JPWO2019187603A1 - 免疫グロブリンｇ結合性ペプチド - Google Patents

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Abstract

本発明は、アルカリなどに対する化学安定性が高いペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。免疫グロブリンＧ結合性ペプチドに対して、適切な部位に変異を導入したペプチドをアフィニティ・リガンドとして利用することで、上記課題を解決する。

Description

本発明は、アルカリなどに対する化学的安定性が向上した免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンＧまたはその断片の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体に関するものである。
タンパク質の重要な機能の一つとして、特定の分子に特異的に結合する機能が挙げられる。この機能は、生体内における免疫反応やシグナル伝達に重要な役割を果たす。治療・検査などの様々な用途で、この機能を利用した技術開発がなされている。特定の分子に特異的に結合するタンパク質として最も産業利用されているものの１つに抗体が挙げられる。そして、抗原抗体反応とは別の様式で様々な抗体に特異的に結合するタンパク質も、抗体の検出や分離精製に利用できるため、産業的価値は極めて高い。
産業的に利用される抗体は、基本的に免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。ＩｇＧ結合性タンパク質としては、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＨおよびプロテインＬと呼ばれる細菌の細胞壁タンパク質がよく知られており（非特許文献１）、実際に産業的に利用されている一例として、抗体医薬を動物細胞培養物から一度に高い純度でキャプチャリングして精製するために利用されるプロテインＡアフィニティ分離マトリックス（以下、プロテインＡを「ＳｐＡ」と略記する場合がある）が挙げられる（非特許文献２，３）。
プロテインＡの場合には、部位特異的に変異を導入し、アフィニティ分離マトリックス用リガンドとしての機能を改良するタンパク工学研究が盛んに進められており（非特許文献１，４，特許文献１〜６）、例えば、ＳｐＡアフィニティ分離マトリックスの洗浄に広く用いられる水酸化ナトリウム溶液に対する化学的安定性の向上を目的とした研究行われている。具体的には、アルカリ性条件下で脱アミド化反応を受け易いことが知られるアスパラギン残基、および、アスパラギン残基の後ろのグリシン残基へのアミノ酸置換変異が化学的安定性の向上に効果がある。しかし、ＳｐＡ中の全てのアスパラギン残基に関し、このような変異がアルカリ耐性向上効果を示すわけではない（非特許文献４）。
プロテインＧでも、Ｆｃ領域とＦａｂ領域の両方に結合性を示す改変型プロテインＧが開発されているが（特許文献７）、更に、化学的安定性が高いプロテインＧも求められている。
米国特許第５１４３８４４号公報 特表２００６−３０４６３３号公報 欧州特許第１１２３３８９号公報 国際公開第０３／０８０６５５号パンフレット 米国公開第２００６／０１９４９５０号公報 国際公開第２０１１／１１８６９９号パンフレット 国際公開第２０１６／０３１９０９号パンフレット
Nezlin R．ら，Adv．Immunol．，2004，vol．82，pp．155-215 Hober S．ら，J．Chromatogr．B，2007，848巻，40-47頁 Shukla A．A．ら，Trends Biotechnol．，2010，28巻，253-261頁 Linhult M. ら, PROTEINS, 2004, 55巻, 407-416頁
本発明は、アルカリなどに対する化学的安定性が向上したペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、当該ペプチドをリガンドとして有するアフィニティ分離マトリックス、当該アフィニティ分離マトリックスを用いる免疫グロブリンＧまたはその断片の製造方法、当該ペプチドをコードするＤＮＡ、当該ＤＮＡを含むベクター、および当該ベクターにより形質転換された形質転換体を提供することも目的とする。
本発明者は、上記課題を解決するために、特許文献２に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドに新たな変異を導入したペプチドを設計し、タンパク質工学的手法および遺伝子工学的手法を用いて該変異ペプチドを形質転換細胞から取得し、取得した該変異ペプチドの物性を比較する検討を行った。
以下、その結果として完成した本発明を示す。
［１］ 下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｔｙｒ−Ｘａａ4−Ｌｅｕ−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ18−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ24−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｌｅｕ−Ｘａａ31−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｘａａ35−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ50−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ56（配列番号１）
式中、
Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ2＝Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｒｇ
Ｘａａ4＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
Ｘａａ8＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＶａｌ
Ｘａａ10＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ18＝ＴｈｒまたはＡｌａ
Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
Ｘａａ31＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ35＝Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒ
Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ50＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
［２］ Ｘａａ2がＴｈｒである上記［１］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［３］ Ｘａａ4がＡｒｇである上記［１］または［２］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［４］ Ｘａａ6がＩｌｅである上記［１］〜［３］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［５］ Ｘａａ7がＬｅｕである上記［１］〜［４］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［６］ Ｘａａ8がＬｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎである上記［１］〜［５］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［７］ Ｘａａ10がＡｒｇである上記［１］〜［６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［８］ Ｘａａ18がＡｌａである上記［１］〜［７］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［９］ Ｘａａ24がＡｌａである上記［１］〜［８］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１０］ Ｘａａ29がＶａｌである上記［１］〜［９］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１１］ Ｘａａ31がＡｒｇである上記［１］〜［１０］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１２］ Ｘａａ35がＰｈｅまたはＡｓｎである上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１３］ Ｘａａ40がＡｓｐである上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１４］ Ｘａａ42がＧｌｕである上記［１］〜［１３］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１５］ Ｘａａ50がＡｒｇである上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１６］ Ｘａａ4、Ｘａａ10、Ｘａａ31およびＸａａ50がＡｒｇである上記［１］〜［１５］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
［１７］ 上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体。
［１８］ 上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または上記［１７］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドまたは免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
［１９］ 免疫グロブリンＧまたはその断片を製造する方法であって、
上記［１８］に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンＧまたはその断片を含む液体試料とを接触させる工程、および、
アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたはその断片を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
［２０］ 上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または上記［１７］に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
［２１］ 上記［２０］に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
［２２］ 上記［２１］に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
本発明で得られた免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを固定化したアフィニティ精製用クロマトグラフィ担体は、アルカリ処理のダメージによる免疫グロブリン結合活性の低下が少ない。よって、繰返し使用に際して、高濃度または長時間での水酸化ナトリウム水溶液を用いた洗浄が可能となる。
各種ペプチドのアルカリ処理前後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果を示した図である。
本発明において「ペプチド」という用語は、ペプチド構造を有するあらゆる分子を含むものとする。本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、その必須構造を構成するアミノ酸の数から、一般的には「タンパク質」または「（タンパク質の）ドメイン」と呼ばれることもある。
「免疫グロブリン」は、リンパ球のＢ細胞が産生する糖タンパク質であり、特定のタンパク質などの分子を認識して結合する働きを持つ。免疫グロブリンは、かかる特定の分子（抗原）に特異的に結合する機能に加えて、他の生体分子や細胞と協同して抗原を含む因子を無毒化・除去する機能も有する。免疫グロブリンは、一般的に「抗体」と呼ばれるが、それはこのような機能に着目した名称である。全ての免疫グロブリンは、基本的には同じ分子構造を有し、軽鎖および重鎖のポリペプチド鎖それぞれ２本ずつからなる“Ｙ”字型の４本鎖構造を基本構造としている。軽鎖（Ｌ鎖）にはλ鎖とκ鎖の２種類があり、すべての免疫グロブリンはこのどちらかを持つ。重鎖（Ｈ鎖）には、γ鎖、μ鎖、α鎖、δ鎖、ε鎖という構造の異なる５種類があり、この重鎖の違いによって免疫グロブリンの種類（アイソタイプ）が変わる。免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、単量体型の免疫グロブリンで、２本の重鎖（γ鎖）と２本の軽鎖から構成され、２箇所の抗原結合部位を持っている。
免疫グロブリンの“Ｙ”字の下半分の縦棒部分にあたる場所をＦｃ領域と呼び、上半分の“Ｖ”字の部分をＦａｂ領域と呼ぶ。Ｆｃ領域は抗体が抗原に結合した後の反応を惹起するエフェクター機能を有し、Ｆａｂ領域は抗原と結合する機能を有する。重鎖のＦａｂ領域とＦｃ領域はヒンジ部でつながっており、パパイヤに含まれるタンパク分解酵素パパインは、このヒンジ部を分解して２つのＦａｂ領域と１つのＦｃ領域に切断する。Ｆａｂ領域のうち“Ｙ”字の先端に近い部分は、多様な抗原に結合できるように、アミノ酸配列に多彩な変化が見られるため可変領域（Ｖ領域）と呼ばれている。軽鎖の可変領域をＶＬ領域、重鎖の可変領域をＶＨ領域と呼ぶ。Ｖ領域以外のＦａｂ領域とＦｃ領域は、比較的変化の少ない領域であり定常領域（Ｃ領域）と呼ばれる。軽鎖の定常領域をＣＬ領域と呼び、重鎖の定常領域をＣＨ領域と呼ぶが、ＣＨ領域はさらにＣＨ１〜ＣＨ３の３つに分けられる。重鎖のＦａｂ領域はＶＨ領域とＣＨ１からなり、重鎖のＦｃ領域はＣＨ２とＣＨ３からなる。ヒンジ部はＣＨ１とＣＨ２の間に位置する。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする。
Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｔｙｒ−Ｘａａ4−Ｌｅｕ−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ18−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ24−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｌｅｕ−Ｘａａ31−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｘａａ35−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ50−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ56（配列番号１）
式中、
Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ2＝Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｒｇ
Ｘａａ4＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
Ｘａａ8＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＶａｌ
Ｘａａ10＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ18＝ＴｈｒまたはＡｌａ
Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
Ｘａａ31＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ35＝Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒ
Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
Ｘａａ50＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１のアミノ酸配列、または、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列であってもよいし、これらアミノ酸配列に加えて他のアミノ酸配列を含むものであってもよいし、或いは他の化合物が結合しているものであってもよい。他のアミノ酸配列としては、例えば、後述するペプチド多量体において各ドメインを結合するリンカーペプチド、機能の異なる他のペプチド、水不溶性担体に本発明ペプチドを結合させるためのリンカーペプチドなどを挙げることができる。
本発明に係る免疫グロブリンＧ結合性ペプチドは、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）に対して高い結合能を示し、免疫グロブリンＧのＦｃ領域とＦａｂ領域の両方に対して高い結合能を示し得る。具体的には、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する各々の結合力が、結合定数（ＫA）にしてＫA＝１０6［１／Ｍ］以上である。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドの、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する結合力（親和性）は、例えば、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。
免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域に対する結合性の測定条件としては、免疫グロブリンＧのＦｃ領域およびＦａｂ領域それぞれに結合した時の結合シグナルが検出できればよく、２０〜４０℃の一定温度にてｐＨ６〜８の中性条件にて測定することで簡単に評価することができる。
結合相手の免疫グロブリンＧ分子は、Ｆｃ領域またはＦａｂ領域への結合が検出できれば特に限定はされない。しかし、両方を含む免疫グロブリンＧ分子を用いた場合には、２つの領域への結合を区別して検出することが難しいので、Ｆｃ領域かＦａｂ領域のどちらかのみを含む断片化ＩｇＧを用いることが好ましい。
結合パラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田ら，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明に係るペプチドとＦｃ断片またはＦａｂ断片との親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにＦｃ断片またはＦａｂ断片を固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、本発明で得られたペプチドを流路に添加する実験系で求めることができる。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、Ｆｃ断片に対する結合定数ＫAがオーダーにして１０の６乗以上で、かつ、Ｆａｂ断片に対する結合定数ＫAもオーダーにして１０の６乗以上であり、さらに好ましくは、Ｆｃ断片に対する結合定数とＦａｂ断片に対する結合定数が同じオーダーである。別の側面からは、Ｆａｂ断片に対する結合定数がＦｃ断片に対する結合定数よりも１０倍を超えない程度に強いことが、さらにより好ましい。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドに関し、配列同一性としては、９５％以上または９６％以上が好ましく、９７％以上または９８％以上がさらに好ましく、９９％以上または９９．５％以上がさらにより好ましく、９９．８％以上が特に好ましい。配列同一性は、アミノ酸配列多重アラインメント用プログラムであるＣｌｕｓｔａｌ（http://www.clustal.org/omega/）などを使って測定することができる。また、上記範囲内でアミノ酸配列の一部が変異しても、配列番号１のアミノ酸配列の特定位置に対応するアミノ酸残基は、当業者であればアライメント解析ソフトを用いて容易に求めることができる。
本発明に係る配列番号１のアミノ酸配列において、Ｆａｂ領域およびＦｃ領域に対する結合性の観点から、第２位がＴｈｒ、第６位がＩｌｅ、第７位がＬｅｕ、第１８位がＡｌａ、第２４位がＡｌａ、第２９位がＶａｌ、第４０位がＡｓｐおよび／または第４２位がＧｌｕであることが好ましい。また、第１３位がＴｈｒ、第１５位がＴｙｒ、第１９位がＩｌｅ、第３０位がＬｅｕおよび／または第３３位がＰｈｅであることも好ましい。同様の観点から、第３５位はＡｓｎまたはＰｈｅであることが好ましく、Ｐｈｅであることがより好ましい。
本発明によって得られたＩｇＧ結合性ペプチドは、後記の実施例において確かめられている通り、アルカリ性水溶液で処理（浸潤）した後の、アルカリによるダメージがより少なく、結合性能を高いレベルで維持している。
「アルカリ性水溶液」とは、洗浄または殺菌の目的を達成し得る程度のアルカリ性を指す。より具体的には、０．０１Ｍ以上、１．０Ｍ以下、または０．０１Ｎ以上、１．０Ｎ以下の水酸化ナトリウム水溶液などが該当するが、これに限定されるものではない。水酸化ナトリウムを例とした場合、その濃度の下限は、０．０１Ｍが好ましく、０．０２Ｍがより好ましく、０．０５Ｍがさらにより好ましい。一方、水酸化ナトリウムの濃度の上限は、１．０Ｍが好ましく、０．５Ｍがより好ましく、０．３Ｍがさらにより好ましく、０．２Ｍがさらにより好ましく、０．１Ｍがさらにより好ましい。アルカリ性水溶液としては、水酸化ナトリウム水溶液である必要はないが、そのｐＨは１２以上、１４以下が好ましい。ｐＨの下限に関し、ｐＨ１２．０以上が好ましく、ｐＨ１２．５以上がより好ましい。ｐＨの上限に関し、ｐＨ１４以下が好ましく、ｐＨ１３．５以下がさらにより好ましく、ｐＨ１３．０以下がさらにより好ましい。
「化学的安定性」とは、タンパク質がアミノ酸残基の化学変化などの化学修飾、および、アミド結合の転移や切断などの化学変性に対して、タンパク質の機能を保持する性質を指す。本発明においては、タンパク質の機能保持とは、ＩｇＧへの結合活性（化学変性を受けずに親和性を保持しているポリペプチドの割合）の維持を指すものであり、すなわち、「化学的安定性」が高い程、アルカリ性水溶液への浸漬処理の後も、ＩｇＧへの結合活性が低下する度合いが小さい。ＶＬ−κへの結合活性は、具体的には、化学変性を受けずにＶＬ−κへの親和性を保持しているポリペプチドの割合をいう。なお、本明細書中における「アルカリ耐性」という用語も、「アルカリ性条件下における化学的安定性」と同義である。
アルカリに浸漬する時間は、アルカリの濃度や浸漬時の温度によってペプチドの受けるダメージは大きく異なるので、特に限定はされない。例えば、水酸化ナトリウムの濃度が０．０５Ｍで、浸漬時の温度が室温の場合、アルカリに浸漬する時間の下限は、１時間が好ましく、２時間がより好ましく、４時間がより好ましく、１０時間がより好ましく、２０時間がより好ましいが、特に限定はされない。上記時間の上限も特に限定されないが、例えば５０時間とすることができる。
ＩｇＧに対する親和性は、表面プラズモン共鳴原理を用いたＢｉａｃｏｒｅシステム（ＧＥヘルスケア社）や、バイオレイヤー干渉法を用いたＯｃｔｅｔ（ポール社）などのバイオセンサーによって試験することができるが、これに限定されるものではない。測定条件としては、本発明のペプチドがＩｇＧに結合した時の結合シグナルが検出できれば良い。測定条件としては、温度は２０〜４０℃の一定温度にし、結合状態を見るときのｐＨはｐＨ５〜８の中性条件にすることが好ましい。緩衝液の成分としては、中性の場合には、リン酸、トリス、ビストリスなどが挙げられるが、これらに限定されない。緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、特に限定はされないが、０〜０．１５Ｍ程度が好ましい。
ＩｇＧに結合していることを示すパラメータとしては、例えば、親和定数（ＫA）や解離定数（ＫD）を用いることができる（永田他 著，「生体物質相互作用のリアルタイム解析実験法」，シュプリンガー・フェアラーク東京，１９９８年，４１頁）。本発明のタンパク質のＩｇＧに対する親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを利用して、センサーチップにヒトＩｇＧを固定化して、温度２５℃、ｐＨ７．４の条件下にて、各ドメイン変異体を流路添加する実験系で求めることができる。本発明に係るタンパク質について、ヒトＩｇＧへの親和定数（ＫA）が好ましくは１×１０5（Ｍ-1）以上、より好ましくは１×１０6（Ｍ-1）以上であるタンパク質を好適に用いることができる。しかし、親和定数は、ＩｇＧ結合性ペプチドの種類やドメイン数によっても変わるので、これに限定されない。
ただし、アルカリ処理後の残存結合活性を求める場合には、結合パラメータとして、ＫAやＫDは不適切である。アルカリ処理によって、ＩｇＧに結合できる分子の比率が変化しても、ペプチド１分子のＩｇＧに対する結合能は変化しない場合には、パラメータとしては変化が見られないからである。ペプチドの残存結合活性を求める場合には、例えば、ペプチドを、センサーチップ（Ｂｉａｃｏｒｅ）またはバイオセンサー（Ｏｃｔｅｔ）に固定化し、ペプチドを化学処理する前と後で、同一濃度のＩｇＧを添加したときの、結合レスポンスの大きさを指標とするのが良い。結合レスポンスの大きさを示す単位は、Ｂｉａｃｏｒｅではレゾナンスユニット（ＲＵ）であり、Ｏｃｔｅｔではナノメートル（ｎｍ）であるが、これらに限定されるものではない。例えば、ＩｇＧを固定化した系に対し、同じ濃度のアルカリ処理していないペプチドとアルカリ処理したペプチドを添加して、結合レスポンスの大きさを比較しても良い。
残存結合活性は、アルカリ処理前後の比較なので、基本的には、アルカリ処理前の結合活性を分母とし、アルカリ処理後の結合活性を分子とする、比率（パーセンテージ）で表すことができる。その数値は、同じ条件でアルカリ処理した本発明の変異が導入されていないペプチドと比較して高ければ、特に限定はされないが、その比率が５％以上であるのが好ましく、１０％以上であるのが好ましく、２０％以上であるのがより好ましく、３０％以上であるのがさらにより好ましく、４０％以上であるのがさらにより好ましく、５０％以上であるのがさらにより好ましい。上記比率の上限は、勿論１００％が好ましい。
また、アルカリに対する化学的安定性は、ＩｇＧへの結合性以外に、ポリペプチド物質自体の安定性を指標としても良い。例えば、電気泳動法によって、アルカリ処理前後のポリペプチドの泳動バンドを比較することで、アルカリ性条件下における化学的安定性を評価することが可能である。具体的には、ごく一般的なＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、目的のペプチドのバンドがアルカリ処理の前後で変化しないことを目視で確認することによって評価することが可能である。分解によって低分子量側にバンドが現れたり、化学修飾によって高分子量側にバンドがスメア化するなどの変化が、抑えられていれば、化学的な安定性が高いと言える。デンシトメトリーによるバンド解析によって比較することも可能であり、その場合のバンドの濃さを示す数値によって、上述の残存結合活性と同様の評価が可能である。
本発明に係る配列番号１のアミノ酸配列において、アルカリに対する化学的安定性の観点からは、第４位、第１０位、第３１位および／または第５０位はＡｒｇであることが好ましく、これらのアミノ酸残基の２つ以上がＡｒｇであることがより好ましく、３つ以上がＡｒｇであることがさらにより好ましく、全てがＡｒｇであることが最も好ましい。第８位についてはＬｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎであることが好ましく、ＬｙｓまたはＬｅｕであることがより好ましい。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、上記アミノ酸配列に対して、１または数個のアミノ酸が付加されても本発明に含まれる。
付加される部位としては、Ｎ末端および／またはＣ末端が好ましい。前記「１または数個」の範囲は、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個もしくは２個、または１個程度であることができる。いずれにしても、本発明のアミノ酸配列を含有する場合には、本発明に含まれる。実施形態の１つとして、Ｎ末端および／またはＣ末端のアミノ酸（Ｘａａ1またはＸａａ56）が欠失されていても、本発明に含まれる。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、実施形態の１つとして、当該ペプチドを単ドメインとして、その単ドメインが２個以上、好ましくは３個以上、より好ましくは４個以上、さらに好ましくは５個以上連結された複数ドメインの多量体であってもよい。連結されるドメイン数の上限としては、１０個以下が好ましく、８個以下がより好ましく、６個以下がさらに好ましい。これらの多量体は、単一のＩｇＧ結合性ペプチドの連結体であるホモダイマー、ホモトリマー等のホモポリマーであってもよいし、複数種類のＩｇＧ結合性ペプチドの連結体であるヘテロダイマー、ヘテロトリマー等のヘテロポリマーであってもよい。
本発明によって得られる単量体ペプチドの連結のされ方としては、１または複数のアミノ酸残基で連結する方法、および、アミノ酸残基を挟まず直接連結する方法が挙げられるが、これらの方法に限定されるものではない。連結のためのアミノ酸残基数に特に制限は無いが、好ましくは２０残基以下であり、より好ましくは１５残基以下であり、さらにより好ましくは１０残基以下であり、さらにより好ましくは５残基以下であり、さらにより好ましくは２残基以下である。また、別の観点からは、単量体ペプチドの３次元立体構造を不安定化しないものが好ましい。
また、実施形態の１つとして、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドが、１つの構成成分として、機能の異なる他のペプチドと融合されていることを特徴とする融合ペプチドが挙げられる。融合ペプチドの例としては、アルブミンやＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）が融合したペプチドを例として挙げることができるが、これに限定されるものではない。また、ＤＮＡアプタマーなどの核酸、抗生物質などの薬物、ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）などの高分子が融合されている場合も、本発明で得られたペプチドの有用性を利用するものであれば、本発明に包含される。
本発明は、上記の本発明ペプチドを、免疫グロブリンＧまたはその断片に親和性を有することを特徴とするアフィニティリガンドとして利用することも、実施形態の１つとして包含する。同様に、当該リガンドを水不溶性担体に固定化したことを特徴とするアフィニティ分離マトリックスも、実施形態の１つとして包含する。ここで「アフィニティリガンド」とは、抗原と抗体の結合に代表される特異的な分子間の親和力に基づいて、ある分子の集合から目的の分子を選択的に結合して捕集する物質や官能基を指す用語であり、本発明においては、免疫グロブリンＧまたはその断片に対して特異的に結合するペプチドを指す。本発明においては、単に「リガンド」と表記した場合も、「アフィニティリガンド」と同意である。
本発明に用いる水不溶性担体としては、無機担体、有機担体、さらにはこれらの組み合わせによって得られる有機担体−有機担体、有機担体−無機担体などの複合担体などが挙げられる。無機担体の材料としては、ガラスビーズ、シリカゲルなどが挙げられる。有機担体の材料としては合成高分子や多糖類などが挙げられ、合成高分子としては架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレンなどが挙げられ、多糖類としては結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アガロース、架橋デキストランなどが挙げられる。市販品としては、多孔質セルロースゲルであるＧＣＬ２０００、アリルデキストランとメチレンビスアクリルアミドを共有結合で架橋したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標） Ｓ−１０００、アクリレート系の担体であるＴｏｙｏｐｅａｒｌ（登録商標）、アガロース系の架橋担体であるＳｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標） ＣＬ４Ｂ、および、セルロース系の架橋担体であるＣｅｌｌｕｆｉｎｅ（登録商標）などを例示することができる。但し、本発明における水不溶性担体は、例示したこれらの担体のみに限定されるものではない。
また、本発明に用いる水不溶性担体は、本発明のアフィニティ分離マトリックスの使用目的および方法からみて表面積が大きいことが望ましく、適当な大きさの細孔を多数有する多孔質であることが好ましい。担体の形態としては、ビーズ状、モノリス状、繊維状、膜状（中空糸を含む）などいずれも可能であり、任意の形態を選ぶことができる。
リガンドの固定化方法については、例えば、リガンドに存在するアミノ基、カルボキシ基またはチオール基を利用した従来のカップリング法で担体に結合してよい。カップリング法としては、臭化シアン、エピクロロヒドリン、ジグリシジルエーテル、トシルクロライド、トレシルクロライド、ヒドラジンまたは過ヨウ素酸ナトリウムなどと担体とを反応させて担体を活性化するか、或いは担体表面に反応性官能基を導入し、リガンドとして固定化する化合物とカップリング反応を行い固定化する方法、また、担体とリガンドとして固定化する化合物が存在する系にカルボジイミドのような縮合試薬、または、グルタルアルデヒドのように分子中に複数の官能基を持つ試薬を加えて縮合、架橋することによる固定化方法が挙げられる。
また、リガンドと担体の間に複数の原子からなるスペーサー分子を導入してもよいし、担体にリガンドを直接固定化してもよい。従って、固定化のために、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを化学修飾してもよいし、固定化に有用なアミノ酸残基を加えてもよい。固定化に有用なアミノ酸としては、側鎖に固定化の化学反応に有用な官能基を有しているアミノ酸が挙げられ、例えば、側鎖にアミノ基を含むＬｙｓや、側鎖にチオール基を含むＣｙｓが挙げられる。本発明の本質は、本発明においてペプチドに付与したＩｇＧ結合性が、当該ペプチドをリガンドとして固定化したマトリックスにおいても同様に付与されることにあり、固定化のためにいかように修飾・改変しても、本発明の範囲に含まれる。
本発明のアフィニティ分離マトリックスを利用して、免疫グロブリンＧまたはその断片をアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法により分離精製することが可能となる。これらの免疫グロブリンＧまたはその断片の精製法は、免疫グロブリンのアフィニティカラム・クロマトグラフィ精製法、例えばＳｐＡアフィニティ分離マトリックスを利用した精製法に準じる手順により達成することができる（非特許文献１）。即ち、免疫グロブリンＧまたはその断片を含有する緩衝液を調製（ｐＨは中性付近）した後、当該溶液を本発明のアフィニティ分離マトリックスを充填したアフィニティカラムに通過させ、免疫グロブリンＧまたはその断片を吸着させる。次いで、アフィニティカラムに純粋な緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。この時点では所望の免疫グロブリンＧまたはその断片はカラム内の本発明のアフィニティ分離マトリックスに吸着されている。そして、本発明で得られたペプチドをリガンドとして固定化したアフィニティ分離マトリックスは、このサンプル添加の工程からマトリックス洗浄の工程において、目的とする免疫グロブリンＧまたはその断片を吸着保持する性能に優れる。次いで、適切なｐＨに調整した酸性緩衝液をカラムに通液し、所望の免疫グロブリンＧまたはその断片を溶出することにより、高純度な精製が達成される。溶出に用いる酸性緩衝液には、マトリックスからの解離を促進する物質を添加してもよい。
本発明のアフィニティ分離マトリックスは、リガンド化合物や担体の基材が完全に機能を損なわない程度の、適当な強酸性または強アルカリ性の純粋な緩衝液を通過させて洗浄することにより、再利用が可能である。当該洗浄液としては、適当な変性剤や有機溶剤を含む溶液も使用できる。
本発明は、上記ペプチドをコードするＤＮＡにも関する。かかるＤＮＡの塩基配列は、例えば、上記ペプチドのアミノ酸配列を逆翻訳することにより決定することができる。本発明ペプチドをコードするＤＮＡは、その塩基配列を翻訳したアミノ酸配列が、当該ペプチドを構成するものであればいずれでもよい。そのような塩基配列は、通常用いられる公知の方法、例えば、ポリメラーゼ・チェーン・リアクション（以下、「ＰＣＲ」と略記する）法を利用して取得できる。また、公知の化学合成法で合成することも可能であり、さらに、ＤＮＡライブラリーから得ることもできる。当該塩基配列は、コドンが縮重コドンで置換されていてもよく、翻訳されたときに同一のアミノ酸をコードしている限り、本来の塩基配列と同一である必要性は無い。当該塩基配列を一つ又はそれ以上有する組換えＤＮＡ、または、当該組換えＤＮＡを含む、プラスミドおよびファージなどのベクター、さらには、当該ＤＮＡを有するベクターにより形質転換された形質転換体、当該ＤＮＡを導入した遺伝子改変生物、または、当該ＤＮＡを転写の鋳型ＤＮＡとする無細胞タンパク質合成系を得ることができる。
また、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、タンパク質発現を補助する作用または精製を容易にするという利点がある公知のタンパク質との融合ペプチドとして取得することができる。即ち、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを含む融合ペプチドをコードする組換えＤＮＡを少なくとも一つ含有する微生物や細胞を得ることができる。上記タンパク質の例としては、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）等が挙げられるが、それらのタンパク質に限定されるものではない。
本発明のペプチドをコードするＤＮＡを改変するための部位特異的な変異の導入は、以下のように、組換えＤＮＡ技術、ＰＣＲ法等を用いて行うことができる。
即ち、組換えＤＮＡ技術による変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする遺伝子中において、変異導入を希望する目的の部位の両側に適当な制限酵素認識配列が存在する場合に、それら制限酵素認識配列部分を前記制限酵素で切断し、変異導入を希望する部位を含む領域を除去した後、化学合成等によって目的の部位のみに変異導入したＤＮＡ断片を挿入するカセット変異法によって行うことができる。
また、ＰＣＲによる部位特異的変異の導入は、例えば、本発明ペプチドをコードする二本鎖プラスミドを鋳型として、＋鎖および−鎖に相補的な変異を含む２種の合成オリゴプライマーを用いてＰＣＲを行うダブルプライマー法により行うことができる。
また、本発明の単量体ペプチド（１つのドメイン）をコードするＤＮＡを、意図する数だけ直列に連結することにより、多量体ペプチドをコードするＤＮＡを作製することもできる。例えば、多量体ペプチドをコードするＤＮＡの連結方法は、ＤＮＡ配列に適当な制限酵素部位を導入し、制限酵素で断片化した２本鎖ＤＮＡをＤＮＡリガーゼで連結することができる。制限酵素部位は１種類でもよいが、複数の異なる種類の制限酵素部位を導入することもできる。また、多量体ペプチドをコードするＤＮＡにおいて、各々の単量体ペプチドをコードする塩基配列が同一の場合には、宿主にて相同組み換えを誘発する可能性があるので、連結されている単量体ペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列間の配列同一性が９０％以下、好ましくは８５％以下、より好ましくは８０％以下、さらにより好ましくは７５％以下であることが好ましい。なお、塩基配列の同一性も、アミノ酸配列と同様に、常法により決定することが可能である。
本発明の「発現ベクター」は、前述した本発明ペプチドまたはその部分アミノ酸配列をコードする塩基配列、およびその塩基配列に作動可能に連結された宿主で機能しうるプロモーターを含む。通常は、本発明ペプチドをコードする遺伝子を、適当なベクターに連結もしくは挿入することにより得ることができ、遺伝子を挿入するためのベクターは、宿主中で自律複製可能なものであれば特に限定されず、プラスミドＤＮＡやファージＤＮＡをベクターとして用いることができる。例えば、大腸菌を宿主として用いる場合には、ｐＱＥ系ベクター（キアゲン社）、ｐＥＴ系ベクター（メルク社）およびｐＧＥＸ系ベクター（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社）のベクターなどが挙げられる。
本発明の形質転換細胞は、宿主となる細胞へ本発明の組換えベクターを導入することにより得ることができる。宿主への組換え体ＤＮＡの導入方法としては、例えばカルシウムイオンを用いる方法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、酢酸リチウム法、アグロバクテリウム感染法、パーティクルガン法およびポリエチレングリコール法などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。また、得られた遺伝子の機能を宿主で発現する方法としては、本発明で得られた遺伝子をゲノム（染色体）に組み込む方法なども挙げられる。宿主となる細胞については、特に限定されるものではないが、安価に大量生産する上では、大腸菌、枯草菌、ブレビバチルス属、スタフィロコッカス属、ストレプトコッカス属、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）等のバクテリア（真正細菌）を好適に使用しうる。
本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に本発明のタンパク質を生成蓄積させ、該培養物から所望のタンパク質を採取することにより製造することができる。また、本発明ペプチドは、前記した形質転換細胞を培地で培養し、培養菌体中（菌体ぺリプラズム領域中も含む）、または、培養液中（菌体外）に、本発明ペプチドを含む融合ペプチドを生成蓄積させ、当該培養物から当該融合ペプチドを採取し、当該融合ペプチドを適切なプロテアーゼによって切断し、所望のペプチドを採取することにより製造することができる。
本発明の形質転換細胞を培地で培養する方法は、宿主の培養に用いられる通常の方法に従って行われる。得られた形質転換体の培養に用いる培地は、本発明ペプチドを高効率、高収量で生産できるものであれば特に制限は無い。具体的には、グルコース、蔗糖、グリセロール、ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸などの炭素源や窒素源を使用することが出来る。その他、カリウム塩、ナトリウム塩、リン酸塩、マグネシウム塩、マンガン塩、亜鉛塩、鉄塩等の無機塩類が必要に応じて添加される。栄養要求性の宿主細胞を用いる場合は、生育に要求される栄養物質を添加すればよい。また、必要であればペニシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコール、ネオマイシンなどの抗生物質が添加されてもよい。
さらに、菌体内外に存在する宿主由来のプロテアーゼによる当該目的ペプチドの分解を抑えるために、公知の各種プロテアーゼ阻害剤、すなわち、Ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）、Ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ、４−（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）−ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ ｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＡＥＢＳＦ）、Ａｎｔｉｐａｉｎ、Ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ、Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、Ｐｅｐｓｔａｔｉｎ Ａ、Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｏｎ、Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ、Ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ（ＥＤＴＡ）および／またはその他市販されているプロテアーゼ阻害剤を適当な濃度で添加してもよい。
さらに、本発明に係るＩｇＧ結合性ペプチドを正しくフォールディングさせるために、例えば、ＧｒｏＥＬ／ＥＳ、Ｈｓｐ７０／ＤｎａＫ、Ｈｓｐ９０、Ｈｓｐ１０４／ＣｌｐＢなどの分子シャペロンを利用してもよい。かかる分子シャペロンは、例えば、共発現、または、融合タンパク質化などの手法で、本発明のペプチドと共存させる。なお、本発明ペプチドの正しいフォールディングを目的とする場合には、正しいフォールディングを助長する添加剤を培地中に加える、および、低温にて培養するなどの手法もあるが、これらに限定されるものではない。
大腸菌を宿主として得られた形質転換細胞を培養する培地としては、ＬＢ培地（トリプトン１％，酵母エキス０．５％，ＮａＣｌ１％）、または、２ｘＹＴ培地（トリプトン１．６％，酵母エキス１．０％，ＮａＣｌ０．５％）等が挙げられる。
また、培養温度は、例えば１５〜４２℃、好ましくは２０〜３７℃で、通気攪拌条件で好気的に数時間〜数日培養することにより本発明ペプチドを、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）、または、培養溶液（細胞外）に蓄積させて回収する。場合によっては、通気を遮断し嫌気的に培養してもよい。組換えペプチドが分泌生産される場合には、培養終了後に、遠心分離、ろ過などの一般的な分離方法で、培養細胞と分泌生産されたペプチドを含む上清を分離することにより生産された組換えペプチドを回収することができる。また、培養細胞内（ぺリプラズム領域内を含む）に蓄積される場合にも、例えば、培養液から遠心分離、ろ過などの方法により菌体を採取し、次いで、この菌体を超音波破砕法、フレンチプレス法などにより破砕し、および／または、界面活性剤等を添加して可溶化することにより、細胞内に蓄積生産されたペプチドを回収することができる。
本発明に係るペプチドの精製はアフィニティクロマトグラフィ、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ等を単独でまたは適宜組み合わせることによって行うことができる。得られた精製物質が目的のペプチドであることの確認は、通常の方法、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、Ｎ末端アミノ酸配列分析、ウエスタンブロッティング等により行うことができる。
本願は、２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８−６４８９１号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１８年３月２９日に出願された日本国特許出願第２０１８−６４８９１号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。
以下、実施例に基づいて本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１： ＩｇＧ結合性ペプチドの調製
（１）ＩｇＧ結合性ペプチドの発現プラスミド調製
配列番号２〜４で示すＩｇＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列を２個連結したペプチド（配列番号５〜７）を評価に用いた。２個のアミノ酸配列を連結したのは、ペプチドの分子量を大きくすることで、大腸菌での発現を良好にし、かつ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの分析を容易にすることが目的である。
配列番号５〜７で示す各々のアミノ酸配列から逆翻訳を行い、コードＤＮＡの塩基配列（配列番号８〜１０）を設計し、当該ＤＮＡを汎用ベクターｐＥＸに挿入したプラスミドを購入した（ユーロフィンジェノミクス社）。Ｂｌｅｎｄ Ｔａｑ −Ｐｌｕｓ−（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、添付のプロトコルに従い、各々のプラスミドを鋳型として、２本のＤＮＡプライマー（配列番号１１，１２）を用いたＰＣＲ反応を行った。
合成・抽出した二本鎖ＤＮＡを、制限酵素ＳｐｅＩとＸｈｏＩ（いずれもタカラバイオ社）により切断した。次に、プラスミドベクターｐＥＴ−４９ｂ（＋）（メルクミリポア社）のマルチクローニングサイト中のＳｐｅＩ／ＸｈｏＩサイトに制限酵素処理した二本鎖ＤＮＡをサブクローニングした。サブクローニングにおけるライゲーション反応は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用いて、製品に添付のプロトコルに準ずる形で実施した。
上記ライゲーション反応液を用いて、コンピテント細胞ＤＨ５α（タカラバイオ社）の形質転換を、本コンピテント細胞製品に付属のプロトコルに従って行った。次いで、プラスミド精製キット（プロメガ社製「Ｗｉｚａｒｄ Ｐｌｕｓ ＳＶ Ｍｉｎｉｐｒｅｐｓ ＤＮＡ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」）を用い、キット付属の標準プロトコルに従って、形質転換した細胞を培養し、プラスミドＤＮＡを増幅し、抽出した。発現プラスミドのコードＤＮＡの塩基配列確認は、ＤＮＡシークエンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「３１３０ｘｌ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ」）を用いて行った。遺伝子解析キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ ｖ．１．１ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ」）と、シークエンシング用ＤＮＡプライマー（配列番号１３）を用いて、添付のプロトコルに従いシークエンシングＰＣＲ反応を行った。そのシークエンシング産物を、プラスミド精製キットＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製「ＢｉｇＤｙｅ ＸＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ」）を用いて、添付のプロトコルに従い精製し、塩基配列解析に用いた。コードＤＮＡの塩基配列を確認した発現プラスミドを用いて、コンピテント細胞ＢＬ２１（ＤＥ３）（バイオダイナミクス社）の形質転換を行い、各種ＩｇＧ結合性ペプチドの発現用形質転換細胞を調製した。
（２）ＩｇＧ結合性ペプチドの発現と精製
上記（１）で得られた各種形質転換細胞を、カナマイシンを３０μｇ／ｍＬの濃度で含有するオート・インダクション培地Ｍａｇｉｃ Ｍｅｄｉａ（ライフテクノロジーズ社）を用いて、３０℃で２４時間培養した。培養終了後、遠心にて集菌し、ＰＢＳ緩衝液に再懸濁した。超音波破砕にて細胞を破砕し、遠心分離して上清画分（無細胞抽出液）と不溶性画分に分画した。ｐＥＴ−４９ｂ（＋）ベクターのマルチクローニングサイトに目的の遺伝子を導入すると、ＧＳＴがＮ末端に付与した融合ペプチドとして発現される。なお、配列番号５〜７のアミノ酸配列に対して、プライマーに起因するアミノ酸がＮ末端に付加されるが、全てに共通であり、その後の実験では特に問題とはならない。
ＧＳＴ融合ペプチドを含む各々の無細胞抽出液から、ＧＳＴに対して親和性のあるＧＳＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたアフィニティクロマトグラフィにて、ＧＳＴ融合ペプチドを粗精製した。各々の無細胞抽出液をＧＳＴｒａｐ ＨＰカラムに添加し、標準緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ2ＰＯ4−Ｎａ2ＨＰＯ4，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，ｐＨ７．４）にてカラムを洗浄し、続いて溶出用緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，２０ｍＭグルタチオン，ｐＨ８．０）にて目的のＧＳＴ融合ペプチドを溶出した。
配列番号１１のプライマーを用いてサブクローニングすると、目的のペプチド配列のＮ末端とＧＳＴとの間に、Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇというアミノ酸配列が付加される。このアミノ酸配列は、配列特異的プロテアーゼＦａｃｔｏｒ Ｘａ（メルクミリポア社）の認識配列であり、このプロテアーゼを作用させるとＡｒｇの後ろで切断されるため、ＧＳＴを含むＮ末端側のベクター由来配列を切断して除去することが可能である。ＧＳＴ融合ペプチド含有溶出液をＦａｃｔｏｒ Ｘａ消化用緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ ＮａＣｌ，２ｍＭ ＣａＣｌ2，ｐＨ８．０）にて透析し、添付プロトコルに従い酵素反応を行った。
本反応液から、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を用いたゲルろ過クロマトグラフィにて、目的のペプチドを精製した。標準緩衝液にて平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ ７５ １０／３００ ＧＬカラムに、各々の反応溶液を添加し、目的のペプチドを、切断したＧＳＴ含有ベクター由来配列やＦａｃｔｏｒ Ｘａから分離精製した。なお、以上のカラムを用いたクロマトグラフィによるペプチド精製は、全てＡＫＴＡｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステム（ＧＥヘルスケア・バイオサイエンス社）を利用して実施した。
比較例１： 特許文献７に記載のＩｇＧ結合性ペプチド
実施例１と同様に、配列番号１４で示すＩｇＧ結合性ペプチドのアミノ酸配列を２個連結したペプチド（配列番号１５）を評価に用いた。実施例１と同様の方法でコードＤＮＡの塩基配列（配列番号１６）を設計し、プラスミド調製から発現・精製を実施することにより、特許文献７に記載のＩｇＧ結合性ペプチドを得た。
実施例２： ＩｇＧ結合性ペプチドのアルカリ耐性評価
（１）ＩｇＧ結合性ペプチドのアルカリ処理
実施例１または比較例１で精製した各々のペプチドを超純水で希釈し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度に調整した。１０μＬのペプチド溶液と１０μＬの３０ｍＭ ＮａＯＨを混合し、２５℃で１４時間インキュベートした（最終濃度として、５ｍｇ／ｍＬの各ペプチドを１５ｍＭ ＮａＯＨで処理したこととなる）。その後、５０ｍＭ 酢酸緩衝液（ｐＨ３．０，６μＬ）を添加して中和した。
（２）アルカリ処理サンプルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
アルカリ処理前のサンプルも、１０μＬのペプチド溶液に１６μＬの超純水を加えて、アルカリ処理後と同じ濃度となるよう調整した。そして、１５％濃度のポリアクリルアミドゲル「ｅ−パジェル」（アトー株式会社）を用いて、添付のプロトコルに従って、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。アルカリ処理前と後のサンプルを隣のレーンに並べて添加した。その結果を図１に示す。サンプルを流したレーンとペプチドの対応について、レーン１・２が比較例１の配列番号１５、レーン３・４が配列番号５、レーン５・６が配列番号６、レーン７・８が配列番号７のペプチドであり、奇数がアルカリ処理前、偶数がアルカリ処理後のサンプルである。
比較例１のペプチドのバンドは、アルカリ処理後に、ほぼ全てがスメア化して上方にシフトし、同じ位置のバンドは見えなくなっていた。一方、本発明で得られたペプチドは、アルカリ処理後も同じ位置にバンドが残っていた。特に、配列番号６〜７のペプチドは、ごく一部がスメア化しただけで、同じ位置にほぼ同じ強度でバンドが存在し、アルカリでの処理が可能なレベルであると考えられる。

Claims (22)

  1. 下記アミノ酸配列（配列番号１）、または、下記アミノ酸配列と９５％以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
    Ｘａａ1−Ｘａａ2−Ｔｙｒ−Ｘａａ4−Ｌｅｕ−Ｘａａ6−Ｘａａ7−Ｘａａ8−Ｇｌｙ−Ｘａａ10−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｘａａ18−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｘａａ21−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｘａａ24−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘａａ28−Ｘａａ29−Ｌｅｕ−Ｘａａ31−Ｇｌｎ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｘａａ35−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｘａａ39−Ｘａａ40−Ｇｌｙ−Ｘａａ42−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｘａａ47−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｘａａ50−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｘａａ56（配列番号１）
    式中、
    Ｘａａ1＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    Ｘａａ2＝Ｌｙｓ、ＴｈｒまたはＡｒｇ
    Ｘａａ4＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    Ｘａａ6＝ＩｌｅまたはＶａｌ
    Ｘａａ7＝ＬｅｕまたはＩｌｅ
    Ｘａａ8＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｓｎ、ＧｌｎまたはＶａｌ
    Ｘａａ10＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    Ｘａａ18＝ＴｈｒまたはＡｌａ
    Ｘａａ21＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
    Ｘａａ24＝ＡｌａまたはＧｌｕ
    Ｘａａ28＝Ｌｙｓ、ＩｌｅまたはＡｒｇ
    Ｘａａ29＝ＶａｌまたはＡｌａ
    Ｘａａ31＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    Ｘａａ35＝Ａｌａ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＶａｌまたはＴｙｒ
    Ｘａａ39＝ＶａｌまたはＩｌｅ
    Ｘａａ40＝ＡｓｐまたはＧｌｕ
    Ｘａａ42＝Ｇｌｕ、ＶａｌまたはＭｅｔ
    Ｘａａ47＝Ａｓｐ、ＡｌａまたはＰｒｏ
    Ｘａａ50＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
    Ｘａａ56＝Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌ
  2. Ｘａａ2がＴｈｒである請求項１に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  3. Ｘａａ4がＡｒｇである請求項１または２に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  4. Ｘａａ6がＩｌｅである請求項１〜３のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  5. Ｘａａ7がＬｅｕである請求項１〜４のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  6. Ｘａａ8がＬｙｓ、ＬｅｕまたはＡｓｎである請求項１〜５のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  7. Ｘａａ10がＡｒｇである請求項１〜６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  8. Ｘａａ18がＡｌａである請求項１〜７のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  9. Ｘａａ24がＡｌａである請求項１〜８のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  10. Ｘａａ29がＶａｌである請求項１〜９のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  11. Ｘａａ31がＡｒｇである請求項１〜１０のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  12. Ｘａａ35がＰｈｅまたはＡｓｎである請求項１〜１１のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  13. Ｘａａ40がＡｓｐである請求項１〜１２のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  14. Ｘａａ42がＧｌｕである請求項１〜１３のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  15. Ｘａａ50がＡｒｇである請求項１〜１４のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  16. Ｘａａ4、Ｘａａ10、Ｘａａ31およびＸａａ50がＡｒｇである請求項１〜１５のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド。
  17. 請求項１〜１６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチドを２個以上有することを特徴とする免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体。
  18. 請求項１〜１６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または請求項１７に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体、および水不溶性担体を有し、免疫グロブリンＧ結合性ペプチドまたは免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体がリガンドとして水不溶性担体に固定化されたものであることを特徴とするアフィニティ分離マトリックス。
  19. 免疫グロブリンＧまたはその断片を製造する方法であって、
    請求項１８に記載のアフィニティ分離マトリックスと、免疫グロブリンＧまたはその断片を含む液体試料とを接触させる工程、および、
    アフィニティ分離マトリックスに結合した免疫グロブリンＧまたはその断片を、アフィニティ分離マトリックスから分離する工程を含むことを特徴とする方法。
  20. 請求項１〜１６のいずれかに記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド、または請求項１７に記載の免疫グロブリンＧ結合性ペプチド多量体をコードすることを特徴とするＤＮＡ。
  21. 請求項２０に記載のＤＮＡを含むことを特徴とするベクター。
  22. 請求項２１に記載のベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
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