残基26から40からなる。すなわち、好ましい膜ア
ンカードメインのアミノ酸残基配列は、M13 糸状ファージ遺伝子VIIIコートたん
ぱく質(これもまたcpVIIIまたはCP8 と指定される)から誘導される。遺伝子VI
IIコートたんぱく質はコートたんぱく質の一般的には約2500から3000のコピーを
有するファージ粒子の大部分にわたって成熟糸状ファージに存在する。
さらに、別の好ましい膜アンカードメインのアミノ酸残基配列は、M13 糸状フ
ァージ遺伝子III コートたんぱく質(これもまたcpIII と指定される)から誘導
される。遺伝子III コートたんぱく質はコートたんぱく質の一般的には約4 から
6 のコピーを有するファージ粒子の一端部において成熟糸状ファージに存在する
。
糸状ファージ粒子の構造、これらのコートたんぱく質および粒子構成体の詳細
な記載については、次の文献を参照せよ:ラチェッドら(Rached et al.)、Mi
crobiol.Rev.,50:401-427(1986);モデルら(Model et al.)、“The Bacteriop
hages:Vol.2”、アール.カレンダー(R.Calendar)編、Plenum Publishing Co
.,p.375-456(1988)。
分泌シグナルは、グラム陰性菌の原形質膜に対してたんぱく質を攻撃するたん
ぱく質のリーダーペプチドドメインである。好ましい分泌シグナルは、pe1B分泌
シグナルである。エウニア カロトバ(Erwinia carotova)からの二つのpe1B遺伝
子生成物変種からの分泌シグナルドメインの予測されるアミノ酸残基配列は、レ
イら(Lei et al.)、Nature,331:543-546(1988)に記載されている。
pe1Bたんぱく質のリーダー配列は、融合たんぱく質に対する分泌シグナルとし
てこれまで使用されてきた(ベターら(Better et al.)、Science,240:1041-
1043(1988);サストリーら(Sastry et al.)、Proc.Natl.Acad.Sci.,US
A,86:5728−5732(1989); ムリナックスら(Mullinax et al.)、Proc.Nat
l.Acad.Sci.,USA,87:8095−8099(1990))。
別の好ましい分泌シグナルは、ompA分泌シグナルである。大腸菌からのompA遺
伝子生成物からの分泌シグナルドメインの予測されるアミノ酸残基配列は、モッ
バら(Movva et al.)、J.Mol.Biol.,147:317−328(1980)に記載されている。
ompAたんぱく質のリーダー配列は、スケッラら(Skerra et al.)、Science,24
0: 1038-1041(1988)による融合たんぱく質に対する分泌シグナルとしてこれまで
使用されてきた。
本発明に有用な大腸菌からの他の分泌シグナルポリペプチドドメインに対する
アミノ酸残基配列は次のものに記載されている:オリバー(Oliver),Escherichia
coli and Salmonella Typhimurium,ニードハード、エフ.シィ.(Neidhard,F.C
.)編、American Society for Microbiology,Washington,D.C.,1:56-69(1987)
。
DNA 発現対照配列は、構造遺伝子生成物を発現するための一連のDNA 発現シグ
ナルからなり、そしてよく知られているように、シストロンが構造遺伝子生成物
を発現することができるように、シストロンへ作動的に結合した5'および3'の単
位を両方とも含む。5'対照配列は、転写を開始するプロモーターおよび上流の翻
訳可能なDNA 配列の5 ´末端で作動的に結合したリボソーム結合部位を定義する
。
3 ´対照配列は、非相同融合ポリペプチドと作動的に結合して形成したフレー
ムにおいて少なくとも一つの停止(ストップ)コドンを定義する。
好ましい実施態様において、利用されるベクターは、複製またはレプリコンの
原核生物起点を含み、すなわち自己複製を行いそしてこれで形質転換された原核
生物宿主細胞たとえば細菌宿主細胞において染色体外組み換えDNA 分子を維持す
ることができる。このような複製の起点は、当該技術で良く知られている。好ま
しい複製の起点は、宿主微生物において有効なものである。好ましい宿主細胞は
大腸菌である。大腸菌にベクターを使用するために、好ましい複製の起点は、pB
R322および他の通常のプラスミドの変種に見られるCo1E1 である。また好ましく
は、pACYCpおよびその誘導体に見られる複製のp15A起点である。Co1E1 およびp1
5Aレプリコンは、分子生物学で非常に広範囲に使用されており、これは様々なプ
ラスミドにおいて利用可能であり、少なくとも次のものに記載されている:サム
ブロックら(Sqambrook et al.)、“Molecular Cloning:a Laboratory Manual”
,2 版,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)。
Co1E1 およびp15Aレプリコンは、二つの“二型”プラスミドを利用する本発明
の一実施態様において使用するのに特に好ましい。なぜなら、これらは各々大腸
菌においてプラスミドの複製を行うことができ、一方で他のレプリコンは同じ大
腸菌の第二のプラスミドに存在するからである。換言すれば、Co1E1 およびp15A
は、同じ宿主において二つのプラスミドの維持を可能にする非- 干渉性レプリコ
ンである(たとえば、サムブルックら、“Molecular Cloning:a Laboratory Man
ual”2 版、Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)、p.1.3-1.4)。この特
徴は、二型ベクターを使用した場合に特に重要であり、なぜなら、たとえば第一
のベクターが大きい鎖のポリペプチドを発現し第二のベクターが小さい鎖のポリ
ペプチドを発現する場合、ファージ複製を許す一つの宿主細胞が二つの別々のベ
クターの別々の同時複製を維持しなければならないからである。
さらに、原核生物レプリコンを含む実施態様は、これで形質転換された細菌宿
主に対しその発現により選択的利点、たとえば薬剤耐性を与える遺伝子を含むこ
とができる。代表的細菌性薬剤耐性遺伝子は、アンピシリン、テトラサイクリン
、ネオマイシン/ カナマイシンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を付与
するものである。ベクターはまた一般的には翻訳可能なDNA 配列の挿入のために
都合のよい制限部位を含む。このようなベクターの例は、プラスミドpUC8,pUC9
,pBR322および pBR329 であり、これらはカリフォルニア州、リッチモンドのバ
イオラド ラボラトリーズ(BioRad Laboratories)から入手でき、そしてニュー
ジャージィー州ピッツカタウェイのファルマシアからはpPL およびpKK223が入手
できる。
ここで使用されるように、用語“ベクター”は、異なった遺伝的環境の間を、
これが作動的(operatively)に結合している他の核酸まで移動しうる核酸分子に
関する。好ましいベクターは、自己複製することができそしてこれが作動的に結
合しているDNA セグメントに存在する構造遺伝子生成物の発現ができるものであ
る。したがってベクターは、好ましくは前記したようなレプリコンおよび選択可
能な標識物を含む。
DNA 配列またはセグメントに関しここで使用されているように、“作動的に結
合した”とは、配列またはセグメントが、通常のリン酸ジエステル結合により、
一重鎖または二重鎖形に係わらず、DNA の一つのストランドへ共有結合により結
合していることを意味する。本発明の転写単位またはカセットが作動的に結合し
たベクターの選択は、当該技術でよく知られているように、所望の機能的性質、
たとえばベクター複製、たんぱく質発現および形質転換される宿主細胞に依存す
るが、これらは組み換えDNA 分子を構築する技術において特有の制限である。
好ましい実施態様において、DNA 発現ベクターは、本発明の技術にしたがって
ゲノムを封入した糸状ファージ粒子の形で通常の操作のためにデザインされる。
この実施態様において、DNA 発現ベクターはさらに、複製の糸状ファージ起点を
定義するヌクレオチド配列を含み、これによりベクターーが、適当な遺伝子相補
性を示した時、一重鎖ストランド複製形の糸状ファージとして複製しそして糸状
ファージ粒子へ包装されうる。この特徴はDNA 発現ベクターがファージ粒子へ包
装される能力を提供し、そしてここに含まれるベクターがファージ粒子の集団を
含む他の粒子から離れる。
複製の糸状ファージ起点は、よく知られているように、複製の開始、複製の終
結および複製により作られる複製可能形体の包装に対する部位を定義するファー
ジゲノムの領域である(たとえば、ラスチェドら(Rasched et al.,Microbiol.Re
v.50: 401-427,1986; およびホリウチ(Horiuchi)、J.Mol.Biol.,188:215-2
23,1986)。本発明に使用するための複製の好ましい糸状ファージ起点は、複製
のM13,fl またはfdファージ起点である(ショートら(Short et al.)、Nucl.Ac
ids Res.16:7583-7600,1988)。
本発明のファージミド表示たんぱく質をクローニングし発現するための好まし
いDNA 発現ベクターは、ジシストロンプラスミド発現ベクターpComb3,pComb3H-T
T pPHO-TTおよびpMT4-3である。pComb3H-TTおよび pPHO-TTの全ヌクレオチド配
列をそれぞれ配列番号:43および51における配列リストで示す。
遺伝子コードおよびこれに付随する重複のために、多数のポリヌクレオチド配
列は意図する大または小鎖免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列をコードす
るようにデザインされる。すなわち、本発明は、遺伝子コードの重複の特徴を組
み入れた変更したポリヌクレオチド配列を意図するものである。
本発明のファージミドおよび発現ベクターは、様々な方法で製造されうる。ベ
クターは好ましいベクターの開示した全ヌクレオチド配列を用いて成分の一部か
ら構成されてもよいし、または存在するベクターを選択的に修飾することにより
誘導してもよい。他の方法も、当業者にとって明らかであり、したがって、ベク
ターの製造および処理方法は本発明を限定するものと考えるべきではない。
本発明のヒトモノクロナール抗体を作るための発現ベクターーが抗体の発現と
適合する宿主細胞に保持される限りにおいて、本発明はこの発明のベクターーま
たはポリヌクレオチドを含む宿主細胞を意図する。好ましい宿主細胞はここに記
載したように大腸菌である。
本発明のファージミド表示たんぱく質を作るために使用される好ましい発現ベ
クタープラスミドpMT4-3は、ここに記載したように、メリーランド州、ロックヴ
ィレのアメリカン タイプ カルチャー コレクション(ATCC)で、ブダペスト
条約の要求に従って、1993年10月19日にpMT4の形で寄託された。
用語“pMT4-3”は、遺伝子3 膜アンカーが存在する特定のファージミド発現ベ
クターに関し、用語“pMT4”は、同じベクターであるが但し遺伝子3 膜アンカー
が除去されて発現したFab が実施例に記載のように可溶性であるようなものに関
する。
ポリヌクレオチドがヒトモノクロナール抗体大および小鎖免疫グロブリン可変
領域アミノ酸残基配列を作るためのDNA発現ベクターの成分の一部であるかぎり
、本発明はまたこのような大および小鎖配列をコードする分離したポリヌクレオ
チドをも意図するものである。
2. オリゴヌクレオチド
この発明の合成ヒト抗体分子を形成するためのクローン化免疫グロブリンの修
飾には、クローン化免疫グロブリン遺伝子の予め選択されたドメインに無作為突
然変異を導入するように設計された合成オリゴヌクレオチドの使用が関与する。
さらに、ここに記述されるオリゴヌクレオチド法には、変質オリゴヌクレオチド
を用いることにより、単一の反応で異なる結合部位の巨大なポピュレーションが
創出される特別な利点がある。
この方法の1つにおいて用いられる好ましいオリゴヌクレオチドの一般的な構
造を以下にさらに記述する。
本発明において用いられるオリゴヌクレオチドは、周知の様々な化学反応によ
って合成することができる。“Oligonucleotide Synthesis: A Practical Appro
ach”、M.J.Gait編、JRL Press、ニューヨーク、NY(1990)が優秀な書評誌で
ある。適切な合成法には、例えば、ホスホトリエステル又はホスホジエステル法
が含まれる。これらについては、Narangら、Meth.Enzymol.、68:90、(1979
);米国特許4、356、270 号:及びBrown ら、Meth.Enzymol.、68:109、(1979
)を参照のこと。プライマー伸長及びPCR反応で用いるための合成されたオリ
ゴヌクレオチドの精製は周知である。例えば、Ausubel ら、“Current Protocol
s in Molecular Biology”、Jhon Wiley & Sons、ニューヨーク、(1987)を参
照のこと。例示合成は実施例に記述されている。
3. プライマー伸長反応
プライマー伸長によって合成されるプライマー、プローブ及び核酸断片もしく
は分節に関してここで用いられる“ポリヌクレオチド”という用語は、2以上、
好ましくは3より多いデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含んで
なる分子であると定義される。その正確なサイズは多くの因子に依存するであろ
うし、その因子はまた、使用の最終条件に依存する。
ここで用いられる“プライマー”という用語は、核酸制限分解から精製された
ものであろうと、あるいは合成によって生成したものであろうと、核酸鎖に相補
的なプライマー伸長生成物の合成が誘発される条件下におかれた場合、すなわち
、ヌクレオチド及び重合の作用物質、例えばDNAポリメラーゼ、逆転写酵素等
の存在下、並びに適切な温度及びpHにおかれた場合に、核酸合成の開始点とし
て
作用し得るポリヌクレオチドを指す。このプライマーは、最大の効率を得るため
には好ましくは一本鎖であるが、代わりに二本鎖の形態であってもよい。二本鎖
である場合には、伸長生成物の調製に用いる前に、まずプライマーを処理してそ
の相補鎖から分離する。好ましくは、プライマーはポリデオキシリボヌクレオチ
ドである。プライマーは、重合の作用物質の存在下において伸長生成物の合成を
開始するに十分な長さでなければならない。プライマーの正確な長さは、温度及
びプライマーの源を含む多くの因子に依存するであろう。例えば、標的配列の複
雑さによって、ポリヌクレオチドプライマーは、より少ない数のヌクレオチドで
あってもよいのであるが、典型的には15ないし25、もしくはそれ以上のヌクレオ
チドを含む。短いプライマー分子は、テンプレートとの十分に安定なハイブリッ
ド複合体を形成するために、一般により低い温度を必要とする。
ここで用いられるプライマーは、合成もしくは増幅される特定の配列の各々の
異なる鎖に“実質的に”相補的であるように選択される。これは、プライマーが
、その各々のテンプレート鎖と選択的にハイブリダイズするに十分な相補性を有
していなければならないことを意味する。したがって、プライマー配列は、テン
プレートの正確な配列を反映していても、いなくてもよい。例えば、非相補的な
ヌクレオチド断片が、配列の残りの部分がこの鎖に実質的に相補的なプライマー
の5’末端に付着することが可能である。このような非相補的な断片は、典型的
には、エンドヌクレアーゼ制限部位をコードする。あるいは、プライマー配列が
、合成もしくは増幅される鎖の配列と選択的にハイブリダイズするに十分な相補
性を有しており、それによってポリヌクレオチド合成条件の下で伸長生成物が形
成されるのであれば、非相補的な塩基もしくはより長い配列をこのプライマーの
所々に挿入することもできる。
本発明のプライマーは、DNA依存RNAポリメラーゼプロモータ配列または
その相補鎖を含んでいてもよい。例えば、Krieg ら、Nuc.Acids Res.、12:70
57-70(1984);Studier ら、J.Mol.Biol.、189:113-130(1986);及びMol ecular Cloning: A Laboratory Manual,Second Edition
、Sambrook ら編、Co
ld Spring Harbor、NY(1989)を参照のこと。
DNA依存RNAポリメラーゼプロモータを含むプライマーが用いられる場合
には、このプライマーを増幅されるポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズさせ、E.Coli
DNAポリメラーゼI、又はE.Coli DNAポリメラーゼのクレノウ断
片を用いることでDNA依存RNAポリメラーゼプロモータの第2 のポリヌクレ
オチド鎖を完成させる。出発ポリヌクレオチドは、RNAポリヌクレオチドとD
NAポリヌクレオチドの生成を交互に行うことにより増幅される。
プライマーは、テンプレート配列又はRNA指向性RNAポリメラーゼの複製
開始部位を含んでいてもよい。典型的なRNA指向性RNAポリメラーゼには、
Lizardi ら、Biotechnology 、6:1197-1202(1988)に記述されるQBレプリカ
ーゼが含まれる。RNA指向性RNAポリメラーゼは、テンプレート配列又は複
製開始部位を含む少数のテンプレートRNA鎖から多数のRNA鎖を生成する。
Kramerら、J.Mol.Biol.、89:719-736(1974)に記述されているように、こ
れらのポリメラーゼによって、典型的には、テンプレート鎖の100万倍の増幅が
得られる。
プライマーのヌクレオチドの選択は、結合部位が導入される、表示タンパク質
(display protein)遺伝子の領域からの核酸上の距離、あらゆる第2 のプライ
マーに対する核酸上のハイブリダイゼーション部位のような因子に依存する。
PCR反応は、あらゆる適当な方法を用いて行われる。一般には、PCR反応
は、緩衝水溶液、すなわち、好ましくはpH7−9、最も好ましくは8のPCR
バッファー中で起こる。好ましくは、モル過剰量のプライマーをテンプレート鎖
を含むバッファーに加える。このプロセスの効率を向上させるためには、プライ
マー対テンプレートが約104:1のモル大過剰量であることが好ましい。
また、PCRバッファーには、全てプライマー伸長(ポリヌクレオチド合成)
反応に適当な量のデオキシリボヌクレオチド三リン酸塩dATP、dCTP、d
GTP及びdTTP、並びに典型的には温度安定性のポリメラーゼも含まれる。
得られた溶液(PCR混合液)を、約1 ないし10分間、好ましくは約4 分間、摂
氏約90度(90℃)ないし100 ℃に加熱する。この加熱期間の後、溶液を、プライ
マーハイブリダイゼーションに適当な54℃に冷却する。この合成反応は、室温か
ら、それより上ではポリメラーゼ(誘発作用物質)がもはや効率的に機能しない
温度で起こり得る。このため、例えばDNAポリメラーゼを誘発作用物質として
用いた場合には、一般にこの温度は約40℃以下である。例としてのPCRバッフ
ァーには以下のものが含まれる:バッファー100 マイクロリットル(μl)当り
、50ミリモル(mM)KCl;10mMトリス−HCl;pH8.3;1.5 mM M
gCl2;0.001 %(重量/容量)ゼラチン;200 マイクロモル(μM)dAT
P;200 μM dTTP;200 μM dCTP;200 μM dGTP;及び2.5
ユニツトのThermus aguaticus DNAポリメラーゼI(米国特許4、889、818 号
)。
誘発作用物質は、酵素を含めて、プライマー伸長生成物の合成を遂行する機能
を果たすいかなる化合物またはシステムであってもよい。この目的に適切な酵素
には、例えば、E.coli DNAポリメラーゼI、E.coli DNAポリメラーゼI
のクレノウ断片、T4DNAポリメラーゼ、他の利用可能なDNAポリメラーゼ
、逆転写酵素、及び、熱安定性酵素を含めて、核酸鎖の各々に対して相補的なプ
ライマー伸長生成物を形成するための正しい様式でのヌクレオチドの組み合わせ
を容易にする他の酵素が含まれる。一般に、この合成は各プライマーの3’末端
で開始され、合成が終了するまでテンプレート鎖に沿って5’方向に進行し、異
なる長さの分子を生成する。しかしながら、5’末端で合成を開始し、上記プロ
セスを用いて上の方向に進行する誘発作用物質も存在し得る。
また、誘発作用物質は、酵素を含めて、RNAプライマー伸長生成物の合成を
遂行する機能を果たす化合物またはシステムであってもよい。好ましい態様にお
いては、この誘発作用物質は、T7 RNAポリメラーゼ、T3 RNAポリメ
ラーゼもしくはSP6 RNAポリメラーゼのようなDNA依存RNAポリメラ
ーゼであってもよい。Chamberlinら、The Enzymes 、P.Boyer編、PP.87-108、
Academic Press、ニューヨーク(1982)に記述されているように、高ターンオー
バ率のRNAポリメラーゼは出発ポリヌクレオチドを増幅する。T7 RNAポ
リメラーゼの他の利点は、Joyce ら、Nuc.Acids Res.、17:711-722(1989)
に既述されているように、cDNAのある部分を1以上の突然変異誘発性オリゴ
デオキシヌクレオチド(ポリヌクレオチド)で置換し、この部分的に組み合わせ
が不適切なテンプレートを直接転写することにより、ポリヌクレオチド合成に突
然変異を導入できることである。転写に基づく増幅システムは、PCR Protocols, A Guide to Methods and Application
、pp.245-252、Academic Press、Inc.
、
サンディエゴ、CA(1990)にGingerasらによって記述されている。
誘発作用物質がDNA依存RNAポリメラーゼであり、したがってリボヌクレ
オチド三リン酸塩が組み込まれている場合には、十分な量のATP、CTP、G
TP及びUTPをプライマー伸長反応混合液に添加し、得られた溶液を上述の通
り処理する。
新たに合成された鎖及びその相補核酸鎖は、PCRとして知られるこのプロセ
スの次工程において用いることができる二本鎖分子を形成する。
PCRは、典型的には、サーモサイクリング(thermocycling)、すなわち、
下限が約10℃ないし約40℃、かつ上限が約90℃ないし約100 ℃の温度範囲内でP
CR反応混合液の温度の上昇及び下降を繰返すことにより行われる。この上昇及
び下降は連続的なものであってもよいが、好ましくは、各々の温度がポリヌクレ
オチド合成、変性及びハイブリダイゼーションに有利な相対的温度安定期を有す
る段階的なものである。
PCR増幅法は、米国特許4、683、192 号、4、683、202 号、4、800 、159 号及び
4、965、188 号、並びに“PCR Technology: Principles and Applications for DN
A Amplification”、H.Erlich 編、Stockton Press、ニューヨーク(1989);
及び“PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications”、Innis ら編、
Academic Press、サンディエゴ、カリフォルニア(1990)を含む少なくともいく
つかのテキストに詳細に記述されており、これらの教示は参照することによりこ
こに組み込まれる。
オリゴヌクレオチド及びこの発明の方法を用いる好ましいPCR反応は、実施
例に記述されている。
4. 合成抗体の生成方法
本発明は、モノクローナル抗体又はこの発明のモノクローナル抗体のライブラ
リーの多様性を変化させる方法を提供する。これらの方法は一般にライブラリー
の多様性を増大させ、それにより、所望の、かつ改良された結合活性及びHIV
−中和活性についてスクリーニングを行うエピトープ結合複合体候補のプールを
増加させる。あるいは、この方法は、エピトープ結合複合体のクラスを増加させ
ることに向けることもできる。このクラスは、典型的には、予め選択された抗原
もしくは抗原群に存在する特定のエピトープもしくはエピトープ系統群に結合す
る能力によって定義される。
合成モノクローナル抗体を生成する方法は、一般に、(1)ここに記述されて
いるオリゴヌクレオチドを用いるプライマー伸長によってファージミド表示タン
パク質ベクターにコードされている免疫グロブリン可変遺伝子の予め選択された
部分に突然変異誘発によって無作為突然変異を導入し、各々ファージミド表面表
示タンパク質上に現れる異なるモノクローナル抗体を発現し得る表示ベクター(
display vector)の大きなポピュレーションを形成し、(2)糸状ファージ粒子
表面上に表示タンパク質及び抗体を発現させ、及び(3)予め選択された標的分
子に対するファージ粒子のパンニングのような親和性技法を用いて表面発現ファ
ージ粒子を単離し、それによって予め選択された標的分子に結合する合成モノク
ローナル抗体を含むファージミドの1種以上を単離することに関与する。
例としての、免疫グロブリン重鎖のCDR3領域における結合部位の調製が実
施例に記述されている。関心のある結合部位を発現し得る特定のベクターの単離
は、糸状ファージ遺伝子の発現及びファージ粒子の組立てが可能な宿主細胞にジ
シストロニック(dicisrtonic)発現ベクターを導入することに関与する。典型
的には、宿主はE.coli である。その後、ファージミド発現ベクターを有する宿
主細胞にヘルパーファージゲノムを導入し、ファージ粒子の組立てに必要な遺伝
的な補足を行う。得られた宿主細胞を培養して導入されたファージ遺伝子及び表
示タンパク質遺伝子を発現させ、さらにファージ粒子を組み立てて宿主細胞から
脱落させる。次いで、脱落したファージ粒子を宿主細胞培養培地から回収(収集
)し、所望の結合特性についてスクリーニングする。典型的には、回収した粒子
を予め選択した分子との結合について“パンニング”する。次に、強く結合する
粒子を収集し、粒子の個々の種をコロニーによって単離して、標的分子に対する
結合性及びHIV中和についてさらにスクリーニングする。所望の結合特性と中
和能力の抗体分子を生成するファージを選択する。
本発明のさらなる特徴付けとして、この結合部位をコードするヌクレオチド及
び対応するアミノ酸残基の配列が核酸配列決定法によって決定される。一次アミ
ノ酸残基配列の情報によって結合部位の反応性に関する本質的な情報が得られる
。
核酸の突然変異は様々な手段で発生させることができるが、本発明のPCR法
の最中に,PCR反応によって発生させることが最も好都合である。周知の通り
、PCR突然変異誘発は無作為のものでも、特定のヌクレオチド配列を指向する
ものでもよい。無作為突然変異誘発に有利な条件下でPCRを行うことは以前に
記述されており、“エラー傾向のあるPCR(error prone PCR)”と呼ばれて
いる。同様に、指向性突然変異誘発は、特定のタイプの突然変異をヌクレオチド
配列の特定の領域に狙いを定めて導入するように設計されたPCRプライマーの
使用に関与する。
態様の1つにおいて、本発明は、本発明のエピトープ結合複合体ポリペプチド
に存在する抗体可変ドメインの相補性決定領域(CDR)のPCR指向性突然変
異誘発によって、1以上のエピトープ結合複合体の多様性を増加することを目論
んでいる。CDR突然変異誘発は、以前に、ネズミ抗体のCDR領域にヒトの配
列を導入することによる抗体の“ヒト化”について一般的な用語で記述されてい
る。欧州特許出願 EP 239400を参照のこと。
このように、本発明は、本発明のDNAベクターに存在するクローン化免疫グ
ロブリン遺伝子の免疫学的特異性を変える突然変異誘発法を目論んでいる。この
方法は、免疫グロブリン遺伝子の予め選択されたCDRにおける指向性突然変異
誘発であって、標的CDRを有するクローン化免疫グロブリン遺伝子を含む組換
えDNA分子(rDNA)をCDRの予め選択された領域の増幅に適したPCR
条件に処することを包含する突然変異誘発を提供する。この方法においては、r
DNA分子を、増幅PCR生成物を生成することが知られているPCRプライマ
ー対の第1のプライマーを構成するPCRプライマーオリゴヌクレオチドであっ
て、予め選択されたCDRから誘導されるものの上記PCRプライマーのヌクレ
オチド配列を含む下記プライマーを含むPCR条件に処する。このPCR増幅条
件における第2のオリゴヌクレオチドは、ここに記述されているように、突然変
異誘発を受ける免疫グロブリンから誘導されるいかなるPCRプライマーであっ
てもよい。
以下に記述されるように、本発明のオリゴヌクレオチドを用いる方法が好まし
い。
したがって、関連する態様においては、免疫グロブリン遺伝子の相補性決定領
域(CDR)に突然変異を誘発するポリメラーゼ連鎖反応(PCR)におけるプ
ライマーとして有用なオリゴヌクレオチドが目論まれている。このオリゴヌクレ
オチドは3’及び5’末端を有し、さらに(1)免疫グロブリン遺伝子の第1フ
レームワーク領域とハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列をその3
’末端に含み、(2)免疫グロブリン遺伝子の第2フレームワーク領域とハイブ
リダイズすることができるヌクレオチド配列をその5’末端に含み、かつ(3)
免疫グロブリン遺伝子の第1及び第2フレームワーク領域の間に存在するCDR
へのPCR中の突然変異誘発に適しており、それによってCDRに突然変異を生
成させるヌクレオチド配列をその3’末端と5’末端との間に含んでいる。
免疫グロブリン遺伝子が、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の両者に、各々個別の
フレームワーク領域で分離されている3つのCDRを有する限りにおいて、標的
CDRに隣接するフレームワーク領域とハイブリダイズするように上記5’及び
3’ヌクレオチド配列を選択することにより、上記の例が特定のCDRへの突然
変異の導入に容易に適用可能であることが理解される。したがって、上記第1及
び第2フレームワーク配列は、重鎖もしくは軽鎖のいずれかのCDR1、CDR
2もしくはCDR3に隣接する保存領域であればよい。
突然変異誘発を受けるオリゴヌクレオチドの3’及び5’末端ヌクレオチド配
列の長さは、その長さがハイブリダイズさせようとする標的フレームワーク配列
に相補的なヌクレオチドの広がりを提供するのであれば、周知の長さの範囲内で
変化させることができる。3’末端ヌクレオチド配列の場合には、十分な長さと
、突然変異を誘発させようとするCDRに対して3’に位置する、ハイブリダイ
ズさせようとする標的フレームワーク領域に対する相補性とを有しており、かつ
プライマー伸長反応を開始するための3’ヒドロキシル末端を提供しなればなら
ない。5’末端ヌクレオチド配列の場合には、十分な長さと、突然変異を誘発さ
せようとするCDRに対して5’に位置する標的フレームワーク領域であって、
完全な免疫グロブリン重鎖及び軽鎖を組立てるために上記PCR重複伸長反応に
おいてハイブリダイズするための手段を提供するフレームワーク領域に対する相
補
性とを有していなければならない。
CDRに隣接するフレームワーク領域は免疫学分野において十分に特徴付けら
れており、この明細書の他の部分に記述されているように、周知のヌクレオチド
配列及びコンセンサス配列が含まれる。単一の予め選択された免疫グロブリン遺
伝子が突然変異を受ける場合には、特定のCDRに隣接する、フレームワークが
定義された配列が知られており、もしくはヌクレオチド配列決定プロトコルによ
って容易に決定することができる。可能な限りの免疫グロブリン遺伝子が突然変
異を受ける場合には、この明細書の他の部分に記述されているように、フレーム
ワークから誘導された配列は好ましくは保存される。
好ましくは、3’及び5’末端ヌクレオチド配列の長さは、それらの長さが正
確かつ反復可能なハイブリダイゼーションを保証するために必要ではないとして
も、各々少なくとも6ヌクレオチドの長さであり、50ヌクレオチドもしくはそれ
以上の長さまでであってもよい。12ないし30ヌクレオチドの範囲の長さ、典型的
には約18ヌクレオチドであることが好ましい。
CDRの突然変異誘発に適した、3’及び5’末端の間に位置するヌクレオチ
ド配列は、上記方法によって新規の配列が組み込まれるのであれば、いかなるヌ
クレオチド配列であってもよい。しかしながら、本発明のアプローチは、突然変
異を受けるCDRにおいてランダム化もしくはほぼランダム化されたヌクレオチ
ドを定義する冗長配列の集団を用いて、単一のPCR反応で突然変異が誘発され
たCDRの大集団を生成する手段を提供する。
CDR1の突然変異誘発に好ましいオリゴヌクレオチドには、例えば、5’か
ら3’に向かって式A−B−Cで表されるヌクレオチド配列が含まれる。ここで
、A及びBはそれぞれFR1及びFR2に相補的な核酸配列を表し、Bは式[N
NS]n(ここで、Nは独立にいかなるヌクレオチドでもよく、SはGもしくは
C、nは3 ないし約24)を有する核酸配列を表し、FR1及びFR2はそれぞれ
CDR1の5’及び3’末端に隣接するフレームワーク領域である。好ましくは
、nは5 である。
同様に、CDR3の突然変異誘発に好ましいオリゴヌクレオチドには、例えば
、5’から3’に向かって式C−D−Aで表される、CDR3のセンス(コード
)
鎖に相補的なヌクレオチド配列が含まれる。ここで、A及びCはそれぞれFR3
及びFR4に相補的な核酸配列を表し、Dは式[MNN]n(ここで、Nは独立
にいかなるヌクレオチドでもよく、MはCもしくはA、nは3 ないし24)を有す
る核酸配列を表し、FR3及びFR4はそれぞれCDR3の5’及び3’末端に
隣接するフレームワーク領域である。好ましくは、nは4 である。
このように、本発明は、糸状ファージ粒子のライブラリーの多様性を増大させ
る方法であって、a)本発明による1 以上の糸状ファージ粒子を用意する工程、
及びb)DNA発現ベクターを有する用意されたファージ粒子の各々に存在する
、免疫グロブリン可変ドメインをコードするヌクレオチド配列に突然変異を誘発
して、各々突然変異が誘発された免疫グロブリン可変ドメインヌクレオチド配列
を有するファージ粒子のライブラリーを形成する工程を具備する方法を目論んで
いる。
この用意には、突然変異誘発PCR反応の準備に核酸を単離するために、ライ
ブラリーのファージ粒子のゲノムを操作することが含まれ得る。PCR反応に用
いるためのファージゲノム単離のためのファージライブラリーの操作は、この明
細書の他の部分に記述されている。
合成モノクローナル抗体を含むファージのライブラリーを形成するための、C
DRの予め選択された部分への突然変異誘発に続いて、本発明は、エピトープ結
合複合体の予め選択されたクラスを富化することによる、ライブラリーの多様性
を変化させる操作に関与する。これらのプロセスは、一般に、予め選択された抗
原を結合し得る、ライブラリー中のファージ粒子の親和性選別に関与する。親和
性選別、すなわちパンニングのプロセスは、実施例に詳細に記述されている。
関連する態様において、本発明は、糸状ファージ粒子のライブラリーの多様性
を変化させる方法であって、a)本発明による糸状ファージ粒子のライブラリー
を用意する工程、b)用意されたライブラリーを予め選択されたリガンドと、ラ
イブラリーの構成要素がこのリガンドに結合し、かつリガンド−ファージ粒子複
合体を形成するに十分な条件下で、接触させる工程、及びc)複合体中のファー
ジ粒子を非結合ライブラリー構成要素から単離して、予め選択されたリガンドに
対する結合特異性を有するファージ粒子を含む、リガンド富化ライブラリーを形
成する工程を具備する方法を目論んでいる。
好ましい態様において、この予め選択されたリガンドは固体支持体に固定され
ており、リガンド−ファージ粒子複合体はこの固相に形成される。この態様はさ
らに、i)接触工程の後に固体支持体を洗浄して固体支持体から非結合ライブラ
リー構成要素を濯ぐ工程、及びii)固体支持体から固相結合ファージ粒子を溶出
する工程を具備する。溶出されたファージ粒子を収集し、それによって、富化さ
れたライブラリーを含む単離ファージ粒子を形成する。
溶出は、リガンド−エピトープ結合複合体の相互作用を破壊する、様々な条件
の下で行うことができる。典型的な条件には、高塩濃度又は低pHバッファーが
含まれる。pHが約1 ないし5 、好ましくはpHが約2 ないし3 のバッファーが
特に好ましい。あるいは、過剰量の予め選択されたリガンドを含む溶出バッファ
ーを用いる競合によって相互作用を破壊することもできる。両溶出手順は、実施
例に記述されている。
関連する態様では、突然変異によるライブラリーの多様性の増加、並びに予め
選択されたリガンドに対するエピトープ結合複合体の親和性を“熟成”するため
のパンニングによるライブラリーの富化の両者の特徴が組合わせられる。このよ
うに、ライブラリーの多様性を変化させる本発明の方法を用いて、新規の結合特
異性、及びより潜在的な結合特異性を展開させることが可能である。
これらの方法の組合わせは、熟練した実行者には明らかなように、様々なやり
方で設計することができる。例えば、ライブラリーを単離し、突然変異を誘発さ
せ(多様性)、次いで特定の結合活性についてスクリーニングする(富化)する
ことができる。あるいは、ライブラリーから特定の活性について富化し、特定の
エピトープ結合複合体に突然変異を誘発させ、突然変異誘発によって生成したラ
イブラリーをさらに富化することもできる。
このテーマに基づく他の順列においては、cpIII −及びcpVIII誘導膜アン
カーをベースとするライブラリー間の、それら固有の価の相違による相違を利用
することができる。cpIII 誘導膜アンカーを有するファージのライブラリーは
、典型的には各ファージ粒子の表面上に僅か1 ないし4 コピーのエピトープ結合
複合体しか持たないため、このファージは比較的“低い”価の結合複合体を提示
す
る。これが1 つ。対照的に、cpVIII誘導膜アンカーを有するファージのライブ
ラリーは、典型的には各ファージ粒子の表面上に20ないし100 コピーのエピトー
プ結合複合体を有しており、この粒子は比較的“高い”価を提示する。このため
、cpIII をベースとするライブラリーは単価と呼ばれ、cpVIIIをベースとす
るライブラリーは多価と呼ばれる。
抗体親和性及び抗体価の周知の原理並びにここに記述される方法を適用すると
、通常単離し得る、もしくは本発明によるcpVIIIをベースとするライブラリー
において見出される多価試薬を用いることによるより広い範囲の親和性(104な
いし103M-1の結合定数)と比較して、106ないし1012M-1の解離結合定数(Kd
)として表現される、非常に高い親和結合相互作用を有する抗体を含めるように
スクリーニングすることにより、cpIII をベースとするライブラリーを生成し
、及び/又は富化することができることが示される。したがって、cpVIIIをベ
ースとするライブラリーは、低いものから高いものまで広い範囲の親和性を有す
るエピトープ結合複合体の単離に有用であり、これに対して、cpIII をベース
とするライブラリーは、より狭い範囲の高親和性エピトープ結合複合体の単離に
有用である。高親和性抗体は、ここに示されている通りの、それらの強い免疫反
応性及びそれに付随する選択性、並びに強い中和能力のために特に好ましい。好
ましい抗体は、少なくとも10-9、好ましくは少なくとも10-10、より好ましくは
少なくとも10-11、最も好ましくは少なくとも10-12の親和性を有している。
本発明はまた、cpVIIIをベースとするライブラリーを富化することによって
、第1 の富化ライブラリーを生成することをも目論んでいる。その後、エピトー
プ結合複合体ポリペプチドをコードする遺伝子をcpIII をベースとするベクタ
ーに移し、次いで高親和結合相互作用について富化する。態様の1 つにおいては
、cpIII をベースとするベクターに移す前に、突然変異生成工程を利用するこ
とが可能である。
このように、本発明はまた、本発明の糸状ファージによってコードされるエピ
トープ結合複合体の親和性を熟成する方法であって、a)糸状ファージのゲノム
を用意する工程、b)用意されたゲノムに存在する免疫グロブリン可変ドメイン
をコードするヌクレオチド配列に突然変異を誘発して、突然変異が誘発された免
疫グロブリン可変領域ドメインヌクレオチド配列を有するファージ粒子のライブ
ラリーを形成する工程、c)工程(b)において形成されたライブラリーを予め
選択されたリガンドと、ライブラリーの構成要素がリガンドと結合してリガンド
−ファージ粒子複合体を形成するに十分な条件下で接触させる工程、及びd)前
記複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成要素から単離して、予め選
択されたリガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含むリガンド富化
ライブラリーを形成する工程を具備する方法をも目論んでいる。
ここに示される特に好ましい態様においては、合成により非常に優れたモノク
ローナル抗体を進化させるために、突然変異誘発及び富化の一連のサイクルを通
して多数のCDRに突然変異が誘発される。
例えば、ファージ表現(display)タンパク質の形の抗HIV糖タンパク質gp
120モノクローナル抗体をまずCDR1ドメイン内にランダムに突然変異を誘
発させて合成抗体を有するファージミドの第1ライブラリーを作成し、次にその
ライブラリーを固相で前選択リガンド、即ち、HIVgp120に対してパンニ
ングすることにより強化した。その後、ライブラリー中の最高親和性結合ファー
ジミドを集め、更にCDR3ドメイン内にランダムに突然変異を誘発させるため
に1以上を選択して合成抗体を有するファージミドの第2ライブラリーを作成し
、次に得られたライブラリーを前選択リガンドgp120に対してパンニングす
ることにより強化してHIVgp120に高親和性結合することができる合成モ
ノクローナル抗体を有する高親和性ファージミドを作成した。次に、得られた高
親和性抗体を本明細書中に記載される慣用のウイルス中和分析でスクリーンして
最高中和能を有する合成抗体を同定し、本発明の抗体として選ばれる。
突然変異誘発及びパンニングの場合の配列は変えることができる。例えば、C
DR1の前にCDR3の突然変異を誘発させることができ、その逆もできる。ま
た、第2突然変異誘発及び強化工程の前に強化工程の精製としての中和のために
第1ライブラリーを更にスクリーンすることができる。
従って、1実施態様において、本発明は下記工程を含む合成ヒト抗HIVモノ
クローナル抗体の産生方法を記載するものである。
a)免疫グロブリン重鎖及び軽鎖可変領域を有するモノクローナル抗体をコー
ドする繊維状ファージのゲノムであって、前記重鎖可変領域が繊維状ファージ膜
アンカードメインを含む融合ポリペプチドとして存在し、前記モノクローナル抗
体がHIVと免疫反応する前記ゲノムを与える工程;
b)その与えられたゲノム内に存在する免疫グロブリン重鎖可変領域コーディ
ングヌクレオチド配列を突然変異して突然変異した免疫グロブリン重鎖可変領域
ヌクレオチド配列を含む突然変異を誘発させたファージ粒子の第1ライブラリー
を作成する工程;
c)工程(b)で作られた該ライブラリーを前選択リガンドと該ライブラリー
の構成部分が該リガンドに結合しかつ第1リガンド−ファージ粒子複合体を形成
するのに十分な条件下で接触させる工程;
d)前記第1複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成部分から分離
して前記前選択リガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含む第1リ
ガンド強化ライブラリーを作成する工程;
e)前記第1リガンド強化ライブラリーからの繊維状ファージのゲノムを与え
る工程;
f)その与えられたゲノム内に存在する免疫グロブリン重鎖可変領域コーディ
ングヌクレオチド配列を突然変異して突然変異した免疫グロブリン重鎖可変領域
ヌクレオチド配列を含む突然変異を誘発させたファージ粒子の第2ライブラリー
を作成する工程;
g)工程(f)で作られた該ライブラリーを前選択リガンドと該ライブラリー
の構成部分が該リガンドに結合しかつ第2リガンド−ファージ粒子複合体を形成
するのに十分な条件下で接触させる工程;
h)前記第2複合体中のファージ粒子を非結合ライブラリー構成部分から分離
して前記前選択リガンドに対する結合特異性を有するファージ粒子を含む第2リ
ガンド強化ライブラリーを作成する工程。
好適実施態様においては、工程(b)及び(f)の突然変異は免疫グロブリン
重鎖可変領域の同一領域に対するものである。また、工程(b)及び(f)の突
然変異は免疫グロブリン重鎖可変領域の2つの異なる領域に対するものであるこ
とができる。例えば、好適方法においては、工程(b)の突然変異は第1CDR
に対し、工程(f)の突然変異は第2CDRに対するものである。好適及び具体
的方法においては、第1及び第2CDRは各々CDR1及びCDR3である。
HIVに適用されるように、工程(a)のモノクローナル抗体がHIV糖タン
パク質gp120と免疫反応しかつ強化工程(c)及び(g)に用いられる前選
択リガンドがHIV糖タンパク質gp120である場合が特に好ましい。
工程(b)において突然変異を誘発させる特に好ましい方法は、ファージミド
ゲノム内の免疫グロブリン遺伝子のCDRにおいて突然変異を誘発させる工程を
含み、その免疫グロブリン遺伝子のそのCDRの一部をPCRプライマーオリゴ
ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅することを
含む工程であり、ここでそのオリゴヌクレオチドは5′及び3′末端を有しかつ
下記配列を含む。
a)CDRの上流のフレームワーク領域に対してハイブリッド形成することが
できる5′末端のヌクレオチド配列;
b)CDRの下流のフレームワーク領域に対してハイブリッド形成することが
できる3′末端のヌクレオチド配列;及び
c)下記式を有する5′末端と3′末端間のヌクレオチド配列:
[NNS]n'
(式中、Nは独立して任意のヌクレオチドであり、SはG又はC又はその類縁体
であり、nは3〜約24である。なお、該3′末端及び5′末端ヌクレオチド配
列は約6〜50ヌクレオチドの長さを有する。)並びにそれに相補的な配列。特
に好適で具体的なこの実施態様は、nが5であり、CDRがCDR1であり、上
流及び下流フレームワーク領域が各々FR1及びFR2である方法である。
また、工程(f)において突然変異を誘発させる方法であって、ファージミド
ゲノム内の免疫グロブリン遺伝子のCDRにおいて突然変異を誘発させる工程を
含み、その免疫グロブリン遺伝子のそのCDRの一部をPCRプライマーオリゴ
ヌクレオチドを用いるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって増幅する工程を
含む方法が好ましく、ここでそのオリゴヌクレオチドは5′及び3′末端を有し
かつ下記配列を含む。
a)CDRの下流のアンチセンス(非コード)フレームワーク領域に対してハ
イブリッド形成することができる5′末端のヌクレオチド配列;
b)CDRの上流のアンチセンス(非コード)フレームワーク領域に対してハ
イブリッド形成することができる3′末端のヌクレオチド配列;及び
c)下記式を有する5′末端と3′末端間のヌクレオチド配列:
[MNN]n'
(式中、Nは独立して任意のヌクレオチドであり、MはC又はA又はその類縁体
であり、nは3〜約24である。なお、該3′末端及び5′末端ヌクレオチド配
列は約6〜50ヌクレオチドの長さを有する。)並びにそれに相補的な配列。特
に好適で具体的なこの実施態様は、nが4であり、CDRがCDR3であり、上
流及び下流フレームワーク領域が各々FR3及びFR4である方法である。
また、本発明の、HIVと免疫反応する合成モノクローナル抗体が企図され、
上記方法の実施態様によって産生される。実施例
本発明に関する下記実施例は、本発明を具体的に説明するものであり、本発明
を詳細に限定するものとして解釈されるべきでないことは当然のことである。更
に、当該技術の範囲内である現在既知であるか又は後に開発される本発明の変更
は下記請求の範囲の本発明の範囲内に包含するとみなされるべきである。
1.HIV−1のgp120に対する親和性を高めかつ中和する能力を高めた合
成ヒトFabヘテロ二量体の調製
A.pMT4の説明並びにCDR1及びCDR3ランダム化gp120特異的
Fab抗体を得る方法の概要
コードされたFab(MT4)よりむしろファージミドを示すpMT4と称す
る免疫グロブリン遺伝子ファージミド発現ベクターは、本明細書中に示されるよ
うに相補性決定領域(CDR)のランダム化の鋳型として用いられるFabヘテ
ロ二量体を発現するための重鎖及び軽鎖配列を含む。寄託されたpMT4ファー
ジミドは、HIV−1のエンベロープ糖タンパク質、gp120に結合するMT
4と称する可溶性Fab抗体を発現する。HIV−1血清陽性個体(MT)から
生じたIgG1K骨髄ライブラリーをスクリーニングすることからpMT4を選
択すること及びその確認は、Barbasら,J.Mol.Biol.,230:812-823(1993)に記
載されており、この開示を参考として引用する。pMT4によってコードされた
Fabの重鎖及び軽鎖可変領域双方の誘導アミノ酸残基配列もBarbasら,J.Mol
.Biol.,230:812-823(1993)に発表されている。
pMT4プラスミドをアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション、1301
パークラウンドライブ、ロックビル、メリーランド州、米国(ATCC)に寄託
した。プラスミド含有細胞の寄託物はMT4の名称で載せられ、ATCC受託番
号75574に指定された。この寄託は、実施例に記載されるように特許手続上
の微生物の寄託の国際承認に関するプダペスト条約及びその規則(プダペスト条
約)の規定により行われた。
寄託したpMT4は、gene3膜アンカーを挿入してそのアンカーをコード
するヌクレオチド配列を実施例2Bに記載されるpComb3H−TTから切断
により、例えばNotI及びXhoIで切断することにより誘導しかつその切断
した断片を同じNotI/XhoI部位でpMT4−3に移動させることにより
pMT4−3を作成するように操作することができる。
ファージミドpMT4−3を本明細書に記載されるポリメラーゼ連鎖反応(P
CR)増幅に用いてヌクレオチド突然変異とも言われるヌクレオチド置換をファ
ージミド内のFab重鎖のCDR1及びCDR3の双方に導入し、結合特性及び
中和特性を高めた新規なFab抗体を産生した。pMT4−3ベクターは、E.co li
中で効率よく産生されかつgp120に対する親和性及び細胞におけるHIV
−1感染の中和が高いランダム化が行われる鋳型DNAとして選ばれた。
細胞のHIV−1感染の阻止能力を高めた本発明の高親和性gp120Fab
抗体の産生方法は、概要として示した下記工程を含んだ。1)pMT4−3の重
鎖CDR1をまずポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用によりランダム化する
工程;2)ランダム化CDR1を含むPCRからの増幅産物をもとのpMT4−
3に結合してランダム化ライブラリーを作成する工程;3)そのライブラリーか
らのバクテリオファージコートタンパク質3−アンカーFabを発現した後、F
ab発現ファージをgp120、IIIb株に対してパンニングし、gp120
特異的CDR1ランダム化Fabが選択される工程;4)次に、その選択された
Fabをコードするファージミドを一段PCR増幅においてCDR3内の
12ヌクレオチドのランダム化に供する工程;5)次に、得られたランダム化し
たCDR1とCDR3の一部を共に有する増幅産物をもとのpMT4−3に結合
し、発現及びパンニング過程を繰り返す工程;6)gp120特異的CDR1及
びCDR3ランダム化Fabを選択した後、対応するファージミドの配列を決定
し、アミノ酸残基配列を誘導する工程;及び最後の7)得られたCDR1及びC
DR3ランダム化gp120特異的Fabの最終確認として結合親和性を求める
ための表面プラスモン共鳴分析及び抗体のHIV−1感染阻止能力を求めるため
の中和分析の双方を行う工程。
上記で挙げた工程は、下記の項で詳細に示される。
B.ファージミドMT4−3の重鎖可変領域のランダム化CDR1の調製
1.オーバーラップPCRによるランダム化
重鎖可変領域ランダム化CDR1を有するライブラリーを2種類の異なる方法
で作製した。1つの方法に対してここに記載されるようにオーバーラップPCR
を用いた。別の方法は、下記実施例1B2)に記載される一段PCR増幅法を用
いた。本発明のFabの重鎖CDR1のランダム化は、後者の一段PCR法から
誘導した。
上記実施例1Aに記載されたpMT4−3の重鎖可変領域のCDR1をランダ
ム化するために、2つの別個のPCR増幅をここに記載されるように行った後に
、第3オーバーラップPCR増幅を続け、前の2つの増幅産物のアニーリングを
得、次に、第3増幅を続けた。鋳型pMT4−3の重鎖可変領域のヌクレオチド
配列を図4に示し、配列番号:7に示す。次のPCR増幅及びサブクローニング
を促進するために、pMT4−3鋳型をまずPCRで突然変異を誘発させてHi
ndIII制限部位を導入して図4及び配列番号:7に示されるヌクレオチド位
置60で切断した。コード鎖中位置60のもとのグアニン(G)ヌクレオチドを
、当業者に良く知られたPCR部位特異的突然変異誘発法を用いてアデニン(A
)に変えた。部位特異的突然変異誘発の結果として、pMT4−3鋳型は位置6
0にアデニンヌクレオチドをPCR増幅相補的チミンヌクレオチドと共に含有し
た。位置60に突然変異誘発塩基を有するpMT4−3重鎖可変領域のコード配
列を
、図4及び配列番号:7に示す。次に、この突然変異を誘発させたpMT4−3
を以後の全てのPCR増幅に用いてCDRランダム化を導入した。
pMT4−3の重鎖内にランダム化されるヌクレオチド位置は、ヌクレオチド
位置82で開始し位置96で終止した。その指定した部位の鋳型pMT4−3重
鎖配列は、CDR1に5つの全アミノ酸残基をコードした。pMT4−3によっ
てコードされたCDR1のアミノ酸残基配列は、MT4にラベルされた図1の重
鎖可変領域の完全アミノ酸残基配列に示されるようにAsn-Phe-Vla-Ile-His(配列
番号:8)であった。図1及び対応する配列番号:1において、MT4−3のC
DR1はアミノ酸残基位置28で開始し32で終止する。これは、保存 Kabat位
置31〜35に対応する。
Operon Technologies、アラメダ、カリフォルニア州で合成された下記ヌクレ
オチド式を有する12cdr1h3−fと称する縮重オリゴヌクレオチドプライ
マーのプールをpMT4−3の重鎖CDR1をランダム化するために用いた。ラ
ンダム化ヌクレオチドを導入するための5つのトリプレットコドンは、反復配列
NNS(SはG又はCであり、NはA、C、G又はTである。)を有した。
第1PCR増幅により、ほとんどのフレームワーク領域1(FR1)のpMT
4−3ファージミドベクタークローン中の重鎖フラグメントの領域の増幅が得ら
れた。この領域を増幅するために、次のプライマー対を用いた。ヌクレオチド配
列 5′-GCAATTAACCCTCACTAAAGGG- 3′(配列番号:9)を有する5′オリゴヌク
レオチドプライマー、FTX3は、FR1の領域5′(ベクター配列)に対応し
最初の2つのヌクレオチドを含む重鎖の非コーディング鎖に対してハイブリッド
形成した。ヌクレオチド配列 5′-AGAAGCTTGACAAGAAGAAACCTTC-3′(配列番号:
10)を有する3′オリゴヌクレオチドプライマー、12h3−bは、フレーム
ワーク1の終わりから15ヌクレオチドで終止する重鎖のコード鎖に対してハイ
ブリッド形成した。オリゴヌクレオチドプライマーは、Operon Technologiesで
合成された。
PCR反応は、各々1マイクログラム(μg)のオリゴヌクレオチドプライマー
FTX3及び12h3−b、200ミリモル(mM)dNTP(dATP、dCTP
、dGTP、dTTP)、1.5mMMgCl2Taqポリメラーゼ(5単位)(Perki
n
-Elmer Corp.、ノルウォーク、コネチカット州)、10ナノグラム(ng)の鋳型p
MT4−3及び10μlの市販で購入された(Perkin-Elmer Corp.)10×PCR
バッファーを含む100マイクロリットル(μl)の反応中で行った。次に、Perki
n-Elmer Cetus 9600 GeneAmp PCR システムサーモサイクラーで35ラウンドの
PCR増殖を行った。増殖サイクルは、94℃(94C)で1分間変性し、50
Cで1分間アニーリングし、次に72Cで2分間エクステンションすることから
構成された。十分量の増幅産物を得るために、15の同−PCR反応を行った。
次に、得られたPCR増幅産物を“Molecular Cloning: A Laboratory Manual
”,Sambrookら,eds.,Cold Spring Harbor,NY(1989)に記載されている標準電気
溶出法を用いて1.5%アガロースゲルによりゲル精製した。簡単に言えば、消
化した合成結合部位をコードするPCR増幅Fab表現断片をゲル電気泳動した
後、所定のサイズのDNA断片を含むゲルの領域を切り取り、透析膜中に電気溶
出し、エタノール沈澱し、10ミリモル(mM)トリス−HCl[トリス(ヒドロキ
シメチル)アミノメタン塩酸塩]、pH7.5及び1mMEDTA(エチレンジア
ミン四酢酸)を含有するバッファーに50ナノグラム/ミリリットル(ng/ml)の
最終濃度まで再懸濁した。
次に、第1反応から得られた精製したPCR増幅産物を、下記で共に記載され
る第2PCR反応の産物とのオーバーラップエクステンションPCR反応に用い
て2つの産物をランダム化CDR1を含む再構築重鎖に組換えた。
第2PCR反応により、重鎖フレームワーク1を上記産物とオーバーラップし
重鎖のフレームワーク4の3′を伸長する重鎖が増幅された。CDR1の5つの
コードされたアミノ酸残基配列をランダム化するこの領域を増殖するために、下
記プライマー対を用いた。12cdr1h3と称する上記5′コードオリゴヌク
レオチドプライマープールは、下記式で表されるヌクレオチド配列を有した。
5′-GAAGGTTTCTTGTCAAGCTTCTGGATACAGATTCAGTNNSNNSNNSNNSNNSTGGGTGCGCCAGGCCC
CC- 3′(配列番号:11)(NはA、C、G又はTであり、SはG又はCであ
る。) 3′非コードプライマー、R3Bは、 5′-TTGATATTCACAAACGAATGG-3′
の配列(配列番号:12)を有するCH1の3′端のコード鎖に対してハイブリ
ッド形成した。オリゴヌクレオチドプライマープールの5′端はフレームワーク
1の3′端に相補的であり、オリゴヌクレオチドプライマープールの3′端はフ
レームワーク2の5′端に相補的である。プライマープールの指定した2つの端
間の領域は、15量体NNS縮重で表される。第2PCR反応は、1μg の記載
されたオリゴヌクレオチドプライマーを各々含む上記100μl 反応物中pMT
4−3鋳型の第2分割量で行った。得られたPCR産物は、長さが5アミノ酸残
基のランダム化重鎖CDR1領域の異種集団をコードした。次に、産物を上記の
ようにゲル精製した。
次に、2つのPCR増幅のアニーリング反応の場合、各1mgの第1及び第2P
CR反応からのゲル精製産物を混合し、上記のように35サイクルのPCRに対
してプライマーを存在させずに融合した。次に、得られた融合産物を最終PCR
反応のプライマー対として各1μg のFTX3及びR3Bオリゴヌクレオチドプ
ライマーで増幅してオーバーラップエクステンションにより完全重鎖フラグメン
トを作成した。オーバーラップPCR増幅は上記のように行った。
十分量の増幅産物を得るために、15の同一オーバーラップPCR反応を行っ
た。得られた重鎖フラグメントは、5′のフレームワーク1からCH1の終わり
まで伸長し、5アミノ酸残基をコードするランダム化CDR1を有した。15反
応の各々において長さが約880塩基対(bp)のCDR1ランダム化重鎖フラ
グメント増殖産物をまずプールし、次に上記のようにゲル精製した後、pMT4
−3表面表現ファージミド発現ベクターに再結合して以後のgp120に対する
スクリーニングのためのライブラリーを作成した。発現ベクターライブラリーを
作成する際の連結反応手順、以後の重鎖CDR1ランダム化pMT4−3クロー
ンの発現は、実施例1Cに記載されるように行った。
2)一段PCRによるランダム化
重鎖可変領域内のCDR1をランダム化して本発明の重鎖CDR1ランダム化
Fabを作製する他の方法は、ここに記載される一段PCR突然変異誘発工程で
行った。下記実施例に記載されるCDR1ランダム化重鎖可変領域を有する本発
明のFabは、一段PCR法から作製されたファージミド表現Fabライブラリ
ーをスクリーニングすることから得られた。
一段PCRにおいて、オーバーラップPCRに対して実施例1B1)に記載さ
れた突然変異を誘発させたCDR1を有する全長可変領域を作製するために3回
PCR増幅を行う代わりに、実施例1B1)に記載されたpMT4−3ファージ
ミドベクター鋳型に以前に導入された重鎖CDR1の前にあるHindIII制
限部位を利用する増幅を行った。鋳型pMT4−3の重鎖可変領域のヌクレオチ
ド配列を図4に示し、配列番号:7に示す。突然変異をCDR1に導入するため
にランダム化される鋳型の領域は、オーバーラップPCRに対して前述されたよ
うにした。即ち、CDR1をランダム化するために、前述のプライマー、突然変
異を誘発させるコードプライマー12cdr1h3−f(配列番号:11)及び
3′非コードプライマーR3B(配列番号:12)を用いてランダム化されたヌ
クレオチドを重鎖CDR1に実施例1B1)に記載されたPCRプロトコールを
用いて導入すると共に図4及び配列番号:7に示されるヌクレオチド位置で開始
して前述のCH1に伸びる配列を増幅した。
得られたPCR産物をゲル精製し、HindIII及びSpeIで消化し、ゲ
ル精製した。HindIII/SpeI消化物により、HindIII5′コー
ド突出端を有するPCR産物が得られ、その5′端は図4及び配列番号:7に示
されるpMT4−3重鎖可変領域配列のヌクレオチド位置60及び重鎖可変領域
のフレームワーク4のSpeI3′端と一致した。
次に、二重消化PCR産物を同様に消化したpMT4−3ベクターに方向性を
もって結合し、FabMT4をコードする突然変異を誘発させていない軽鎖可変
領域を保持した。実施例1B1)に記載された導入HindIIIに基づくpM
T4−3のHindIII消化物は、pMT4−3の図4及び配列番号:7に示
されるヌクレオチド位置59と60間で切断し、消化したPCR産物を消化した
pMT4−3ベクターに方向性をもって結合することができる非コード突出端と
共に線状にしたベクターの3′コード端の位置59にアデニン塩基が残った。
即ち、HindIII及びSpeIで二重に消化されるランダム化産物のライ
ブラリーを同様に消化したpMT4−3ベクターに方向性をもって結合してCD
R1ランダム化重鎖可変領域と実施例1Cに記載されたpMT4−3ベクターか
らの突然変異を誘発させていない軽鎖可変領域を有する環状にしたpMT4
−3ベクターのライブラリーを作成した。連結反応により、位置60で開始する
PCR増幅ランダム化重鎖可変領域とヌクレオチド位置1〜59からの重鎖の5
′端をコードするヌクレオチド配列とのフレーム内結合が得られた。得られたフ
ァージミドライブラリーはランダム化ヌクレオチド配列をpMT4−3の重鎖可
変領域に導入するために一段PCRから作製され、次に実施例1Dに記載される
ようにスクリーンされ、本発明に記載されるCDR1ランダム化重鎖可変領域F
abを誘導するために用いた。
C.ランダム化CDR1を有するファージミド表現Fabの調製
重鎖及び軽鎖可変領域配列を含むファージミドpMT4−3は、ファージ表現
アンカータンパク質を発現するpComb3ファージミド発現ベクターである。
pComb3発現ベクターは、発現したタンパク質をバクテリオファージコート
タンパク質3上にアンカーすることができるように設計された。繊維状ファージ
のGeneIIIはこの406残基微量ファージコートタンパク質、cpIII
(cp3)をコードし、これを発現した後に細菌膜上のファージ集合過程に押し
出されかつE.coliの周縁細胞質に向いている内部膜上に蓄積される。
ファージ表面上でランダム化CDRを含むFab表現タンパク質の発現を得る
本発明を実施するにあたり、ヘテロ二量体Fab分子の集合のために抗体の重鎖
(VH及びCH1からなるFd)及び軽鎖(κ)(VL、CL)をまずE.coliの周縁細胞
質の標的にした。
この系において、第1シストロンは融合タンパク質、Fd−cpIIIに操作
的に連結した周縁細胞質分泌シグナル(pe1Bリーダー)をコードした。第2
シストロンは、κ軽鎖に操作的に連結した第2pe1Bリーダーをコードした。
pe1Bリーダーが存在すると、合成結合部位と軽鎖を含む融合タンパク質の双
方を細菌細胞質から周縁細胞質空間へ協調されているが別個に分泌することが促
進された。
この過程において、各鎖はpe1Bリーダー配列によって周縁細胞質空間に送
られ、引き続き切断された。合成結合を含む重鎖は、cpIII膜アンカードメ
インによって膜内に固定され、軽鎖は周縁細胞質に分泌された。Fab分子は、
重鎖と可溶性軽細胞を結合することから作成された。
pComb3と称するファージミドベクターはFabの表面表現及び可溶性形
態の双方を可能にした。このベクターは、組合わせFabライブラリーのクロー
ニングのために設計された。XhoI及びSpeI部位は、フレームワーク1で
開始しフレームワーク4中に伸びる領域からなる完全PCR増幅重鎖(Fd)配
列のクローニングを与えた。pMT4−3の中に遺伝子操作されたHindII
I部位は、部分的PCR増幅重鎖可変領域フラグメントを方向性のあるフレーム
内連結反応を与えた。AatII制限部位は重鎖CDR3にも存在する。Aat
II部位が存在すると、突然変異を誘発させたCDR1及びCDR3の双方をコ
ードする配列が位置するフレーム1で開始しCDR3ドメインの終わりまで伸び
る配列を含む実施例1Eで調製されるPCR産物のXhoI/AatII消化物
の挿入が可能であった。実施例1Fに記載されるようにXhoI/AatII消
化物をpMT4−3に挿入すると、ランダム化pMT4−3重鎖可変領域とpM
T4−3ベクターに既に存在するフレームワーク4との融合が得られた。即ち、
実施例1Eで調製される最後の重鎖突然変異誘発ヌクレオチド配列を結合すると
、CDR3の中のPCR増幅フレームワーク1からなる完全重鎖フラグメントの
フレーム内結合が得られ、pMT4−3フレームワーク4が保持された。pCo
mb3発現ベクター内のクローニング部位は、Huseら,Science, 246: 1275-128
1(1989)及び Perssonら,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA, 88:2432- 2436(1991)
に記載されている以前に報告されているマウス及びヒトPCRプライマーと一致
した。pe1Bのヌクレオチド配列、発現タンパク質の周縁細胞質空間に対する
リーダー配列は、Huseら,Science, 246:1275-1281に報告された通りであった。
本ベクターは、また、Shineら,Nature,254:34(1975)に記載されているリ
ボソーム結合部位を含有した。ColE1及びF1起原及びβ−ラクタマーゼ遺
伝子を含むファージミドベクター、pBluescriptの配列は、Short ら
,Nuc.Acids Res.,16:7583-7600(1988)に以前に記載されており、完全配列に
対して遺伝子バンク受託番号 52330を有する。エンプティーベクターのXhoI
とSpeI部位間に位置した追加の制限部位、SalI、AccI、HincI
I、ClaI、HindIII、EcoRV、PstI及びSmaIは、Short
ら,Nuc.Acids Res.,16:7583-7600(1988)に記載されているpBluescr
iptの51塩基対スタファーフラグメントから誘導された。規則正しい二次構
造のない可変性5アミノ酸残基連鎖配列をコードするヌクレオチド配列は、Fa
bとcp3ヌクレオチドドメイン間に並置されたので発現融合タンパク質中の相
互作用が最少になった。
即ち、得られた組合わせベクター、pComb3は、1つの融合タンパク質、
Fd/cp3と1つの可溶性タンパク質、軽鎖を発現する2つのカセットを有す
るDNA分子から構成された。本ベクターは、また、5′→3′方向に示された
次の操作的に結合された要素のヌクレオチド残基配列を含有した:プロモーター
/オペレーター配列からなる第1カセット;NotI制限部位;リボソーム結合
部位;pe1Bリーダー;スペーサー領域;5′Xhoと3′SpeI制限部位
によって隣接したクローニング領域;連鎖配列;バクテリオファージcp3をコ
ードし、次に停止コドンが続く配列:2つのカセットの間に位置したNheI制
限部位;第21acZプロモーター/オペレーター配列、次に発現制御リボソー
ム結合部位;pe1Bリーダー;スペーサ一領域;5′SacIと3′XbaI
制限部位によって隣接したクローニング領域、次に発現制御停止配列及び第2N
otI制限部位。
上記発現ベクターにおいて、Fd/cp3融合タンパク質及び軽鎖タンパク質
は、別個の1acプロモーター/オペレーター配列の制御によって配置され、膜
上の機能集合のpe1Bリーダーによって周縁細胞質空間に特定された。ベクタ
ー内のファージF1遺伝子間領域の介在物は、ヘルパーファージによって一本鎖
ファージミドのパッケージングを可能にした。ヘルパーファージ重感染を使用す
ると、cp3の2形態を発現することができた。従って、正常なファージ形態形
成は、Fd/cp3融合とビリオンに取込むためのヘルパーファージの未変性c
p3間の競合によって混乱した。得られたパッケージングファージミドは感染に
必要な未変性cp3及び選択のために表現されるコードされたFab融合タンパ
ク質を有した。C末端ドメインとの融合は、感染N末端ドメインとの融合が宿主
細胞を感染に対して耐性にすることから、ファージミド法によって必要とされた
。
上記pComb3発現ベクターは、HIV−1のgp120に対する合成ヒト
Fab抗体の産生のために本発明に用いられるpMT4−3とも呼ばれるMT4
Fab表現ファージミド発現ベクターの基本的構築物を作成する。
1)ファージミドライブラリーの構築
重鎖及び軽鎖可変領域を共に有する発現合成ヒトFab抗体を得るために、フ
ァージミドライブラリーを構築した。これらのライブラリーは、CDR1が実施
例1Bに記載された重鎖内にランダム化される重鎖及び軽鎖を有する組換えヒト
Fab抗体の発現を与えた。
実施例1Bで調製されたPCR産物を発現するためのファージミドライブラリ
ーの調製の場合、オーバーラップPCRからのPCR産物をまずXhoI及びS
peIで消化し、実施例1Aに記載されたように調製された同様に消化されたも
との(即ち、ランダム化されていない)pMT4−3ファージミド発現ベクター
と別個に結合した。XhoI及びSpeI部位は、各々フレームワーク1領域及
びCH1ドメイン内に存在した。連結反応により、5′の位置にあるpMT4−
3に対するフレームワーク1からフレームワーク4の終わりまでの重鎖可変領域
をcp3遺伝子に操作的に結合することが得られた。増幅産物は本来はFabM
T4を発現するために重鎖及び軽鎖可変領域配列の双方を有する鋳型pMT4−
3発現ベクターに挿入されるので、重鎖領域のみが置き換えられpMT4−3発
現ベクターの残りは未変化のままであった。言い換えると、新たにランダム化さ
れたCDR1重鎖増幅産物をもとのpMT4−3軽鎖可変領域を有するpMT4
−3に再結合した。即ち、組換え体クローンからの発現の際に、発現したFab
はCDR1ランダム化重鎖とpMT4−3軽鎖配列を含み、その後者を図2及び
配列番号:6に示す。一段PCR法からのPCR産物をHindIII及びSp
eIで消化し、次に同様に消化したpMT4−3発現ベクターと別個に結合した
。結果は、オーバーラップPCRに対して記載されたものと同じであった。
pMT4−3軽鎖可変領域ヌクレオチド配列は、突然変異誘発手順中未変化の
ままであった。従って、実施例1に記載される本発明の方法によって得られた好
ましい抗gp120Fab抗体は全て、もとのpMT4−3によってコードされ
た軽鎖アミノ酸残基配列を含有する。
本発明のFab表現合成結合部位の各々を発現するためのファージミドを、次
の手順で調製した。PCR産物挿入断片を含む環状にしたベクターを作成するた
めに、640ngの消化PCR産物を2μg の線状にしたpMT4−3ファージミ
ドベクターと混合し、150μl の反応容量中BRLリガーゼバッファー中10
単位のBRLリガーゼ(ガイザースバーグ、メリーランド州)を用いて室温で一
晩連結反応を進行させた。ランダム化CDR1を有するファージライブラリーの
サイズを増大するために、5回の別個の連結反応を行った。連結反応後、環状に
したDNAを2μl の20 mg/mlグリコン、15μl の3M 酢酸ナトリウム、p
H5.2及び300μl のエタノールの混合物により−20℃(−20C)で2
時
間沈澱した。次に、ミクロ遠心分離で4Cにおいて15分間DNAを沈降した。
DNA沈降物を冷70%エタノールで洗浄し、減圧下で乾燥した。その沈降物を
10μl の水に再懸濁し、電気穿孔により300μl のE.coliXL1−Blue
細胞へ形質転換してファージライブラリーを作成した。
形質転換後、突然変異を誘発させたCDR1を有するFabが実施例1Dに記
載されるgp120糖タンパク質による次のパンニングに誘導されるファージを
分離するために、3mlのSOC培地(SOCは1リットルの水中20グラム(g
)のバクト−トリプトン、5gの酵母エキス及び0.5gのNaClを混合し、
pH7.5に調整し、オートクレーブにかけた後20mMグルコースを混合するこ
とにより調製した)を混合し、培養液を220 rpm、37Cで1時間振盪した。
その後、20μg/mlのカルベニシリン及び10μg/mlのテトラサイクリンを含有
する10mlのSB(SBは1リットルあたり30gのトリプトン、20gの酵母
エキス及び10gのMopバッファーを混合しpH7に調整することにより調製
した)を混合し、この混合液を300 rpmで更に1時間振盪した。得られたこの
混合液を50μg/mlのカルベニシリン及び10μg/mlのテトラサイクリンを含有
する100mlのSBに混合し、1時間振盪し、その後ヘルパーファージVCSM
13(1012pfu)を混合し、この混合液を37Cで更に2時間振盪した。こ
の後、70μg/mlのカナマイシンを混合し、30Cで一晩維持した。低温により
、ファージの表面上に良好なヘテロ二量体の取込みが得られた。上清は遠心分離
(JA10ローター中4000 rpm、4Cで15分間)により透明になった。4%(w
/v)ポリエチレングリコール8000及び3%(w/v)NaClを混合することによりフ
ァージを沈澱し、氷上で30分間維持した後、遠心分離(JA10ローター中900
0 rpm、4Cで20分間)した。ファージ沈降物を2mlのPBSに再懸濁し、3
分間ミクロ遠心分離してデブリを沈降し、新しい試験管に移して下に記載される
次のスクリーニングのために−20Cで貯蔵した。
タイタリングコロニー形成単位(cfu)を求めるために、ファージ(パッケ
ージングファージミド)をSBに希釈し、1μl を用いて10μg/mlのテトラサ
イクリンを含むSB中で増殖した50μl の新たな(AOD600=1)E.coliXL
1−Blue細胞に感染させた。ファージと細胞を室温で15分間維持し、次に
LB/カルベニシリンプレート上に直接播種した。これにより、得られたランダ
ム化CDR1重鎖遺伝子を含むファージライブラリーが約2×107ファージ粒
子(cfu)を含むことがわかった。
引き続きライブラリーをスクリーニングするために、ライブラリーを2×107
粒子の多様性を含む約1011cfuの集団サイズに増幅し、必要なときにこの
増幅したライブラリーを用いた。ファージライブラリーの増幅は、溶離したファ
ージを増幅する下記実施例1D1)に記載されるように行われた。
D.ファージ表面上で発現した抗gp120Fabヘテロ二量体の選択
1)ファージライブラリーの多重パンニング
一段PCR法から実施例1Cで作製したファージライブラリーを、抗HIV−
1ヘテロ二量体に選んだ被覆マイクロタイタープレート上でここに記載されるH
IV−1株IIIbの組換え体gp120に対してパンニングした。
使用したパンニング手順は、数ラウンドの認識及び複製を含み、最初にParmle
y & Smith(Parmleyら,Gene,73:305-318(1988)に記載されたものを変更した
。特異抗原−結合クローンを強化するために4ラウンドのパンニングを行った。
この手順に対して、4ウェルのマイクロタイタープレート(Costar 3690)を0.
1M 重炭酸塩、pH8.6中25μl の上記で調製した40μg/mlgp120(Am
erican Biotechnologies、オシニング、ニューヨーク州)で4Cにおいて一晩被
覆した。それらのウェルを水で2回洗浄し、ウェルをPBS中3%(w/v)BS
Aで完全に充填しかつプレートを37Cで1時間維持することにより遮断した。
その遮断溶液を振盪した後、50μl の上記で調製した増幅ファージ懸濁液(典
型的には1011cfu)を各ウェルに混合し、プレートを37Cで2時間維持し
た。
ファージを取り出し、プレートを水で1回洗浄した。次に、各ウェルをTBS
/トウイーン(50mMトリス−HCl、pH7.5、150mMNaCl、0.5%
トウイーン20)で10回室温で1時間かけて洗浄し、洗浄はウェルを洗浄する
ためにピペットを上下することからなり、洗浄間にはウェルをTBS/トウイー
ンで完全に充填しておいた。プレートを蒸留水で1回以上洗浄し、50μl の溶
離バッファー(0.1M HCl、固体グリシンでpH2.2に調整、1mg/ml BS
Aを
含有)を各ウェルに加えることにより粘着ファージを溶離した後、室温で10分
間維持した。この溶離バッファーをピペットで数回上下し、取り出し、50μl
の使用溶離バッファーあたり3μl の2M トリス塩基で中和した。
溶離したファージ集団を、ライブラリー中の粒子の全体数を増加させかつ引き
続きライブラリーの力価測定を容易にするために増幅した。これを目的として、
溶離したファージを用いて2mlの新たな(OD600=1)E.coliXL1−Blu
e細胞に室温で15分間感染させ、その後、20μg/mlのカルベニシリン及び1
0μg/mlのテトラサイクリンを含む10mlのSBを混合した。20、10及び1
/10μl の分割量を平板培養するために培養液から取り出してプレートから溶
離するファージ数(パッケージングファージミド)を求めた。培養液を37Cで
1時間振盪し、その後、50μg/mlのカルベニシリン及び10μg/mlのテトラサ
イクリンを含む100mlのSBに加え、1時間振盪した。次に、ヘルパーファー
ジVCSM13(1012pfu)を加え、培養液を更に2時間振盪した。その後
、70μg/mlのカナマイシンを加え、培養液を37Cで一晩インキュベートして
増幅ファージ集団を形成した。ファージ調製及び次のパンニングを全4ラウンド
のパンニングに対する上記のように繰り返した。
各ラウンドのパンニング後、ファージの収率%を求めることができる。ここで
収率%−(溶離したファージ数/加えたファージ数)×100。各ラウンドのパ
ンニングに対して約1011cfuであるように選択的プレート上で増幅したファ
ージ集団の力価測定に基づいて最初のファージ播種時比率を計算した。2mlの上
記対数期XL1−Blue細胞に感染しかつ分割量を選択的プレート上に播種す
ることにより最終ファージ播種後比率を求めることができる。典型的には、パン
ニング手順から溶離したファージの播種後量は約105〜106cfuであった。
このパンニング手順から、HIV−1のIIIB株からのグリコシル化組換え体
gp120への結合能に対してクローンをFabライブラリーから選択した。選
択されたクローンは、ランダム化CDR1重鎖可変領域とpMT4−3からの軽
鎖可変領域配列を有した。
得られたgp120を結合した選択クローンの配列を決定して実施例1D1)
に記載されたCDR1重鎖配列を求めた。
2)HIV−1特異的モノクローナル抗体FabとCDR1のランダム化後
の対応する誘導アミノ酸残基配列間の核酸配列分析
実施例1D1)で作製されたCDR1ランダム化クローンの核酸の配列決定は
、シークエナーゼ1.0(USB、クレーブランド、オハイオ州)を用いて12のラン
ダムに選ばれた可溶性二本鎖Fab発現DNA上で行った。誘導された配列と相
互の及び遺伝子バンクデータベースとの一列並びは、MacVectorプログラムを利
用した。12の選択された特定の合成gp120特異的Fab及びMT4の誘導
重鎖アミノ酸残基配列を実験Aの項目の下の図5に示す。図5に示される重鎖可
変領域の一列並びは、HIV−1血清陽性個体からの骨髄ライブラリーをスクリ
ーニングすることから得られたもとのMT4gp120特異的FabのCDR1
において、アミノ酸残基配列がAsn-Phe-Val-Ile-His(配列番号:8)であったこ
とが明らかである。配列の比較は、位置31にアスパラギン(N)、位置32に
芳香族残基、位置33に主としてセリン(S)又はトレオニン(T)、位置34
に分枝疎水残基及び位置35に疎水及び/又は芳香族残基が好ましいことを示し
た。アミノ酸残基の位置31〜35は、保存 Kabat位置番号に基づいて表された
。図1に示される完全可変領域アミノ酸残基配列の実際のアミノ酸残基位置は各
々28〜32で開始及び終止し、短縮したフレームワーク1から得られた。12
の選択FabのCDR1に対する実験Aに示される12のアミノ酸残基配列は次
の通り配列番号:14〜25に指定された。Arg-Tyr-Thr-Val-Phe(配列番号:1
4)、Asn-Trp-Ser-Val-Met(配列番号:15)、Gly-Tyr-Thr-Leu-Met(配列番号:
16)、Asn-Phe-Thr-Leu-Leu(配列番号:17)、His-Tyr-Ser-Leu-Met(配列番号
:18)、Asn-Trp-Val-Val-His(配列番号:19)、Asn-Phe-Ser-Ile-Met(配列番
号:20)、Asn-Phe-Ala-Ile-His(配列番号:21)、Asn-Phe-Thr-Met-Val(配列
番号:22)、Asn-Phe-Thr-Leu-Gln(配列番号:23)、Tyr-Phe-Thr-Met-His(配
列番号:24)、及びSer-Tyr-Pro-Leu-His(配列番号:25)。
次に、選択されたクローンの重鎖領域内のCDR3を実施例1Eに記載される
ようにランダム化してgp120による選択ためのタランダム化CDR1及びC
DR3を有するファージミドを作成した。
E.CDR1ランダム化Fab発現クローンの重鎖可変領域のランダム化
CDR3の調製
実施例1Dからの選択CDR1ランダム化重鎖Fab発現クローンを、それら
のクローンの重鎖CDR3配列の12のヌクレオチドを選択的にランダム化する
ために更にPCR増幅に供した。ヌクレオチドランダム化が特定されるヌクレオ
チド位置は、もとのpMT4−3ファージミドの重鎖配列の図4及び配列番号:
7に示される位置292で開始し位置303で終止した。指定された12のヌク
レオチドをランダム化し、縮重オリゴヌクレオチドプライマーのプールはコーデ
ィング鎖の5′→3′方向に書かれたNNK(NはA、C、G又はTであり、K
はG又はTである。)の反復を有する。この場合、重鎖の3′端がランダム化さ
れているので、オリゴヌクレオチドプライマープールは3′プライマーであった
。即ち、ランダム化ヌクレオチドを取込むために設計された縮重オリゴヌクレオ
チドは、PCR増幅においてコード鎖に対してハイブリッド形成されるアンチセ
ンス又は非コード鎖であった。NNKの相補的配列はNNM(Nは上記で定義さ
れており、MはA又はCである)であり、NNMは3′→5′方向に書かれる。
NNM反復は慣例の5′→3′でMNNと書かれる。縮重は、縮重オリゴヌクレ
オチドプール中4回反復する。
12−4−cdr3と称する5′→3′方向に書かれた非コード縮重オリゴヌ
クレオチドプライマーは、ヌクレオチド配列 5′-CCCTTTGCCCCAGACGTCCATATAATA
ATTGTCCTGGGGAGAATCATCMNNMNNMNNMNNCCCCACTCTCGCACA- 3′(配列番号:13)
を有した。12−4−cdr3プライマーは、XhoI及びAatII制限増幅
産物を下記実施例1Fに記載される同様に消化されたpMT4−3ファージミド
に挿入することを可能にするための自然AatII制限部位を有した。実施例1
DからのCDR1突然変異誘発選択クローンを増幅するのに用いられる5′オリ
ゴヌクレオチドプライマーは、配列番号:9のヌクレオチドを有する実施例1C
に記載されたFTX3であった。
PCR増幅は、実施例1Cに記載されたように、この場合には全重鎖可変領域
が1反応において増幅されて前から伸びフレームワーク4の中央にフレームワー
ク1を含むのでオーバーラップPCRを必要としないことを除いて行われた。得
られたPCR産物を実施例1Cに記載されたように精製し、引き続き実施例1F
に記載されるようにpMT4−3の軽鎖可変領域を有する線状にしたpMT4−
3ファージミドに再挿入した。
F.ランダム化CDR1及びCDR3を有するファージミド表現Fabの調
製
次に、重鎖可変領域CDR1及びCDR3の12ヌクレオチド配列をランダム
化した実施例1Eに記載されるように作製された増幅産物を、同様に消化したも
とのpMT4−3ファージミド内で連結反応するためにXhoI及びAatII
で消化した。XhoI部位は重鎖フレームワーク1領域の最初の6ヌクレオチド
に存在し、AatII部位はCDR3の最後の6ヌクレオチドであった。増幅し
たXhoI/AatII制限消化重鎖CDR1とCDR3突然変異誘発産物の集
団の連結反応により、重鎖のこの部分のpMT4−3から維持されたフレームワ
ーク4領域へのフレーム内連結反応が得られた。即ち、CDR1及びCDR3の
段階ランダム化において、指定されたヌクレオチドのみがpMT4−3重鎖可変
領域のヌクレオチド配列内でランダム化した。前述のように、pMT4−3の軽
鎖は未変化のままであった。
次に、得られたCDR1及びCDR3のランダム化重鎖領域を有する連結した
pMT4−3を、次のXL1−Blueへの形質転換に対して実施例1Cに記載
されたように処理した。形質転換後、前述のように発現してファージライブラリ
ーのCDR1及びCDR3のランダム化重鎖領域を有するFab抗体のファージ
表現断片を得た。ファージライブラリーを前のように力価測定し、約8×106
ファージ粒子(cfu)を含有した。次の操作のために、このライブラリーをま
ず増幅して実施例1Dに記載された1011cfuの貯蔵ライブラリーを得た。
次に、6ラウンドのパンニングを含む第2パンニング選択プロトコールを、実
施例1Dに記載された増幅ライブラリーで行ってgp120に結合したFabを
得た。パンニング手順から、重鎖CDR1及びCDR3ランダム化アミノ酸残基
配列と図2に示され配列番号:6で示されたもとのMT4軽鎖配列を有する8個
のgp120特異的Fabヘテロ二量体を選択し、更に実施例1G及び1Hに記
載されるように確認した。
G.HIV−1特異的モノクローナル抗体Fabと対応する誘導アミノ酸残基
配列間の核酸配列分析の比較
更に上記のようにファージ表面で発現した突然変異誘発ヘテロ二量体の特異性
を配列分析及び機能特性によって確認するために、酸で溶離したファージから可
溶性Fabヘテロ二量体を調製した。
可溶性ヘテロ二量体を調製するために、上記で調製したgp120反応性クロ
ーンからのファージミドDNAを単離し、SpeI及びNheIで消化した。こ
れらの制限酵素で消化すると、適合しうる付着端を生じた。geneIII部分
を欠く4.7kbDNA断片をゲル精製(0.6%アガロース)し、自己結合させ
た。E.coliXL1−Blueを形質転換すると、cpIIIフラグメントを欠く
組換え体が分離した。クローンの1.6kb断片を生じるにちがいないcpII
IフラグメントのXhoI−XbaI消化による除去を試験した。クローンを5
0μg/mlのカルベニシリン及び20mMMgCl2を含有する100mlSB中37
CでOD6000.2が得られるまで増殖した。IPTG(1mM)を加え、培養液を
30Cで一晩増殖した(37Cにおける増殖はヘテロ二量体の収率がわずかだけ
減少する)。細胞をJA10ローター中4000 rpm、4Cで15分間遠心すること
により沈降させた。細胞を34μg/mlのフッ化フェニルメチルスルホニル(PM
SF)を含む4mlのPBSに再懸濁し、氷上で音波処理することにより溶解した
(50%処理に2〜4分)。デブリをJA10ローター中4000 rpm、4Cで15
分間遠心することにより沈降させた。上清を−20Cで貯蔵した。多量のクロー
ンを調べるために、10mlの培養液は分析に十分なヘテロ二量体を与えた。この
場合、音波処理は2mlのバッファー中で行った。
核酸の配列決定は、シークエナーゼ1.0(USB、クレーブランド、オハイ
オ州)を用いて可溶性二本鎖Fab発現DNAについて行った。4つの選択され
た特定の合成gp120特異的Fabの誘導重鎖アミノ酸残基を図1に示す。選
択されたFabは3b1、3b3、3b4及び3b9と称した。8種の選択され
た特定の合成gp120特異的Fabの誘導重鎖アミノ酸残基配列を図5に示す
。図5に示される8配列は、図1に示される3b1、3b3、3b4及び3b9
のCDR1の Kabat同定アミノ酸残基31〜35及びCDR3のアミノ酸残基9
6
〜99が含まれる。Kabat位置96〜99は、図1及び配列表(配列番号:1〜
5)に示される実際のアミノ酸残基位置98〜101に対応する。選択された合
成Fabは、3b1、3b2、3b3、3b4、3b6、3b7、3b8及び3
b9と称した。
CDR1のアミノ酸残基31〜35に対して図5の実験Bに示されたアミノ酸
残基は、次の通り配列番号:26〜33に指定された:Asn-Phe-Thr-Leu-Met(
3b1、配列番号:26)、Asn-Tyr-Thr-Ile-Met(3b2、配列番号:27)、A
sn-Phe-Thr-Val-His(3b3、配列番号:28)、Asn-Tyr-Thr-Leu-Ile(3b4、
配列番号:29)、Asn-Phe-Ile-Ile-Met(3b6、配列番号:30)、Asn-Phe-Se
r-Ile-Met(3b7、配列番号:31)、Asn-Tyr-Thr-Ile-Gln(3b8、配列番号
:32)及びAsn-Phe-Thr-Val-His(3b9、配列番号:33)。CDR3のKabat
同定アミノ酸残基96〜99に対して図5の実験Bに示されたアミノ酸残基は、
次の通り配列番号:34〜42に指定された:Pro-Tyr-Ser-Trp(MT4、配列番
号:34)、Gln-Trp-Asn-Trp(3b1、配列番号35)、Pro-Trp-Thr-Trp(3b2
、配列番号36)、Glu-Trp-Gly-Trp(3b3、配列番号37)、Pro-Trp-Asn-Trp(
3b4、配列番号38)、Leu-Trp-Asn-Trp(3b6、配列番号39)、Ser-Trp-Ar
g-Trp(3b7、配列番号40)、Pro-Tyr-Ser-Trp(3b8、配列番号41)及びPr
o-Trp-Arg-Trp(3b9、配列番号42)。
誘導配列を相互に及び遺伝子バンクデータベースとの整合並びは、MacVector
プログラムを利用した。SanZ,J.Immunol., 147:1720-1729(1991)に記載され
ている重鎖CDR3配列の分析の場合、Kabatら,免疫学的に関心のあるタンパ
ク質の配列、米国保健社会福祉省、ワシントン、DC(1991)によればほとんどの
5′ヌクレオチドがH鎖可変領域のコドン95後の第1ヌクレオチドであるとみ
なされた。
CDR3のアミノ酸残基配列のランダム化後の6ラウンドのIIIb由来gp
120に結合するための選択を評価するにあたり、具体的なアミノ酸残基の保存
も留意される。詳細には、MT4Fabにランダム化されたアミノ酸残基は、M
T4の3〜6番目のアミノ酸残基位置の図1に示されるPro-Tyr-Ser-Trpであっ
た。これは、配列番号:1のアミノ酸残基位置98〜101に対応する(Kabat
位置96〜99)。トリプトファン残基は、ランダム化及び選択手順中未変化の
ままであった。4つの好ましいCDR1及びCDR3ランダム化Fab全てにお
いて、チロシンアミノ酸残基はトリプトファンによって置き換えられ、その点で
この位置の具体的なアミノ酸残基に選択の強制を示した。3b8の誘導アミノ酸
残基配列は、MT4のものと同じであり、CDR1及びCDR3ランダム化ライ
ブラリーに汚染を示すことがある。
重鎖CDR1及びCDR3のランダム化アミノ酸残基配列が可溶性Fabの機
能上の能力に効果があったことを評価するために、結合親和性の調査及び中和分
析の双方を実施例1Hに記載されるように行った。4種のクローン、3b1、3
b3、3b4及び3b9を次の調査に選んだ。これらの4種のクローンは、アミ
ノ酸配列の小さな変化により確認された相互に近い配列を有し、また、位置96
及び98においてアミノ酸残基の同一性の最も劇的な変化を示すものである。
H.ランダム化CDR1及びCDR3重鎖領域を有するgp120特異的
Fabの機能上の確認
1)結合親和性分析
全CDR1及びCDR3の18のアミノ酸残基の4つにランダム化されたアミ
ノ酸残基配列を有する4種の選択Fab、3b1、3b3、3b4及び3b9を
結合親和性分析に用いた。表面プラスモン共鳴分析を BIAcore結合親和性測定装
置(Pharmacia、ピスカタウエイ、ニュージャージー州)で製造業者の説明書に従
って行いランダム化Fabの親和性が新しいFabが誘導されたもとのMT4F
abに比べて結合親和性を改善したかを求めた。
本分析において、HIV−1のMN(AgMed、ケンブリッジ、マサチューセツ州
)及びIIIb(American Bio-Technologies)株の双方から単離したgp120糖
タンパク質をゴールドチップ上に被覆した。次に、MT4を含む上記の4種の可
溶性Fabを別個にgp120被覆ゴールドチップと混合し、Fabのリガンド
への結合を BIAcore装置で測定した。ゴールドチップの質量がFabのリガンド
への結合のために増加するので、そのチップの屈折率が増加し質量の増加におい
て同等の増加を示す。“on”速度の測定が“off”速度のほかに行われ、後
者はFabがリガンドから解離し始めかつ質量が同等に減少するにつれて生じ、
もって、屈折率の変化を測定することができる。簡単に言えば、N−ヒドロキシ
スクシンイミド及びN−エチル−N′−(3−ジエチルアミノプロピル)カルボ
ジイミドで固定化するためにセンサーチップを活性化した。50μl の50μg/
ml試料を注入することにより、MN由来又はIIIb由来のgp120タンパク
質を表面に結合した。過剰の活性化エステルを15μl のエタノールアミン、1
M pH8.5で急冷した。典型的には、4000共鳴単位を固定化した。濃度範
囲(0.5〜10μg/ml)のFabを流速5μl/分で注入することにより、Fa
bフラグメントの固定化gp120への結合を調べた。1単位時間あたりの共鳴
単位の増加として会合をモニターした。会合相の終わりに続いて流速50μl/分
で解離測定値を得た。結合表面をHCl、1M NaCl、pH3で再生し、20
〜40の測定の間活性のままであった。会合及び解離速度定数、Kon及びKoff
をBarbasら,Gene,印刷中(1993); Altschuh ら,Biochemistry,31:6298-6304(
1992);及びKarlssonら,J.Immunol.Methods, 145:229-240,(1991)に記載され
ている一連の測定から求めた。平衡会合及び解離定数は、速度定数から演繹した
。
4種のランダム化Fab及びMT4全てに対するon及びoff測定値を共に
集めた。これらの測定値から、on定数(Kon(M-1s-1)をoff(Koff(s-1
)定数で割ることによりKaを求めた。解離定数、Kdもこれらの測定値から求
め、Koff/Konとして示される。MN株及びIIIb株の双方から単離したg
p120に対するon及びoff値の双方の測定値を各々下記表1及び表2に示
す。更に、分析したFab全てに対して結合親和性の測定から算出したKa及び
Kd値を示す。
表1及び表2のそれぞれのデータの分析、つまりHIV−1のMN株及び III
b株からのgp120へのランダム化Fabの結合親和性分析では、ランダム化
Fabの結合親和性は、それらランダム化Fabが誘導された元のgp120特
異性Fab、つまりMT4に比較して高くなっている。ただ1つのFab、つま
り3b4だけが、表1に示すように、MN株からのgp120への結合において
Kaの増加を示さなかった。MN由来gp120への結合において他の全てのF
abは、MT4のものよりも3〜10倍の結合親和性の増加を有した。全てのラ
ンダム化Fabは、表2に示すように、IIIb由来gp120に対してはより大
きな親和性を示した。Fab 3b3は、MN由来gp120でそうであるよう
に、MT4よりも10倍大きなKaを有した。しかしながら、MN株への3b3
の結合親和性に対して IIIb株への3b3の結合親和性も、それぞれ 1.3×108
に対して 1.3×109と10倍高かった。
このように、ランダム化CDR1及びCDR3を有するFabは、元のMT4
Fabに比較して高まった結合親和性を示すだけでなく、その結合親和性はそ
のgp120リガンドが誘導されたHIV−1株に依存して更に高まった。従っ
て、4種のFab、つまり3b1、3b3、3b4及び3b9内のCDR1及び
CDR3アミノ酸残基配列のランダム化は、HIV−1のMN株及び IIIb株の
両方からのgp120へのFabの結合親和性の有意義かつ意外な増大をもたら
した。この機能的側面は、既知のgp120特異性抗体並びに他のHIV−1抗
体に比較して高まった結合親和性が、以下に記載するように、標的設定機能及び
中和機能を高めるであろうという点で、診断及び治療用途にとって重要な属性で
ある。
2)ランダム化CDR1及びCDR3を有するgp120特異性Fabの中
和活性
ウィルスへの抗体の結合は、感染力の低下又は中和をもたらし得るので、抗体
はウィルスに対する防御メカニズムのほかにも果たすべき重要な役割を有するこ
とが幅広く受け入れられている。しかしながら、抗体中和の基礎をなす分子的原
理の理解が限られており、抗体の他のエフェクター機能の理解に遅れをとってい
る。かかる理解は、ワクチンの理に適ったデザイン及び予防又は治療用に受動抗
体を最も有効に用いるのに必要である。このことは、ヒト免疫不全ウィルスにと
っては特に緊急事である。
幾つかの研究で、ウィルスは1を越えるメカニズムにより中和され、そして採
用されるそのメカニズムはウィルスの性質、認識されるエピトープ、抗体のアイ
ソタイプ、ウィルスの侵入に使用される細胞レセプター、及びウィルス:抗体比
の如き要因に依存するであろうという一般的結論が導かれた。中和の原理メカニ
ズムは、ウィルス粒子の凝集、細胞レセプターへのウィルスの付着の阻害、及び
ウィルス膜と細胞膜の融合及びウィルス粒子の第2の脱外被の如き付着後の事象
の阻害として考慮することができる。第3のメカニズムの重要な特徴の1つは、
それが、最初の2つのメカニズムに期待される抗体の凡その理論量よりも遙かに
少ない量を必要とするに過ぎないということである。というのは、中和にはウィ
ルス粒子上の少数の重要部位を占拠するだけで十分であり得るからである。例え
ば、インフルエンザAウィルス粒子の中和は、Outlawら,Epidemiol.Infect.,
106:205-220(1992)に記載された通り単一のヒット速度論に従うことが分かっ
ている。
HIV−1の抗体中和に関して集中的な研究が行われてきた。委細については
、Naraら,FASEB J.,5:2437-2455(1991)を参照のこと。その殆どのものは、
V3ループとして知られるウィルスエンベロープ糖タンパク質gp120の第3
超可変ドメイン内の単一線状エピトープに焦点を定めてきた。このループへの抗
体は、ウィルス膜と細胞膜との融合を阻害することにより中和すると示唆されて
いる。中和をもたらすこのループへの結合は、ウィルス−細胞相互作用の前又は
CD4へのgp120結合の後に起こり得る。Nara,In Retroviruses of Human
Aids and Related Animal Diseases,Girard ら編,pp.138-150(1988);Lin
sely ら,J.Virol.,62:3695-3702(1988);及びSkinnerら,J.Virol.,67:4
195-4200(1988)を参照のこと。V3ループの特徴は、そのループ内の配列可変
性[Goudsmitら,FASEB J.,5:2427-2436(1991)及び Albertら,AIDS,4:107-
112(1990)]及びそのループの外側の配列変化へのそのループに対する中和抗体
の感受性である[Naraら,FASEB J.,5:2437-2455(1991);Albertら,AIDS,4:
107-112(1990);Mckeating ら,AIDS,3:777-784(1989);及びWahlberg ら
,AIDS Res.Hum.Retroviruses,7:983-990(1991)]。このことから、抗V3ル
ープ抗体はしばしば株特異的となるので、ループ内での in vivo突然変異が抗体
中和からのウィルスの逃避のメカニズムを提供するのかも知れない。
最近、gp120へのCD4結合を遮断することができる抗体にかなりの興味
が集中している。幾つかのグループは、これら抗体の特徴を次のように記載して
いる:(a)配座性、即ち非線状エピトープと反応する、(b)広範囲のウィルス分離
株と反応する、及び(c)長期間感染後にはヒトにおける優勢な中和抗体となる。B
arkowerら,J.Virol.,65:5983-5990(1991);Steimer ら,Science,254:105
-108(1991);Hoら,J.Virol.,65:489-493(1991);Kangら,Proc.Natl.A
cad.Sci.USA,88:6171-6175(1991);Posnerら,J.Immunol.,146:
4325-4332(1991);及び Tilley ら,Res.Virol.,142:247-259(1991)を参
照のこと。
このタイプの中和抗体は、潜在的療法の有望な標的を提示するように思われる
。これら抗体の中和のメカニズムは未知であるが、ウィルス付着の遮断ではない
だろうという幾つかの指摘がある。というのは、gp120へのCD4結合を阻
害する幾つかのマウスモノクローナル抗体が非中和性であるか又は弱く中和する
に過ぎないからである。
Burtonら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:10134-10137(1991)により記載
された組み合わせライブラリーを用いるHIV−1のエンベロープに対するヒト
モノクローナル抗体の産生で、中和の問題への新規なアプローチが可能になる。
gp120のための3次元構造とウィルスの複雑性の欠如を前提として、重鎖、
軽鎖のいずれか又はその両方におけるCDRのランダム化を介してgp120特
異性Fabの機能的活性を高めるアプローチは、関連抗体の挙動を介して分子レ
ベルで中和することを模索している。実施例1Fで調製したヒト組換えFabに
関してここに記載したようにして中和検討を行って、MN株又は IIIb株のいず
れかから誘導したgp120への結合親和性について上記の通り分析した。
a)ランダム化CDR1及びCDR3を有するgp120特異性Fab
のMN由来gp120での中和活性
融合細胞アッセイを行って、組換えヒトHIV−1免疫反応性Fabの中和活
性を測定した。これらアッセイの幾つかのために、まず組換えFabを精製した
。50μg/mlカルベニシリン及び20mM MgCl2を含有するSBの1
リッター培養液に適切なクローンを接種し、7時間後に2mM IPTGで誘発
し、そして30℃で一晩増殖させた。細胞ペレットを音波処理して得られた上澄
み液を50ml容量まで濃縮した。濾過した上澄み液を25mlプロテインG−
抗Fabカラムにかけ、3ml/分の速度で120ml緩衝液で洗浄してpH2
.3のクエン酸で溶離させた。次いで、中和した画分を濃縮してpH6.0の5
0mM MES中に交換して2mlの Mono-S カラムに1ml/分の速度でかけ
た。0〜500mMの勾配のNaClを1ml/分で流すと、Fabが200〜
250mM NaClの範囲内で溶離した。濃縮後、ELISAでgp120に
対し
て滴定するとそのFabは陽性で、10〜15%SDS−PAGEにより50k
Dの単一バンドを与えた。濃度は、1.4の吸光係数(1mg/ml)を用いる
280nmでの吸光度測定により出した。
HIV−1のMN株での定量的中和アッセイを Nara ら,AIDS Res.Human Re
troviruses,3:283-302(1987)に記載された通りに行った。なお、その開示内
容は参照によりここに組み入れられるものとする。CEM−SS標的細胞の単層
をFab抗体、つまり3b1、3b3、3b4、3b9及びMT4の存在下又は
不存在下でウィルスと共に培養して、融合細胞形成単位の数を3〜5日後に測定
した。試験する種々の抗体濃度を直接比較できるように等量のウィルスをこのア
ッセイに用いた。このアッセイは、2〜4倍の抗体濃度の差の範囲内で1〜0.
001のウィルス生存画分範囲にわたって反復可能であった(P<0.001)
。
概して少なくとも2回アッセイを繰り返して再現性ある結果を得た。表3に示
すデータについて、データをIC50(M-1)として及びナノグラム/ミリリッタ
ー(ng/ml)での中和力価としての両方で表している。中和力価は、1/I
C50×(5×1010)として計算される。元のgp120特異性Fab、つまり
HIV−1血清陽性個体からの骨髄ライブラリーから最初に選択されたFabは
、Barbasら,J.Mol.Biol.,230:812-823(1993)により、融合細胞形成アッセ
イとp24アッセイの両方において、高い結合親和性及び等しく有効な中和能力
を有するとして、以前にその特徴が明らかにされている。ここに記載した通りに
行った中和アッセイでは、MT4 Fabは、融合細胞形成の減少度により測定
して、細胞内へのHIV−1の感染力を阻害する約300ng/mlの中和力価
を示した。全く対照的に、全てが元のクローンpMT4−3から誘導されたこの
発明の4種のランダム化Fab、つまり3b1、3b3、3b4及び3b9は、
このアッセイで約5ng/mlから20ng/mlまでの中和力価を示した。こ
れは、MT4及びHIV−1感染を中和することが知られている抗体と比較して
、ランダム化Fabの中和能力の力価が10倍を越えて増加するという、大きな
向上に相当する。
このように、gp120への結合及びHIV−1感染の中和に元々有効なクロ
ーンの重鎖のCDR1及びCDR3の両方をランダム化するこの発明の方法は、
高まった結合親和性並びに感染力の中和能を有するFabの有意義かつ意外な改
良をもたらした。更には、図3にグラフで示す通り、結合親和性の増加と細胞の
HIV−1感染を阻害する能力の間の相関関係が存在する。その図では、MT4
と一緒にランダム化Fabの結合親和性をIC50により示される中和力価に対し
てプロットした。この図では5つの別々の四角形が、2つの機能的特性値に基づ
いてプロットされた5種のFabそれぞれについて示されている。このグラフを
見ると直線的関係が容易に理解できる。このように、結合親和性とHIV−1感
染を中和する能力に相関関係がある。更には、この発明の全4種のランダム化F
abは、この図でそれらFabが直線的に増加することが示されていると共にM
T4が最低の結合親和性と中和能力を有し、それに3b4、3b9と3b1(比
較的近い)及び最後に3b3が続くことが示されているように、MT4に比較し
て高い相関関係を示した。後者のFabはMN株又は IIIb株のいずれから誘導
されたgp120にも結合し、そしてこの発明の全てのランダム化Fabのうち
で最低の中和力価を有した。このように、CDR1及び3種のCDR3アミノ酸
残基のランダム化(後者における6番目の位置のトリプトファンが選択全体を通
して保存されている)が、非ランダム化gp120特異性Fabに比較して、結
合親和性及びHIV−1感染を中和する能力の両方に有意な向上をもたらした。
b)ランダム化CDR1及びCDR3を有するgp120特異性Fab
のII b由来gp120での中和活性
実施例H2aで記載した通りに、HIV−1の IIIb株で定量的中和アッセイ
を行った。表4に示す結果について、データをIC50(M)として及びナノグラ
ム/ミリリッター(ng/ml)での中和力価としての両方で表している。中和
力価は、1/IC50×(5×1010)として計算される。gp120特異性Fa
b MT4、つまりHIV−1血清陽性個体からの骨髄ライブラリーから最初に
選択したFabは、Barbasら,J.Mol.Biol.,230:812-823(1993)により、融
合細胞形成アッセイとp24アッセイの両方において、高い結合親和性及び等し
く有効な中和能力を有するとして、以前にその特徴が明らかにされている。ここ
に記載した通りにHIV−1の IIIb株からのgp120で行った中和アッセイ
では、MT4 Fabは、融合細胞形成の減少度により測定して、細胞内へのH
IV−1の感染力を阻害するのに要求される約39ng/mlの中和力価を有し
た。全てが元のクローンpMT4−3から誘導されたこの発明の4種のランダム
化Fab、つまり3b1、3b3、3b4及び3b9は、約22〜66ng/m
lの中和力価を有した。これは、類似の効力を有するFabのクラスター化を表
わすものである。HIV−1の IIIb株からのgp120では、最も効力のある
Fab、つまり3b1で僅か3倍のレンジに過ぎない反応性が記録され、元のM
T4 Fabに比較すると2倍というあまり大きくない増加を示すに過ぎなかっ
た。
この発明のFab、つまり3b1、3b3、3b4及び3b9は、MNで示さ
れたのと同じの目立った効力の増加をIII bでは示さないが、これらFabが誘
導されたMT4 Fabが、MN由来gp120でよりも10倍大きな効力をII
Ib由来gp120で示すということが注目されるべきである。
2つのタイプのgp120への精製Fabの結合の速度が、高度に発散した分
離株MN及び IIIbから比較された。Myers ら,Human Retroviruses and Aids
1992,Theoretical Biology and Biophysics,Los Alamos,NM,(1992)。組換え
タンパク質MN由来gp120と IIIb由来gp120との比較で、88のアミ
ノ酸残基が整列させた配列内で変わっているだけでなく、11のアミノ酸残基の
欠失と5のアミノ酸残基の挿入が明らかになった。標的細胞の感染性には、その
標的の表面上のCD4分子へのウィルス表面糖タンパク質gp120の結合が要
求されるので、gp120上のCD4結合部位が抗ウィルス抗体のとっての共通
の標的である。Sun ら,J.Virol.,63:3579-3585(1989);Thali ら,J.Virol.
,65:6188-6193(1991);Tilleyら,Res.Virol.,142:247-259(1991);Karw
owska ら,AIDS Res.Hum.Retroviruses,8:1099-1106(1992);及びMooreら
,J.Virol.,67:863-875(1993)。しかしながら、この領域に対する抗体は、一
般にウィルス中和の点で特に効力がない。更には、かかる抗体は、より普通に用
いられている実験株よりもウィルスの一次分離株(primary isolate)に対して
効力がより低い傾向さえある。Mooreら,Perspectives in Drug Discovery and
Design,1:235-250(1993)。従って、gp120上のCD4結合部位に向けら
れた、高い親和性、効力、及び幅広い株反応性を示すHIV−1中和ヒト抗体が
、予防的及び治療的用途に非常の望ましい。
この発明のFabは、HIV−1のMN及び IIIb実験株から誘導されたgp
120の両方で10-9レンジの格別な効力を示す。Fab 3b3のMN由来g
p120への親和性が54倍向上したことから、Fab 3b3を一次臨床(フ
ィールド)分離株での中和アッセイにおける更なる検討のために選択した。
c)ランダム化CDR1及びCDR3を有するgp120特異性Fab
の一次臨床HIV分離株での中和活性
治療又は予防目的のためにHIV−1に対する抗体を産生させるに際して鍵と
なる点は、それらが(高い親和性と中和能力という)高い効力を有しそして広い
範囲の一次臨床(フィールド)分離株と交叉反応性でなければならないという点
である。これらは、一般には、2つの相反する特性である。HIVの異なる患者
分離株間での抗原的関連の度合いは、ミクロプラーク(microplaque)アッセイ
における交叉中和(cross-neutralization)により検査されてきた。Wrinら,J.
of Acquired Immune Deficiency Syndromes,7:211-219(1994)。11個体からの
異種の血清及びウィルス分離株での交叉中和アッセイで、個々の血清間の中和の
幅が様々であること及び異なる一次臨床分離株間の中和の頻度が様々であること
が明らかになった。
HIV−1の一次臨床分離株の感染力の低下を測定するためのFab MT4
及び3b3の存在下での定量的アッセイを、Hansonら,J.of Clin.Microb.,2
030-2034(1990)に記載されたミクロプラークアッセイで行った。HIV−1の
一次臨床分離株は、Gallo ら,J.of Clin.Microb.,1291-1294(1987)に記載
された通りに血清陽性ドナーから得られた凍結末梢血リンパ球から分離して末梢
血単核細胞(PBMC)中で培養した。簡単に説明すると、HIV分離株は、凍
結HIV感染患者PBMCを血清陰性ドナーPBMCと共に、20%熱不活化ウ
シ胎児血清、2μg/mlポリブレン、5%インターロイキン−2、及び0.1
%抗ヒト白血球インターフェロンを含有するRPMI−1640培地中でインキ
ュベートすることにより得られた。この培養物に新鮮なドナーPBMCを1週間
に1回与え、そして11日目に逆転写酵素(RT)活性初動の存在についてその
上澄み液をアッセイした。RT数が2週間続けて血清陰性ドナーPBMC単独の
培養物中のものよりも10倍を越えて多いならこの培養物は陽性と考えられる。
得られたRT陽性ウィルス分離株をMT2(α−4クローン)内での細胞溶解
について試験し(Hansonら,J.of Clin.Microb.,2030-2034,1990)、これら
ウィルスが細胞溶解性であることが分かった。これは、後のMT2ミクロプラー
クアッセイ系に使用できるウィルスの要件である。一次PBMC分離株培養物か
らの上澄み液を用いて、健康な血清陰性血液ドナーからのフィトヘムアグルチニ
ン(PHA)刺激PBMCの拡大培養物を感染させた。これら感染PBMC培養
物を、15%ウシ胎児血清、5%インターロイキン−2、0.1%抗α−インタ
ーフェロン、2μg/mlポリブレン、50μg/mlゲンタマイシン、100
U/mlペニシリン、及び100μg/mlストレプトマイシンを補充したRP
MI−1640培地中で増殖させた。その粗上澄み液を7日後に採取してウィル
スストックとして−70℃で凍結させた。
このミクロプラークアッセイに用いたHIV−1の一次臨床分離株をVL13
5、VL263、VL596、VL069、VL434、VL114、VL17
2、VL530、及びVL750と名付ける。分離株VL135、VL434、
VL069、VL263、及びVL596は、以前にそれぞれ分離株1、3、4
、5、及び7として Wrin ら,J.of Acquired Immune Deficiency Syndromes,
7:211-219(1994)に記載されたものである。
実験HIV−1株MN及び IIIb並びに分離株VL069をこのミクロプラー
クアッセイにおける対照としてH9細胞内で増殖させた。H9細胞内でのVL0
69の増殖は、分離株をH9細胞内で増殖させたときに感作をもたらす宿主細胞
効果であって以前に Sawyerら,J.Virol.,68:1342-1349(1994)に記載された
効果を示すために行ったものである。
Fab MT4及び3b3及び13人のHIV−1血清陽性患者(+PHP)
からのヒト血漿のプールを、Hansonら,J.of Clin.Microb.,2030-2034(1990)
に記載された通りに、96ウェルマイクロタイタープラーク減少アッセイにおけ
る中和抗体の供給源として用いた。簡単に説明すると、Fab MT4又は3b
3の段階的希釈液(50μg/mlで始めて下げてゆく)又は熱不活化プール患
者血漿(1:10希釈比で始めて1:256まで下げてゆく)をウェル当たり1
0〜25プラーク形成単位(PFU)を含有する等容量のHIVと混合して37
℃で18時間インキュベートした。ウィルス及び患者血漿の両方の希釈に用いた
希釈剤は、56℃で60分間熱不活化して補体を除去した50%正常ヒト血清プ
ール(ヒト血漿の再石灰化により調製したもの)を含有するものであった。陰性
対照ウェルも、患者免疫血清のない50%正常ヒト血清プールを含有するもので
あった。Fab又は血清とウィルスとを18時間インキュベートした後、ウェル
当たり90,000のMT2細胞を加えて37℃で1時間インキュベートした。
次いで、39.5℃のアッセイ媒質中の SeaPlaque Agarose を加えて1.6%
の最終濃度にした。この温アガロースを融解させたまま、それらマイクロタイタ
ープレートを20℃で20分間500×gで遠心分離して細胞単層を形成させた
。これらプレートを37℃で5日間インキュベートしてから、50μg/m
lヨウ化プロピジウムで18〜24時間染色した。それら蛍光プラーク数を低拡
大能ステレオズーム顕微鏡を用いる304nm紫外線光源による透視で数えた。
感染力の阻害性又は中和力価は、対照と比較してプラーク数の50%阻害を与え
るFabのμg/ml数又は血漿希釈度として定義される。実験を行っている間
、内挿力価(interpolated titer)の固有統計的誤差は平均±30%である。
Fab MT4及び3b3及び13ドナーからのプールHIV血清陽性ヒト血
漿(+PHP)についての感染力の阻害性又は中和力価を表5に示す。各ウィル
ス分離株についての中和力価を、対照に比較したプラーク数の50%阻害に要求
されるFab MT4及び3b3の最少μg/ml数として表わす。各ウィルス
分離株についての中和力価を、対照に比較したプラーク数の50%阻害に要求さ
れる13ドナーからのプールHIV血清陽性ヒト血漿(+PHP)の最少力価と
して表わす。
Fab MT4は、対照に比較したプラーク数の50%阻害に要求されるμg
/ml数として測定して50μg/ml及びそれ未満の濃度で、アッセイした9
の一次臨床分離株のうち2だけを中和できたに過ぎなかった。対照的に、Fab
3b3は、対照に比較したプラーク数の50%阻害に要求されるμg/ml数
として測定して50μg/ml及びそれ未満の濃度で、9の一次臨床分離株のう
ち6を中和することができた。かくして、最も親和性が高いFab、つまり3b
3は、それが誘導されたFab MT4に比較して更に4の一次臨床分離株を中
和できた。Fab 3b3によるそれぞれ38.9及び29.5μg/mlでの
分離株VL135及びVL530の50%中和はかなりのものである。というの
は、3b3が誘導されたFab MT4は50μg/mlで大したこといのない
レベルの中和(約10%)を示したに過ぎないからである。MN及び IIIb由来
gp120の中和は、実施例2Hで記載した先に行った融合細胞形成アッセイに
比較した場合、このミクロプラークアッセイでは約5倍向上した。
このように、gp120への結合及びHIV−1感染の中和に元来有効である
Fabクローンの重鎖のCDR1及びCDR3の両方をランダム化するこの発明
の方法は、幅広い中和活性を有するFabの有意義かつ意外な改良ももたらした
。この幅広い中和活性は、まず、高度に発散したHIV−1 gp120分離株
MN及び IIIbとの結合親和性の増加により証明された。パンニング過程の間の
選択圧力を、発散したgp120の混合物で選択することにより交叉反応性に有
利なようにかけることができたであろうが、これは、MN及び IIIb由来gp1
20の両方への高まった結合親和性を有するFabが同定されたので、必要では
なくなった。
MN及び IIIb由来gp120ストックでの中和アッセイでの量的感染性によ
り判定した効力もやはり向上している。親和性は、MN由来gp120では中和
能力とよく相関している。この発明のFabの効力は、可溶性CD4(sCD4
)の効力と同等である。Layne ら,Nature,346:277-279(1990)。sCD4と同
等の効力で中和するこの能力は、特有のものである。
この発明のFabの幅広い中和活性は、HIVの一次臨床分離株での定量的中
和アッセイで更に証明された。MN由来gp120への最高の親和性を示したF
ab 3b3は、それが誘導されたFab MT4に比較して更に4の一次臨床
分離株を中和することができる。中和アッセイにおいてこれら一次臨床分離株の
特徴を明らかにしたところ、複数表現型を示唆する異種性中和のパターンが明ら
かになった(Wrinら,J.of Acquired Inmmune Deficiency Syndromes,7:211-21
9,1994)。かくして、gp120に効果的に結合してHIV−1感染を中和する
Fabの重鎖のCDR1及びCDR3のランダム化が、複数表現型の一次臨床分
離株との幅広い中和反応性を有するFabをもたらした。
2.ランダム化重鎖及び軽鎖CDRを有する4種のファージミドライブラリーの
調製及びそれから発現される親和性最適化Fabの分泌
A.ランダム化重鎖及び軽鎖gp120特異性Fab抗体を得るための方法
の概説
実施例1に記載したpMT4−3の重鎖CDR1及びCDR3領域の突然変異
誘発で、gp120についての親和性の増加と共に複数表現型の一次臨床分離株
との幅広い中和反応性を示す3b3重鎖及び軽鎖Fabヘテロダイマー抗体を発
現するためのp3b3と名付けられるファージミド(phagemid)が生成した。
この発明の高親和性gp120特異性Fab抗体を産生する方法は、実施例2
及び3に記載の通り、実施例1で得たpMT4−3又はp3b3のいずれかのC
DR特異的ランダム突然変異誘発法(CDR-directed random mutagenesis)に基
礎を置いている。より詳しくは、予め選択したCDRを鋳型DNA中でランダム
化して基質gp120への結合性を最適化した。この選択的最適化の後、異なる
gp120反応性Fabからの突然変異CDRをコードするヌクレオチド断片を
特定の組み合わせで結合させて、複合重鎖及び軽鎖ドメインを形成させた後、1
0-10M又はそれより大きな解離定数(Kd)を有する可溶性複合最適化CDR含
有Fabの発現のための発現ベクター内に挿入した。
次の一般的アプローチを用いて、高まった親和性を有する複合最適化CDR含
有Fabを得た:1)予め選択したファージミド鋳型内での特定CDRのランダ
ム突然変異誘発と結び付けた増幅から各ライブラリーを生じさせるこの発明の方
法を用いて、新たなファージミドライブラリーを生じさせ;2)ファージミド−
Fabディスプレイドライブラリー(phagemid-Fab displayed libraries)をg
p120でスクリーニングした後、追加のライブラリーの調製用に特定クローン
を選択してgp120との高親和性Fab抗体相互作用を付与するための複数の
最適化CDRを有するクローンを得;3)次いで、好ましい突然変異Fabを発
現するクローンを用いて、ランダム化して選択したCDR1及びCDR3重鎖及
び軽鎖を有する、gp120への高親和性結合について最適化された特有のFa
b発現性クローンを作り出した。
上の概説に記載した通りにライブラリーを作りそしてスクリーニングするに際
し、発現されるFabの配列及び親和性分析用に、次のライブラリーを調製して
gp120特異性クローンをそれから選択した。
1つのライブラリーについては、Fab 3b1、3b3、3b4、及び3b
9をコードするクローン内での第1回目のスクリーニングで得られた、グリコシ
ル化反応性アスパラギン残基の代わりにヒスチジン残基をCDR1の最初の位置
に有することによりグリコシル化されないFabを発現する、追加のgp120
特異性クローンを得るために、ランダム化重鎖CDR1(15ヌクレオチド)を
有するpMT4−3ライブラリーを、実施例1に記載した通りに第2回目のスク
リーニングに付した。次いで、選択されたFabをコードするDNAを、親和性
及びヌクレオチド配列決定用の可溶性Fabの調製のために、pPho−TTベ
クター内に挿入した。
第2のライブラリーについては、pComb3H内のファージミド3b3の重
鎖CDR3も、Fab 3b3を発現するファージミドを形成するために実施例
1に記載した通りにpMT4−3内で先に突然変異誘発した12ヌクレオチドに
隣接する15ヌクレオチドにわたって別々にランダム化した。CDR3における
この突然変異域の拡張は、Fab 3b3で得られるものと等しいか又はそれよ
りも大きなgp120への親和性を有するFabを得るために行った。新たにラ
ンダム化したCDR3を含有するオーバーラップPCRからの増幅産物を3b3
中に連結し直して、ランダム化重鎖CDR3を先にランダム化して選択した重鎖
CDR1及び元々pMT4−3から誘導された非突然変異軽鎖と一緒に有するラ
ンダム化ライブラリーを形成させた。発現、選択及び特性決定は、上に記載した
通りに行った。
第3のライブラリーについては、pComb3H内のファージミド3b3の軽
鎖CDR1を、CDR1内の12アミノ酸のうちの6をコードする18ヌクレオ
チドにわたって別々にランダム化した。次いで、ランダム化軽鎖CDR1を有す
る得られた増幅産物を3b3中に連結して、3b3に基づく軽鎖CDR1突然変
異ライブラリーを形成させた。かくして、このライブラリーから選択したクロー
ンは、元の3b3突然変異重鎖CDR1及びCDR3及び新たに突然変異誘発さ
れた軽鎖CDR1を発現するためのヌクレオチド配列を含有した。
軽鎖CDR3の一部分(15ヌクレオチド)がランダム化された第4のライブ
ラリーを上で第3のライブラリーについて記載した通りに調製した。得られた3
b3に基づくライブラリーは、3b3突然変異重鎖CDR1及びCDR3及び新
たに突然変異誘発された軽鎖CDR3を元の3b3軽鎖CDR1と共に発現する
ためのヌクレオチド配列を有するクローンを含有した。
最適化軽鎖CDRI及びCDR3を有するgp120結合性合成Fabを作る
ために、好ましいクローン、つまりファージミドDを、ランダム化して選択した
軽鎖CDR1を有する第4ライブラリーから選択してから、軽鎖CDR3上でも
う1回の突然変異誘発に付した。得られたライブラリーについて、発現及びパン
ニング過程を2種の異なる方法、つまり酸で特異的に溶離する方法対可溶性Fa
b 3b3との競合後に酸で溶離する方法により行った。後者の溶離操作で、軽
鎖及び重鎖突然変異CDR1/CDR3の両方を有する10-11M又はそれより
大きなKdを示すFabをコードするクローンの分離ができた。
別々に同定して特性決定したFab発現性クローンにより提供される複合CD
Rを有する個別の軽鎖配列及び重鎖配列を調製して、そのCDRが得られるクロ
ーンに比較して親和性最適化された重鎖及び軽鎖可変ドメインを有する特有のF
abを作り上げた。
当業者は、上に列挙した工程を示した順序で行っても異なる順序で行っても、
突然変異重鎖及び軽鎖CDR領域を有するFabを調製できることが分かるであ
ろう。前述のライブラリーの調製及びそれからのgp120特異性Fabの選択
を以下に詳細に示す。
1)pComb3H発現ベクターの調製
発現ベクター、つまりpComb3Hは、実施例1に記載した元のpComb
3ファージミドの修飾型である。pComb3でのように、pComb3Hもフ
ァージディスプレイドバクテリオファージ外皮タンパク質3係留タンパク質(pha
ge-displayed bacteriophage coat protein 3-anchored proteins)を発現できる
。糸状ファージの遺伝子 III は、細菌膜上でのファージ組み立て過程における
押出しの前に発現されそして大腸菌の周辺質内に面する内膜上に蓄積する406
残基非主要ファージ外皮タンパク質、つまりcpIII(cp3)をコードする。
遺伝3及びコードされる外皮タンパク質の、それぞれヌクレオチド及びアミノ酸
残基配列は当業者によく知られており、かつ国際出願WO92/18619に公
表されている。なお、その開示内容は参照によりここに組み入れられるものとす
る。
修飾されたベクター、つまりpComb3Hは、以下に記載するように、重鎖
のアミノ末端にヒトコンセンサス配列を与えるようにデザインされたものである
。更には、そのベクターの安定性を高めるために、元のpComb3に見出され
る全ての相同性領域を除去した。1acZプロモーターからNotI制限部位に
かけてのpComb3Hベクターを図6に示し、抗破傷風毒素Fabをコードす
るヌクレオチド配列を含む完全ベクターのヌクレオチド配列であって、重鎖カセ
ット及び軽鎖カセットを占める配列を配列番号:43に掲げる。抗破傷風毒素(
TT)コーディング配列を含有するpComb3HベクターをpComb3H−
TTと名付ける。このTTコーディングスタッファー(TT-encoding stuffer)
をpComb3H−TTベクターから取り除くと、この発明の予め選択した重鎖
及び軽鎖ヌクレオチド配列を指向的に挿入することができる。
pComb3Hを用いるに際し、周辺質分泌シグナル(ompAリーダー)を
コードする第1シストロンをκ軽鎖に機能できるように連結する。このompA
のヌクレオチド配列、つまり発現されたタンパク質を周辺質空間に向けるための
リーダー配列は、Skerraら,Science,240:1038-1041(1988)に報告されている
。第2シストロンは、その融合タンパク質、つまりFd−cpIII に機能できる
よ
うに連結されたpe1Bリーダーをコードした。pe1B及びompAリーダー
の存在で、細菌の細胞質から周辺質空間への、Fd/cp3融合タンパク質を含
む融合タンパク質とκ軽鎖との両方の調和しているが別々の分泌が容易になった
。
各鎖は、後で開裂してしまうpe1B又はompAリーダー配列により周辺質
空間に送られた。重鎖はcp3膜アンカードメインにより膜内に係留され、軽鎖
は周辺質空間内に分泌された。Fab分子は、この係留された重鎖とこの可溶性
軽鎖との結合から形成されたものである。
pComb3HベクターはpComb3ベクターから誘導されたものなので、
以前に Shortら,Nucleic Acids Res.,16:7583-7600(1988)に記載されたpBlu
escript から誘導された1acZプロモーター、リボソーム結合部位、Co1E
1及びf1起点、及びペニシリナーゼ遺伝子を含有する。pBluescript の完全ヌ
クレオチド配列は、GenBank Accession Number 52330 を有する。cp3のアミ
ノ酸残基230〜406をコードするDNAをSpeI制限部位の3'であるS
fiI制限部位の後ろに挿入した(図6)。
pComb3Hベクターは2つのSfiI制限部位を含有する(図6)。これ
らSfiI部位の1つは、軽鎖の分泌を行わせるompAリーダーをコードする
ヌクレオチド配列内に含まれているので、SacI部位の5’に位置している。
第2SfiI部位は、SpeI部位とcp3膜アンカー配列の間にある。pCo
mb3Hベクターが軽鎖及びFdをコードするDNAを含有するときは、これら
2つのSfiI部位は、それぞれ軽鎖をコードするDNA配列の5’末端とFd
をコードするDNA配列の3’末端に位置する。重鎖及び軽鎖をコードするDN
Aを含有するpComb3HベクターをSfiIで消化すると、軽鎖、翻訳停止
配列、リボソーム結合部位、pe1Bリーダー及びFdをコードするDNAを含
むカセットが外れる。次いで、このカセットをこの発明に記載したpPho−T
Tベクターの如き他の発現ベクターに指向的に挿入することができる。従って、
pComb3内の元の制限部位に加えて、SfiI制限部位を付け加えることは
、1つの断片内の重鎖及び軽鎖カセット全体を以下に記載する通り可溶性Fab
の発現用のpPhoと名付けられた発現ベクター内にサブクローン化できるもう
1つの修飾である。
かくして、得られた組み合わせベクター、つまりpComb3Hは、1種の融
合タンパク質、つまりFd/cp3、及び1種の可溶性タンパク質、つまり軽鎖
を発現するための2つのカセットを有する3394塩基対DNA分子からなるも
のとなった。このベクターは、以下に5’から3’方向で列挙した機能できるよ
うに連結された要素のためのヌクレオチド配列も含有した:LacZプロモータ
ー/オペレーター配列;EcoRI制限部位;リボソーム結合部位;ompAリ
ーダー;SfiI制限部位;スペーサー領域;5’SacI及び3’XbaI制
限部位により縁取られたクローニング領域からなる第1カセット;これら2つの
カセット間に位置するNcoI制限部位;及び発現制御リボソーム結合部位;p
e1Bリーダー;アミノ酸残基 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu(配列番号:44)を
コードするヒトコンセンサスアミノ末端スペーサー領域;5’XhoI及び3’
SpeI制限部位により縁取られたクローニング領域であってSfiI制限部位
が後に続いている領域;バクテリオファージcp3をコードする配列であって停
止コドン及びNheI制限部位が後に続いている配列;発現制御停止配列及びN
otI制限部位からなる第2カセット。
配列番号:43に示され、pComb3H−TTと名付けられたpComb3
Hベクター配列は、長さが1,200bpである軽鎖TTコーディングスタッフ
ァー及び長さが300bpである重鎖TTコーディングスタッファーを含有する
。この発明のFabを発現するための軽鎖可変ドメインをクローニングするため
に、抗破傷風毒素Fab軽鎖の軽鎖スタッファーを制限酵素SacI及びXba
Iで消化することにより除去してから、同じようにして消化した軽鎖を挿入した
。この発明のFabを発現するための重鎖可変ドメインをクローニングするため
に、抗破傷風毒素Fab重鎖の重鎖スタッファーを制限酵素XhoI及びSpe
Iで消化することにより除去してから、同じようにして消化した重鎖を挿入した
。
次いで、この重鎖の発現に要求される軽鎖配列をコードするDNA及びこの重
鎖をコードするDNAを含有するカセットを以下に記載するようにpComb3
Hベクターから外し、そして制限酵素SfiIでの消化により、可溶性Fabの
産生用のpPho−TTベクター内に指向的に挿入した。また別に、pComb
3Hベクターを制限酵素NheI及びSpeIで消化してから再連結してcp3
膜アンカー配列を除去し、そして可溶性Fabを発現させることができる。
2)ファージミッド3b3重鎖及び軽鎖可変ドメインを含有するpComb
3Hの調製
重鎖及び軽鎖可変ドメインの両方を有するCDRランダム化発現合成ヒトFa
b抗体を得るために、各TTスタッファーを続けざまに置換することにより、フ
ァージミッド3b3の重鎖及び軽鎖可変ドメイン配列をpComb3H−TT内
に指向的に連結した。次いで、ファージミッドベクターを含有するこのpCom
b3H−3b3と名付けたベクターを、後の突然変異誘発操作のための鋳型とし
て用いた。3b3由来Fabのランダム化は、実施例2Cから2Eにかけて記載
されている。
pComb3H−3b3を調製するために、まずファージミッド3b3をXh
oI及びSpeIで消化してから、その断片を同じように消化したpComb3
H−TTベクターと連結してファージミッド3b3の重鎖可変ドメインを含有す
るpComb3Hベクターを生成させた。3b3から誘導される重鎖及び軽鎖の
両方を発現するためのpComb3Hファージミッドを作るために、3b3の軽
鎖カセットをSacI及びXbaIで消化してから、3b3重鎖を含有する同じ
ように消化したpComb3H−TTベクター内に挿入した。換言すると、pC
omb3H−TT内の重鎖及び軽鎖抗破傷風毒素スタッファーにそれぞれ置き換
わった3b3突然変異重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列及び3b
3由来軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を含有するpComb3
Hに基づくベクターである。この3b3軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列は、
図10及び配列番号:62に示すように、pMT4−3の配列と同じである。
発現後、pComb3H−ファージ係留Fabのライブラリーを先に記載した
通りのパンニングすることによりスクリーニングした。
B.ファージミッドpMT4−3の重鎖可変ドメインのランダム化CDR1
の調製
pMT4−3内の重鎖可変ドメインのCDR1を実施例1に記載しかつBarbas
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,91:3809-3813(1994)に記載された通りに
突然変異誘発した。なお、その開示内容は参照によりここに組み入れられ
るものとする。しかしながら、全てのスクリーニング及び選択したgp120特
異性Fabは、CDR1の最初の位置にアスパラギン(N)残基を含有した。こ
れはグリコシル化部位として役立つので好ましい残基ではない。従って、その位
置に好ましいヒスチジン(H)残基を有する更なるFabを得るために、第2回
目のスクリーニングを実施例1に記載した通りにpMT4−3内の重鎖CDR1
に関して行った。次いで、得られたgp120反応性ファージディスプレイドF
ab(gp120-reactive phage-displayed Fabs)をコードするヌクレオチド配列
を以下に記載する通りにpPho−TTベクター内にサブクローン化した。
1)ランダム化重鎖CDR1を有するpMT4−3由来Fabのアミノ酸残
基配列分析
上で作ったCDR1ランダム化クローンの核酸配列決定を、Sequenase 1.0(US
B,Cleveland,OH)を用いて、無作為に選んだ6種の二本鎖Fab発現性DNA
クローンについて行った。核酸配列決定は、この発明に記載したあらゆるFab
発現性ベクターを鋳型として用いて行うことができ、そのベクター推進Fab発
現が可溶性であるか膜係留性であるかに依存しない。MacVector の一連のプログ
ラムを用いて、誘導されるアミノ酸残基配列をお互いに及び Genbank データベ
ースと一緒に整列させた。選択した6種の特定の合成gp120特異性Fab及
びMT4の誘導された重鎖アミノ酸残基配列を図7A及び7Bに示す。図7に示
すように、可変重鎖ドメイン内のフレームワーク(FR)及び相補性決定領域(
CDR)を整列させると、無症候性HIV−1個体からの骨髄ライブラリーのス
クリーニングから得られた元のMT4 gp120特異性Fabでは、CDR1
のアミノ酸残基配列は、Asn-Phe-Val-Ile-His(配列番号:1,残基28〜32
より)であることが分かる。配列を比較して、位置31ではアスパラギン(N)
又はヒスチジン(H)のいずれかが好ましく、位置32では芳香族残基が好まし
く、位置33では主としてスレオニン(T)が好ましく、位置34ではイソロイ
シン(I)又はロイシン(L)が好ましく、そして位置35では疎水性及び/又
は芳香族残基が好ましいことが分かった。
CDR1について図7A及び7Bに示したこれら6種のアミノ酸残基は、ラン
ダム化されておりかつ示した各配列番号の位置28〜32、つまりH4H1−
1:His-Phe-Thr-Val-His(配列番号:45);H4H1−3:His-Phe-Thr-Leu
-His(配列番号:46);H4H1−5:His-Phe-Thr-Ile-Met(配列番号:4
7);H4H1−6:Asn-Tyr-Thr-Leu-Gln(配列番号:48);H4H1−7
:Asn-Phe-Thr-Leu-Ile(配列番号:49);及びH4H1−8:Asn-Trp-Thr-I
le-Met(配列番号:50)から選択されるアミノ酸残基配列を有する。図7A及
び7Bに示すように、スクリーニングして選択した重鎖CDR1突然変異Fab
の6種のうち3種が、CDR1内の最初の残基として、グリコシル化を回避する
好ましいヒスチジン残基を含有した。このグリコシル化は、MT4の場合のよう
にアスパラギンが存在していると起こる。
次いで、gp120への結合について選択されたCDR1突然変異重鎖Fab
をコードするDNAを可溶性Fabの発現用のベクターpPho−TTに別々に
移した。次いで、その可溶性Fabをgp120への結合親和性について分析し
た。
2)ランダム化重鎖CDR1を有するgp120特異性Fabの結合親和性
分析
次いで、gp120への結合性について選択したランダム化重鎖CDR1を含
有するFabをコードしたDNAを可溶性Fabの発現用のベクターpPho−
TTに移した。次いで、可溶性Fabの結合親和性の分析を以下に記載する通り
に行った。この目的のためのgp120特異性Fabコーディング領域をコード
するヌクレオチド配列の移動は、pComb3H−TT及びpPho−TTベク
ターの両方において、Fabコーディング領域の隣にあるSfiI制限部位の存
在により容易になった。
a)gp120特異性Fabを含有するpPho−TTの調製
発現ベクターpPho−TTは、それぞれ実施例1及び2Aに記載したpCo
mb3及びpComb3Hファージミッド発現ベクターの修飾型である。これら
pComb3及びpComb3H−TTベクターは、実施例1Gに記載した発現
ベクターからcp3をコードするファージミッド遺伝子3アンカー配列を除去す
ることにより、可溶性Fabを発現できる。pComb3及びpComb3Hベ
クターでのように、pPho−TTも、周辺質空間に分泌される可溶性Fabを
発現できる。しかしながら、pComb3及びpComb3H−TTベクターか
らの可溶性Fabの発現は1acZプロモーターにより調節される一方、pPh
o−TTベクターからの可溶性Fabの発現はアルカリ性ホスファターゼ(ph
oA)プロモーターにより調節される。当業者にとって周知なように、このph
oAプロモーターはリン酸飢餓条件化で誘発性である(Sambrookら,“Molecula
r Cloning:a Laboratory Manual”,第2編,Cold Spring Harbor Laboratory
Press(1989))。
pPho−TTベクターは、EcoRI部位からSpeI部位の後ろの第2S
fiI部位まではpComb3H−TTベクターと同一である。pComb3H
−TTのこの領域は、図6に示してある。pPho−TT、つまり抗破傷風毒素
Fabをコードするヌクレオチド配列であって重鎖及び軽鎖カセットを占める配
列を含む完全pPhoベクターは、配列番号51に掲げられている。
pPho−TTを用いるに際し、その第1シストロンは、pComb3H−T
T第1シストロンによりコードされるのと同一であるので、κ軽鎖の発現及び分
泌ができる。第2シストロンは、重鎖タンパク質、つまりFdに機能できるよう
に連結されたpe1Bリーダーをコードした。ompA及びpe1Bリーダーの
存在で、細菌の細胞質から周辺質空間へのκ軽鎖及びFdの両方の調和している
が別々の分泌が容易になった。
これらFd及びκ軽鎖は、それらそれぞれの後で開裂してしまうリーダー配列
により細胞質空間に分泌された。Fab分子は、選択されたFdとκ軽鎖の結合
から形成されたものである。
その制限酵素地図が図8に図示されているpPho−TTベクターは、実施例
2B1a)でpComb3Hベクターについて記載したように、リボソーム結合
部位、Co1E1及びf1起点、及びペニシリナーゼ遺伝子も含有した。このp
Pho−TTベクターは、重鎖をコードするDNAの指向的挿入のためのXho
I部位及びSpeI部位を含有し、軽鎖をコードするDNAの指向的挿入のため
のSacI部位及びXbaI部位を含有した。加えて、このpPhoベクターは
、ここに記載した可溶性Fabの発現のために、1つの断片内の重鎖及び軽鎖カ
セット全体をpComb3HベクターからpPhoベクター内に移すのを容易に
す
る、pComb3Hベクターのものと同一の2つのSfiI部位を含有した。か
くして、pPhoベクター内のこれら部位は、重鎖又は軽鎖をコードするDNA
を別々の2工程で指向的に挿入するのを、又は重鎖及び軽鎖の両方をコードする
DNAを含む単一カセットを1工程で指向的に挿入するのを可能にした。重鎖又
は軽鎖をコードするDNAを別々の工程でpPho−TTベクター内に挿入する
場合、挿入されるDNAの供給源は、同じFabからであっても異なるFabか
らであってもよい。加えて、更にここに記載するように、重鎖又は軽鎖DNAコ
ーディング配列のいずれの部分をpPhoベクター内に挿入してもよい。
かくして、このpPho−TTベクターは、2種の可溶性タンパク質、重鎖(
Fd)及び軽鎖を発現する2種のカセットを有するDNA分子からなるものとな
った。このベクターは、以下に5’から3’方向で列挙した機能できるように連
結された要素のためのヌクレオチド配列を含有した:phoAプロモーター/オ
ペレーター配列;EcoRI制限部位;リボソーム結合部位;ompAリーダー
;SfiI制限部位:スペーサー領域;5’SacI及び3’XbaI制限部位
により縁取られたクローニング領域からなる第1カセット;これら2つのカセッ
トの間に位置するNcoI制限部位;及び発現制御リボソーム結合部位;pe1
Bリーダー:アミノ酸残基 Glu-Val-Gln-Leu-Leu-Glu(配列番号:44)をコー
ドするヒトコンセンサスアミノ末端スペーサー領域;5’XhoI及び3’Sp
eI制限部位により縁取られたクローニング領域であってSfiI部位が後に続
いている領域;発現制御停止配列、及びNotI制限部位からなる第2カセット
。
配列番号:51に示すように、pPho−TTベクター配列は、長さが1,2
00bpである軽鎖スタッファー及び長さが300bpである重鎖スタッファー
を含有する。これら重鎖及び軽鎖スタッファーのヌクレオチド配列は、それぞれ
破傷風毒素(TT)特異性Fabの重鎖及び軽鎖可変ドメインをコードした。か
くして、配列番号:51に示した軽鎖及び重鎖スタッファーを含有するpPho
ベクター配列をpPho−TTと名付けている。この発明のFabを発現するた
めの重鎖又は軽鎖可変ドメインを挿入するために、pPho−TTの重鎖及び軽
鎖スタッファーを、この発明のFabの発現のためのpComb3H−TTベク
ターの調製についての実施例2B1a)に記載した通りに除去した。
実施例2C〜2Eに記載した通りにpComb3Hベクターから可溶性ヘテロ
ダイマーを調製するために、まずgp120反応性クローンをコードするファー
ジミッドDNAを単離してから、SfiIで消化した。pPho−TTを同じく
消化した。このファージミッドDNA及びpPho−TTのSfiI制限酵素で
の消化で、両立性の粘着末端が生成した。gp120反応性重鎖及び軽鎖を含む
1.6kb DNA断片及びpPhoベクターを含む4.7kb DNA断片を
ゲル精製(0.6%アガロース)して一つに連結した。大腸菌DH10B(BioRa
d,Richmond,CA)を形質転換して、gp120反応性重鎖及び軽鎖をコードする
DNA及びpPho発現ベクターを含む組換え体を単離した。XhoI−Xba
I消化により、重鎖及び軽鎖コーディングDNA断片の挿入についてクローンを
検査した。この消化で1.6kb断片が生成する筈である。かくして、gp12
0反応性重鎖及び軽鎖をコードするDNAが、可溶性Fabの発現のために、p
Comb3HからpPhoベクターに移された。
CDR1ランダム化重鎖を有するベクターについて実施例2Bに記載した通り
にpComb3に基づくベクターから可溶性ヘテロダイマーを調製するために、
重鎖及び軽鎖カセットをそれぞれXhoI/SpeI及びSacI/XbaIで
の消化により別々に単離してから、同じようにして消化したpPho−TT内に
続けて指向的に連結することにより、TT重鎖及び軽鎖スタッファー断片を連続
的に置換した。
b)pPho発現ベクターからの可溶性gp120特異性Fabの発現
及び精製
gp120特異性可溶性Fabの発現及び精製のため、当業者にとって周知で
ありかつ Sambrook ら,“Molecular Cloning: a Laboratory Manual”,第2編
,Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されているように、ク
ローンを低リン酸培地中で増殖させて誘発させ、そして可溶性Fabを実施例1
H2a)に記載した通りに精製した。
c)プラズモン共鳴を用いる結合親和性分析
実施例2B2)に記載した通りにgp120に対してパンニングすることによ
り選択した重鎖CDR1突然変異Fabの第2スクリーニンググループが、gp
120の実験単離物との親和性測定に用いるために上に記載したpPhoから可
溶型で発現された。実施例1Hに記載した通りに表面プラズモン共鳴を行って、
重鎖CDR1の第1位置に好ましいヒスチジン残基を有する選択Fabの親和性
を出した。
IIIb株のgp120にとって好ましいヒスチジン残基を有するFab(H4
H1−1、H4H1−3及びH4H1−5)の平衡解離定数(Kd,M)により
測定したFab結合親和性分析の結果を表6に列挙する。その表中の全ての測定
値は、Kd,Mとして示されている。更に、予め選択した重鎖又は軽鎖CDRを
突然変異誘発することの親和性への作用を患者から得られた非突然変異Fab
MT4のもの比較するために、親和性の増加倍率が計算されている。これら増加
倍率は、Fab MT4の測定Kd(6.3×10-9)を、突然変異CDRを有す
るそれぞれの新たなFabの測定Kdで割ることにより計算される。
表6から明らかなように、誘導したFabのKdは10-9Mのレンジにあり、
それぞれは元のFab MT4のものよりも2〜3倍のgp120 IIIB株結合
親和性の増加を示した。H4H1シリーズのFabをコードするヌクレオチド配
列を含有する各pPhoベクターから、XhoI/SacII消化により、ヒスチ
ジン含有重鎖CDRIをコードするヌクレオチド配列を別々に単離し、そして実
施例3(表11)に記載する通りに用いて、好ましいCDR1を、以下のCに記
載する通りに調製した親和性最適化CDR3と合わせて有する別々の複合重鎖を
調製した。
C.ファージミッドpComb3H−3b3の重鎖可変ドメイン内の先にラ
ンダム化されたアミノ酸に隣接するランダム化CDR3の調製
実施例1に記載したオーバーラップPCRにより調製したランダム化重鎖CD
R1及びCDR3を有するFab 3b3のgp120結合親和性を更に高める
ために、実施例1Aに記載した通りpComb3H内にサブクローン化したp3
b3の重鎖CDR3内の追加の予め選択した15ヌクレオチドをオーバーラップ
PCRによる突然変異誘発に付した。実施例1に記載した通りにpMT4−3か
らFab 3b3を得るために、重鎖CDR3内の第3〜第6アミノ酸残基位置
に位置する4つのアミノ酸をコードする12ヌクレオチドをランダム化した。次
いで、これら第1ランダム化12ヌクレオチドに対して3'である15の隣接ヌ
クレオチドをpComb3H−3b3内で突然変異誘発して、図9A及び9Bに
示す通り第7〜第11CDR3残基の5つの新たなアミノ酸残基をコードさせた
。その結果、以下に記載するようにこの新たなライブラリーから選択されるFa
bは、Fab 3b3重鎖のCDR3内の18のアミノ酸残基のうち全部で9の
ランダム化アミノ酸残基、つまり5つの新たにランダム化して選択した4つのア
ミノ酸とFab 3b3内で先に突然変異誘発して選択したアミノ酸を合わせた
残基を含有した。
かくして、基本的には、Fab 3b3は元々pMT4−3から誘導されたも
のなので、9のアミノ酸突然変異がオーバーラップPCRによりFab MT4
の重鎖CDR3内に作られたことになる。
実施例1Bに記載したように、オーバーラップPCRを先に得られたpCom
b3H−3b3発現ベクター鋳型上で同じように行った。第1回目のPCRで、
5’FTX3オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号:9)を、ヌクレオチド
配列 5'-CCAGACGTCCATATAATAATTGTCMNNMNNMNNMNNMNNCCAACCCCACTCCCCCACTCT-3'(
配列番号:52)を有する3'非コーディング突然変異誘発性オリゴヌクレオチド
プライマー、つまり3b3C35obと共に用いて重鎖CDR3を増幅し、そし
て上記の15ヌクレオチド領域を突然変異誘発した。次いで、得られた増幅産物
を実施例1Bに記載した通りに精製して第2回目からの産物とのオーバーラップ
PCRに用いた。
この後の回のPCRも、ヌクレオチド配列 5'-GACAATTATTATATGGACGTCTGG-3'(
配列番号:53)を有する5'コーディングオーバーラップオリゴヌクレオチドプ
ライマー、つまりh4h3of及び3'非コーディングオリゴヌクレオチドプラ
イマーR3B(配列番号:12)で行った以外は、先に実施例1Bに記載した通
りに行った。次いで、得られた増幅産物を実施例1Bに記載した通りに精製し、
そしてオリゴヌクレオチドプライマーペアFTX3及びR3Bを用いて第1回目
からの産物でのオーバーラップPCRに用い、新たに突然変異誘発されたCDR
3を有する増幅重鎖可変ドメインの集団を生成させた。
次いで、これら重鎖CDR3ランダム化増幅産物を、SacI/XbaI消化
pMT4−3軽鎖可変ドメインヌクレオチド配列(p3b3のものと同じ)が実
施例2Bに記載の通りに連結されているpComb3H−TT内に連結して、p
3b3由来pComb3H−CDR3ランダム化発現ベクターのライブラリーを
生成させた。次いで、それぞれが突然変異重鎖とpMT4由来軽鎖を有するファ
ージディスプレイドFabを発現させて実施例1に記載した通りにgp120で
パンニングした。
1)ランダム化重鎖CDR3を有するp3b3由来Fabのアミノ酸残基配
列分析
次いで、gp120に特異的に結合したファージディスプレイドFabをコー
ドするクローンを配列決定してその誘導されるアミノ酸残基配列を先に記載した
通りに分析した。上で作ったCDR3ランダム化クローンの核酸配列決定を、Se
quenase 1.0(USB,Cleveland,OH)を用いて、無作為に選んだ8種の二本鎖F
ab発現性DNAクローンについて行った。MacVector の一連のプログラムを
用いて、誘導されるアミノ酸残基配列をお互いに及び Genbank データベースと
共に整列させた。選択した8種の特定の合成gp120特異性M556シリーズ
Fab及び3b3の誘導された重鎖アミノ酸残基配列を図9A及び9Bに示す。
選択した全てのM556 Fabは、先にFab 3b3を突然変異誘発して選
択したCDR1(NFTVH−配列番号:3の残基28〜32)及びCDR3(EWGW−
配列番号:3の残基98〜101)の両方を含有した。各M556 Fabは、M
556シリーズの名称の後の番号により示されるように、突然変異誘発され選択
されたアミノ酸配列を102〜106のアミノ酸残基位置に対応するCDR3内
に有することにより特有なものとなっている。これらM556シリーズの完全重
鎖可変ドメインアミノ酸残基配列は、選任した配列表確認者により、図9Bに示
す通りに配列表に掲げられている。
2)ランダム化重鎖CDR3を有するgp120特異性Fabの結合親和性
分析
次いで、上で得られたgp120への結合性について選択されたCDR3突然
変異重鎖M556シリーズFabをコードするDNAを、先に記載した可溶性F
abの発現のためのベクターpPho−TTに移した。次いで、これら可溶性M
556シリーズFabをgp120(IIIB株)への結合親和性について分析し
た。実施例1Hに記載した通りに表面プラズモン共鳴を行って、選択したFab
の親和性を出した。
M556シリーズFabの平衡解離定数(Kd,M)により測定したFab結
合親和性分析の結果を表7に列挙する。加えて、親和性の増加倍率も先に記載し
た通りに計算する。
表7から明らかなように、これら8種のM556シリーズFabのうち6種が
、gp120 IIIB株への結合のKdにより測定して10-10M〜10-11Mのレ
ンジで、高められた親和性を示した。2種だけ、つまりM556−5とM556
−13だけが10-9Mレンジで親和性を有した。10-10M又はそれより大きな
親和性を有するM556 Fabの増加倍率は、元のFab MT4の親和性に比
べてM556−2についての14からM556−3についての63、及びM55
6−10についての70までの範囲であった。次いで、これら誘導したM556
Fabからの重鎖CDR3をコードするヌクレオチド配列をSacII/Spe
I消化によりpPhoベクターから別々に単離し、そして実施例3(表11)に
記載する通りに用いて、上で調製した好ましいCDR1をM556シリーズ親和
性最適化重鎖CDR3と合わせて有する別々の複合重鎖を調製した。
D.ファージミッドpComb3H−3b3のκ軽鎖(pMT4−3の元の
軽鎖)可変ドメイン内のランダム化CDR1の調製
実施例1に記載した通りのオーバーラップPCRにより調製したランダム化重
鎖CDR1及びCDR3を有するFab 3b3のgp120結合親和性を更に
高めるために、pComb3H−3b3内の3b3の軽鎖CDR1内の予め選択
した15ヌクレオチドをオーバーラップPCRによる突然変異誘発に付した。実
施例1で調製したCDR1及びCDR3突然変異重鎖を有する3b3ヌクレオチ
ド配列をオーバーラップPCRに付して、図10に示しかつ配列番号:62とし
て掲げる通り、pComb3H−3b3軽鎖可変ドメイン内の位置76から93
の18ヌクレオチドをランダム化した。p3b3配列はpMT4−3からその軽
鎖を突然変異誘発することなく誘導したものなので、pComb3H内の未突然
変異3b3軽鎖への関係は、pMT4−3の軽鎖への関係と同じである。前述の
18ヌクレオチドのランダム化により、コードされるランダム化アミノ酸残基は
、以下に記載する図11A及び11Bに示す位置22から33までの完全CDR
1の位置26から31までのCDR1内にある。
pComb3H−3b3内の3b3の軽鎖CDR1突然変異誘発の結果として
、以下に記載するこの新たなライブラリーから選択されるFabは、Fab 3
b3軽鎖CDR1内の12のアミノ酸残基のうち全部で6のランダム化アミノ酸
残基を含有し、そしてFab 3b3 CDR1及びCDR3の突然変異され選択
された重鎖を有した。
実施例1Bに記載したようにして、オーバーラップPCRを先に得られたpC
omb3H−3b3発現ベクター鋳型上で同じように行った。第1回目のPCR
で、ヌクレオチド配列 5'-GAATTCTAAACTAGCTAGTCG-3'(配列番号:63)を有す
る5'オリゴヌクレオチドプライマー、つまりKEFを、ヌクレオチド配列 5'-AG
GTTTGTGCTGGTACCAGGCTACMNNMNNMNNMNNMNNMNNGTGACTGGACCTACAGGAGAAGGT-3'(配列
番号:64)を有する3'非コーディング突然変異誘発性オリゴヌクレオチドプラ
イマー、つまりHIV4cdr1-ov-b と共に用いて、軽鎖CDR1を増幅して上記
の18ヌクレオチド領域を突然変異誘発した。次いで、得られた増幅産物を実施
例IBに記載した通りに精製して第2回目からの産物とのオーバーラップPCR
に用いた。
この後の回のPCRも、ヌクレオチド配列 5'-GTAGCCTGGTACCAGCACAAACCT-3'(
配列番号:65)を有する5'コーディングオーバーラップオリゴヌクレオチドプ
ライマー、つまりHIV4cdr1-fo 及びヌクレオチド配列 5'−AATACGACTCACTAT
AGGGCG-3'(配列番号:66)を有する3'非コーデイングオリゴヌクレオチドプ
ライマー、つまりT7Bで行った以外は、先に実施例1Bに記載した通りに行っ
た。次いで、得られた増幅産物を実施例1Bに記載した通りに精製し、そしてオ
リゴヌクレオチドプライマーペアKEF及びT7Bを用いて第1回目からの産物
でのオーバーラップPCRに用い、新たに突然変異誘発された
CDR1を有する増幅軽鎖可変ドメインの集団を生成させた。
次いで、これら軽鎖CDR1ランダム化増幅産物を、配列番号:3に示すアミ
ノ酸残基配列をコードするp3b3重鎖可変ドメインヌクレオチド配列が実施例
2Bに記載の通りに連結されているpComb3H−TT内に連結して、p3b
3由来pComb3H−CDR1軽鎖ランダム化発現ベクターのライブラリーを
生成させた。次いで、それぞれが突然変異軽鎖とそのp3b3由来重鎖を有する
ファージディスプレイドFabを発現させて実施例1に記載した通りにgp12
0でパンニングした。
1)ランダム化軽鎖CDR1を有するp3b3由来Fabのアミノ酸残基配
列分析
次いで、gp120に特異的に結合したファージディスプレイドFabをコー
ドするクローンを配列決定してその誘導されるアミノ酸残基配列を先に記載した
通りに分析した。上で作ったCDR1ランダム化クローンの核酸配列決定を、Se
quenase 1.0(USB,Cleveland,OH)を用いて、無作為に選んだ4種の二本鎖F
ab発現性DNAクローンについて行った。選択した4種の特定の合成gp12
0特異性A〜DシリーズFab及び3b3の誘導された軽鎖アミノ酸残基配列を
図11に示す。
選択した全てのA〜D Fabは、p3b3由来重鎖可変ドメインを含有した
。各A〜D Fabは、突然変異誘発され選択されたアミノ酸配列を、配列番号
:67〜70に掲げる22〜33のアミノ酸残基位置の完全CDR1内の26〜
31のアミノ酸残基位置に対応する軽鎖CDR1内に有することにより特有なも
のとなっている。これらA〜Dシリーズのこれら完全軽鎖可変ドメインアミノ酸
残基配列を、選任した配列表確認者により、図11に示す通りに配列表に掲げる
。
2)ランダム化軽鎖CDR1を有するgp120特異性Fabの結合親和性
分析
次いで、上で得られたgp120への結合性について選択されたCDR1突然
変異軽鎖A〜DシリーズFabをコードするDNAを、先に記載した可溶性Fa
bの発現のためのベクターpPho−TTに移した。次いで、これら可溶性A〜
DシリーズFabをgp120 IIIB株への結合親和性について分析した。実施
例1Hに記載した通りに表面プラズモン共鳴を行って、これら選択したFabの
親和性を出した。
A〜DシリーズFabの平衡解離定数(Kd,M)により測定したFab結合
親和性分析の結果を表8に列挙する。加えて、親和性の増加倍率も先に記載した
通りに計算する。
表8から明らかなように、これら4種のA〜DシリーズFabのうち2種のF
ab、つまりFab C及びFab Dが、gp120 IIIB株への結合のKdに
より測定して10-10Mのレンジで、高められた親和性を示した。Fab A及び
Bは、10-9Mレンジで親和性を有した。Fab C及びFab Dの増加倍率
は、Fab 3b3が誘導された元のFab MT4の親和性に比べてそれぞれ約
9倍及び28倍であった。Fab A〜Dが誘導されたFab 3b3鋳型に比較
した増加倍率も、7.7×10-10MであるFab 3b3のKdを用いることによ
り同じように計算することができる。
これらの誘導されたCDR1−変異誘発Fab 由来の軽鎖可変ドメインをコードする
該ヌクレオチド配列を、次いで実施例3に記載の如く、更なる変異誘発手順のた
めの鋳型として別々に使用した。更に、ここで得られたFab A-D の軽鎖CDR1をコ
ードする該ヌクレオチド配列を、該pPhoベクターから、Sac I/Kpn I 消化により
別々に単離し、実施例3に記載したように使用して(第11表)、別々の複合軽鎖
を調製した。この複合軽鎖は、上で調製した好ましいCDR1を、以下で調製される
H4L3系のアフィニティー最適化軽鎖CDR3との組み合わせとしてもつ。
E. ファージミドpComb3H-3b3(該元のpMT4-3軽鎖)のκ軽鎖可変ドメインにお
けるランダム化されたCDR3の調製
実施例1に記載したような、オーバーラップPCR により調製したランダム化さ
れた重鎖CDR1およびCDR3を有するFab 3b3 のgp120 結合アフィニティーを更に高
めるために、pComb3H 中の3b3 の軽鎖CDR3における予め選択された15個の不連続
なヌクレオチドを、オーバーラップPCR による変異形成に付した。実施例1で調
製されたような、CDR1およびCDR3により変異誘発された重鎖をもつp3b3から単離
された3b3 ヌクレオチド配列を、オーバーラップPCR にかけて、位置265 〜267
および次いで271 〜282 からの15個のヌクレオチドをランダム化し、かくして該
サイトは、第10図に示され、かつ配列番号: 62として記載した、該p3b3−由来の
軽鎖可変ドメインにおける単一の変異誘発されていないトリプレットによって分
離されていた。p3b3は、該軽鎖を変異誘発することなしにpMT4-3から誘導された
ので、該変異誘発されていないp3b3−由来の軽鎖に対する言及は、pMT4-3の軽鎖
に対する言及と同一である。上記の15個ヌクレオチドのランダム化によって、該
コードされたランダム化アミノ酸残基は、CDR3中の位置89および位置91〜94にあ
り、それぞれ位置88および90にある保存されたグルタミンおよびチロシン残基お
よびそれぞれ位置95および96にある保存されたチロシンおよびスレオニン残基が
残されており、結果として9個のアミノ酸の軽鎖CDR3を構成する。
pComb3H-3b3 中の3b3 の軽鎖CDR3変異誘発の結果として、以下に記載するこの
新規なライブラリーから選択されるFab は、全体として、該Fab 3b3 軽鎖CDR3中
の9個のアミノ酸残基のうちの5個のアミノ酸残基を含み、かつ変異誘発されか
つ選択された重鎖Fab 3b3 CDR1およびCDR3を有していた。
実施例1Bに記載したように、オーバーラップPCR は、同様に以前に得られたpC
omb3H-3b3 発現ベクター鋳型上で実施した。PCR の第一ラウンドにおいては、5'
オリゴヌクレオチドプライマー、KEF(配列番号: 63)を、3'非コード変異誘
発オリゴヌクレオチドプライマーh4kcdr3-bo(これはヌクレオチド配列:5'-CAG
TTTGGTCCCCTGGCCAAAAGTGTAMNNMNNMNNMNNATAMNNCTGACAGTAGTACAGTGCAAAGTC-3'(
配列番号: 71)を有する)と共に使用して、軽鎖CDR3を増幅し、かつ上記の15ヌ
クレオチド領域を変異誘発した。得られる増幅された生成物を、次いで実施例1B
に記載のように精製し、かつ第二ラウンドからの生成物と共にオーバーラップPC
R で使用した。
該PCR の後者のラウンドも、前に実施例1Bに記載したように実施したが、ヌク
レオチド配列5'-TACACTTTTGGCCAGGGGACCAAACTG-3'(配列番号: 72)をもつ5'コ
ードオーパーラップオリゴヌクレオチドプライマーhvkfr4-fo および3'非コード
オリゴヌクレオチドT7B(配列番号: 66)を使用した。得られた増幅生成物を、
次に実施例1Bに記載のように精製し、かつ該オリゴヌクレオチドプライマー対KE
F T7B を使用して、該第一のラウンドの生成物と共に、オーバーラップPCR で使
用して、一群の新たに変異誘発させたCDR3をもつ、増幅された軽鎖可変ドメイン
を形成した。
該軽鎖CDR3−ランダム化増幅生成物を、次にpComb3H-TTと連結した。ここで、
pComb3H-TTには、配列番号: 3に示したアミノ酸残基配列をコードするp3b3重鎖
可変ドメインヌクレオチド配列が、実施例2Bに記載したように連結されていて、
p3b3−由来のpComb3H-CDR3ランダム化発現ベクターのライブラリーを形成してい
る。各々変異誘発された軽鎖およびp3b3−由来の重鎖をもつ、ファージ−表示Fa
b が次に発現され、これを実施例1に記載のようにgp120 についてパンニングし
た。1) ランダム化軽鎖CDR3をもつp3b3由来のFabのアミノ酸残基配列分析
次いで、特異的にgp120 に結合するファージ−表示Fab をコードするクローン
を配列決定し、誘導されるアミノ酸残基配列を前に記載したよに分析した。上で
製造した該CDR3ランダム化クローンの核酸配列決定を、シーケナーゼ1.0(USB,ク
リーブランド,OH)を使用して、3個の無作為に選択した二本鎖Fab-発現DNA ク
ローン上で実施した。Fab および3b3 の3種の選択された特定の合成gp120-特異
的H4L3系列に関する、誘導された軽鎖アミノ酸残基配列を第12Aおよび12B図に
示す。
全ての選択されたH4L3 Fabは該p3b3−由来の重鎖可変ドメインを含んでいた。
各H4L3 Fabは、上に示した位置に対応するCDR3中に、変異誘発され、選択された
アミノ酸配列をもつことから、類のないものである。該H4L3系列の、完全な軽鎖
可変ドメインのアミノ酸残基配列は、付与された配列表の識別名によって、第12
B図に示されたように、配列表中に掲載されている。
2) ランダム化された軽鎖CDR3を有するgp120-特異的Fab の結合アフィニ
ティー分析
上で得たgp120 に結合するために選択された、該CDR3−変異誘発された軽鎖H4
L3系列の FabをコードするDNA を、次に前に記載されたような可溶性のFab の発
現のために、該ベクターpPho-TT に転移した。この可溶性のH4L3系列の Fabを、
次にgp120 株IIIBに対する結合アフィニティーにつき解析した。表面プラスモン
共鳴を、実施例1Hに記載の如く実施して、該選択された Fabのアフィニティーを
測定した。
H4L3系列 Fabの平衡解離定数(Kd,M)により測定した、該 Fabの結合アフィニ
ティー解析の結果を第9表に記載した。更に、アフィニティーの増加倍率をも前
に記載の如く算出した。
第9表から明らかな如く、該3種のFab のうちの2種、即ちH4L3-2および
H4L3-4は、Fab 3b3 およびその結果としてのA-D Fab が由来とする、元のFab MT
4 のKdのそれぞれ約45および26倍の増加倍率に相当する、gp120 IIIB株に対する
結合の平衡解離定数Kdにより測定した、10-10Mの範囲の高いアフィニティーを示
した。Fab A-D が由来とする、該Fab 3b3 鋳型と比較した該増加倍率は、同様に
Fab 3b3 のKd(7.7×10-10M)を使用して算出することもできる。
これらの誘導されCDR3変異誘発されたFab 由来の軽鎖可変ドメインをコードす
るヌクレオチド配列を、次に別々に使用して、最適化され、変異誘発され、かつ
選択されたCDR を有する複合軽鎖可変ドメインを生成した。具体的には、該変異
誘発された軽鎖CDR3をコードするヌクレオチド配列を、該H4L3-pPho ベクターか
ら、Kpn I/Xba I消化により単離し、実施例3(第11表)に記載のように使用し
て、上で調製した好ましいCDR3を、上で調製したA-D 系列のアフィニティーを最
適化した軽鎖CDR1との組み合わせとしてもつ、別々の複合軽鎖を調製した。
3. ファージミド3b3 およびMT4 の、予備選択しランダム化したCDR に基づ
き、gp120 に対して最適化されたアフィニティーを有する、ランダム化
CDR 複合Fab の調製
A. ランダム化したCDR1をもつファージミドDに基づく、ランダム化したCDR3
軽鎖の調製
ランダム化されたCDR1およびCDR3両者をもつ軽鎖を作成するために、実施例2D
で調製した、ランダム化CDR1を有するファージミドの一方、即ちファージミドD
を、後のCDR3のランダム化のための鋳型として使用した。実施例1および2に記
載した如く、ファージミドDの変異誘発した軽鎖は、ランダム化されていない軽
鎖3b3(これは元の軽鎖MT4 または4Lとも呼ばれる)から誘導された。3b3 におい
て、MT4 のランダム化されていない軽鎖は保持され、一方重鎖はCDR1およびCDR3
においてランダム化された。ファージミドDはpComb3H-3b3 のファージミド3b3
から誘導されたので、このファージミドDは前にランダム化された3b3-由来の重
鎖と、CDR1中の新たにランダム化されたMT4 または3b3 軽鎖とをもつ。
本実施例においては、ランダム化されたCDR1およびCDR3重鎖配列およびランダ
ム化されたCDR1軽鎖配列を有するファージミドDを、ここに記載したように、軽
鎖CDR3変異形成に付した。ファージミドDのCDR3軽鎖の予め選択した部分を、実
施例1Bに記載した如く、オーバーラップPCR 法によるランダム化のために選択し
た。上記の如く元々MT4 由来のCDR3は、27個のヌクレオチドを含み、これは9個
のアミノ酸残基配列:QVYGASSYT(配列番号: 6;アミノ酸残基位置88から96まで)
を発現した。該CDR3軽鎖を変異誘発する際に、第二(バリン)、および第四乃至
第七のアミノ酸残基(グリシン、アラニン、セリン、セリン)を、該領域を変異
誘発するために使用したオリゴヌクレオチドプライマーの設計によって指示され
るようにして、ランダム化した。該軽鎖CDR3の第一、第三、第八および第九残基
は、これらが軽鎖に見出される保存性残基であることから、保持されていた。
PCR 増幅の第一のラウンドにおいて、該ファージミドD鋳型は、実施例2Dに記
載した5'オリゴヌクレオチドプライマーKEF(配列番号: 63)および3'非コード
ランダム化オリゴヌクレオチドプライマーh4kcdr3-bo(配列番号: 71)を使用し
て変異誘発された。このPCR 生成物を上記のように精製し、かつオーバーラップ
PCR において、該第二のPCR 生成物と共に使用した。
後者は、5'コードオリゴヌクレオチドプライマーhvkfr4-fo(配列番号: 72)お
よび実施例2Dに記載した3'非コードオリゴヌクレオチドプライマーT7b(配列番
号: 72)を使用して、ファージミドDについて実施した。
この第二の増幅のPCR 生成物を上記の如く精製し、該第一のPCR 生成物と共に
オーバーラップPCR で、該プライマー対KEF とT7B とを用いたオーバーラップPC
R 使用した。該プライマー対は該コードhvkfr4foプライマーの5'末端と、該非コ
ードランダム化h4kcdr3-boプライマーの5'末端との間にオーバーラップを有して
いた。該ファージミドD配列の残りの部分に、一群のランダム化されたCDR3を有
し、既にランダム化され選択された軽鎖CDR1および重鎖CDR1およびCDR3を有して
いる、該ファージミドD−由来の軽鎖のオーバーラップPCR 生成物のライブラリ
ーを、次に後のファージ−表示Fab 発現のために実施例1Bに記載の如く精製し、
以下に記載のようにスクリーニングした。
2) CDR1およびCDR3ランダム化軽鎖を有する抗-gp120 Fabの選別
pComb3H-ファージミドD由来のおよび新たに変異誘発した、軽鎖CDR3−含有ラ
イブラリーの構築を、前に実施例2Bに記載したように実施した。但し、該重鎖可
変ドメインのカセットはファージミドDから得、かつ軽鎖可変ドメインは変異誘
発されたCDR3をもつ増幅されたフラグメント中に与えた。上記のような発現およ
びパンニングに引き続き、gp120-反応性ファージ−表示Fab を上記の如く酸溶出
にかけた。QA1〜QA9 と名付けたFab をコードする該クローンを、この標準的な
溶出手順を使用して得た。該対応する可溶性Fab のアフィニティーを、以下に記
載するように測定した場合、第10表に示した如く、該アフィニティーは予想され
た程には、この変異誘発により高められなかった。
従って、別の溶出手順を使用して、gp120 に対してより高いアフィニティーを
もつFab D-由来のFab を得た。この手順において、該洗浄したgp120-結合ファー
ジ−表示Fab を、全容積25μl中で1〜2時間、可溶性Fab 3b3 の10μg/ウエル
をインキュベートすることにより競合させた。このようにして、過剰のFab と競
合させることにより、低アフィニティー結合体は、gp120 に固定化されたより高
いアフィニティーをもつ結合体から分離され、上記のように実施される酸による
後の溶出により溶出された。このFab 競合/酸溶出手順により得られたクローン
は、第13Aおよび13B図および以下の第10表に示すように、QA10、QA11およびQA
12と名付けられたFab をコードした。
3) アミノ酸残基配列解析、親Fab Dと、該Fab D-に基づくCDR1およびCDR3軽
鎖ランダム化Fab との間の比較
特異的にgp120 に結合し、かつ上記の溶出手順を利用して回収される、上で調
製したファージミドD-由来のFab をコードするクローンを、ついで配列決定し、
かっ誘導されたアミノ酸残基配列を解析した。上で作成したCDR3ランダム化クロ
ーンの核酸配列決定は、シーケナーゼ1.0(USB,クリーブランド,OH)を使用し、
4種の無秩序に選択した二本鎖Fab-発現DNA クローンに基づいて実施した。Fab
および3b3 の、12個の選択された特定の合成gp120-特異的QA系列の、該誘導され
た軽鎖アミノ酸残基配列を第13Aおよび13B図に示した。
全ての選択されたQA系列のFab は、該ファージミドD-由来の重鎖可変ドメイン
(これは実施例2Dに記載した如く、p3b3重鎖である)と、アミノ酸残基配列:
RSSHQLDGSRVA(配列番号: 70; 残基位置22〜33)を有する、前に変異誘発されか
つ選択された軽鎖CDR1とを含む。各QA Fabは、上に明記した位置に対応する該軽
鎖CDR3中に、変異誘発されかつ選択されたアミノ酸配列をもつ点で他に類をみな
いものである。該QA系列の競合軽鎖可変ドメインのアミノ酸残基配列は、与えら
れた配列表の識別名によって第13B図に示されたように、配列表に掲載されてい
る。QA11と名付けられたFab 由来のヌクレオチド配列および対応するコードされ
た軽鎖可変ドメインは、以下に記載する複合Fab の調製に対してLHと呼ぶ。
4) CDR1およびCDR3ランダム化軽鎖ドメインをもつファージミドD由来の
gp120-由来のFab の結合アフィニティー解析
上で得たgp120 への結合のために選択された、該CDR3−変異誘発された軽鎖QA
系列Fab をコードするDNA を、次に前に記載した如く可溶性Fab の発現のために
、ベクターpPho-TT に転移させた。この可溶性QA系列Fab を、次にgp120 株IIIB
に対する結合アフィニティーにつき分析した。表面プラスモン共鳴を、実施例1H
に記載のように実施して、該選択されたFab のアフィニティーを測定した。
該QA系列Fab の平衡解離定数(Kd,M)によって測定した、該Fab の結合アフィ
ニティー分析の結果を第10表に示した。更に、アフィニティーの増加倍率をも前
に記載した如く算出した。
第10表に示した如く、該Fab 競合/酸溶出により得られた、該Fab-発現ファー
ジー表示クローンは、予想されたようにより高いgp120 に対するアフィニティー
を示した。該QAFab の殆どが10-10Mを越えるKdをもつのに対して、QA10およびQA
11Fab はgp120 IIIB株に対する結合について10-11Mを越える Kdを示した。後者
はそれぞれ、Fab 3b3 およびFab Dが由来とする元のFab MT4 の Kdに対して約8
6および94倍の増加倍率に相当する。
これらの誘導されたCDR3−変異誘発Fab からの軽鎖可変ドメインをコードする
ヌクレオチド配列を、次に以下に記載しかつ第12および13表に示した、新規な重
鎖および軽鎖を有する固有の複合アフィニティー最適化Fab を製造するのに使用
した。
B. 予め選択した重鎖および軽鎖構築物を結合することによる複合Fab の調製
1) 複合重鎖または軽鎖の何れかを発現するためのpPho構築物の調製
本発明および実施例1、2および3Aにおいて教示されたCDR-特異的変異誘発法
により製造されるgp120-特異的高アフィニティーFab をコードするヌクレオチド
配列を、次いで新規な重鎖および軽鎖可変ドメイン構築物を作成するのに使用し
た。次に、該構築物を、以下の実施例3B2)に記載するような、本発明の新規なFa
b 組成物の成分としての、新規なgp120 アフィニティー最適化した重鎖および軽
鎖可変ドメインを発現するために使用した。
第11表において、4種の新規な重鎖(VH)ファージミド構築物および1種の新規
な軽鎖(Vk)構築物を、特異的に同定されたFab をコードするヌクレオチド配
列を含む該pPhoに基づく構築物から調製した。この新規な重鎖または軽鎖複合構
築物を形成するために、選択されたpPho-Fabの二重制限酵素消化を実施して、変
異誘発されたCDR を含有するDNA フラグメントを単離した。該重鎖の消化の全て
に対して、第4図に示されかつ配列番号: 7 に示した如く、ヌクレオチド位置20
3 〜208 において、Xho I はフレームワークIに、Spe I はフレームワーク4に
およびSac IIはフレームワークIIに切断する。該軽鎖の消化全てに対して、第10
図に示されかつ配列番号: 62に示した如く、ヌクレオチド位置100 〜105 におい
て、Sac IはフレームワークIに、Xba Iはフレームワーク4におよびKpn Iは
フレームワークIIに切断する。
各複合重鎖または軽鎖を形成するための、特定の消化されたフラグメントを、
該複合ヌクレオチド配列によってコードされる各アミノ酸残基配列に関するそれ
ぞれの配列番号: と共に、第11表に示した。更に、L42 と名付けられた該軽鎖複
合体に対する複合アミノ酸残基配列は、第14Aおよび14B図に示され、またH31
、H33、H101およびH103と名付けられた、該重鎖複合体に対する複合アミノ酸残
基配列を第15Aおよび15B図に示した。
該重鎖および軽鎖複合体を発現するために、該単離したフラグメントを、まず
該消化により得られる相補性末端と連結して、1個の重鎖または軽鎖フラグメン
トを形成した。この後者を、次に同様に消化したpPho-TT ベクターと別々に連結
して、以下に記載するように、結合アフィニティーを解析し、後に該ベクターを
発現するために、該ベクター内に方向性連結した。更に、実施例1、2および3A
で製造し、最適化したFab をコードするクローンを使用して、付随的な重鎖およ
び軽鎖複合体を、予め選択し、単離した重鎖または軽鎖DNA フラグメントを連結
することにより、同様にして調製した。
2) 予め選択された重鎖および軽鎖構築物を結合することによる、ランダム化
されたCDR をもつ固有のFab を発現するためのpPho構築物の調製
4Lと名付けられた、元のpMT4−由来の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と共
に、上で調製した該重鎖および軽鎖複合DNA 構築物を使用して、該QA11−由来の
軽鎖(LHとも呼ばれる)をコードするヌクレオチド配列、および4Hと名付けられ
た該本来のpMT4重鎖をコードするヌクレオチド配列、重鎖および軽鎖の予め選択
された対をコードする固有のDNA 構築物を調製した。
Xho I/Spe I 重鎖構築物と、Sac I/Xba I 軽鎖構築物とを、連続連結により、
pPho-TT 中で結合することによって、この新規なFab-コードpPho構築物を調製し
た。また、予め選択した重鎖または軽鎖構築物が既に存在する該pPho構築物を、
該ベクター中に存在する連鎖によって指定されるような他の連鎖と連結するため
に、制限酵素で消化した。例えば、MT4 を発現するための、該重鎖および軽鎖構
築物をもつ発現ベクター、pPho-MT4を、上で調製したL42 複合軽鎖構築物の方向
性連結のために、Sac I/Xba I で消化した。同様な構成は、当業者には周知の方
法によって達成される。
本発明の好ましい固有の高アフィニティー結合Fab をコードするための、好ま
しい最適化された複合構築物を第12表に掲載した。各好ましい複合Fab の重鎖お
よび軽鎖アミノ酸残基配列の対をも、1個のコドンによって分離された配列番号
: の対、例えば元の変異誘発されていない軽鎖4Lと対となった、該変異誘発され
た複合重鎖H31 をもっ複合Fab については89:6として、第12表に示した。
第12表に記載したもの以外の重鎖および軽鎖の他の対は、gp120 に対する結合
性を示す追加の固有の複合Fab の発現のために、同様にして構築される。
3) gp120 に対する改善されたアフィニティーをもつ最適にCDR ランダム化さ
れた複合Fab の結合アフィニティー分析
これら実施例において記載されたような、該重鎖および軽鎖CDR-特異的変異誘
発最適化手順により達成される改善されたアフィニティーの測定のために、溶解
型の該選択された複合Fab を、上で調製した該pPho複合構築物から発現させた。
次いで、該可溶性複合Fab をgp120 株IIIBに対する結合アフィニティーにつき分
析した。表面プラスモン共鳴を実施例1Hに記載の如く実施して、該選択された複
合Fab のアフィニティーを測定した。
結合速度定数KonおよびKoffによって測定した、該複合Fab 結合アフィニティ
ー分析の結果を第13表に示し、計算された平衡会合および解離定数(Ka,M-1,Kd
,M)を第14表に記載した。選択された個々のクローンを、該Fab 名称からダッシ
ュによって分離された数値により示す。更に、アフィニティーの増加倍率をも、
該複合Fab 各々について上記のように算出し、該変異誘発されていないかつ最適
化されていないgp120-結合MT4 Fab の値と比較した。
上記表に示したように、変異誘発−最適化重鎖および軽鎖可変ドメインDNA カ
セットの選択的組み合わせにより得た、該Fab-発現ファージ−表示クローンは、
gp120 に対する高い結合アフィニティーを示すFab をコードした。特に、重鎖ま
たは軽鎖CDR の何れかを変異誘発し、かつ最適gp120 結合性につき選択されたFa
b は、10-10Mを越える Kdを示し、2個のFab は10-11Mを越える Kdを有し、1個
の好ましい、H31/L42-1 と命名されたFab は10-12Mを越える Kdを示した。gp120
結合アフィニティーの対応する増加倍率は元のFab MT4 の値の約16倍〜2400倍
以上であった。更に、該gp120-反応性Fabのgp120 に対する結合の半減期は自然
対数(ln2)を該 Koff速度定数で割ることにより得ることができ、これによって相
互作用の特徴に関連するもう一つのパラメータが得られる。H31/L42-1と命名さ
れたFab については、gp120 に対する結合の計算された半減期は44.5日であり、
一方HIV に対して血清学的に正の無症候性患者由来の、ランダム化されておらず
かつ最適化されていないFab MT4 の値は24分である。かくして、この半減期の測
定は、本発明の合成最適化Fab の、HIV のgp120 に対する高い結合アフィニティ
ーを特徴付けるもう一つの方法である。
最大のアフィニティーをもつ、H31/L42-1 と命名された該Fab は、該重鎖複合
H31 を含むFab 複合体であって、軽鎖複合体L42 との組み合わせとして添加され
た、重鎖CDR1−変異誘発されたFab H4H1および重鎖CDR3−変異誘発されたFab M5
56-3を含み、該軽鎖複合体L42 はFab Dからの軽鎖CDR1−変異誘発領域および軽
鎖CDR3−変異誘発されたFab H4L3-2を含んでいた。
該Fab H31/L42-1 をコードするヌクレオチド配列が存在する、該pPho構築物を
含む、E.コリ菌株DH10B の細胞培養物は、実施例4に記載した通り、1994年9月
16日付けで、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Americal Type Culture
Collection)に寄託されており、ATCC承認番号69691 が与えられている。
従って、重鎖および軽鎖遺伝子両者を含むCDR-特異的変異形成を利用する本発
明の方法は、これまでに進化的選択圧によっては得られておらず、またHIV のgp
120 に対する内因性の抗体を生成する患者中にも存在しない、固有のFab を生成
した。実施例3で調製された該複合Fab は、実施例2で調製され、4つのライブ
ラリーから選択された該gp120-反応性Fab と共に、任意の他の公知のgp120-反応
性Fab または完全な免疫グロブリンよりも高い、gp120 に対する結合アフィニ
ティーを示すFab の典型である。
本明細書に記載の如く生成され、かつ特徴付けされた、gp120 に対して高い結
合アフィニティーを示す、好ましい合成Fab を第15表に掲載した。第15表には、
各Fab の名称が、Kd,M で表した対応するアフィニティー測定値と共に与えられ
ている。また、本発明の好ましいFab を含む、該重鎖および軽鎖可変ドメインの
アミノ酸残基配列は、1個のコドンによって分離された配列番号: の対によって
第15表に示されている。例えば、最大の結合アフィニテイーをもつFab 、即ちH3
1/L42-1 の重鎖および軽鎖のアミノ酸残基配列は、それぞれ配列番号: 89および
88に対応し、これら自体は配列表に掲載されている。
4. 物質の寄託
プラスミド、pMT4は、1993年10月19日付けで、1301パークローンドライブ,ロ
ックビル,MD,USA の、アメリカンタイプカルチャーコレクション(Americal Ty
pe Culture Collection: ATCC)に寄託されており、ATCC承認番号75574 が与えら
れている。この寄託物は、MT4 と命名されたFab 抗体をコードかつ発現するプラ
スミドを与え、その重鎖および軽鎖の可変ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ
配列番号: 1および6に記載され、かつ第1図および第2図に示されている。
プラスミドpPho-H31/L42-1を含む、DH10B-pPho-H31/L42-1と命名された細胞培
養物は1994年9月19日にまたはその前に、ATCCに寄託され、ATCC承認番号69691
が与えられている。この寄託物は、pPhoを主体とするプラスミドを含むE.コリ細
胞培養物を与え、これからH31/L42-1 と命名されたFab 抗体が発現され、その重
鎖および軽鎖のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号: 89および88に記載され、かつ
第15図および第14図に示されている。
これらの寄託は、特許手続きの目的のための微生物の寄託についての国際的承
認に関するブダペスト条約の規定およびその規則(ブダペスト条約)に基づきな
させれた。これは、該各寄託の日から30年間に渡り、生きたプラスミドおよび生
きた細胞培養物の維持を保証する。これらのプラスミドおよび細胞培養物は、該
ブダペスト条約の定めに基づいて、ATCCから入手可能であるはずであり、該条約
は、該プラスミドおよび培養物の子孫の恒久的かつ制約の無い入手性を、該関連
するUS特許の許可時点または任意のUSまたは外国特許出願の公開時点の何れか早
い時期に公に対して保証し、また35U.S.C.§122 および該規定に準ずるコミッシ
ョナーの規則(37 CFR §1.14、特に886 OG 638を含む)に従って資格あるもの
とされた、USパテンツ&トレードマークス(Patents and Trademarks)の長官によ
って決定された者に対して、該子孫の入手性を保証している。本特許出願の譲受
け人は、該プラスミドおよび培養物の寄託物が死滅し、あるいは適当な条件下で
培養した場合に喪失し、もしくは破壊された場合に、通知に基づき、速やかに同
一のプラスミドおよび培養物の生きた試料と交換することに同意している。該寄
託物の入手性は、特許法に従ってあらゆる政府の権威の下に許可された権利に違
反する、本発明の実施に対するライセンスとして解釈すべきものではない。
上記の詳細は、当業者が本発明を実施するのに十分であると考えられる。本発
明の範囲は、寄託された細胞系によって制限されるものではない。というのは、
該寄託された態様は、本発明の一局面の単なる例示と考えるべきであり、機能的
に等価なあらゆる細胞系が本発明の範囲内に入るからである。物質の寄託は、本
明細書に含まれる説明が、本発明の最良の態様を含めて、本発明の任意の局面の
実施を可能とするのに不十分であることを認めたものではなく、また請求の範囲
を該寄託物が代表する特定の例示に限定されるものと解釈すべきでもない。実際
に、本明細書に示しかつ記載したもの以外に、本発明の種々の改良が、上記説明
から当業者には明らかであり、添付した本発明の範囲に入る。
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フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI
G01N 33/577 0276−2J G01N 33/577 B
//(C12N 1/21
C12R 1:19)
(C12P 21/08
C12R 1:19)
(31)優先権主張番号 08/308,841
(32)優先日 1994年9月19日
(33)優先権主張国 米国(US)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),AU,CA,FI,JP,N
O,US
(72)発明者 バートン デニス アール
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
92037 ラ ジョラ ビューモント アベ
ニュー 6044
(72)発明者 ラーナー リチャード エイ
アメリカ合衆国 カリフォルニア州
92037 ラ ジョラ イースト ローズラ
ンド ドライヴ 7750
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.ヒト免疫不全ウイルス(HIV)と免疫反応し、かつこれを中和することのでき る合成ヒトモノクローナル抗体であって、該モノクローナル抗体が、インビトロ でのウイルス感染性アッセイにおいて、HIV 感染性力価を、100ng/ml未満の抗体 濃度において50% 減ずる能力を有することを特徴とする、上記ヒトモノクローナ ル抗体。 2.該抗体濃度が20 ng/ml未満である、請求の範囲第1項に記載のヒトモノクロ ーナル抗体。 3.該抗体濃度が10 ng/ml未満である、請求の範囲第1項に記載のヒトモノクロ ーナル抗体。 4.該HIV が予め選択された一次HIV 株であり、該モノクローナル抗体がHIV の 二次フィールド株の該HIV 感染性力価を、10 ng/ml未満の抗体濃度において50% 減ずる能力を有する、請求の範囲第1項に記載のヒトモノクローナル抗体。 5.該抗体がFab フラグメントである請求の範囲第1項に記載のヒトモノクロー ナル抗体。 6.該抗体が、配列番号: 2、3、4および5、およびその保存性置換体からな る群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノク ローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第1項に記載のヒトモノクロー ナル抗体。 7.該モノクローナル抗体が、配列番号: 2:6 、3:6 、4:6 および5:6 、および その保存性置換体からなる群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変 領域のアミノ酸残基配列を対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有 する、請求の範囲第1項に記載のヒトモノクローナル抗体。 8.該モノクローナル抗体が、解離定数(Kd)約1×10-8M 以下で、HIV gp120と 免疫反応する、請求の範囲第1項に記載のヒトモノクローナル抗体。 9.該抗体が、配列番号: 1、3、54、55、56、57、58、59、89、90、91および 92、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領 域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の 範囲第8項に記載のヒトモノクローナル抗体。 10.該抗体が、配列番号: 6、69、70、73、75、76、77、79、80、82、83、84、 85、86、87および88、およびその保存性置換体からなる群から選ばれる軽鎖免疫 グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル抗体の結合特異性 を有する、請求の範囲第8項に記載のヒトモノクローナル抗体。 11.該解離定数が約1×10-9M 〜約1×10-10Mである請求の範囲第8項に記載の ヒトモノクローナル抗体。 12.該モノクローナル抗体が、配列番号: 3:6 、3:69、3:70、3:73、3:75、3:76 、3:77、3:79、3:80、3:82、3:83、3:84、3:87、54:6、55:6、56:6、57:6、58:6 、59:6、90:88 、91:6、91:88 および92:88 、およびその保存性置換体からなる 群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を 対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第11項に 記載のヒトモノクローナル抗体。 13.該解離定数が約1×10-10M〜約1×10-11Mである請求の範囲第8項に記載の ヒトモノクローナル抗体。 14.該モノクローナル抗体が、配列番号: 3:85、3:86、89:6および90:86 、およ びその保存性置換体からなる群から選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可 変領域のアミノ酸残基配列を対として含む、モノクローナル抗体の結合特異性を 有する、請求の範囲第13項に記載のヒトモノクローナル抗体。 15.該解離定数が約1×10-11M〜約1×10-12Mである請求の範囲第8項に記載の ヒトモノクローナル抗体。 16.該モノクローナル抗体が、対として、配列番号: 89:88 で示される重鎖およ び軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列、およびその保存性置換体を 含むモノクローナル抗体の結合特異性を有する、請求の範囲第15項に記載のヒト モノクローナル抗体。 17.該抗体が、ATCC承認番号69691 中に含まれるプラスミドpPho-H31/L42-1によ って生成されるモノクローナル抗体の結合特異性をもつ、請求の範囲第16項に記 載のヒトモノクローナル抗体。 18.ヒト免疫不全ウイルス(HIV)糖タンパク質gp120 と免疫反応し、かつHIV を 中和することのできる、合成ヒトモノクローナル抗体の、重鎖免疫グロブリン可 変領域のアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該モノ クローナル抗体が、配列番号: 1、2、3、4、5、54、55、56、57、58、59、 89、90、91および92、および該アミノ酸残基配列の保存性置換体からなる群から 選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクローナル 抗体の結合特異性を有する、上記ポリヌクレオチド配列、又はこれに相補的なポ リヌクレオチド配列。 19.ヒト免疫不全ウイルス(HIV)糖タンパク質gp120 と免疫反応し、かつHIV を 中和することのできる、合成ヒトモノクローナル抗体の、軽鎖免疫グロブリン可 変領域のアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列であって、該モノ クローナル抗体が、配列番号: 6、69、70、73、75、76、77、79、80、82、83、 84、85、86、87および88、および該アミノ酸残基配列の保存性置換体からなる群 から選ばれる重鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を含むモノクロー ナル抗体の結合特異性を有する、上記ポリヌクレオチド配列、又はこれに相補的 なポリヌクレオチド配列。 20.ヒト免疫不全ウイルス(HIV)糖タンパク質gp120 と免疫反応し、かつHIV を 中和することのできる、合成ヒトモノクローナル抗体の、重鎖および軽鎖免疫グ ロブリン可変領域のアミノ酸残基配列をコードするポリヌクレオチド配列であっ て、該モノクローナル抗体が、配列番号: 2:6 、3:6 、4:6 、5:6 、3:69、3:70 、3:73、3:75、3:76、3:77、3:79、3:80、3:82、3:83、3:84、3:85、3:86、3:87 、54:6、55:6、56:6、57:6、58:6、59:6、89:6、89:88 、90:86 、90:88 、91:6 、91:88 および92:88 、および該アミノ酸残基配列の保存性置換体からなる群か ら選ばれる、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変領域のアミノ酸残基配列を対と して含む、モノクローナル抗体の結合特異性を有する、上記ポリヌクレオチド配 列、又はこれに相補的なポリヌクレオチド配列。 21.請求の範囲第18、19または20項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを 特徴とする宿主細胞。 22.請求の範囲第18、19または20項に記載のポリヌクレオチド配列を含むことを 特徴とするDNA発現ベクター。 23.ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むものと推定されるサンプルを、診断上有 効な量の請求の範囲第1項に記載のモノクローナル抗体と接触させる工程と、該 モノクローナル抗体が該サンプルと反応するか否かを決定する工程とを含むこと を特徴とする、HIV を検出する方法。 24.該検出がインビボで行われる、請求の範囲第23項に記載の方法。 25.該モノクローナル抗体が、放射性同位元素および常磁性ラベルからなる群か ら選ばれるラベルによって、検出可能に標識されている、請求の範囲第24項に記 載の方法。 26.該検出がインビトロで行われる、請求の範囲第23項に記載の方法。 27.該モノクローナル抗体が、放射性同位元素、蛍光化合物、コロイド状金属、 化学発光化合物、生物発光化合物、および酵素からなる群から選ばれるラベルに よって、検出可能に標識されている、請求の範囲第26項に記載の方法。 28.該モノクローナル抗体が、固体相に結合する、請求の範囲第26項に記載の方 法。 29.ヒトに、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)疾患に対する受動免疫治療を与える方 法であって、該ヒトに免疫治療上有効な量の、請求の範囲第1項に記載のモノク ローナル抗体を投与する工程を含むことを特徴とする方法。 30.該受動免疫治療が、予防の目的で与えられる、請求の範囲第29項に記載の方 法。 31.該投与が非経口投与である、請求の範囲第29項に記載の方法。 32.該非経口投与が、皮下、筋肉内、腹腔内、洞内、経皮、または血管内による 投与である、請求の範囲第31項に記載の方法。 33.該非経口投与が、穏やかな灌流による投与である、請求の範囲第31項に記載 の方法。 34.該穏やかな灌流が、血管内または蠕動手段により行われる、請求の範囲第33 項に記載の方法。 35.該免疫療法上有効な量が、約0.1 mg/kg 〜約300 mg/kg である、請求の範囲 第29項に記載の方法。 36.ヒトに、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)疾患に対する活性な免疫治療を誘発す る方法であって、該ヒトに免疫原的に有効な量の、請求の範囲第1項に記載のモ ノクローナル抗体に対する抗−イディオタイプ抗体を投与する工程を含むことを 特徴とする方法。 37.免疫療法上有効な量の請求の範囲第1項に記載のモノクローナル抗体を、少 なくとも1単位投与量で、薬理学的担体中に含有することを特徴とする薬理組成 物。 38.該組成物が2種以上の異なるモノクローナル抗体を含む、請求の範囲第37項 に記載の薬理組成物。 39.ヒト免疫不全ウイルス(HIV)を含むと推定される源中のHIV を検出するのに 有用なキットであって、請求の範囲第1項に記載のモノクローナル抗体を含有す る1個の容器を含む、1またはそれ以上の容器を厳密な拘束状態で受け取るよう に区分されている、担体手段を含むことを特徴とするキット。 40.合成ヒト抗-HIVモノクローナル抗体の製法であって、 a) 免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインをもつヒトモノクローナ ル抗体をコードする、糸状ファージのゲノムを調製する工程と、ここで該重鎖可 変ドメインは、糸状ファージ膜の固定ドメインを含む融合ポリペプチドとして存 在し、該モノクローナル抗体はHIV 糖タンパク質gp120 と免疫反応する、 b) 該調製したゲノム中に存在する、該免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコ ードするヌクレオチド配列を突然変異させて、変異させた免疫グロブリン重鎖可 変ドメインヌクレオチド配列を含む変異誘発されたファージ粒子の第一のライブ ラリーを作成する工程と、 c) 該工程(b)で作成したライブラリーと、HIV 糖タンパク質gp120 リガンド とを、該ライブラリーの構成員が該リガンドに結合し、かつ第一のリガンド−フ ァージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程と、 d) 該第一の複合体中のファージ粒子を、非−結合ライブラリー構成員から分 離して、第一のリガンドに富むライブラリーを形成する工程と、ここで該第一の リガンドに富むライブラリーは、該HIV 糖タンパク質gp120 リガンドに対する結 合特異性をもつファージ粒子を含む、 e) 該第一のリガンドに富むライブラリーから、糸状ファージの該ゲノムを調 製する工程と、 f) 該調製したゲノム中に存在する、該免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコ ードするヌクレオチド配列を突然変異させて、変異させた免疫グロブリン重鎖可 変ドメインヌクレオチド配列を含む変異誘発されたファージ粒子の第二のライブ ラリーを作成する工程と、 g) 該工程(f)で作成したライブラリーと、HIV 糖タンパク質gp120 リガンド とを、該ライブラリーの構成員が該リガンドに結合し、かつ第二のリガンド−フ ァージ粒子複合体を形成するのに十分な条件下で接触させる工程と、 h) 該第二の複合体中のファージ粒子を、非−結合ライブラリー構成員から分 離して、第二のリガンドに富むライブラリーを形成する工程と、ここで該第二の リガンドに富むライブラリーは、該予め選択されたHIV リガンドに対する結合特 異性をもつファージ粒子を含み、これによってHIV と免疫反応性の合成ヒトモノ クローナル抗体を単離する工程、 を含むことを特徴とする、上記合成ヒト抗-HIVモノクローナル抗体の製造方法。 41.該工程(b)および(f)における変異形成が、該免疫グロブリンの重鎖可変ドメ インの同一の領域を指向する、請求の範囲第40項に記載の方法。 42.該工程(b)および(f)における変異形成が、該免疫グロブリンの重鎖可変ドメ インの異なる2つの領域を指向する、請求の範囲第40項に記載の方法。 43.該免疫グロブリンの重鎖可変ドメインが、CDRI、CDR2およびCDR3からなる群 から選ばれる相補性決定領域(CDR)である、請求の範囲第40項に記載の方法。 44.該工程(b)における変異形成が第一のCDR を指向し、かつ該工程(f)における 変異形成が第二のCDR を指向する、請求の範囲第43項に記載の方法。 45.該第一および第二のCDR が、それぞれCDR1およびCDR3である、請求の範囲第 44項に記載の方法。 46.該工程(b)における変異形成が、該ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子のCDR 中に変異形成を誘発する工程を含み、該変異誘発工程がポリメラーゼ連鎖反応(P CR)プライマーオリゴヌクレオチドまたはその配列に相補的な配列を有するオリ ゴヌクレオチドを使用した、PCR によって、該免疫グロブリン遺伝子の該CDR の 一部を増幅する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが5'および3'末端を有し、か つ a) 該5'末端に、該CDR の上流のフレームワーク領域とハイブリッド化可能な ヌクレオチド配列、 b) 該3'末端に、該CDR の下流のフレームワーク領域とハイブリッド化可能な ヌクレオチド配列、および c) 該5'末端と該3'末端との間に、以下の式で表されるヌクレオチド配列: [NNS]n' ここで、Nは独立に任意のヌクレオチドを表し、SはG、Cまたはその類似体で あり、nは3〜約24である、 を含み、該3'および5'末端ヌクレオチド配列は約6〜50個のヌクレオチドに相当 する長さをもつ、請求の範囲第40項に記載の方法。 47.nが5であり、該CDR がCDR1であり、かつ該上流および下流フレームワーク 領域がそれぞれFR1 およびFR2 である、請求の範囲第46項に記載の方法。 48.該工程(f)における変異形成が、該ゲノム中の免疫グロブリン遺伝子のCDR 中に変異形成を誘発する工程を含み、該変異誘発工程がポリメラーゼ連鎖反応(P CR)プライマーオリゴヌクレオチドまたはその配列に相補的な配列を有するオリ ゴヌクレオチドを使用した、PCR によって、該免疫グロブリン遺伝子の該CDR の 一部を増幅する工程を含み、該オリゴヌクレオチドが5'および3'末端を有し、か つ a) 該5'末端に、該CDR の下流のアンチセンス(非コード)フレームワーク領 域とハイブリッド化可能なヌクレオチド配列、 b) 該3'末端に、該CDR の上流のアンチセンス(非コード)フレームワーク領 域とハイブリッド化可能なヌクレオチド配列、および c) 該5'末端と該3'末端との間に、以下の式で表されるヌクレオチド配列: [MNN]n' ここで、Nは独立に任意のヌクレオチドを表し、MはA、Cまたはその類似体で あり、nは3〜約24である、 を含み、該3'および5'末端ヌクレオチド配列は約6〜50個のヌクレオチドに相当 する長さをもつ、請求の範囲第40項に記載の方法。 49.nが4であり、該CDR がCDR3であり、かつ該上流および下流フレームワーク 領域がそれぞれFR3およびFR4である、請求の範囲第48項に記載の方法。 50.該第二のリガンドに富むライブラリーが、合成抗体分子を含むファージ粒子 を含有し、該合成抗体分子が、インビトロウイルス感染アッセイにおいて、該ア ッセイにおける培地1ml当たり100 nm未満なる抗体濃度において、HIV 感染性力 価を50% 減ずる能力をもつ、請求の範囲第40項に記載の方法。 51.請求の範囲第50項記載の方法により生成される合成モノクローナル抗体。
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Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010195798A (ja) * | 1997-10-20 | 2010-09-09 | Domantis Ltd | 種々のリガンドによるファージ提示ライブラリーのスクリーニング方法 |
WO2018021012A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2018-02-01 | 株式会社カネカ | 抗体断片の製造方法 |
Families Citing this family (61)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20030187247A1 (en) * | 1992-09-30 | 2003-10-02 | The Scripps Research Institute | Human neutralizing monoclonal antibodies to human immunodeficiency virus |
US6090382A (en) * | 1996-02-09 | 2000-07-18 | Basf Aktiengesellschaft | Human antibodies that bind human TNFα |
HU228630B1 (en) | 1996-02-09 | 2013-04-29 | Abbott Biotech Ltd | Use of human anti bodies that bind human tnf-alpha and process for inhibiting of human tnf-alpha activity |
AU6685698A (en) * | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Sunol Molecular Corporation | Fusion proteins comprising bacteriophage coat protein and a single-chain t cell receptor |
US7763258B2 (en) * | 1997-05-20 | 2010-07-27 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Virus-like particles (VLPs) comprising heterologous multiple membrane spanning proteins |
CA2358385C (en) | 1998-12-31 | 2013-08-06 | Chiron Corporation | Polynucleotides encoding antigenic hiv type c polypeptides, polypeptides and uses thereof |
US7135287B1 (en) | 1999-10-02 | 2006-11-14 | Biosite, Inc. | Human antibodies |
US20070111259A1 (en) * | 1999-10-02 | 2007-05-17 | Medarex, Inc. | Human antibodies |
US6680209B1 (en) * | 1999-12-06 | 2004-01-20 | Biosite, Incorporated | Human antibodies as diagnostic reagents |
US7030219B2 (en) | 2000-04-28 | 2006-04-18 | Johns Hopkins University | B7-DC, Dendritic cell co-stimulatory molecules |
EP1642910B1 (en) * | 2000-12-05 | 2012-02-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
US7396917B2 (en) | 2000-12-05 | 2008-07-08 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Rationally designed antibodies |
WO2002046436A2 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Plasmid vectors |
WO2002046434A2 (en) * | 2000-12-08 | 2002-06-13 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Plasmid vectors |
WO2002088315A2 (en) | 2001-04-27 | 2002-11-07 | Alexion Pharmaceuticals, Inc. | Phagemid vectors |
EP1411770A4 (en) | 2001-07-05 | 2006-05-10 | Chiron Corp | POLYNUCLEOTIDES CODING FOR ANTIGENIC C-TYPE HIV POLYPEPTIDES, POLYPEPTIDES AND THEIR USE |
WO2003033666A2 (en) * | 2001-10-16 | 2003-04-24 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Broadly cross-reactive neutralizing antibodies against human immunodeficiency virus selected by env-cd4-co-receptor complexes |
GB0202206D0 (en) * | 2002-01-31 | 2002-03-20 | Bioinvent Int Ab | Method of making libraries of anti-ligands |
US7803913B2 (en) * | 2002-05-06 | 2010-09-28 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Identification of novel broadly cross-reactive neutralizing human monoclonal antibodies using sequential antigen panning of phage display libraries |
CA2485120C (en) * | 2002-05-06 | 2013-02-19 | The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Identification of novel broadly cross-reactive hiv-1 neutralizing human monoclonal antibodies |
US20050208587A1 (en) * | 2002-09-09 | 2005-09-22 | Rosa Cardoso | Peptides that bind to broadly neutralizing anti-HIV antibody-structure of 4E10 Fab fragment complex. uses thereof, compositions therefrom |
US20050014230A1 (en) * | 2003-07-16 | 2005-01-20 | Ccl Holding Co., Ltd. | Preparation of fully human antibodies |
US20110124842A1 (en) * | 2003-09-19 | 2011-05-26 | Brunel Florence M | Peptide that binds to a broadly neutralizing anti-HIV antibody-structure of 4E10 Fab fragment complex, uses thereof, compositions therefrom |
US7750123B2 (en) * | 2003-11-25 | 2010-07-06 | Dana Farber Cancer Institute, Inc. | Antibodies against SARS-CoV and methods of use thereof |
US20080038280A1 (en) * | 2004-10-14 | 2008-02-14 | Government Of The United States Of America | A32 Monoclonal Antibody Fusion Proteins For Use As Hiv Inhibitors And Vaccines |
CA2585574A1 (en) * | 2004-10-29 | 2006-05-11 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary , Department Of Health And Human Services | Broadly cross-reactive hiv-1 neutralizing human monoclonal antibodies |
EP2025762A3 (en) | 2006-01-17 | 2009-09-30 | Health Research Inc. | Heteroduplex tracking assay |
US8026477B2 (en) * | 2006-03-03 | 2011-09-27 | Ionsense, Inc. | Sampling system for use with surface ionization spectroscopy |
CN102203125A (zh) * | 2008-08-25 | 2011-09-28 | 安普利穆尼股份有限公司 | Pd-1拮抗剂及其使用方法 |
AU2011230619C1 (en) | 2010-03-25 | 2016-06-23 | Oregon Health & Science University | CMV glycoproteins and recombinant vectors |
EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
LT2691530T (lt) | 2011-06-10 | 2018-08-10 | Oregon Health & Science University | Cmv glikoproteinai ir rekombinantiniai vektoriai |
US20130189754A1 (en) | 2011-09-12 | 2013-07-25 | International Aids Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
US9181572B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Methods to modulate lysine variant distribution |
US9334319B2 (en) | 2012-04-20 | 2016-05-10 | Abbvie Inc. | Low acidic species compositions |
US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
KR20150043523A (ko) | 2012-09-02 | 2015-04-22 | 애브비 인코포레이티드 | 단백질 불균일성의 제어 방법 |
US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
SG11201507230PA (en) | 2013-03-12 | 2015-10-29 | Abbvie Inc | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
US8921526B2 (en) | 2013-03-14 | 2014-12-30 | Abbvie, Inc. | Mutated anti-TNFα antibodies and methods of their use |
US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
US9499614B2 (en) | 2013-03-14 | 2016-11-22 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosaccharides |
US20150065381A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-05 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel hiv-1 immunogens |
US9598667B2 (en) | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
US20150139988A1 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
US10174292B2 (en) | 2015-03-20 | 2019-01-08 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
KR102573622B1 (ko) | 2016-12-26 | 2023-08-31 | 제이씨알 파마 가부시키가이샤 | Bdnf를 포함하는 융합 단백질 |
BR112019009316A2 (pt) | 2016-12-26 | 2019-08-06 | Japan Chem Res | anticorpo antirreceptor de transferrina humana, proteína de fusão, fragmento de dna, vetor de expressão, célula de mamífero, complexo de composto farmacologicamente ativo e de anticorpo antirreceptor de transferrina humana, usos do anticorpo antirreceptor de transferrina humana e da proteína de fusão, e, métodos para tratamento de um distúrbio do sistema nervoso central e de uma doença do sistema nervoso central que acompanha a doença de pompe, a síndrome de hurler ou a síndrome de hurler-scheie. |
SG11202006433PA (en) | 2018-02-05 | 2020-08-28 | Jcr Pharmaceuticals Co Ltd | Method for delivering drug to muscle |
KR20210153674A (ko) * | 2019-04-22 | 2021-12-17 | 디디바이오. 코포레이션 엘티디.,(상하이) | 파지 라이브러리 제조방법 |
IL294218A (en) | 2019-12-27 | 2022-08-01 | Chiome Bioscience Inc | Antibody against cdcp1 |
WO2022049867A1 (ja) | 2020-09-02 | 2022-03-10 | 国立大学法人東京大学 | がん免疫微小環境の調節物質およびそれによる予防・診断・治療的利用 |
CA3238914A1 (en) | 2021-11-19 | 2023-05-25 | Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. | Peptide having affinity for human transferrin receptor |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US5223409A (en) | 1988-09-02 | 1993-06-29 | Protein Engineering Corp. | Directed evolution of novel binding proteins |
AP237A (en) * | 1990-05-29 | 1993-04-29 | Cedars Sinai Medical Center | Immunoreagents reactive with a conserved epitope of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) gp120 and methods of use. |
WO1991019797A1 (en) * | 1990-06-15 | 1991-12-26 | New York University | Heterohybridomas producing human monoclonal antibodies to hiv-1 |
WO1993008216A1 (en) * | 1991-10-15 | 1993-04-29 | New York University | Human monoclonal antibodies to the cd4-binding domain of hiv, uses thereof and synergistic neutralization of hiv |
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010195798A (ja) * | 1997-10-20 | 2010-09-09 | Domantis Ltd | 種々のリガンドによるファージ提示ライブラリーのスクリーニング方法 |
WO2018021012A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2018-02-01 | 株式会社カネカ | 抗体断片の製造方法 |
JPWO2018021012A1 (ja) * | 2016-07-28 | 2019-05-09 | 株式会社カネカ | 抗体断片の製造方法 |
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