ES2306876T3 - Marcador para celulas madre y su uso. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un marcador que comprende una cadena de integrina alfa10, o una cadena de integrina alfa10 y una cadena de integrina alfa11, expresadas sobre la superficie de una célula madre mesenquimal o en el interior de una célula madre mesenquimal como marcador para células madre mesenquimales in vitro.
Description
Marcador para células madre y su uso.
Esta invención está relacionada con un marcador
para el aislamiento e identificación de células madre mesenquimales
de mamífero. También se incluyen métodos y usos de dicho marcador
así como una población celular enriquecida y una composición
celular que comprende la composición celular enriquecida.
El organismo adulto alberga las denominadas
células madre capaces de dividirse muchas veces al tiempo que dan
lugar a células hijas con características fenotípicas específicas.
En el organismo existen diversos tipos de células madre, incluyendo
las células madre embrionarias, las células madre hematopoyéticas y
las células madre mesenquimales. Las células madre mesenquimales
son capaces de formar tejidos mesenquimales como, por ejemplo,
hueso, cartílago, músculo, hueso, ligamento, grasa y estroma de la
médula ósea. La Figura 1 muestra un itinerario de transiciones
progresivas sugerido desde células madre mesenquimales putativas
(MSC) hacia fenotipos altamente diferenciados. Las células madre
mesenquimales se encuentran en la médula ósea, alrededor de los
vasos sanguíneos, en la grasa, la piel, los músculos, los huesos y
otros tejidos. Su presencia contribuye a la capacidad reparadora de
estos tejidos.
En la actualidad, el uso médico de las MSC
consiste en explorar su potencial en la regeneración de tejidos que
el organismo no puede reparar o regenerar de forma natural cuando se
ve estimulado a hacerlo. Para ello, las MSC se aíslan, se
desarrollan en cultivo y se estimulan para diferenciarse en tejidos
conectivos como, por ejemplo, hueso, cartílago, músculo, estroma de
médula ósea, tendón, grasa y otros. A continuación, estos
constructos de tejido fabricado pueden ser reintroducidos en el
organismo humano para reparar un tejido perdido o dañado. En otro
tratamiento, se puede estimular directamente a las MSC in
vivo para inducir la formación de tejidos específicos in
situ.
Habiendo definido a las MSC como
"componentes" potenciales para la ingeniería y el transplante
de tejidos, los investigadores se centran ahora en la búsqueda de
mejores formas para identificar, separar y caracterizar a las
MSC.
Una integrina que se une al colágeno
recientemente descubierta, la alfa10beta1, incluye la subunidad de
la integrina alfa10 (Camper y otros, (1998) J. Biol. Chem.
273:20383-20389). La integrina se expresa en los
condrocitos y muestra una M_{r} de 160 kDa tras reducción cuando
se aísla a partir de condrocitos de bovino mediante purificación
por cromatografía de afinidad del colágeno de tipo II.
La clonación y secuenciación del ADNc han
mostrado que comparte la estructura general de otras subunidades de
integrinas alfa. La secuencia de aminoácidos predicha consta de una
proteína madura de 1167 aminoácidos, que incluye un péptido señal
(22 aminoácidos), un dominio extracelular largo (1098 aminoácidos),
un dominio transmembrana (22 aminoácidos) y un dominio
citoplasmático corto (22 aminoácidos). En contraste con la mayoría
de las subunidades de integrinas-alfa, el dominio
citoplasmático de la alfa10 no contiene la secuencia conservada
KXGFF(R/K)R. En su lugar, la secuencia de aminoácidos
predicha en alfa10 es KLGFFAH. Se sugiere que los motivos GFFKR en
las cadenas-alfa son importantes para la asociación
de las subunidades de integrinas y para el transporte de las
integrinas a la membrana plasmática (De Melker y otros (1997)
Biochem. J. 328:529-537).
La porción extracelular contiene una secuencia
repetida séptuple, un dominio-I (199 aminoácidos) y
tres sitios putativos de unión a cationes divalentes. El análisis
de la secuencia ha revelado que la subunidad alfa10 está
relacionada más estrechamente con las subunidades \alpha que
contienen el dominio I, siendo las más parecidas alfa1 (37%), alfa2
(35%) y alfa11 (42%).
La integrina alfa11 ha sido identificada
recientemente y su clonación y caracterización han revelado una
integrina asociada a beta1 que contiene un dominio I. El marco de
lectura abierto del ADNc codifica un precursor de 1188 aminoácidos.
La proteína madura predicha de 1166 aminoácidos contiene 7
repeticiones de FGGAP conservadas, un dominio I con un motivo
MIDAS, una región transmembrana corta y un único dominio
citoplasmático de 24 aminoácidos que contiene la secuencia
GFFRS.
Alfa11 contiene tres sitios potenciales de unión
a cationes divalentes en las repeticiones 5-7. La
presencia de 22 aminoácidos insertados en la porción del tallo
extracelular (aminoácidos 804-826) diferencia aún
más la secuencia de la integrina alfa11 de otras cadenas de
integrinas alfa.
Las comparaciones de las secuencias de
aminoácidos revelan el mayor parecido más alto (42%) con la cadena
de la integrina alfa10. La inmunoprecipitación con anticuerpos a la
integrina alfa11 capturó una proteína de 145 kDa, que resultó ser
claramente más grande que la cadena de la integrina alfa2 de 140 kDa
al analizarla mediante PAGE-SDS en condiciones no
reductoras.
La identificación de las MSC in situ se
ve obstaculizada por el hecho de que no existen sondas moleculares
monoespecíficas y únicas. Por consiguiente, es necesario
caracterizar con mayor precisión las células madre mesenquimales
para identificar sondas o combinaciones de sondas capaces de
identificar unívocamente las células madre mesenquimales en un
tejido. Estos marcadores también serán útiles para el aislamiento de
células madre mesenquimales a partir de médula ósea (MO) y de la
sangre.
Se puede esperar que aproximadamente una de cada
10.000-100.000 células nucleadas en aspirados de
médula ósea sean células madre mesenquimales. Actualmente, el
principal método para el aislamiento de células madre mesenquimales
a partir de médula ósea se basa en su capacidad para adherirse a las
placas de cultivo de plástico y formar colonias, mientras que la
mayoría de las células de médula ósea no se adhieren ni forman
colonias. Estas colonias se desarrollan posteriormente y, con
factores definidos, se les induce a diferenciarse en tejidos
mesenquimales específicos. Sin embargo, no está claro si las
células madre mesenquimales aisladas de este modo constituyen una
población homogénea. Por lo tanto, es importante descubrir
marcadores que puedan ser utilizados para identificar subclases de
células madre mesenquimales con potenciales de diferenciación
específicos.
En la patente de los Estados Unidos 6 200 606 se
describe el aislamiento de células precursoras de cartílago o hueso
a partir de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas mediante la
utilización de CD34 como marcador de selección negativa y la
posterior utilización de las células madre aisladas en procesos de
regeneración de hueso y cartílago. No obstante, no se identifica ni
divulga ningún marcador específico para células madre
mesenquimales. El marcador CD34 se expresa en células madre y
progenitoras linfohematopoyéticas tempranas, células endoteliales
de vasos pequeños, fibroblastos embrionarios, y algunas células de
tejido nervioso fetal y adulto, progenitoras hematopoyéticas
procedentes de saco vitelino fetal, hígado embrionario, y tejidos
embrionarios extrahepáticos, incluyendo progenitoras
hematopoyéticas asociadas a la aorta en embrión humano de 5
semanas.
Pittenger y otros ((1999) Science
284:143-147) han utilizado centrifugación en
gradiente de densidad de médula ósea humana para aislar MSC
humanas. Los marcadores celulares utilizados para identificar las
MSC son SH-2, SH-3, CD29, CD44,
CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124.
Majumdar y otros, ((2000) J. Cell. Physiol.
185:98-106) han utilizado CD105 como marcador para
el enriquecimiento de MSC humanas procedentes de médula ósea.
Denni y otros, ((2002) Cells Tissues Organs
170:73-82) han utilizado un marcador denominado
Stro-1 para enriquecer MSC humanas procedentes de
médula ósea.
Todos los marcadores mencionados hasta el
momento se pueden utilizar para el enriquecimiento de las MSC
humanas. No obstante, no son exclusivos para las MSC, la población
aislada es heterogénea cuando se enriquece utilizando estos
marcadores. Hasta el presente, no existen sondas monoespecíficas y
únicas para la identificación de las MSC humanas.
Además, se necesitan marcadores para monitorizar
la diferenciación de las células madre mesenquimales en tipos
específicos de células mesenquimales. Esto será especialmente
importante cuando estas células vuelven a ser introducidas en el
organismo humano para reemplazar tejido mesenquimal perdido o
dañado, como, por ejemplo, hueso o cartílago.
Finalmente, la identificación de marcadores de
superficie celular específicos para las células madre mesenquimales
se puede utilizar para su aislamiento a partir de una mezcla
compleja de células mediante técnicas de separación de células
como, por ejemplo, la separación de células activada por
fluorescencia (FACS).
Por ello, ante los problemas mencionados más
arriba, es sumamente deseable identificar y aislar MSC para su
utilización posterior en la reparación in vivo o in
vitro de hueso, cartílago, músculo, médula ósea, tendón o
tejido conectivo. A este respecto, la presente invención trata estas
necesidades e intereses.
Ante las anteriormente citadas desventajas
conocidas en la técnica al tratar de aislar e identificar MSC de
mamífero, la presente invención proporciona un marcador para MSC de
mamífero apropiado para la identificación y aislamiento de MSC de
mamífero in vitro.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar métodos para la identificación o aislamiento de MSC de
mamífero, o una población celular enriquecida de MSC in
vitro.
Otro objetivo es proporcionar formas de
utilización del marcador según la invención para la identificación
o aislamiento de MSC de mamífero in vitro.
Así pues, la presente invención proporciona un
marcador para células madre mesenquimales de mamífero. El marcador
comprende una cadena de integrina alfa10 y/o cadena de integrina
alfa11 expresada en la superficie celular de las células madre
mesenquimales, o en el interior de las células madre
mesenquimales.
En algunos modos de realización adicionales, la
cadena de integrina alfa10 y/o integrina alfa11 se expresa en forma
de un heterodímero en combinación con una cadena de integrina
beta1.
Asimismo, la presente invención proporciona un
método para la identificación de células madre mesenquimales de
mamífero in vitro. Dicho método comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar una muestra que comprenda unas células madre mesenquimales,
- b)
- detectar la expresión de la cadena de integrina alfa10 y/o alfa11 en la superficie celular de las células madre mesenquimales, o en el interior de las células madre mesenquimales,
- c)
- calificar la expresión de la cadena de integrina alfa10 y/o alfa11, y
- d)
- identificar las células madre mesenquimales en función de su calificación en el apartado c) anterior.
En algunos modos de realización adicionales, la
expresión mencionada en el apartado b) anterior se identifica
mediante la detección de la expresión de la proteína de la integrina
alfa10 y/o integrina alfa11.
Incluso en algunos modos de realización
adicionales, la expresión mencionada en el apartado b) anterior se
identifica mediante la detección de la expresión del ARNm de la
integrina alfa10 y/o integrina alfa11.
Aún más, la presente invención proporciona un
método para la determinar si un compuesto de ensayo modula la
diferenciación de las células madre mesenquimales de mamífero in
vitro.
Dicho método comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar unas células madre mesenquimales,
- b)
- poner en contacto las células madre mesenquimales con el compuesto de ensayo, y
- c)
- detectar un cambio en la tasa o el patrón de diferenciación de las células madre mesenquimales como indicación de que el compuesto de ensayo modula la diferenciación de las células madre mesenquimales.
Incluso más, la presente invención proporciona
un método para la producción in vitro de una población de
células de mamífero aislada, enriquecida en células madre
mesenquimales respecto a una población de referencia. Dicho método
comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar al menos una porción de una población de células, o una porción de una población de referencia, que comprenda MSC y al menos unas células que no sean las células madre mesenquimales,
- b)
- introducir en la población de células mencionada en el apartado a) anterior un compuesto que identifique las células madre mesenquimales,
- c)
- seleccionar y aislar de la población de células mencionada en el apartado b) anterior las células madre mesenquimales, dando lugar de este modo a una población de células enriquecida en células madre mesenquimales.
El método según la invención puede incluir modos
de realización adicionales en los que las células madre
mesenquimales se identifican como tales mediante la detección de la
expresión in vitro de la cadena de integrina alfa10 y/o
alfa11 en la superficie celular de dichas células madre
mesenquimales, según el método divulgado en la presente
invención.
Aún más, en la presente solicitud se describe
una población celular enriquecida de células madre mesenquimales de
mamífero que comprende al menos unas células madre mesenquimales
intactas viables. Dicha población celular enriquecida es una
población en la que las células madre mesenquimales están
caracterizadas por:
- a)
- expresar una cadena de integrina alfa10 y/o una cadena de integrina alfa11 en la superficie celular, o en el interior de dichas células madre mesenquimales,
- b)
- encontrarse sustancialmente libre de la expresión de moléculas específicas para células linfohematopoyéticas comprometidas o células madre no comprometidas.
Asimismo, en la presente solicitud se describen
unas células madre mesenquimales de mamífero aisladas que expresan
un marcador según la invención, que se puede obtener mediante el
método que consiste en producir una población de células
enriquecida en células madre mesenquimales in vitro según la
invención.
Incluso más, en la presente solicitud se
describe una composición de células de mamífero que comprende la
población celular enriquecida o las células madre mesenquimales
aisladas.
También se proporcionan formas de utilización
in vitro de un marcador según la invención para identificar
de células madre mesenquimales de mamífero, para modular de la
diferenciación de células madre mesenquimales de mamífero y para
aislar de células madre mesenquimales de mamífero.
La Fig. 1 muestra una vista esquemática de la
transición paso a paso sugerida desde las células madre
mesenquimales putativas (MSC) hacia fenotipos altamente
diferenciados. (De Caplan, A.I. y Bruder, S.P., Trends Mol. Med.
2001, 7(6): 259-264).
La Fig. 2 muestra que las células madre
mesenquimales en cultivo expresan en su superficie celular ambas
cadenas de integrina alfa10 y alfa11. En la figura, la banda
superior de ambas columnas es alfa10 (en la columna izquierda) y
alfa11 (en la columna derecha). La banda inferior en ambas columnas
representa la cadena beta1.
La Fig. 3 muestra histogramas tras un análisis
de citometría de flujo. En la figura 3E se muestra el anticuerpo
contra alfa10 unido a las células HEK293 transfectadas con
subunidades de integrina alfa10 humana. El anticuerpo contra alfa10
no se unió a las células HEK293 transfectadas con subunidades de
integrina alfa11 humana, como se muestra en el panel central (a la
derecha, figura 3F), ni a las células HEK293 no transfectadas, como
se muestra en la figura 3D. Mostrado en la figura 3I, el anticuerpo
contra alfa11 unido a las células HEK293 transfectadas con
subunidades de integrina alfa11 humana. El anticuerpo contra alfa11
no se unió a las células HEK293 transfectadas con subunidades de
integrina alfa10 humana, como se muestra en figura 3H, ni a las
células HEK293 no transfectadas, como se muestra en la figura 3G.
Las figuras 3A-C representan el control (el
anticuerpo secundario solo), que no se unió a ninguna de las
células HEK293 del ensayo.
La Fig. 4 muestra histogramas de la citometría
de flujo. Tras un tratamiento de 2 semanas con
FGF-2, un 96% de las células tratadas con
FGF-2 expresaron la integrina alfa10 (panel
inferior, figura 4b). El control (el anticuerpo secundario solo) se
muestra en el panel superior en la figura 4a.
Tal como se utilizan en la presente solicitud,
los términos "roedor" y "roedores" se refieren a todos los
miembros del orden filogenético Rodentia.
El término "murino" se refiere a todos y
cada uno de los miembros de la familia Muridae, incluidos las
ratas y los ratones.
Con la expresión "sustancialmente libre
de", en la presente solicitud se quiere dar a entender por debajo
de los límites de detección del ensayo utilizado, apareciendo en
consecuencia como negativos, es decir, en forma libre.
Con el término "comprometida", en la
presente solicitud se quiere dar a entender dedicada a o centrada
en. Así, una célula comprometida es una célula que está dedicada a
o centrada en una ruta de diferenciación específica. A partir de
esto se deduce que una célula no comprometida no está dedicada a, ni
centrada en, ninguna ruta de diferenciación específica y tiene
diversas opciones.
Se ha descubierto inesperadamente que las
integrinas alfa10beta1 y alfa11beta1 están presentes en las células
madre mesenquimales humanas. Por lo tanto, estas integrinas se
pueden utilizar para identificar, diferenciar y aislar células
madre mesenquimales a partir de una población mezclada de células, y
resultarán un instrumento útil en la terapia celular para la
reparación de tejido dañado.
La secuencia de la cadena de integrina alfa10
humana es conocida y se encuentra públicamente disponible en
GenBank^{TM}/EBI Data Bank, número de acceso AF074015. Así pues,
en la presente invención se divulgan nuevos usos y métodos de la
cadena de integrina alfa10.
La secuencia de la cadena de integrina alfa11
humana es conocida y se encuentra públicamente disponible en
GenBank^{TM}/EBI Data Bank, número de acceso AF137378. Así pues,
en la presente invención se divulgan nuevos usos y métodos de la
cadena de integrina alfa11.
Como se ha manifestado más arriba, la presente
invención está relacionada con la utilización de un marcador para
células madre mesenquimales (MSC) in vitro, que comprende una
cadena de integrina alfa10 y/o una cadena de integrina alfa11
expresada en la superficie celular de las MSC de mamífero, o en el
interior de las MSC de mamífero.
En un modo de realización adicional, la cadena
de integrina alfa10 y/o integrina alfa11 se expresa en forma de un
heterodímero en combinación con una cadena de integrina beta1.
Las (MSC) de mamífero se aíslan generalmente a
partir de médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón
umbilical, hígado, hueso, cartílago, pericondrio, músculo,
periostio, tejido sinovial o grasa. El aislamiento se puede basar
en la capacidad de las células para adherirse a placas de cultivo de
plástico y formar colonias en condiciones de cultivo específicas,
aunque la mayoría de las células de médula ósea no se adhieren ni
forman colonias. Además, en Manson, J.M. y otros (2000, Cartilage
and bone regeneration using gene-enhanced tissue
engineering. Clin. Orthop. 379S:S171-178), Chu, C.R.
y otros (1997, Osteochondral repair using perichondrial cells, in
Clin. Orthop. 340:220-229 (2000), y Dounchis, J.S. y
otros (2000, Cartilage repair with autogenic perichondrium cell and
polylactic acid grafts. Clin. Orthop. 377:248-264),
se explica de forma detallada un protocolo apropiado para el
aislamiento de MSC de mamífero, sin incluir el marcador según la
invención. Así, se pueden utilizar métodos conocidos, pero con la
introducción de los marcadores según la invención.
Las colonias se pueden desarrollar
posteriormente y, a continuación, ser inducidas mediante factores
específicos a diferenciarse en tejidos mesenquimales específicos.
Para los condrocitos, el cultivo se realiza en forma de micromasa
comprimida o en alginato sin suero, y con TGFbeta3 añadido como
factor definido. En el caso de las células osteogénicas, estas se
pueden cultivar en presencia de dexametasona, fosfato de
bata-glicerol, ascorbato y SFB (suero fetal bovino)
al 10%. Y en el de los adipocitos, las células se pueden cultivar en
presencia de
1-metil-3-ispbutilxantina,
dexametasona, insulina e indometacina.
Así pues, la utilización in vitro de los
marcadores según la invención en los protocolos de aislamiento y
desarrollo dará lugar a una población homogénea de MSC. Las células
madre mesenquimales que no son aisladas y desarrolladas de esta
forma no constituyen una población homogénea. En Caplan, A.I. (1991,
Mesenchymal Stem Cells. J. Orthop. Res. 9:641-650),
Pittenger, M.F. y otros (1999, Multilineage potential of adult human
mesenchymal stem cells, Science. 284:143-7) y en
Minguell, J.J., Erices, A. y Conget, P. (2001, Mesenchymal Stem
Cells. Exp. Biol. Med. 226(6):507-520 - para
diferenciar las células puede ser necesaria la tabla con todos los
factores), se proporcionan más detalles en relación con los
factores apropiados para ser incluidos en cultivos para el
desarrollo de MSC específicas. Todas las referencias se incorporan a
la presente solicitud a modo de referencia.
Las MSC humanas se pueden aislar a partir de
médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón umbilical, hígado,
hueso, cartílago, pericondrio, músculo, periostio, tejido sinovial o
grasa. Las MSC se pueden aislar posteriormente tras una
centrifugación en gradiente de densidad y encontrarse formando parte
de una capa fraccionaria de células mononucleares en la zona de
interfase de densidad de 1,073 g/ml (Percoll^{TM}, Pharmacia). En
Vogel, W. y otros (2003, Heterogeneity among bone
marrow-derived mesenchymal stem cells and neural
progenitor cells) y en Nevo, Z. y otros (1998, The manipulated
mesenchymal stem cells in regenerated skeletal tissues. Cell
Transplant 7:63-70) se explican detalladamente
protocolos apropiados. Ambas referencias se incorporan en la
presente solicitud a modo de referencia.
De esta fracción de células mononucleares, 1/10
000 - 1/100 000 células forman colonias al ser cultivadas en suero
en placas de cultivo (Bruder, S.P. y otros (1997), Growth kinetics,
self-renewal, and the osteogenic potential of
purified human mesenchymal stem cells during extensive
subcultivation and following cryopreservation. J. Cell. Biochem.
64:278-294).
Así pues, la inclusión del marcador como se
describe en la presente solicitud, que comprende una cadena de
integrina alfa10 y/o una cadena de integrina alfa11 en protocolos de
aislamiento y desarrollo conocidos, así como la utilización de los
marcadores por sí solos, resultarán valiosas en gran medida para la
posterior evaluación y enriquecimiento de la población de MSC. En
particular, no se conoce ningún otro marcador específico y único
para las MSC de mamífero como lo es el marcador según la
invención.
De acuerdo con la invención, se divulga un
método para la identificación in vitro de MSC de mamífero.
El método comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar una muestra que comprenda MSC,
- c)
- calificar la expresión de la cadena de integrina alfa10 y/o alfa11, y
- d)
- identificar las MSC en función de su calificación en el apartado c) anterior.
De forma más detallada, el método según la
invención puede comprender, además, los pasos de:
- e)
- proporcionar una suspensión de células que comprenda células madre mesenquimales de mamífero,
- f)
- poner en contacto la suspensión de células del punto e) con un anticuerpo monoclonal o fragmentos del mismo unidos a la integrina alfa10beta1/o alfa11beta1, en condiciones en las que dicho anticuerpo monoclonal o los fragmentos del mismo formen un complejo anticuerpo-antígeno con el dominio extracelular de integrina alfa10beta1/o alfa11beta1,
- g)
- separar las células que se han unido a dicho anticuerpo monoclonal o a los fragmentos del mismo en f), y, opcionalmente,
- h)
- recuperar las células que se han unido al anticuerpo monoclonal o a los fragmentos del mismo en g) a partir de dicho anticuerpo o de los fragmentos del mismo, dando lugar de este modo a una población de células madre mesenquimales, de mamífero opcionalmente libre de dicho anticuerpo o de los fragmentos del mismo.
La suspensión de células que se proporciona en
el apartado e) anterior, que comprende MSC de mamífero, se puede
aislar a partir de médula ósea, sangre periférica, sangre de cordón
umbilical, hígado, hueso, cartílago, músculo, pericondrio,
periostio, tejido sinovial, grasa, o cualquier tejido que comprenda
MSC. La suspensión de células se puede aislar, además, a partir de
cresta ilíaca, fémur, tibia, columna vertebral, costilla u otros
espacios medulares de un mamífero, a condición de que no se aíslen a
partir de un embrión humano. Otras fuentes de MSC humanas, a
condición de que no se obtengan a partir de un embrión humano,
incluyen el saco vitelino, la placenta y el cordón umbilical no
humanos.
Si la población de células se recoge a partir de
MO, únicamente el 0,01-0,001% de la población
inicial, o "población bruta", son MSC. No obstante, esta
proporción puede variar entre donantes diferentes.
En un modo de realización adicional, las MSC de
mamífero son MSC humanas.
En un modo de realización adicional, las MSC de
mamífero son MSC murinas.
En un modo de realización adicional, el cultivo
anterior es un cultivo de 2-4 semanas.
En un modo de realización, el método para aislar
una población de MSC puede comprender, además, los pasos de:
- i)
- recoger aspirado de médula ósea (5-30 ml) obtenido a partir de un paciente humano, en una jeringa que contenga heparina, por ejemplo, para impedir la coagulación,
- j)
- lavar la muestra de médula con tampón fosfato salino de Dulbecco (DPBS), por ejemplo, o cualquier solución salina similar y recuperar las células tras una centrifugación a 900 g, y repetir este procedimiento una vez más.
- k)
- introducir las células en 25 ml de Percoll de una densidad de 1,073 g/ml en un tubo cónico de 50 ml y separar las células mediante centrifugación a 1100 g durante 30 min a 20ºC,
- l)
- recoger las células nucleadas de la zona de interfase, diluirlas con dos volúmenes de DPBS y recogerlas mediante centrifugación a 900 g. Suspender de nuevo las células, contarlas y depositarlas en una placa a la densidad requerida (la apropiada es de 200.000 células/cm^{2}),
- m)
- cultivar las células en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o cualquier otro medio apropiado (bajo en glucosa) que contenga suero fetal bovino (SFB) al 10%,
- n)
- reemplazar el medio a las 24 y 72 horas y, a partir de entonces, cada 3 o 4 días, y
- o)
- crear subcultivos con las MSC humanas que proliferan en forma de colonias simétricas entre los 10 y 14 días, mediante tratamiento con tripsina al 0,05% y EDTA 0,53 mM durante 5 min, extraerlas del sustrato con un medio que contenga suero, recogerlas mediante centrifugación a 800 g durante 5 min, y sembrarlas en frascos limpios a una densidad de 5000 a 6000 células/cm^{2}.
La separación de las MSC consta de un paso de
selección y aislamiento para separar las MSC identificadas. Para
separar las células se pueden utilizar diversas técnicas conocidas
por los expertos, eliminando inicialmente las células dedicadas a
otros linajes distintos de los de las MSC.
Si se utilizan un anticuerpo o fragmentos del
mismo, estos pueden estar unidos a un soporte sólido para permitir
una separación sumamente específica. El procedimiento particular de
separación que se utilice, p.e., centrifugación o separación
mecánica, como, por ejemplo, separación en columnas, mediante
membranas o magnética, debe maximizar la viabilidad de la fracción
que se va a recoger. Se pueden utilizar diversas técnicas de
diferente eficacia conocidas por una persona experta en la técnica.
El procedimiento particular utilizado dependerá de la eficiencia de
separación, la citotoxicidad de la metodología, la facilidad y
velocidad de ejecución, y la necesidad de unos equipos y/o una
capacidad técnica complejos.
Los procedimientos de separación de las MSC a
partir de una suspensión celular con la ayuda del método in vitro
según la invención pueden incluir separación magnética, utilizando,
por ejemplo, gránulos magnéticos recubiertos de anticuerpo,
cromatografía de afinidad basada en el anticuerpo o en fragmentos
del mismo según la invención, y "panning" con un anticuerpo o
fragmentos del mismo unidos a una matriz sólida, p.e., una placa, u
otras técnicas convenientes.
Las técnicas que proporcionan una separación
precisa incluyen separadores de células activados por fluorescencia
mediante la utilización, por ejemplo, de un anticuerpo o fragmentos
del mismo en el método según la invención, que pueden tener
diversos grados de complejidad, p.e., varios canales de color,
canales detectores de dispersión de la luz, canales de impedancia,
etc., conocidos por aquellos expertos en la técnica.
En un modo de realización, se lleva a cabo un
primer paso de enriquecimiento en MSC de la población celular
utilizada. La primera selección puede ser una selección negativa de
las MSC, es decir, las células comprometidas hacia otro linaje
pueden ser sustraídas o eliminadas de la población celular
inicial.
En otro modo de realización adicional, el primer
enriquecimiento consiste en una selección positiva de las MSC, que
se puede repetir hasta lograr la pureza deseada de las mismas.
Como se ha descrito en el párrafo anterior, las
MSC se pueden aislar mediante adhesión al plástico de una población
celular mixta, seguida por un desarrollo posterior opcional de las
células con factores definidos para diferenciarse en tejidos
mesenquimales diferentes.
Para los condrocitos, el cultivo puede
realizarse en forma de micromasa comprimida o en alginato con o sin
suero, y con TGFbet3 añadido como factor definido. En el caso de las
células osteogénicas, estas se pueden cultivar en presencia de
dexametasona, fosfato de betaglicerol, ascorbato y SFB (suero fetal
bovino) al 10%. Y en el de los adipocitos, las células se pueden
cultivar en presencia de
1-metil-3-ispbutilxantina,
dexametasona, insulina e indometacina. Minguell, J.J., Erices, A. y
Conget, P. (2001), en Mesenchymal Stem Cells. Exp. Biol. Med.
226(6):507-520, que se incorpora a la
presente solicitud a modo de referencia, proporcionan ejemplos de
factores más apropiados.
En algunos modos de realización adicionales de
la invención se pueden analizar otros marcadores de MSC de mamífero
menos específicos y no únicos, en paralelo con el marcador descrito
en la presente solicitud. Esos otros marcadores son
SH-2, SH-3, CD29, CD44, CD71, CD90,
CD106, CD120a, CD124, CD105 y Stro-1 que puedan
expresar las MSC. No obstante, estos marcadores no son únicos para
MSC de mamífero. Los marcadores que no se expresan en las MSC son
CD14, CD34 y CD45, y su expresión o falta de expresión, pueden ser
evaluadas en el método según la invención en algunos modos de
realización adicionales.
En un modo de realización adicional, la
expresión anterior se identifica mediante la detección de la
expresión de la proteína de la integrina alfa10 y/o integrina
alfa11.
En un modo de realización, se puede analizar la
expresión de alfa10/alfa11 mediante separación de células activada
por fluorescencia, p.e., utilizando un separador de células activado
por fluorescencia (FACS®) o cualquier otra metodología que posea
una alta especificidad. Con los FACS se pueden utilizar análisis
multicolor, lo que resulta particularmente conveniente. De este
modo, las MSC se pueden separar sobre la base del nivel de tinción
para los antígenos particulares.
En una primera separación, se pueden utilizar
anticuerpos para otros marcadores etiquetados con uno o más
fluorocromos. Otros marcadores para ser utilizados en otros modos de
realización pueden ser SH-2, SH-3,
CD29, CD44, CD71, CD90, CD106, CD120a, CD124, CD105 y
Stro-1 que puedan expresar las MSC. Los marcadores
que no se expresan en las MSC son CD14, CD34 y CD45, y su expresión
o falta de la misma, pueden ser evaluadas en el método según la
invención o un fragmento en algunos modos de realización
adicionales.
Si en un paso es necesario eliminar otros
linajes o poblaciones celulares que no sean MSC, se pueden incluir
diversos anticuerpos a dichos marcadores específicos de linaje.
Los fluorocromos, que pueden ser de utilidad en
un análisis multicolor, incluyen ficobiliproteínas, p.e.,
ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína, rojo de Texas, etc.,
bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Las MSC se pueden seleccionar por exclusión de
las células muertas utilizando tintes asociados a las células
muertas (ioduro de propidio, LDS). Las células se pueden recoger en
un medio que comprenda suero fetal bovino.
Las MSC también se pueden seleccionar sobre la
base de las propiedades de dispersión de la luz y su expresión de
diversos antígenos de superficie celular, en combinación con la
identificación mediante el método según la invención.
Alternativamente, se pueden analizar las MSC
mediante inmunoprecipitación, detectando e identificando de este
modo la expresión de la cadena de integrina alfa10 y/o alfa11. Más
abajo se describe brevemente un protocolo apropiado de
inmunoprecipitación. Por supuesto, se puede utilizar cualquier otro
método de inmunoprecipitación apropiado en el método según la
invención.
Brevemente:
- 1.
- Se pueden utilizar anticuerpos contra los dominios citoplasmáticos de subunidades de integrina alfa10 y alfa11 para inmunoprecipitar específicamente integrinas alfa10beta1 y alfa11beta1 respectivamente a partir de lisados celulares. Los anticuerpos policlonales apropiados para la inmunoprecipitación de integrina alfa10 o alfa11 son conocidos y han sido publicados en J. Biol. Chem. (1998, 273:20383-9).
- 2.
- A continuación, se pueden dejar proliferar las MSC que expresen las subunidades de integrina alfa10 o alfa11 en un medio de cultivo celular apropiado, p.e., DMEM, IMEM, RPMI, opcionalmente con suero y factores de crecimiento. Las células adheridas a la placa se lavan una vez con PBS y, a continuación, se someten a biotinilación de su superficie utilizando Sulfo-NHS-LC-biotina (PIERCE) a 0,5 mg/ml en 4 ml de PBS durante 20 min sobre hielo o cualquier otro reactivo de biotinilación apropiado conocido por aquellos expertos en la técnica.
- 3.
- A continuación, las células se lavan una vez con PBS y se añaden 10 ml de glicina/PBS 0,1M durante 5 min sobre hielo. Después de lavarlas una vez con PBS las células son lisadas en 1 ml de tampón de lisis (NP-40 al 1%, glicerol al 10%, Tris/HCl 20 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM, cóctel Roche inhibidor de la proteasa, pH 7,5) sobre hielo.
- 4.
- El lisado celular se somete a rotación a 15.000 g durante 10 min y el sobrenadante se elimina y se incuba con 1 \mul de suero preinmune \alpha10/\alpha11 y, a continuación, se añaden 20 \mul de Proteína G sefarosa (Amersham) en 100 \mul de tampón de lisis.
- 5.
- Tras 1 hora en rotación a 4ºC, el lisado se centrifuga durante 1 min a 8000 rpm y se recoge el sobrenadante. Para cada inmunoprecipitación ulterior, se pipetean 150 \mul de sobrenadante del lisado celular en un tubo Eppendorf y se añade 1 \mul de antisuero o solución de anticuerpo monoclonal.
- 6.
- Los anticuerpos utilizados son suero \alpha10 de conejo anti-humano y para suero \alpha11 de conejo anti-humano (ambos sueros contra los dominios citoplasmáticos de las integrinas, publicados por Tiger y otros, (Developmental Biology (2001) 237:116 para alfa11 y por Camper y otros, (J. Biol. Chem. (2001) 306:107-116) para alfa10).
- 7.
- Tras 2 horas en rotación a 4ºC, se añaden 20 \mul de proteína G sefarosa (Amersham) en 100 \mul de tampón de lisis y, a continuación, la mezcla se somete a rotación durante otros 45 min. A continuación, se someten a rotación brevemente los gránulos de sefarosa y se lavan tres veces con tampón de lisis.
- 8.
- Se añaden 20 \mul de tampón de muestra PAGE-SDS (incluyendo DTT 100 mM) a los gránulos de sefarosa y las muestras se hierven durante 5 min.
- 9.
- Se procesan 5 \mul de cada muestra sobre un gel alisado (Novex) al 8% y, a continuación, se electrotransfieren a una membrana PVDF. La membrana se bloquea en BSA al 2%/tampón Tris-salino con Tween al 0,05% durante 1 hora, se lavan una vez con tampón Tris-salino con Tween al 0,05% y, después, se incuban con 2 \mul de ExtrAvidina-peroxidasa (Sigma) en 8 ml de tampón bloqueante.
Después de 1 hora se elimina la solución de
ExtrAvidina -peroxidasa y se lava la membrana 3\times20 min en
TBST. Entonces se pueden detectar las proteínas biotiniladas de la
superficie con ECL (Amersham), p.e., y visualizar sobre una
película fotográfica.
En otro modo de realización adicional, la
expresión de la cadena de integrina alfa10 y/o alfa11 se detecta
sobre la superficie celular de unas MSC o en el interior de unas MSC
en el método según la invención. Se pueden utilizar los métodos
descritos más arriba, p.e., la citometría de flujo y la
inmunoprecipitación.
En otro modo de realización adicional, la
expresión del apartado b) anterior se detecta mediante cualquier
ensayo inmunológico, como, por ejemplo, los métodos descritos en
Immunochemical Protocols (Methods in molecular biology, Humana
Press Inc.). La detección se puede realizar mediante varios
métodos, p.e., cualquier método inmunológico conocido por aquellos
expertos en la técnica, como, por ejemplo, la inmunoprecipitación,
el Western blotting, o los métodos de citometría de flujo, como,
por ejemplo, la separación de células activada por fluorescencia
(FACS). Los anticuerpos, como, por ejemplo, los anticuerpos
monoclonales o fragmentos de los mismos, son particularmente útiles
para la identificación de marcadores, proteínas de superficie de la
membrana, así como marcadores intracelulares, asociados con linajes
celulares y/o estadios de diferenciación particulares. Por lo tanto,
resulta apropiado para la identificación de la integrina alfa10 así
como para la de la alfa11. A pesar de todo, la identificación se
puede realizar también mediante cualquier molécula específica, como,
por ejemplo, una proteína o péptido, que se una específicamente a
la molécula de integrina alfa10 y/o integrina alfa11. Ejemplos de
dichas proteínas o péptidos son los ligandos naturales, que se unen
a la molécula de integrina alfa10 y/o integrina alfa11. Dichos
ligandos naturales se pueden preparar recombinantes, sintetizados
químicamente, o purificados a partir de una fuente natural. En aún
otro modo de realización adicional, la expresión anterior se
identifica mediante la detección de la expresión del ARNm de la
integrina alfa10 y/o integrina alfa11. La detección de la expresión
del ARNm de una proteína específica es bien conocida por aquellos
expertos en la técnica y se lleva a cabo generalmente hibridando el
ARNm con una sonda de ADN o ARN específica para el ARNm que
interesa, bajo condiciones de hibridación en las que la sonda no
hibride con otras moléculas de ARNm. También se pueden utilizar
diferentes reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), lo que
resulta obvio para aquellos expertos en la técnica.
Más abajo se proporciona un método de PCR
apropiado. De forma breve, se puede utilizar la reacción en cadena
de la polimerasa (PCR).
El ARN se puede preparar a partir de células
madre mesenquimales humanas o células precursoras condrogénicas
mediante métodos estándar, por ejemplo la utilización de RNeasy Mini
Kit (Qiagen Alemania).
El ADNc se puede producir mediante reacción de
la transcriptasa inversa, Superscript II (Invitrogen, USA) de
acuerdo con la recomendación de los fabricantes con cebadores oligo
d(T) o cebadores específicos del gen.
Posteriormente, se realiza la PCR para
amplificar el ADNc. Se añaden cebadores específicos para \alpha10,
directo 5' GCT CCA GGA AGG CCC CAT TTG TG 3' e inverso 5' GTG TTT
TCT TGA AGG GTG CCA TTT 3' o para \alpha11, directo 5' GCT GCA
GGC AGT GAC AGT A 3' E INVERSO 5' GCG ATG GGA ATG GTG ATC T 3' al
ADNc y el producto específico se amplifica mediante Taq Platinum
ADN polimerasa (Invitrogen, USA) de acuerdo con sus recomendaciones
30 ciclos a 60º.
La calificación de la expresión de la molécula
de integrina alfa10 y/o integrina alfa11 se puede realizar en
relación con una población celular de referencia que exprese la
molécula de integrina alfa10 y/o integrina alfa11, así como con una
población celular de referencia que no exprese la molécula de
integrina alfa10 y/o integrina alfa11. Ejemplos de células que
expresan la integrina alfa10 y alfa11 son las células C2C12, las
células HEK293 transfectadas con secuencias de integrina alfa10 y
alfa11. Ejemplos de células que no expresan alfa10 y alfa11 son las
células C2C12 y las células HEK293 no transfectadas.
De acuerdo con la invención, se divulga un
método para producir una población aislada de células in
vitro enriquecida en MSC de mamífero en relación con una
población de referencia, método que comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar al menos una porción de una población de células, o al menos una porción de una población de referencia, que comprenda MSC y al menos una célula que no sea MSC,
- b)
- introducir en la población de células del apartado a) anterior un compuesto que identifique las MSC,
- c)
- seleccionar y aislar de la población de células del apartado b) anterior las MSC, produciendo de este modo una población de células enriquecida en MSC.
La forma de proporcionar una población se ha
descrito en los párrafos anteriores y se puede realizar de forma
similar a la del método para la identificación de las MSC. Si la
población de células se recoge a partir de MO, aproximadamente el
0,01-0,001% de la población inicial, o población
"bruta", son MSC. No obstante, esto puede variar entre
diferentes donantes.
El compuesto introducido para identificar las
MSC puede ser una proteína, un péptido, un anticuerpo monoclonal, o
un fragmento de los mismos, o un anticuerpo policlonal capaces de
identificar las MSC. En un modo de realización, las MSC se
identifican como tales mediante la detección de la expresión de la
cadena de integrina alfa10 y/o alfa11 sobre la superficie celular
de dichas MSC de acuerdo con el método para la identificación de las
MSC descrito más arriba.
La selección y aislamiento de las MSC es un paso
de separación para separar, y de ese modo aislar, las MSC
identificadas. Se pueden emplear diversas técnicas para separar las
células eliminando al comienzo las células dedicadas a otros
linajes de los de las MSC. Los anticuerpos monoclonales o
policlonales, o fragmentos de los mismos, son particularmente
útiles para la identificación de los marcadores, en este caso sobre
células viables intactas, en donde los marcadores son proteínas de
superficie de la membrana asociadas con linajes de células y/o
estadios de diferenciación particulares. El compuesto utilizado para
identificar las MSC también se puede utilizar para el paso de
separación. Así, dicho(s) compuesto(s), como, por
ejemplo, anticuerpos o fragmentos de los mismos, pueden estar
unidos a un soporte sólido para permitir una primera separación
tosca. Ejemplos de soportes sólidos son los gránulos, p.e.,
gránulos magnéticos, agarosa u otros tipos similares de gránulos
conocidos por aquellos expertos en la técnica. Para la separación de
las células se pueden utilizar cualesquiera medios que sean
apropiados a condición de que la separación no resulte indebidamente
perjudicial para la viabilidad de las células.
Las técnicas de separación empleadas deben
maximizar la conservación de la viabilidad de la fracción que se va
a recoger. La estimación de la viabilidad se describe a
continuación.
De forma sucinta, la viabilidad se puede estimar
mediante, p.e., citometría de flujo. En este caso, después de
tintar las células, pero antes de poner en funcionamiento el
citómetro de flujo, se puede añadir la siguiente
cantidad/concentración de un tinte de viabilidad celular apropiado
para diferenciar las células vivas de las muertas. Existen unos
cuantos de estos tintes, de los cuales se describen algunos ejemplos
y métodos típicos para utilizarlos. El principio es el mismo para
la mayor parte de estos tintes: los tintes penetran en las células
si la membrana celular está comprometida; así pues, las células que
resultan manchadas por estos tintes están muertas y las células que
no resultan manchadas se consideran vivas.
Ejemplos de tintes son:
- a)
- Ioduro de propidio (IP):
- Patrón: 50 \mug/\mul en etanol/PBS
- Añadir: 1 \mul por cada 100 \mul del medio en probeta
- b)
- 7-aminoactinomicina D (7 AAD)
- Patrón: 1 mg/ml en MeOH
- Añadir: 1 \mul por cada 100 \mul del medio en probeta
- c)
- To-Pro3
- Patrón: 1 mM en DMSO
- Añadir: 1 \mul por cada 500 \mul a 1 ml de solución
- d)
- Monoazida de etidio (EMA)
- Patrón: 50 \mug/ml en EtOH
- Añadir: 5 \mug/ml por cada 1\times10^{6} células
En Flow Cytometry and Cell Sorting (Springer Lab
Manual) de A. Radbruch Springer Verlag (2ª edición, Enero 2000)
pueden estar descritos otros métodos.
La viabilidad de las células de la fracción
recogida es >90%, preferiblemente 95, 96, 97, 98, 99, 99,9 o,
incluso 100%.
La técnica particular utilizada para la
separación de las células en el método según la invención dependerá
de la eficiencia en la separación, la citotoxicidad de la
metodología, la facilidad y velocidad de ejecución, y la necesidad
de unos equipos y/o una capacidad técnica complejos.
Los procedimientos de separación pueden incluir
separación magnética, utilizando, p.e., gránulos magnéticos
recubiertos de anticuerpo, cromatografía de afinidad, agentes
citotóxicos unidos a un anticuerpo monoclonal o utilizados
conjuntamente con un anticuerpo monoclonal, p.e., complemento y
citotoxinas, y "panning" con un anticuerpo unido a una matriz
sólida, p.e., una placa, u otras técnicas convenientes. Las técnicas
que proporcionan una separación precisa incluyen separadores de
células activados por fluorescencia, que pueden tener diversos
grados de complejidad, p.e., varios canales de color, canales
detectores de dispersión de la luz, canales de impedancia, etc.,
conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Orfao, A. y Ruiz-Argüelles, A.
((1996) General Concepts about Cell Sorting Techniques. Clin
Biochem. 29(1):5-9) y Herzenberg, L.A., De
Rose, S.C., y Herzenberg, L.A. ((2000) Monoclonal Antibodies and
FACS: complementary tools for immunobiology and medicine. Immunol.
Today. 21(8):383-398) describen otros
protocolos para métodos de separación apropiados para ser
utilizados en el método según la invención.
En un modo de realización del método según la
invención se incluye al menos un paso de enriquecimiento de
MSC.
En aún otro modo de realización adicional, el
primer paso de enriquecimiento de MSC consiste en una selección
negativa de las MSC, es decir, las células comprometidas hacia otro
linaje son sustraídas, o eliminadas, de la población celular
inicial. Ejemplos de células que se eliminarán en la selección
negativa se identifican mediante los siguientes marcadores: CD14
(monocitos, granulocitos, células dendríticas, macrófagos y células
B), CD34 (células progenitoras hematopoyéticas) y CD45 (leucocitos).
Estos y otros marcadores útiles para la selección negativa de MSC
de mamífero se describen de forma detallada en Conget, P.A.,
Minguell, J.J. ((1999) Phenotypical and functional properties of
human bone marrow mesenchymal progenitor cells. J. Cell Physiol.
181:67-73) y en Pittenger, M.F. y otros ((1999)
Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.
Science. 284:143-7). Ambas referencias se incorporan
a la presente solicitud a modo de referencia.
\newpage
En aún otro modo de realización adicional, el
primer enriquecimiento consiste en una selección positiva de las
MSC, que se puede repetir hasta lograr la pureza deseada de las
mismas. Para una selección positiva o negativa se pueden utilizar
proteínas, péptidos o anticuerpos monoclonales o policlonales como
compuestos para identificar la molécula de integrina alfa10 o
integrina alfa11 tal como se ha descrito más arriba. El compuesto
se puede conjugar con medios de separación, como, por ejemplo,
gránulos magnéticos, que permiten una separación directa; con
biotina, que se puede eliminar con avidina; o con estreptavidina
unida a un soporte; con fluorocromos, que se pueden utilizar con un
separador de células activado por fluorescencia; o similares, para
permitir una separación fácil del tipo particular de células, tal
como se ejemplifica en los párrafos anteriores. Se puede utilizar
cualquier técnica que no resulte indebidamente perjudicial para la
viabilidad de las células de interés, es decir, las MSC.
En un modo de realización, la selección se lleva
a cabo mediante separación de células activada por fluorescencia,
utilizando, p.e., un separador de células activado por fluorescencia
como, por ejemplo, un FACS®, o cualquier otra metodología similar
que posea de una alta especificidad. Con los FACS se puede utilizar
análisis multicolor, lo que resulta particularmente conveniente, y
el método es bien conocido para aquellos expertos en la técnica de
la citometría de flujo. Las células se pueden separar sobre la base
del nivel de tinción para los antígenos particulares. En una
primera separación, se pueden utilizar anticuerpos para otros
marcadores etiquetados con un fluorocromo, en tanto que los
anticuerpos para los linajes dedicados, es decir, la integrina
alfa10 y/o la integrina alfa11, se pueden conjugar a fluorocromos
diferentes. En otros modos de realización, otros marcadores pueden
ser SH-2, SH-3, CD29, CD44, CD71,
CD90, CD106, CD120a, CD124, CD105 y Stro-1 que
puedan expresar las MSC. Los marcadores que no se expresan en las
MSC son CD14, CD34 y CD45, y su expresión o falta de expresión,
pueden ser evaluadas junto con el marcador según la invención en
otros modos de realización adicionales, p.e., la expresión de la
integrina alfa10 y/o integrina alfa11.
Si en este paso hay que eliminar otros linajes o
poblaciones celulares, se pueden incluir diversos anticuerpos para
dichos marcadores específicos de esos linajes. Los fluorocromos, que
pueden ser de utilidad en un análisis multicolor, incluyen
ficobiliproteínas, p.e., ficoeritrina y aloficocianinas,
fluoresceína, rojo de Texas, etc.
Las células se pueden seleccionar por exclusión
de las células muertas utilizando tintes asociados a las células
muertas, como, por ejemplo, ioduro de propidio o
LDS-751 (Laser Dye Styryl-751
(perclorato de
6-dimetilamino-2-[4-[4-(dimetilamino)fenil]-1,3-butadienil]-1-etil
quinolino)). Las células se pueden recoger en cualquier medio de
cultivo celular apropiado, como, por ejemplo, el medio de Dulbecco
modificado por Iscove (IMDM), o en cualquier solución salina
fisiológica, preferiblemente tamponada, como, por ejemplo, tampón
fosfato salino (PBS), opcionalmente con suero fetal bovino (SFB) o
albúmina de suero bovino (ASB) presentes. Para la selección
positiva o negativa se pueden utilizar otras técnicas que permiten
una separación precisa, como, por ejemplo, columnas de afinidad y
similares, descritas con más detalle por Silvestri, F., Wunder, E.,
Sovalat, H., Henon, P., Serke, S. en Positive selection of CD34+
cells: a short review of the immunoadsorption methods currently
available for experimental and clinical use (Report on the "2nd
European Workshop on Stem Cell Methodology", Mulhouse, Francia,
3-7 de Mayo de 1993. J. Hematother. Invierno 1993;
2(4):473-81) y por Basch, R.S., Berman, J.W.,
Lakow, E. en Cell separation using positive immunoselective
techniques (J. Immunol. Methods. 11 Feb 1983;
56(3):269-80).
Las células se pueden seleccionar sobre la base
de las propiedades de dispersión de la luz así como su expresión de
diversos antígenos de la superficie celular.
Aunque se cree que el orden de separación
concreto no es crítico para esta invención, el orden indicado
representa una forma de poner en práctica la invención de
funcionamiento comprobado. Así, se sugiere que inicialmente se
separen las células mediante separación una tosca, preferiblemente
una selección negativa que elimine las células no comprometidas
hacia las MSC utilizando marcadores celulares negativos como, por
ejemplo, CD14, CD34 y CD45. Dichas células son negativas para la
expresión de la integrina alfa10 y/o alfa11. La selección negativa
es seguida por una separación fina, que es una selección positiva,
en donde la selección positiva se aplica a un marcador asociado con
las MSC y la selección negativa a marcadores asociados con las
células comprometidas hacia el linaje, y a otras poblaciones de
células madre que no son MSC. Esta separación va seguida por la
selección de una población celular, o una composición celular que
comprenda dicha población, que, como MSC, tenga un potencial
multilinaje y una mejor capacidad de autorregeneración. La
composición se describe con más detalle más abajo.
En la presente solicitud también se divulga una
población celular enriquecida de MSC de mamífero que también se
describe en la misma. Dicha población celular comprende MSC intactas
y viables, en la que las MSC están caracterizadas por
- a)
- expresar una cadena de integrina alfa10 y/o una cadena de integrina alfa11 sobre la superficie celular de dichas MSC, o en el interior de las células MSC.
- b)
- estar sustancialmente libres de expresión de moléculas específicas para las células hematopoyéticas comprometidas.
Las moléculas específicas para las células
hematopoyéticas comprometidas son, p.e., las CD45. Otras moléculas
de las que las MSC se encuentran sustancialmente libres son, p.e.,
CD34 y CD14.
En otros modos de realización, el
enriquecimiento de dicha población es aproximadamente del 70, 80,
90, 95, 98, 99, 99,9 o, incluso 100%. La viabilidad de dichas
células se expone de forma detallada más abajo.
Las MSC aisladas se pueden obtener mediante el
método para producir una población de células enriquecida en MSC
según la invención.
En la presente solicitud también se describe una
composición de células de mamífero. Dicha composición comprende la
población de células de mamífero enriquecida según la invención, o
las MSC de mamífero aisladas según la invención.
De acuerdo con los métodos divulgados para el
enriquecimiento de las MSC, se pueden conseguir composiciones que
tengan más del 90%, usualmente más del aproximadamente 95%, como,
por ejemplo, el 97, 98 ó 99,9%, de células MSC humanas. Dichas MSC
tienen la capacidad de hacer posible la regeneración y el desarrollo
de miembros de todos los diversos linajes de MSC, como, por
ejemplo, osteocitos, condrocitos, p.e., condrocitos hipertróficos,
células musculares, miotubos, células del estroma, fibroblastos T/L,
adipocitos, tenocitos, células dérmicas y otras células. Esto se
lleva a cabo generalmente en cultivos, a los que se les han
suministrado los factores específicos descritos anteriormente.
Por último, se puede obtener una sola célula a
partir de una composición de MSC y utilizarla para la reconstitución
a largo plazo de un mamífero deficiente en MSC y/o la formación o
regeneración de tejido mesenquimal. La composición de MSC debe
administrarse en una dosis terapéutica efectiva, en cuyo caso la
dosis consta de un número específico de células capaces de volver a
colonizar a dicho mamífero, como, por ejemplo, un ser humano. El
número de células puede ser diferente de un donante a otro y se
puede determinar de forma empírica en cada caso por una persona
experta en la técnica del transplante de células a los mamíferos,
como, por ejemplo, un ser humano, en caso de que sea necesario.
Se pueden considerar diversos procedimientos
para transferir e inmovilizar las MSC, y la composición que
comprende las MSC, incluyendo la inyección de las células aisladas
en el lugar del defecto esquelético, p.e., un cartílago articular
dañado, incubando las células aisladas en un gel adecuado e
implantándolas, incubándolas con un andamio biorreabsorbible, o
infundiéndolas sistemáticamente, etc. Se conocen diferentes
procedimientos que han sido descritos con detalle por, p.e.,
Risbud, M.V., y Sittenger, M. ((2002) Tissue Engineering: advances
in in vitro cartilage regeneration. Trends in Biotech.
20(8):351-356), por Caplan, A. y Bruder, S.P.
((2001) Mesenchymal stem cells: building blocks for molecular
medicine in the 21st century. Trends Mol. Med.
7(6):259-64), por Lazarus, H.M. y otros
((1995) Ex vivo expansion and subsequent infusion of human
bone marrow-derived stromal progenitor cells
(mesenchymal progenitor cells):Implications for therapeutic use.
Bone Marrow Transplant 16:557-564), y por Koc, O.N.
y otros ((2000) Rapid hematopoietic recovery after coinfusion of
autologous-blood stem cells and
culture-expanded marrow mesenchymal stem cells in
advanced breast cancer patients receiving high-dose
chemotherapy. J. Clin. Oncol.
18(2):307-16).
Opcionalmente, las MSC se pueden incubar con un
anticuerpo para la integrina alfa10 o alfa11 con objeto de mantener
las células en su lugar. Así, los anticuerpos se pueden conjugar a
un andamio biorreabsorbible que permite la inmovilización de las
células antes de ser implantadas en el lugar dañado o defectuoso,
p.e., en el sitio de un defecto esquelético. El andamio permite la
inmovilización de las MSC en las tres dimensiones. Más abajo se dan
ejemplos de andamios de biomateriales apropiados. Los ejemplos que
se proporcionan no limitan la utilización de otros andamios
apropiados obvios para aquellos expertos que prefieran escogerlos si
resultan más apropiados para una aplicación particular.
Los tipos de andamio incluyen, andamios de
poli(\alpha-hidroxi ésteres)
biorreabsorbibles, como, por ejemplo, ácido poliláctico (PLLA),
ácido poliglicólico (PGA) y el copolímero (PLGA).
Otros modos de realización incluyen andamios
derivados de geles poliméricos como, por ejemplo, ácido hialurónico,
colágeno, alginato y chitosan.
Otros modos de realización incluyen andamios
derivados de portadores porosos, como, por ejemplo, el fosfato
tricálcico y/o bloques de cerámica de hidroxiapatita (Luyten, F.P.,
Dell'Accio, F. y De Bari, C. (2001) Skeletal tissue engineering:
opportunities and challenges. Best Prac. & Res. Clin. Rheum.
15(5):759-770).
La composición celular descrita en la presente
solicitud se puede utilizar para el tratamiento de enfermedades
genéticas. Las enfermedades genéticas asociadas con las MSC se
pueden tratar mediante modificación genética de MSC autólogas o
alogénicas para corregir el defecto genético. Por ejemplo,
enfermedades tales como diferentes enfermedades del tejido
conectivo, p.e., la osteogénesis imperfecta, el síndrome de Ehlers
Danlos, la condrodisplasia o el síndrome de Alport se pueden
corregir mediante la introducción de un gen de tipo salvaje en las
MSC, bien mediante recombinación homóloga o aleatoria. Se conocen
algunos métodos de recombinación homóloga para la corrección de
enfermedades, que han sido descritos por Hatada, S., Nikkuni, K.,
Bentley, S.A., Kirby, S., Smithies, O. ((2000) Gene correction in
hematopoietic progenitor cells by homologous recombination. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 97(25):13807-11).
Con las MSC alogénicas, se pueden utilizar como
terapia las células normales que forman un mamífero de la misma
especie que carezca del defecto genético. Otros modos de realización
de la terapia génica pueden consistir en la introducción de genes
de resistencia a la droga para permitir que las MSC normales tengan
una ventaja y someterlas a presión selectiva, p.e., el gen de la
resistencia a múltiples drogas (MDR). En Aran, J.M., Pastan, I.,
Gottesman, M.M., (1999) Therapeutic strategies involving the
multidrug resistance phenotype: the MDR1 gene as target,
chemoprotectant and selectable marker in gene therapy. (Adv.
Pharmacol. 46:1-42) se proporcionan más
detalles.
También se pueden tratar otras enfermedades
distintas de las asociadas a las MSC, en donde la enfermedad está
relacionada a la carencia de un producto secretado particular como,
por ejemplo, una hormona, una enzima, interferón, un factor, o
similares. Mediante la utilización de una región regulatoria de
iniciación apropiada se puede lograr una producción inducible de la
proteína deficiente, de tal modo que la producción de la proteína
llegue a igualar a la producción natural, aunque la producción
tendrá lugar en un tipo de célula diferente del tipo de célula que
produce normalmente dicha proteína. También es posible insertar una
ribozima, antisentido u otro mensaje para inhibir los productos de
genes particulares o la susceptibilidad a enfermedades, en
particular del tejido conectivo.
De acuerdo con la invención, se divulga un
método para determinar si un compuesto de ensayo modula una
diferenciación in vitro de MSC de mamífero. Dicho método
comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar unas MSC
- b)
- poner en contacto las MSC con un compuesto de ensayo, y
- c)
- detectar un cambio en la tasa o el patrón de diferenciación de las MSC como indicación de que el compuesto de ensayo modula la diferenciación de las MSC.
Las MSC proporcionadas pueden ser una población
celular enriquecida conseguida según cualquiera de los métodos
divulgados, las MSC aisladas según la invención, o la composición
celular según la invención.
El compuesto de ensayo puede ser cualquier
compuesto que se sepa o sospeche que afecta a las MSC, p.e.,
composiciones farmacéuticas, drogas, anticuerpos monoclonales o
policlonales, o fragmentos de los mismos, como, por ejemplo,
anticuerpos que se unen a la integrina alfa10 y/o a la integrina
alfa11, o a cualquier otra molécula sobre las MSC, factores
utilizados para promover el crecimiento de las MSC, p.e., el FGF o
el suero fetal bovino (SFB), o factores utilizados para promover la
diferenciación de las MSC, p.e., la dexametasona, el factor TGFbeta
o la
insulina.
insulina.
La detección de un cambio en la tasa o el patrón
de, p.e., la diferenciación de las MSC como indicación de que el
compuesto de ensayo modula la diferenciación de las MSC se puede
llevar a cabo por medio de una citometría de flujo o cualquier otro
método apropiado, como, por ejemplo, cualquier método inmunológico,
conocido por cualquier persona experta en la técnica. El cambio en
la tasa o el patrón de diferenciación puede ser cinético, funcional
o análisis de variación fenotípica de las MSC moduladas con el
compuesto de ensayo en relación con una población de MSC no
tratada, o sometida a tratamiento mock. También puede tratarse de
una comparación en relación con al menos un segundo compuesto de
ensayo.
En un modo de realización adicional, las MSC se
identifican como tales mediante la detección de la expresión de la
cadena de integrina alfa10 y/o alfa11 en la superficie celular de
dichas MSC o en el interior de las mismas, de acuerdo con el método
para identificar las MSC divulgado en la presente solicitud.
Las MSC de mamífero, como, por ejemplo, MSC
humanas o de ratón, proporcionadas en la presente solicitud tienen
diversos usos. Por ejemplo, 1) regeneración de un anfitrión
deficiente en MSC; 2) tratamiento de un anfitrión mediante el
reinjerto de MSC para la regeneración de hueso, cartílago, músculo,
médula, tendón/ligamento y tejido conectivo en un paciente que lo
requiera; 3) en la detección y evaluación de factores de crecimiento
relevantes para la autorregeneración de las MSC; 4) en el
desarrollo de linajes de MSC y en la identificación de los factores
asociados con su desarrollo y diferenciación.
Además, la integrina alfa10 y/o alfa11 tiene
diversos usos. Ejemplos de dichos usos pueden ser la identificación,
diferenciación y aislamiento de células madre mesenquimales de
mamífero a partir de una población celular mixta como instrumento
útil en la terapia celular para reparar un tejido dañado.
De acuerdo con la invención, se divulga la
utilización de la integrina alfa10 y/o alfa11 según la invención
para la identificación in vitro de las MSC.
Adicionalmente, se divulga la utilización de la
integrina alfa10 y/o alfa11 según la invención para la modulación
in vitro de la diferenciación de las MSC.
Aún más, se divulga la utilización de la
integrina alfa10 y/o alfa11 según la invención para el aislamiento
in vitro de las MSC o de una población enriquecida de
MSC.
En los métodos y usos divulgados en la presente
invención, se divulgan MSC de mamífero, poblaciones de células de
mamífero y composiciones de células de mamífero.
En modos de realización específicos, el mamífero
puede ser un humano.
Se incluyen otros modos de realización
adicionales en los que el mamífero es un roedor, como, por ejemplo,
una rata, un ratón o cualquier otro miembro de la familia
Muridae.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
El objetivo de este ejemplo es analizar MSC
humanas para tratar de identificar la expresión de integrina alfa10
y alfa11 mediante inmunoprecipitación.
Se cultivaron células madre mesenquimales
humanas(obtenidas de In Vitro, Suecia, en pasaje 2) en
un medio MSCBM (proporcionado por In Vitro, Suecia) hasta el
pasaje 4 y, a continuación, sus superficies se sometieron a
biotinilación.
De forma breve, las células que se adhirieron a
la placa se lavaron una vez con PBS y, a continuación, sus
superficies se sometieron a biotinilación utilizando
Sulfo-NHS-LC-biotina
(Pierce) a 0,5 mg/ml en 4 ml de PBS durante 20 min. A continuación,
las células se lavaron una vez con PBS y se añadieron 10 ml de
glicina 0,1M/PBS durante 5 min.
Después de lavarlas una vez con PBS, las células
se lisaron en 1 ml de tampón de lisis (NP40 al 1%, glicerol al 10%,
Tris/HCl 20 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, CaCl_{2} 1 mM,
cóctel BM inhibidor de la proteasa de MO, pH 7,5). El lisado
celular se recogió mediante un raspador de plástico, se pipeteó en
un tubo Eppendorf y se sometió a rotación durante 10 min a 15.000
g.
El sobrenadante recogido de la etapa de
centrifugación anterior se incubó con 2 microlitros de suero
preinmune de alfa10 y, a continuación, se añadieron 20 \mul de
Proteína G sefarosa (Amersham) en 100 \mul de tampón de
lisis.
Después de someter a rotación las células a
rotación en el tampón de lisado durante toda la noche a 4ºC, se
centrifugó el lisado durante 1 min a 8000 rpm y se recogió el
sobrenadante. Para cada inmunoprecipitación ulterior, se pipetearon
150 \mul de lisado celular en un tubo Eppendorf y se añadió 1
\mul de antisuero. Los sueros utilizados fueron a10 de conejo
anti-humano y a11 de conejo
anti-humano, respectivamente (ambos sueros contra
los dominios citoplasmáticos de las integrinas).
Tras 1 hora en rotación a 4ºC, se añadieron 20
\mul de proteína G sefarosa (Amersham) en 100 \mul de tampón de
lisis y se continuó rotando la mezcla durante otros 30 min.
A continuación, los gránulos de sefarosa se
sometieron brevemente a rotación y se lavaron tres veces con tampón
de lisis.
Se añadieron 20 \mul de tampón de muestra
PAGE-SDS (incluyendo DTT 100 mM) a los gránulos de
sefarosa y, a continuación, las muestras se hirvieron durante 5
min. Se procesaron 5 \mul de cada muestra sobre un gel
PAGE-SDS (Novex) al 8% y, a continuación, se
electrotransfirieron a una membrana PVDF.
La membrana se bloqueó en BSA al 2%/TBST (TBST:
Tris/HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,05%) durante 1
hora, se lavaron una vez con TBST y, después, se incubaron con 2
\mul de ExtrAvidina-peroxidasa (Sigma) en 8 ml de
tampón bloqueante.
Después de 1 hora se eliminó la solución de
ExtrAvidina-peroxidasa y se lavó la membrana
3\times20 min en TBST. A continuación, se detectaron las
proteínas biotiniladas de la superficie con ECL (Amersham) y se
visualizaron sobre una película fotográfica.
En la figura 2 se muestra el resultado de la
inmunoprecipitación. Las células madre mesenquimales humanas en
cultivo expresan ambas integrinas alfa10 y alfa11 en su superficie.
En la figura, la banda superior es alfa10 (en la columna izquierda)
y alfa11 (en la columna derecha). La banda inferior en ambas
columnas representa la cadena beta1.
Se identifica la expresión de ambas integrinas,
alfa10 y alfa11.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
El objetivo de este ejemplo es utilizar
anticuerpos contra alfa10 y alfa11 para identificar y diferenciar
entre células HEK293 que expresan la integrina alfa10beta1 y la
integrina alfa11beta1.
Se tripsinizaron células HEK293 transfectadas
con integrina alfa10 y alfa11, así como células HEK293 no
transfectadas, se lavaron con PBS y, a continuación, se incubaron
durante 20 min con anticuerpos de integrina contra alfa10 y alfa11
(1 \mug/ml en PBS suplementado con BSA al 1%).
Las células etiquetadas se lavaron dos veces con
PBS/BSA al 1% y, a continuación, se incubaron durante 20 min con
Ig-PE de cabra anti-ratón
(Pharmingen, BD Biosciences) a una concentración de 1 \mug/ml en
PBS/BSA al 1%.
Posteriormente, las células se lavaron dos veces
en PBS/BAS al 1% y se analizaron en un FACSort®
(Becton-Dickinson) capturándose 10.000 eventos con
el programa de software Cell Quest®
(Becton-Dickinson).
En la figura 3A-I se muestran en
forma de histogramas los resultados tras en análisis FACS.
En las determinaciones FACS, el anticuerpo
contra alfa10 unido a las células HEK293 transfectadas con la
subunidad de integrina alfa10 humana se muestra en la figura 3E. Se
observó como un desplazamiento hacia la derecha en el histograma
FACS.
El anticuerpo contra alfa10 no se unió a las
células HEK293 transfectadas con la subunidad de integrina alfa11
humana, como se muestra en el panel central (figura 3F, a la
derecha), ni a las células HEK293 no transfectadas, como se muestra
en la figura 3D.
De modo análogo, el anticuerpo contra alfa11
unido a las células HEK293 transfectadas con la subunidad de
integrina alfa11 humana se muestra en la figura 3I. Se observó como
un desplazamiento hacia la derecha en el histograma FACS. El
anticuerpo contra alfa11 no se unió a las células HEK293
transfectadas con la subunidad de integrina alfa10 humana, como se
muestra en la figura 3H, ni a las células HEK293 no transfectadas,
como se muestra en la figura 3G.
La figura 3A-C representa el
control (el segundo anticuerpo secundario solo), que no se unió a
ninguna de las células HEK293 del ensayo.
En resumen, la figura 3A-I
muestra que las células HEK293 que expresan la integrina alfa10beta1
y la integrina alfa11beta1 se pueden separar de forma específica
mediante una determinación FACS utilizando anticuerpos dirigidos
contra estas integrinas.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
3
Comprobar si las células humanas que forman
colonias, obtenidas a partir de médula ósea humana, expresan la
integrina alfa10 y representan una población de células madre
mesenquimales.
Se aislaron células de médula ósea mononucleares
humanas a partir de médula ósea mediante centrifugación en
gradiente de densidad.
Se transportaron a un frasco de cultivo T75
3\times10^{6} células en 20 ml de un medio (medio MSCGM
proporcionado por Poietics y entregado a través de In vitro,
que comprendía 440 ml de MSCBM (lote 017190), 2\times25 ml de
MCGS (lote 082295), L-glutamina y
Penicilina/Estreptomicina) y se incubaron en el incubador
celular.
Las células se dejaron proliferar hasta el 12º
día (el medio se cambió dos veces) y, a continuación, se sometieron
a tripsinización y se disgregaron (5000 células/cm^{2}). En
general, las células se disgregaron a una confluencia del 90%.
Las células se dejaron proliferar durante otros
3 días y, a continuación, se disgregaron de nuevo (5000
células/cm^{2}). En este punto se analizó la influencia del
FGF-2 sobre la expresión de alfa10 sobre las MSC
humanas: una placa se dejó proliferar en un medio como el anterior
y otra placa se dejó proliferar en el mismo medio +5 ng/ml de
FGF-2. Tras dos semanas en cultivo con o sin
FGF-2 (incluyendo un pasaje) se analizaron las
células mediante FACS utilizando un anticuerpo monoclonal contra
alfa10 como medio para analizar las células.
Los resultados se muestran en la figura 4 en
forma de histogramas de la citometría de flujo.
Tras dos semanas de tratamiento con
FGF-2, el 96% de las células tratadas con
FGF-2 expresaron la integrina alfa10 (figura 4b,
panel inferior).
El control (segundo anticuerpo secundario solo)
se muestra en el panel superior de la figura 4a. Se comprobó si las
células tenían no marcadores de las MSC (CD34 y CD45) y el resultado
fue negativo (no se muestran los resultados).
También se estudió la morfología de las células
y la microscopia óptica reveló que las células formaron colonias
típicas de las MSC.
Claims (13)
1. Utilización de un marcador que comprende una
cadena de integrina alfa10, o una cadena de integrina alfa10 y una
cadena de integrina alfa11, expresadas sobre la superficie de una
célula madre mesenquimal o en el interior de una célula madre
mesenquimal como marcador para células madre mesenquimales in
vitro.
2. Utilización según la reivindicación 1, en
donde la cadena de integrina alfa10, o la cadena de integrina alfa10
y la cadena de integrina alfa11, se expresa(n) como
un(os) heterodímero(s) en combinación con una cadena
de integrina beta1.
3. Un método para identificar una célula madre
mesenquimal in vitro, método que comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar una muestra que comprenda una célula madre mesenquimal,
- b)
- detectar la expresión de la cadena de integrina alfa10, o de las cadenas de integrina alfa 10 y alfa11, en la superficie celular de una célula madre mesenquimal, o en el interior de una célula madre mesenquimal,
- c)
- calificar la expresión de la cadena de integrina alfa10, o de las cadenas de integrina alfa 10 y alfa11, y
- d)
- identificar la célula madre mesenquimal en función de su calificación en el apartado c) anterior.
4. El método según la reivindicación 3, en donde
la expresión del apartado b) anterior se identifica mediante la
detección de la expresión de la proteína de la cadena de integrina
alfa10, o de las cadenas de integrina alfa 10 y alfa11.
5. El método según la reivindicación 3, en donde
la expresión del apartado b) anterior se identifica mediante la
detección de la expresión del ARNm de la integrina alfa10, o de la
integrina alfa 10 e integrina alfa11.
6. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 3-4, en donde la expresión del
apartado b) anterior se detecta mediante un ensayo
inmunológico.
7. Un método para determinar si un compuesto de
ensayo modula la diferenciación in vitro de una célula madre
mesenquimal de mamífero, método que comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar una célula madre mesenquimal que exprese la integrina alfa10, o la integrina alfa10 y la integrina alfa11.
- b)
- poner en contacto la célula madre mesenquimal con un compuesto de ensayo, y
- c)
- detectar un cambio en la tasa o el patrón de diferenciación de la célula madre mesenquimal como indicación de que el compuesto de ensayo modula la diferenciación de una célula madre mesenquimal,
en donde la tasa o el patrón de
diferenciación se identifican mediante la detección de la expresión
de la cadena de integrina alfa10, o integrina alfa10 e integrina
alfa11, sobre la superficie celular de dicha célula madre
mesenquimal, o en el interior de una célula madre mesenquimal, según
el método de cualquiera de las reivindicaciones
3-6.
8. Un método para producir una población aislada
de células de mamífero in vitro enriquecida en células madre
mesenquimales en relación con una población de referencia, método
que comprende los pasos de:
- a)
- proporcionar al menos una porción de una población de células, o una porción de una población de referencia, que comprenda una célula madre mesenquimal y al menos una célula que no sea una célula madre mesenquimal,
- b)
- introducir en la población de células del apartado a) anterior un compuesto que identifique una cadena de integrina alfa10, o una cadena de integrina alfa10 e integrina alfa11, expresada sobre la superficie celular de una célula madre mesenquimal, o en el interior de una célula madre mesenquimal,
- c)
- seleccionar y aislar de la población de células del apartado b) anterior las células madre mesenquimales, dando lugar de este modo a una población de células enriquecida en células madre mesenquimales.
9. El método según la reivindicación 8, en el
que las células madre mesenquimales se identifican como células
madre mesenquimales mediante la detección de la expresión de la
cadena de integrina alfa10, o de integrina alfa10 y alfa11, sobre
la superficie celular de dichas células madre mesenquimales según el
método de cualquiera de las reivindicaciones
3-6.
10. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 8-9, en el que la selección del
apartado c) anterior se realiza mediante separación de células
activada por fluorescencia.
11. Utilización de un marcador según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, para la identificación
in vitro de una célula madre mesenquimal de mamífero.
12. Utilización de un marcador según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, para la modulación de
la diferenciación in vitro de una célula madre mesenquimal
de mamífero.
13. Utilización de un marcador según cualquiera
de las reivindicaciones 1-2, para el aislamiento
in vitro de una célula madre mesenquimal de mamífero.
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