ES2908586T3

ES2908586T3 - Marcador para células madre neurales

Info

Publication number: ES2908586T3
Application number: ES17754708T
Authority: ES
Inventors: Åkerlund Evy Lundgren; Masoumi Katarzyna Chmielarska
Original assignee: Xintela AB
Current assignee: Xintela AB
Priority date: 2016-08-17
Filing date: 2017-08-17
Publication date: 2022-05-03
Anticipated expiration: 2037-08-17
Also published as: EP3500859A1; SG11201900663UA; ZA201900567B; AU2017314151B2; JP2022091876A; CN109844533A; AU2017314151A1; CA3032343A1; KR20190039965A; CN109844533B; IL264342B2; KR102424170B1; MX2019001946A; JP2019533429A; IL264342B1; BR112019003147A2; JP7098602B2; EP3500859B1; DK3500859T3; US20190369093A1

Abstract

Uso in vitro de un marcador que comprende una subunidad de integrina alfa10 expresada por una célula neural como marcador para células madre neurales de mamífero y células progenitoras neurales de mamífero, donde la subunidad de integrina alfa 10 se expresa en la superficie celular de la célula madre neural y/o célula progenitora neural de mamífero.

Description

DESCRIPCIÓN

Marcador Para Células Madre Neurales

Campo técnico

La presente divulgación se refiere a un marcador para la identificación y el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neurales de mamíferos, así como a usos del mismo para preparar poblaciones celulares enriquecidas de células madre neurales y células progenitoras neurales. La divulgación se refiere además al uso de células madre neurales, células progenitoras neurales y células madre mesenquimales para tratar enfermedades y daños, así como para prevenir y proteger del daño del sistema nervioso. Además, la divulgación se refiere al uso del marcador para detectar y diagnosticar el daño y como marcador de pronóstico.

Antecedentes

Las estructuras complejas y delicadas que componen el sistema nervioso, el cerebro, la médula espinal y los nervios periféricos, son susceptibles a diversos tipos de lesiones que van desde traumatismos hasta enfermedades neurodegenerativas que provocan un deterioro progresivo. Desgraciadamente, se produce muy poca regeneración, reparación o curación espontánea después de las lesiones. Por lo tanto, el daño cerebral, la parálisis debido a una lesión de la médula espinal y el daño a los nervios periféricos suelen ser permanentes e incapacitantes. Los pacientes con lesiones graves del sistema nervioso o accidente cerebrovascular a menudo requieren asistencia de por vida. El accidente cerebrovascular se encuentra entre las causas más frecuentes de muerte y discapacidad en adultos, especialmente en países altamente desarrollados. Sin embargo, las opciones de tratamiento hasta la fecha son muy limitadas. Por tanto, se requieren nuevas estrategias innovadoras para avanzar en el tratamiento de lesiones neurológicas y accidente cerebrovascular.

Las células madre neurales (CMN) son células del sistema nervioso central (SNC) con capacidad para proliferar, autorrenovarse y generar un gran número de progenitores tanto de neuronas como de glía. Durante el proceso de neurogénesis adulta, las CMN pasan por numerosas etapas, incluida la autorrenovación de las CMN, los progenitores amplificadores transitorios, los neuroblastos y las neuronas, astrocitos y oligodendrocitos con madurez terminal (Gage FH y Temple S., 2013). Se han identificado CMN en casi todas las regiones del SNC embrionario de ratón, rata y humano. En el SNC adulto, se ha mostrado que las células madre neurales y las células progenitoras neurales contribuyen a la neurogénesis en nichos especializados de células madre. Por lo tanto, las CMN son útiles para la regeneración del tejido nervioso después de enfermedad y daño.

Las células madre neurales (CMN) y las células progenitoras (CPN) tienen la capacidad de formar todos los principales tipos de células del sistema nervioso central, lo que las convierte en candidatas para terapias basadas en células en lesiones cerebrales y trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, dos razones han dificultado el desarrollo de terapias celulares para aplicaciones clínicas. Una es la dificultad de aislar CMN de tejidos humanos y expandir las células en cantidades suficientes para la terapia. La otra es la incapacidad de purificar las CMN de tipos de células más diferenciadas y otras células contaminantes. Los marcadores celulares específicos de células madre neurales/células progenitoras neurales (CMN) son por lo tanto fundamentales para la identificación, el aislamiento y la selección de CMN humanas para aplicaciones terapéuticas.

Se han usado varios marcadores a lo largo de los años para identificar diferentes tipos de células y etapas de diferenciación:

Sox2 (secuencia 2 de SRY), un miembro de la familia Sox de factores de transcripción, y nestina, una proteína de filamento intracelular, se utilizan con frecuencia como marcadores de CMN tanto en el cerebro embrionario como en el adulto. Sin embargo, dado que ambos marcadores se encuentran intracelularmente, no pueden usarse fácilmente para aislar y seleccionar CMN funcionales.

PSA-NCAM, la molécula de adhesión de células neurales polisialiladas, se expresa en gran medida en las células progenitoras neurales durante el desarrollo del cerebro. Sin embargo, también se encuentra en células neurales diferenciadas (Kim HS et al. 2014; Butenschon J et al. 2016).

GFAP, la proteína ácida fibrilar glial, una proteína de filamento intermedio, se encuentra en las células progenitoras neurales, pero también se considera sobre todo como la principal proteína de filamento intermedio en astrocitos maduros (Zhang QB et al. 2006).

CD133 (prominina-1) está presente en diferentes tipos de células madre, incluidas las CMN, pero también se expresa en células diferenciadas (Kania G, Corbeil D, Fuchs J et al. 2005; Zhang QB et al. 2006).

PDGFR-a se encuentra en todo el SNC adulto y se distribuye uniformemente a lo largo de la pared ventricular (Chojnacki et al. 2011). Dentro de la zona subventricular adulta (ZSV), se ha descubierto que PDGFR-a marca una población específica de células que son células madre neurales de tipo B (Jackson et al. 2006) y que generan sobre todo oligodendrocitos (Chojnacki et al. 2011). Los estudios sugieren que PDGFR-a regula el equilibrio entre la producción neuronal y oligodendrocítica (Farahani y Xaymardan 2015). Por tanto, PDGFR-a se expresa en algunas células neurales diferenciadas, pero se encuentra principalmente en progenitores de oligodendrocitos.

Musashi-1 (Msi-1), una proteína de unión a ARN, se expresa supuestamente en células madre y progenitoras del SNC donde regula la proliferación y el mantenimiento (para una revisión, véase MacNicol et al. 2008). Sin embargo, se localiza en el citoplasma y el núcleo de las células, es decir, intracelularmente, y por tanto no puede usarse fácilmente para aislar y seleccionar CMN funcionales.

CD24 es una molécula de adhesión celular que se encuentra en las células inmunitarias y en las células del SNC. En el cerebro, CD24 se encuentra dentro de las zonas neurogénicas en el ratón adulto joven y se localiza conjuntamente con PSA-NCAM, por lo que se reconoce como un marcador de neuroblastos (CMN de tipo A) (Calaora et al. 1996). Se ha usado para aislar CMN del cerebro de ratón mediante citometría de flujo (Rietze et al. 2001; Panchision et al.

2009) y en combinación con otros marcadores de superficie celular (tales como CD15 y CD29) se usa para enriquecer cultivos neuronales (Pruszak et al. 2009). Sin embargo, dado que los niveles de CD24 aumentan con la maduración de las células neuronales, también se considera un marcador de diferenciación neuronal temprana (Pruszak et al.

2009).

LeX, también conocido como SSEA-1 o CD15, es un marcador de células neuroepiteliales inmaduras que recubren los ventrículos en el SNC adulto y de neuronas postmitóticas en diferenciación (Calaora et al. 1996; Capela y Temple, 2002). Si bien su expresión se superpone con GFAP, solo unas pocas (4 %) células aisladas de la ZSV son positivas para LeX. El hecho de que las células de la ZSV excreten LeX en el nicho extracelular puede explicar tales niveles bajos de LeX libre. Además, LeX se expresa en células de tipo B y C de la ZSV de ratón adulto, pero no en células de tipo A (neuroblastos) (Capela y Temple, 2006).

La vimentina es una de las principales proteínas de filamento intermedio que se expresa principalmente en la glía radial y los astrocitos inmaduros durante el desarrollo temprano del cerebro.

La tubulina p-III o Tuj1 es un marcador de filamento intracelular de neuronas inmaduras. Participa en la guía y el mantenimiento de los axones.

Además, el documento WO 02/086082 se refiere a marcadores para células madre neurales y divulga cultivos celulares de células madre o progenitoras neurales que se han aislado usando gangliósidos como marcadores.

Finalmente, algunos miembros de la familia de las integrinas han sido sugeridos como marcadores de las células madre neurales humanas, incluidas algunas integrinas de la subfamilia p1 que consta de 12 integrinas diferentes donde diferentes subunidades a se combinan con la integrina p1 para formar receptores únicos con diferentes funciones La subunidad p1 de la integrina se ha usado para seleccionar CMN del tejido cerebral fetal; sin embargo, la selección basada en la subunidad p1 no es específica porque las integrinas de la subfamilia p1 están presentes en la mayoría de las células, incluidas las células diferenciadas. No está claro cuál de las integrinas a en las CMN se asocia con p1. La expresión de a2, a3, a5, a6 y a7 se ha detectado en CMN (Flanagan et al., 2006), pero estas integrinas también están presentes en una variedad de tipos de células. Hall PE et al. (2006) sugirieron usar el dímero integrina a6p1 como un posible marcador de CMN humanas. Esta integrina es un receptor de lamininas vasculares y se sabe que desempeña un papel en la adhesión y activación de las plaquetas y la trombosis arterial.

En conclusión, existe una necesidad insatisfecha de marcadores específicos adecuados para la identificación y el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neurales.

Resumen

La integrina a10p1 es un receptor de unión a colágeno tipo II que se encuentra en los condrocitos (Camper et al., 1998). La integrina a10p1 es una integrina importante de unión a colágeno en los condrocitos que se expresa en gran medida en el cartílago, tanto durante el desarrollo como en los tejidos adultos (Camper et al., 2001). La integrina a10p1 también se expresa en células madre mesenquimales (CMM) (Varas et al., 2007). Además, se ha mostrado que el factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2) regula positivamente la expresión de la integrina a10p1 y mejora el potencial condrogénico de las CMM (Varas et al., 2007). Bengtsson et al (2005) demostraron que los ratones que carecen de la integrina a10p1 tienen defectos en la placa de crecimiento cartilaginosa y, como consecuencia, desarrollan un retraso en el crecimiento de los huesos largos. Un estudio reciente reveló que una mutación de origen natural en el gen de la integrina a10 canina es responsable de la condrodisplasia en las razas de perros de caza (Kyoostila et al., 2013), lo que respalda el papel fundamental de a10p1 en el desarrollo del esqueleto.

Los presentes inventores han detectado sorprendentemente la expresión del heterodímero de integrina a10p1 en células madre neurales y células progenitoras neurales derivadas de tejido neural, y divulgan en el presente documento su uso como marcador selectivo para la identificación y aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neurales de mamíferos. A diferencia de los marcadores de superficie de CMN mencionados anteriormente, la integrina a10p1 está presente en los tres tipos celulares de CMN/CPN del nicho de células madre de ZSV de ratón adulto (véase la tabla 1 a continuación), como se muestra en los estudios de colocalización (Figuras 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11 y 12), lo que sugiere que la integrina a10p1 es un marcador más amplio de células madre y progenitoras, en comparación con otros marcadores conocidos, que cubre los diferentes subtipos del nicho de células madre cerebrales.

Tabla 1. Tipos de células de ZSV de ratón adulto identificados por marcadores de superficie de CMN. Tipo A: neuroblastos, que darán lugar a neuronas maduras; Tipo B: células madre, células astrogliales, adyacentes a una capa de células ependimales (células E); Tipo C: células amplificadoras transitorias.

Un aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un marcador que comprende una subunidad de integrina alfa 10 expresada por una célula madre neural y/o una célula progenitora neural como marcador para células madre neurales de mamíferos y células progenitoras neurales de mamíferos.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para identificar una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero, comprendiendo el procedimiento las etapas de: a) detectar la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula comprendida en una muestra que comprende tejido neural,

b) puntuar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de b), y

c) identificar la célula madre neural de mamífero y/o la célula progenitora neural según la puntuación en b).

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para aislar una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) detectar la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula comprendida en una muestra que comprende tejido neural,

b) puntuar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de b), y

c) seleccionar la célula madre neural de mamífero y/o la célula progenitora neural según la puntuación en b).

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar si un compuesto de prueba modula la diferenciación de una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero in vitro, comprendiendo el procedimiento las etapas de

a) proporcionar una célula madre neural y/o una célula progenitora neural que expresa la subunidad de integrina alfa10,

b) poner en contacto la célula madre neural y/o la célula progenitora neural con un compuesto de prueba, y c) detectar un cambio en la tasa o patrón de diferenciación de la célula madre neural y/o célula progenitora neural como una indicación de que el compuesto de prueba modula la diferenciación de una célula madre neural y/o una célula progenitora neural,donde la tasa o patrón de diferenciación se determina detectando la expresión de integrina alfa10 por la célula según el procedimiento descrito en el presente documento.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para fabricar in vitro una población aislada de células de mamíferos que están enriquecidas en células madre neurales y/o células progenitoras neurales con respecto a una población de referencia, comprendiendo el procedimiento las etapas de

a) proporcionar al menos una parte de una población de células del SNC, o una parte de una población de referencia, que comprende una célula madre neural y/o una célula progenitora neural,

b) introducir en la población de células de a) anterior un compuesto que identifica una subunidad de integrina alfa10 expresada por la célula madre neural y/o la célula progenitora neural,

c) seleccionar y aislar de la población de células en b) anterior las células madre neurales y/o las células progenitoras neurales,

produciendo así una población de células enriquecidas en células madre neurales y/o células progenitoras neurales.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un cultivo celular in vitro de células de mamífero indiferenciadas que expresan una subunidad de integrina alfa10, donde las células derivan de tejido neural y donde

a) las células en el cultivo tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas y/u oligodendrocitos y/o astrocitos cuando se diferencian en un medio de cultivo sustancialmente libre tanto de suero como de un factor de crecimiento inductor de proliferación;

b) la célula en cultivo prolifera en un medio de cultivo que contiene un reemplazo de suero tal como B27 y al menos un factor de crecimiento inductor de proliferación;

c) las células en el cultivo se diferencian en neuronas y/u oligodendrocitos y/o astrocitos tras la retirada tanto del reemplazo de suero B27 como del factor de crecimiento inductor de proliferación.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un cultivo celular in vitro que comprende

a) un medio de cultivo que contiene un reemplazo de suero tal como B27 y al menos un factor de crecimiento inductor de proliferación; y

b) células de mamífero indiferenciadas derivadas del sistema nervioso central de un mamífero, donde al menos un 30 %, por ejemplo, al menos un 40 %, por ejemplo, al menos un 50 %, por ejemplo, al menos un 60 %, por ejemplo, al menos un 70 %, por ejemplo, al menos un 80 %, por ejemplo, al menos un 90 %, por ejemplo, al menos un 95 % de las células expresan una subunidad de integrina alfa10.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un cultivo en suspensión de células indiferenciadas de mamíferos que expresan una subunidad de integrina alfa10, donde dichas células se forman sustancialmente en agregados celulares y donde los agregados celulares se mantienen en un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento inductor de proliferación.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar enfermedades o daños en el sistema nervioso y/o prevenir y proteger del daño del SNC en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos, donde las células expresan una subunidad de integrina alfa10; b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales al sujeto,

tratando así la enfermedad o el daño y/o previniendo y protegiendo del daño del sistema nervioso central.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar un trastorno mental y del comportamiento en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos, donde las células expresan una subunidad de integrina alfa10; b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales al sujeto,

tratando así los trastornos neurológicos con síntomas psiquiátricos.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar enfermedades o daños en el sistema nervioso y/o prevenir y proteger del daño del SNC en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento: a) proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales de mamíferos, donde las células expresan la subunidad de integrina alfa10;

b) administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células madre mesenquimales de mamífero,

a) proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células madre mesenquimales de mamíferos, donde las células expresan la subunidad de integrina alfa10;

tratando así los trastornos neurológicos con síntomas psiquiátricos.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un marcador para células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos, que comprende una subunidad de la cadena de integrina alfa10 expresada por la célula madre neural y/o células progenitoras neurales, para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad o daño y/o prevenir y proteger del daño del sistema nervioso y/o tratar un trastorno mental y del comportamiento.

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a una composición que comprende una población aislada de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos que expresan una subunidad de integrina alfa10 para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades o daños del sistema nervioso y/o un trastorno mental y del comportamiento.

Descripción de los dibujos

Figura 1. La integrina a10p1 se expresa por una subpoblación de células aisladas de la zona subventricular del cerebro de un ratón adulto.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 en células aisladas de la zona subventricular del cerebro de un ratón adulto, evaluada mediante citometría de flujo. Análisis de células no teñidas (A). Las células se tiñeron con un anticuerpo monoclonal dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (B) y con un anticuerpo IgG2a de ratón de control (C) y posteriormente se analizó el porcentaje de células positivas. Los resultados muestran que una subpoblación de células aisladas expresa la integrina a10p1.

Figura 2. La integrina a10p1 se expresa por una subpoblación de células aisladas de la zona subventricular y cultivadas como neuroesferas o como monocapa.La figura muestra la expresión de integrina a10p1, PDFGRa, Lex y CD24 por células cultivadas como una monocapa (A-D) y neuroesferas (E-H) evaluado mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron con un anticuerpo monoclonal dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (A, E), un anticuerpo monoclonal dirigido a PDFGRa (B, F), un anticuerpo dirigido a CD24 (C, G) y un anticuerpo dirigido a Lex (D, H) y se analizó el porcentaje de células positivas por citometría de flujo. Los resultados muestran que una subpoblación de células cultivadas en monocapa o como neuroesferas expresa integrina a10p1, PDGFRa, Lex y CD24.

Figura 3. Las neuroesferas expresan la integrina a10p1 y otros marcadores de células madre neurales/progenitoras neurales.

La figura muestra el inmunomarcaje doble de células en neuroesferas, aisladas de la ZSV de ratones e inmunoteñidas para integrina a10p1 y otros marcadores de células madre neurales/progenitoras neurales. Se visualizaron las tinciones y se adquirieron las imágenes mediante microscopía confocal. Toda la neuroesfera muestra expresión tanto de a10 como de los marcadores de células madre/progenitoras neurales nestina (A), PDGFRa (B), GFAP (C), PSA-NCAM (D), vimentina (E). De acuerdo con la composición celular de la ZSV in vivo (Doetsch et al. 1997), las neuroesferas in vitro también muestran una baja abundancia de células de tipo C, como lo demuestra la tinción con Olig2 (F).

Figura 4. Las células madre/progenitoras neurales aisladas de la ZSV y cultivadas en condiciones de células madre conservan su potencial para diferenciarse en células neuronales y gliales. Las células madre/progenitoras neurales se diferenciaron y se midió la expresión de genes neuronales (Map2, ¡5- III Tub) y gliales (Gfap, O4). Se usó Gapdh como gen constitutivo para la normalización. La expresión génica se expresa como media ± error estándar de la media (EEM) de muestras por triplicado.

Figura 5. La integrina a10p1 se expresa por células de la zona subventricular (ZSV) del cerebro de ratón adulto.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 en la ZSV de tejido de ratón adulto evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. El tejido cerebral se tiñó con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (A) y DAPI para visualizar el ADN del núcleo celular (B). En C se muestra una imagen compuesta de A y B.

Figura 6. La integrina a10p1 y el marcador de células madre/progenitoras neurales nestina se colocalizan parcialmente en la zona subventricular (ZSV) del cerebro de ratón adulto.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 y nestina en la ZSV de tejido de ratón adulto evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. El tejido cerebral se tiñó con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (A), un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a la nestina (B) y DAPI para visualizar el ADN del núcleo celular (C).

Figura 7. La integrina a10p1 y el marcador de neuroblastos PSA-NCAM se colocalizan en las células de la zona subventricular (ZSV) del cerebro de ratón adulto.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 y PSA-NCAM en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. El tejido cerebral se tiñó con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (C), un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a PSA-NCAM (B) y DAPI para visualizar el ADN del núcleo celular (A). En D se muestra una imagen compuesta de A, B y C.

Figura 8. La integrina a10p1 y el marcador de células gliales GFAP se colocalizan en las células de la zona subventricular (ZSV) en el cerebro de ratón adulto.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 y GFAP en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. El tejido cerebral se tiñó con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (A) y un anticuerpo policlonal de cabra dirigido a GFAP (B). En C se muestra una imagen compuesta de A y B.

Figura 9. La integrina a10p1 y el marcador de células madre neurales SOX2 se colocalizan en las células de la zona subventricular (ZSV) en el cerebro de ratón recién nacido.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 y el marcador de células madre neurales SOX2 en la ZSV de tejido cerebral de ratón recién nacido evaluado mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía de epifluorescencia. Se tiñó tejido cerebral con DAPI para visualizar el ADN del núcleo celular (A), un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a SOX2 (B) y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa 10 (C). En D se muestra una imagen compuesta de A, B y C.

Figura 10. La integrina a10p1 y PDFGRa colocalizan en una subpoblación de células aisladas de la zona subventricular en el cerebro de ratón adulto.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 en células aisladas de la zona subventricular del cerebro de ratón adulto, evaluada mediante citometría de flujo. Las células se tiñeron con un anticuerpo monoclonal dirigido a la subunidad de integrina alfa10 (A) y con un anticuerpo monoclonal dirigido a PDFGRa (B) y se analizó el porcentaje de células positivas. El análisis de citometría de flujo demuestra que una subpoblación de células aisladas expresa tanto la integrina a10p1 como PDFGRa (C).

Figura 11. La integrina a10p1 se expresa en la zona subgranular (ZSG) del hipocampo en el cerebro de ratón recién nacido y se colocaliza con el marcador de células madre neurales SOX2.La figura muestra la expresión de la integrina a10p1 y el marcador de células madre neurales SOX2 en la ZSG de tejido cerebral de ratón recién nacido, evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía de epifluorescencia. Se tiñó tejido cerebral con DAPI para visualizar el ADN del núcleo celular (A), un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido a SOX2 (B) y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa 10 (C). En D se muestra una imagen compuesta de A, B y C.

Figura 12. La integrina a10p1 se expresa en las meninges del cerebro de ratón recién nacido y se colocaliza parcialmente con PDGFRa, un marcador de células gliales/progenitores de oligodendrocitos.La figura muestra la expresión de integrina a10p1 y PDGFRa en las meninges del tejido cerebral de ratón recién nacido, evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía de epifluorescencia. Se tiñó tejido cerebral con DAPI para visualizar el ADN del núcleo celular (A), un anticuerpo monoclonal de cabra dirigido a PDGFRa (B) y un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa 10 (C). En D se muestra una imagen compuesta de A, B y C.

Figura 13. La integrina a10p1 se regula positivamente en el cerebro de ratón después de accidente cerebrovascular.La figura muestra una mayor expresión de la integrina a10p1 en el área de accidente cerebrovascular en comparación con el área intacta en el cerebro del ratón, evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía de epifluorescencia. El área de accidente cerebrovascular es el área a la derecha de la línea discontinua.

Figura 14. Expresión de integrina a10p1, marcador neuronal NeuN y marcador astrocítico GFAP.La figura muestra la expresión de integrina a10p1, NeuN, GFAP e Iba1 en el cerebro de ratón evaluada mediante tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal. El tejido cerebral se tiñó con un anticuerpo policlonal de conejo dirigido a la subunidad de integrina alfa10, un anticuerpo policlonal de cobaya dirigido a NeuN, un anticuerpo policlonal de cabra dirigido a GFAP e Iba1 (marcador microglial). Las imágenes compuestas del cerebro del ratón de control se muestran en A, D y la imagen compuesta del cerebro con accidente cerebrovascular con respecto a la expresión de la integrina a10p1 y NeuN (B y C), la expresión de la integrina a10p1 y GFAP (E y F) y la expresión de la integrina a10p1 y Iba1 (H e I), la colocalización se muestra mediante flechas. Los resultados muestran que la integrina a10p1 se colocaliza con una mayor expresión de NeuN y GFAP en neuronas y astrocitos respectivamente (respuesta regenerativa) pero no con el marcador microglial Iba1.

Definiciones

Como se usa en el presente documento, los términos "roedor" y "roedores" se refieren a todos los miembros del orden filogenético Rodentia.

"Alfa 10 de integrina" o "subunidad de integrina alfa 10", como se usa en el presente documento, se refiere a la subunidad alfa 10 de la proteína heterodimérica integrina alfa 10 beta 1. Esta denominación no excluye la presencia de la subunidad beta 1 unida a la subunidad alfa 10, formando por tanto la estructura cuaternaria del heterodímero de integrina alfa 10 beta 1.

"Anticuerpo anti-alfa 10 de integrina" o "anticuerpo anti-subunidad de integrina alfa 10" como se usa en el presente documento se refiere a un anticuerpo capaz de reconocer y unirse a al menos la subunidad alfa 10 de la proteína heterodimérica integrina alfa 10 beta 1. Estos anticuerpos pueden ser anticuerpos que reconozcan un epítopo de la proteína heterodimérica integrina alfa10 beta1, donde el epítopo comprende residuos de aminoácidos tanto de la subunidad alfa10 como de la beta1.

El término "identificar" como se usa en el presente documento se refiere a la acción de reconocer una célula como de un cierto tipo celular, por ejemplo, una célula madre neural o una célula progenitora neural. Un término alternativo a la identificación es "detectar", que se usa en el presente documento con el mismo significado. Una célula se identifica como una célula madre neural o una célula progenitora neural, por ejemplo, mediante la detección de la expresión de marcadores específicos por la célula.

Los términos "aislar", "clasificar" y "seleccionar" como se usan en el presente documento se refieren a la acción de identificar una célula como de un cierto tipo celular y separarla de las células que no pertenecen al mismo tipo celular o pertenecen a otro estado de diferenciación.

El término "puntuación", como se usa en el presente documento, se refiere a la puntuación de la expresión de la subunidad de integrina alfa10. La puntuación puede medir la expresión de la subunidad de integrina alfa10 mediante, por ejemplo, inmunoensayo, citometría de flujo, inmunofluorescencia, transferencia Western o inmunoprecipitación en la población de muestra y comparar la medición con una medición realizada en una población celular de referencia que expresa la subunidad de integrina alfa10, así como en una población celular que no expresa la subunidad de integrina alfa10. Son ejemplos de células de referencia que expresan alfa10 de integrina las células C2C12 y las células HEK293 transfectadas con secuencias de integrina. Son ejemplos de células de referencia que no expresan alfa10 las células C2C12 y células HEK293 no transfectadas.

El término "murino" se refiere a todos y cada uno de los miembros de la familia Muridae, incluidas ratas y ratones.

El término "sustancialmente libre de" en el presente documento pretende significar por debajo de los límites de detección del ensayo usado, pareciendo así negativo, es decir, libre de.

El término "comprometido" en el presente documento pretende significar dedicado a, o enfocado en. Por tanto, una célula comprometida es una célula dedicada a o enfocada en una ruta de diferenciación específica. De esto se deduce que una célula no comprometida no está dedicada a ni enfocada en ninguna vía de diferenciación específica y tiene varias opciones.

Por el término "sujeto" usado en el presente documento se entiende cualquier mamífero al que puedan administrarse las células madre neurales y/o células progenitoras neurales y/o células madre mesenquimales identificadas y/o aisladas según los procedimientos divulgados en el presente documento, que se basan en la detección de la expresión de integrina alfa10 en la superficie de las células o intracelular en las células. Los sujetos destinados específicamente para el tratamiento con el procedimiento de la divulgación incluyen humanos, así como primates no humanos, ovejas, caballos, vacas, cabras, cerdos, perros, gatos, conejos, cobayas, hámsters, jerbos, ratas y ratones, así como los órganos, tumores y células derivadas u originarias de estos hospedadores.

Descripción detallada

La invención se define por las reivindicaciones adjuntas. Cualquier realización que no se encuentre dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forma parte de la invención.

Integrina alfa10 como marcador de células madre neurales y células progenitoras neurales

Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que la integrina alfa10beta1 está presente en las células madre neurales humanas (CMN) y/o células progenitoras neurales (CPN). Por tanto, esta integrina se puede usar para identificar, seleccionar y aislar específicamente células madre neurales y células progenitoras neurales de una población celular mixta y será una herramienta útil en la terapia celular para reparar tejidos dañados, por ejemplo, como consecuencia de lesiones del sistema nervioso. o para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. En comparación con los marcadores de superficie de CMN mencionados anteriormente, la integrina a10p1 identifica los tres tipos de células de la ZSV de ratón adulto (véase la Tabla 1 anterior), lo que sugiere que la integrina a10p1 es un marcador de células madre y progenitoras más amplio, en comparación con otros marcadores conocidos, que cubre los diferentes subtipos celulares del nicho de células madre cerebrales.

La secuencia de la cadena de la integrina alfa10 humana es conocida y está disponible públicamente en GenBank™/número de acceso al Banco de Datos del EBI AF074015. Por tanto, en la presente divulgación se divulgan nuevos usos y procedimientos de la cadena de integrina alfa10.

Como se revela anteriormente, un aspecto de la presente divulgación se refiere al uso de un marcador que comprende una subunidad de integrina alfa 10 expresada por una célula madre neural y/o una célula progenitora neural como marcador para células madre neurales de mamíferos y células progenitoras neurales de mamíferos.

En una realización de la presente divulgación, la subunidad de integrina a10 se expresa como un heterodímero en combinación con una cadena de integrina betal.

En una realización de la presente divulgación, la subunidad de integrina alfa10 se expresa en la superficie celular de CMN y/o CPN de mamífero.

En una realización de la presente divulgación, la subunidad de integrina alfa10 se expresa intracelularmente en una CMN y/o CPN de mamífero.

Un procedimiento para identificar células madre neurales (CMN) y células progenitoras neurales (CPN)

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para identificar una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero. El procedimiento comprende las etapas de:

b) puntuar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de a), y

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento in vitro para aislar una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero. El procedimiento comprende las etapas de: a) detectar la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula comprendida en una muestra que comprende tejido neural,

b) puntuar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de a), y

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el procedimiento para identificar una CMN y/o CPN de mamífero y el procedimiento para aislar una CMN y/o CPN de mamífero comprende además la etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la subunidad de integrina alfa10, antes de detectar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de b).

Más detalladamente, los procedimientos para identificar y/o aislar células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamífero según la divulgación puede comprender además las etapas de:

e) proporcionar una suspensión celular que comprende CMN y/o CPN,

f) poner en contacto la suspensión celular en e) con un anticuerpo monoclonal o fragmentos del mismo que se une a la integrina alfa10beta1, en condiciones donde dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos del mismo forman un complejo anticuerpo-antígeno con el dominio extracelular de la integrina alfa10beta1,

g) separar las células que se unen a dicho anticuerpo monoclonal o fragmentos del mismo en f), produciendo así una población pura de CMN y/o CPN de mamífero.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, los procedimientos para identificar y/o aislar células madre neurales de mamífero y/o células progenitoras neural de mamífero según la divulgación pueden comprender además recuperar las células que se unen al anticuerpo monoclonal o fragmentos del mismo de dicho anticuerpo o fragmentos del mismo.

La suspensión celular proporcionada en e) anterior, que comprende CMN y/o CPN de mamífero, se puede aislar del tejido neural como se describe en detalle en la sección siguiente "Tejido neural".

En algunas realizaciones de la presente divulgación, los procedimientos para identificar y/o aislar células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamífero según la divulgación se realizan in vitro. Tejido neural

La principal fuente de CMN y CPN de mamífero es el tejido neural. De hecho, las CMN y CPN se encuentran en nichos en el sistema nervioso central (SNC) de mamíferos adultos o fetales y en el cerebro o la médula espinal de mamíferos adultos o fetales donde tiene lugar la neurogénesis.

El nicho de células madre neurales en el cerebro es un microambiente tisular capaz de albergar y mantener células progenitoras neurales. Hasta hace poco, solo se reconocían dos nichos cerebrales en los mamíferos, la zona subventricular (ZSV) del ventrículo anterolateral y la zona subgranular (ZSG) del giro dentado del hipocampo. Evidencias crecientes muestran neurogénesis y gliogénesis también en otras partes del cerebro adulto, particularmente después de una lesión, lo que sugiere que existen nichos de células madre adicionales en el cerebro adulto (Lin y lacovitti, 2015). Hace poco se mostró que las leptomeninges albergan un subconjunto de células que expresan marcadores de precursores neurales indiferenciados, proliferantes y diferenciadores que presentan nestina y SOX2 y este conjunto de células persiste en la edad adulta. Por tanto, las meninges pueden representar otro nicho funcional para los progenitores durante el desarrollo embrionario y en la edad adulta.

En consecuencia, en algunas realizaciones de la presente divulgación, el tejido neural comprende CMN y CPN. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tejido neural deriva del tejido cerebral.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tejido neural es tejido cerebral adulto.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tejido neural es tejido cerebral fetal.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tejido neural deriva o se obtiene de la zona subventricular (ZSV), la zona subgranular (ZSG) o las meninges de un mamífero.

Todos los mamíferos son adecuados para la obtención de tejido neural. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el tejido neural se selecciona del grupo que consiste en tejido neural humano, canino, equino, bovino, felino, murino, ovino o porcino. Se pueden obtener otros tejidos neurales de mamífero si es necesario.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, las CMN y CPN de mamífero son CMN y CPN humanas. En una realización adicional de la presente divulgación, las CMN y CPN de mamífero son CMN y CPN de murino.

Detección de la expresión de integrina alfa 10

Una etapa clave en el procedimiento para la identificación de una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero, así como para su aislamiento, es la detección de la expresión de la proteína integrina alfa10.

En una realización de la presente divulgación, la detección de la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula se determina mediante citometría de flujo. Por ejemplo, la expresión de alfa10 puede analizarse mediante citometría de flujo o cualquier otra metodología que tenga una alta especificidad. Se pueden emplear análisis multicolores con la citometría de flujo, lo cual es particularmente conveniente. Las CMN y/o CPN pueden, por tanto, separarse de otras células sobre la base del nivel de tinción para los antígenos particulares.

En una realización de la presente divulgación, la detección de la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula se determina midiendo la expresión de la proteína integrina alfa10. Por ejemplo, se pueden usar citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y/o transferencia Western.

En una realización de la presente divulgación, la detección de la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula se determina midiendo la expresión de ARNm de integrina alfa10. La detección de la expresión de ARNm de una proteína específica es bien conocida por el experto en la materia y generalmente se realiza sondeando el ARNm con una sonda de ADN o ARN específica para el ARNm de interés, en condiciones de hibridación en las que la sonda no hibrida con otras moléculas de ARNm. También se pueden usar diferentes reacciones en cadena de la polimerasa (PCR), lo cual es obvio para el experto en la materia.

A continuación se da un procedimiento PCR adecuado. En resumen, puede usarse la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El ARN se puede preparar a partir de células madre neurales humanas o células progenitoras neurales mediante procedimientos estándares, por ejemplo mediante el uso de RNeasy Mini Kit (Qiagen Alemania).

El ADNc se puede producir mediante la reacción de transcriptasa inversa, Superscript II (Invitrogen, EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante con cebadores oligo d(T) o cebadores específicos de genes.

Posteriormente se realiza PCR para amplificar el ADNc. Se añaden cebadores específicos para a10, 5'GCT CCA GGA AGG CCC CAT TTG TG 3' directo y 5'GTG TTT TCT TGA AGG GTG CCA TTT 3' inverso al ADNc y el producto específico se amplifica con la ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen , EE. UU.) según las recomendaciones del fabricante a 65 °C durante 40 ciclos.

El experto en la materia conoce varios procedimientos para la detección de la expresión de marcadores. Por consiguiente, en una realización de la presente divulgación, la detección de la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula se determina mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste en inmunoensayo, citometría de flujo, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación y transferencia Western.

En otra realización más de la presente divulgación, la expresión de la cadena de integrina alfa10 se detecta en la superficie celular de una CMN y/o de una CPN o intracelular en una CMN y/o en una CPN en el procedimiento según la divulgación. Se pueden usar los procedimientos dados anteriormente, por ejemplo, citometría de flujo e inmunoprecipitación. Preferiblemente se usa citometría de flujo.

En otra realización más de la presente divulgación, la expresión de la subunidad de integrina alfa10 se detecta mediante cualquier inmunoensayo, tal como los procedimientos descritos en Immunochemical protocols (Methods in molecular biology, Humana Press Inc). La detección se puede realizar mediante diversos procedimientos, por ejemplo, cualquier procedimiento inmunitario conocido por el experto en la materia, tal como inmunoprecipitación, transferencia Western, clasificación de células activada magnéticamente (MACS) o procedimientos de citometría de flujo, por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS).

Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente divulgación, la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula se detecta a través de un anticuerpo, donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo monocatenario o un fragmento del mismo.

Los anticuerpos, tales como los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, son particularmente útiles para identificar marcadores, proteínas de la superficie celular así como marcadores intracelulares, asociados con linajes celulares y/o etapas de diferenciación particulares. Por tanto, es adecuado para la identificación de la integrina alfa10.

En una realización de la presente divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.

En otra realización de la presente divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo no humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo biespecífico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.

Aún así, la identificación también puede ser realizada por cualquier molécula específica, tal como una proteína o un péptido, que se una específicamente a la molécula de integrina alfa10. Son ejemplos de tales proteínas o péptidos ligandos naturales que se unen a la molécula de integrina alfa10. Tales ligandos naturales pueden elaborarse de forma recombinante, sintetizarse químicamente o purificarse a partir de una fuente natural.

La detección se facilita cuando el anticuerpo, la proteína o el péptido que se une específicamente a la molécula de integrina alfa10 se une a un resto detectable.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, se usa un anticuerpo para la detección de la expresión de la subunidad alfa10 de la integrina y el anticuerpo se une covalentemente a un resto detectable, tal como un resto detectable seleccionado del grupo que consiste en un fluoróforo, una enzima o un trazador radiactivo o radioisótopo.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, el anticuerpo se une a un fluoróforo y el fluoróforo se selecciona del grupo que consiste en isotiocianato de fluoresceína, ficoeritrina y conjugados de ficoeritrina, aloficocianina y conjugados de aloficocianina, rojo de Texas y conjugados de Rojo de Texas, la serie de fluorocromos Alexa y la serie de fluorocromos Violeta brillante y Azul brillante.

Se pueden usar muchos otros fluoróforos y el experto en la materia elegirá el más adecuado según el procedimiento de detección específico y también según las características del anticuerpo usado.

En realizaciones adicionales de la presente divulgación, el anticuerpo tiene un isotipo seleccionado del grupo que consiste en IgA, IgD, IgG e IgM.

En aún más realizaciones preferidas de la presente divulgación, el anticuerpo es

a) un anticuerpo monoclonal, producido por la línea celular de hibridoma depositada en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de registro DSM ACC2583; o

b) un anticuerpo que compite por unirse al mismo epítopo que el epítopo unido por el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH con el número de registro DSM ACC2583; o

c) un fragmento de a) o b), donde dicho fragmento es capaz de unirse específicamente al dominio I extracelular de la cadena de la subunidad alfa 10 de la integrina.

La detección también puede facilitarse cuando el anticuerpo, proteína o péptido que se une específicamente a la molécula de integrina alfa10 se une a un soporte sólido. Por consiguiente, en una realización de la presente divulgación, se usa un anticuerpo para la detección de la expresión de la subunidad alfa10 de la integrina y el anticuerpo se fija a un soporte sólido.

Aislamiento y cultivo de CMN y CPN

El aislamiento de una célula madre neural de mamífero (CMN) y/o una célula progenitora neural de mamífero (CPN) según el procedimiento de la presente divulgación puede basarse en la capacidad de las células para adherirse a placas de cultivo de plástico y formar colonias en condiciones de cultivo específicas. El protocolo adecuado para el aislamiento de células madre neurales y células progenitoras neurales de mamífero, sin incluir el marcador según la divulgación, se da con más detalle en Giachino et al. 2009, Guo W et al., (2012) y Oliver-De la Cruz y Ayuso-Sacido (2012). Por tanto, se pueden usar procedimientos conocidos, pero con la introducción del marcador según la divulgación.

Los procedimientos de separación pueden incluir la separación magnética, usando, por ejemplo, perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, cromatografía de afinidad, agentes unidos a un anticuerpo monoclonal o usados junto con un anticuerpo monoclonal, por ejemplo, complemento y citotoxinas, y "selección por afinidad" con anticuerpo fijado a una matriz sólida, por ejemplo, una placa u otras técnicas convenientes. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores de células activados por fluorescencia, que pueden tener diversos grados de sofisticación, por ejemplo, una pluralidad de canales de color, canales de detección de dispersión de luz, canales de impedancia, etc. conocidos por los expertos en la materia.

Se describen protocolos adicionales para procedimientos de separación adecuados para uso en el procedimiento según la divulgación por Orfao, A y Ruiz-Arguelles, A ((1996) General Concepts about Cell Sorting Techniques. Clin Biochem. 29(1):5-9), y por Herzenberg, LA, De Rose, s C y Herzenberg, LA ((2000) Monoclonal Antibodies and FACS: complementary tools for immunobiology and medicine. Immunol. Today. 21(8):383-390).

Las CMN y CPN de mamífero se purifican primero a partir de la mezcla de células recolectadas del tejido nervioso. Generalmente, los marcadores negativos se usan para separar CMN y CPN de células diferenciadas.

El aislamiento de CMN y CPN de otras células, por ejemplo, células neurales comprometidas, presentes en el tejido neural, comprende una etapa de selección y clasificación en la que primero se identifican las CMN y CPN y luego se separan de las otras células. Se pueden emplear diversas técnicas conocidas por el experto en la materia para separar las células retirando inicialmente las células dedicadas a otros linajes que no sean c Mn y CPN.

En una primera separación, se pueden usar anticuerpos para otros marcadores marcados con uno o más fluorocromos.

Las CMN y las CPN pueden seleccionarse frente a células muertas, empleando colorantes asociados con células muertas (yoduro de propidio, LDS). Las células se pueden recolectar en su medio de cultivo, o en cualquier solución salina fisiológica, preferiblemente tamponada, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS), opcionalmente con suero fetal de ternero (1 % de FCS) o albúmina de suero bovino (1 % de BSA) presente

Los marcadores que no se expresan en CMN y CPN son, por ejemplo, CD326, CD34 y CD45 y su expresión, o falta de expresión, puede usarse en ciertas realizaciones de la presente divulgación como marcadores para la selección negativa de células que no son CMN o CPN.

Si se van a retirar en una sola etapa linajes o poblaciones celulares adicionales que no sean CMN o CPN, se pueden incluir diversos anticuerpos contra tales marcadores específicos de linaje.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, pueden analizarse otros marcadores menos específicos y no únicos de CMN y/o CPN en paralelo con el marcador según la divulgación. De hecho, se ha mostrado que los subconjuntos de CMN y CPN detectados en diferentes etapas del desarrollo del SNC expresan marcadores tales como nestina, GFAP, CD15, CD24, Sox2, Musashi, CD133, EGFR, PDGFRa, doblecortina (DCX), Pax6, FABP7 y GLAST. Estos marcadores son coexpresados por algunas de las células que expresan la subunidad alfa10 de la integrina, como se muestra en los ejemplos. Sin embargo, ninguno de estos marcadores se expresa de forma única por CMN y/o NPC, muchos son expresados en efecto por células neuronales diferenciadas y otros tipos de células no neuronales.

Por el contrario, el uso del marcador integrina alfa10 según la divulgación en los protocolos de aislamiento y expansión dará una población homogénea de células madre neurales y/o células progenitoras neurales con la capacidad de diferenciarse en diferentes células del cerebro y de la médula espinal, siendo así útiles para regenerar tejido cerebral o de la médula espinal.

Por tanto, incluir el marcador según la divulgación, que comprende una subunidad de integrina alfa10, en protocolos de aislamiento y expansión conocidos, así como usar el marcador o marcadores solos, será muy valioso para una mayor evaluación y enriquecimiento de las poblaciones de células madre neurales y células progenitoras neurales. Particularmente, no se conoce ningún otro marcador único y específico como el marcador según la divulgación para células madre neurales y células progenitoras neurales de mamífero.

Las CMN y NPC también pueden seleccionarse en función de las propiedades de dispersión de la luz y su expresión de diversos antígenos de la superficie celular, en combinación con la identificación usando el procedimiento según la divulgación.

Generalmente, los marcadores presentes en la superficie celular o intracelularmente se detectan con la ayuda de fluorocromos. Los fluorocromos, que pueden encontrar uso en un análisis multicolor, incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína, rojo de Texas y muchos otros, todos bien conocidos por los expertos en la materia y disponibles comercialmente.

Las técnicas comúnmente usadas para la detección y selección de células basadas en el uso de marcadores presentes en su superficie celular son la citometría de flujo y la inmunoprecipitación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, las CMN y CPN pueden analizarse mediante citometría de flujo o inmunoprecipitación, detectando e identificando así la expresión de la subunidad alfa10 de la integrina. El experto en la materia está familiarizado con los protocolos adecuados de citometría de flujo e inmunoprecipitación que se usarán para la detección y/o selección de células.

Si se recolecta una población de células de todo el cerebro del ratón, solo una pequeña fracción, por ejemplo, menos de 2 % del número total de células son CMN o NPC.

Si se usa un anticuerpo o fragmentos del mismo, puede fijarse a un soporte sólido para permitir una separación altamente específica. El procedimiento particular de separación empleado, por ejemplo, centrifugación, separación mecánica, tales como columnas, membranas o separación magnética, debe maximizar la viabilidad de la fracción a recolectar. Pueden emplearse diversas técnicas de diferente eficacia conocidas por un experto en la materia. La técnica particular empleada dependerá de la eficiencia de la separación, la citotoxicidad de la metodología, la facilidad y rapidez de ejecución y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidad técnica.

Los procedimientos para la separación de CMN y/o CPN de una suspensión celular con la ayuda del procedimiento según la divulgación pueden incluir separación magnética, usando, por ejemplo, perlas magnéticas recubiertas de anticuerpos, cromatografía de afinidad basada en el anticuerpo o fragmentos del mismo según la divulgación, y "selección por afinidad" con un anticuerpo o fragmentos del mismo fijado a una matriz sólida, por ejemplo, una placa, u otras técnicas convenientes.

Las técnicas para proporcionar una separación precisa incluyen clasificadores de células activadas por fluorescencia, clasificación de perlas magnéticas y cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la materia.

En una realización adicional de la presente divulgación, la primera etapa de enriquecimiento de los procedimientos de la presente divulgación es una selección positiva de las CMN o de las CPN que puede repetirse hasta que se logre la pureza deseada de las CMN o de las CPN.

Un procedimiento para producir una población aislada de células enriquecidas en CMN y/o CPN de mamífero

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para fabricar in vitro una población aislada de células de mamífero que están enriquecidas en células madre neurales y/o células progenitoras neurales con respecto a una población de referencia, comprendiendo el procedimiento las etapas de

a) proporcionar al menos una parte de una población, o una parte de una población de referencia, que comprende una célula madre neural y/o una célula progenitora neural,

produciendo así una población de células enriquecidas en células madre neurales y/o células progenitoras neurales. Proporcionar una población se puede realizar de manera similar al procedimiento para la identificación de CMN y CPN descrito con detalle anteriormente. La población de células puede comprender al menos una CMN y/o al menos una CPN, o puede comprender solo células que no son CMN ni CPN. Por ejemplo, se puede proporcionar una población de células obtenidas o derivadas de tejido neural, o se puede proporcionar una población de células de referencia, tales como células HEK o células C2C12 transfectadas con integrina alfa10.

El compuesto introducido para identificar las CMN y/o CPN puede ser una proteína, un péptido, un anticuerpo monoclonal o parte del mismo, o un anticuerpo policlonal que identifica a las CMN y/o CPN.

El compuesto introducido para identificar las CMN y/o CPN puede ser una proteína, un péptido, un anticuerpo monoclonal, o parte del mismo, o un anticuerpo policlonal que sea capaz de detectar la integrina alfa10.

En una realización de la presente divulgación, las CMN y/o CPN se identifican como una CMN y/o como una CPN al detectar la expresión de la cadena de integrina alfa10 en la superficie celular de dicha CMN y/o de dicha CPN según el procedimiento de identificación de CMN y/o CPN descrito anteriormente.

Los anticuerpos monoclonales o policlonales, o partes de los mismos, son particularmente útiles para identificar marcadores, por ejemplo, marcadores expresados en la superficie celular de células viables intactas. El compuesto usado para identificar la CMN y/o CPN también se puede usar para la etapa de separación. Por tanto, dicho compuesto o compuestos, tales como anticuerpos, o partes de los mismos, pueden fijarse a un soporte sólido para permitir una primera separación bruta. Son ejemplos de soportes sólidos las perlas, por ejemplo, perlas magnéticas, de agarosa u otros tipos similares de perlas conocidas por los expertos en la materia. Puede emplearse cualquier medio adecuado para la separación de células con la condición de que la separación no perjudique indebidamente la viabilidad de una célula.

Las técnicas de separación empleadas deberían maximizan la retención de viabilidad de la fracción para recolectar. La evaluación de la viabilidad se describe a continuación.

En resumen, la evaluación de la viabilidad celular se puede realizar usando, por ejemplo, citometría de flujo. Después de la tinción de la célula apropiada, puede añadirse tinte de viabilidad para discriminar entre células viables y no viables. Existe una serie de tales tintes, de los cuales se describen ejemplos y procedimientos típicos para usarlos. El principio es el mismo para la mayoría de estos tintes: estos tintes entran en las células si la membrana celular está comprometida; como tal, las células que se tiñen con estos tintes no son viables y las células que no se tiñen se consideran viables.

Son ejemplos de tintes yoduro de propidio (PI), 7-aminoactinomicina D (7 AAD), To-Pro3 y monoazida de etidio (EMA). Otros procedimientos se describen en Flow Cytometry and Cell Sorting (Springer Lab Manual) por A. Radbruch (Springer Verlag, 2a edición, enero de 2000).

La viabilidad celular de la fracción recolectada es típicamente > 90 %, preferiblemente 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,9 %, o incluso 100 %.

La técnica particular empleada para la separación de células en el procedimiento según la divulgación dependerá de la eficiencia de la separación, la citotoxicidad de la metodología, la facilidad y velocidad de ejecución y la necesidad de un equipo sofisticado y/o habilidad técnica.

En una realización del procedimiento según la presente divulgación, se incluye al menos una etapa de enriquecimiento de CMN y/o CPN de mamífero.

En una realización del procedimiento según la presente divulgación, se incluye al menos una etapa de enriquecimiento de CMN de mamífero.

En una realización del procedimiento según la presente divulgación, se incluye al menos una etapa de enriquecimiento de CPN de mamífero.

En otra realización más de la presente divulgación, la primera etapa de enriquecimiento de las CMN y/o CPN es una selección negativa de las CMN y/o CPN, es decir, otras células comprometidas con el linaje se agotan o retiran de la población inicial de células. Por ejemplo, las células que expresan marcadores tales como CD34, CD45 y CD326 se seleccionan negativamente.

En otra realización más de la presente divulgación, los procedimientos de la presente divulgación comprenden un paso adicional, una selección negativa basada en la detección de la expresión de la subunidad de la integrina alfa11, por ejemplo, las células que expresan el marcador integrina alfa11 se agotan o se eliminan de la población de células.

En otra realización más de la presente divulgación, el primer enriquecimiento es una selección positiva de CMN y/o CPN que puede repetirse hasta lograr la pureza deseada de CMN y/o CPN. Para una selección positiva o negativa, pueden usarse proteínas, péptidos, anticuerpos monoclonales o policlonales como un compuesto para identificar la molécula de integrina alfa10 como se describe anteriormente. El compuesto se puede conjugar con medios de separación, tales como perlas magnéticas, que permiten la separación directa; biotina, que se puede retirar con avidina; o estreptavidina unida a un soporte; fluorocromos, que se pueden usar con un clasificador de células activado por fluorescencia; o similar, para permitir la fácil separación del tipo de célula particular como se ejemplifica en los párrafos anteriores. Puede emplearse cualquier técnica que no perjudique indebidamente la viabilidad de las células de interés, es decir, las CMN y CPN.

En una realización de la presente divulgación, la selección se realiza mediante clasificación de células fluorescentes, usando, por ejemplo, un clasificador de células basado en citometría de flujo tal como un FACS®, o cualquier otra metodología similar que tenga alta especificidad. Pueden emplearse análisis multicolores con citometría de flujo, que es particularmente conveniente y la técnica es bien conocida por los expertos en la materia de citometría de flujo. Las células pueden separarse sobre la base del nivel de tinción para los antígenos particulares. En una primera separación, se pueden usar anticuerpos para otros marcadores marcados con un fluorocromo, mientras que los anticuerpos para los linajes dedicados, es decir, la integrina alfa10, se pueden conjugar con uno o más fluorocromos diferentes. En realizaciones adicionales de la presente divulgación, otros marcadores pueden ser nestina, GFAP, CD15, CD24, Sox2, Musashi, CD133, EGFR, PDGFRa, doblecortina (DCX), Pax6, FABP7 y GLAST, que CMN y/o CPN pueden expresar. Son ejemplos de marcadores que no se expresan en CMN y CPN CD326, CD34, CD45 e integrina alfal 1 y su expresión, o falta de ella, en realizaciones adicionales de la presente divulgación también puede evaluarse junto con el marcador según la divulgación, por ejemplo, la expresión de integrina alfa10.

Si se van a retirar en esta etapa linajes o poblaciones celulares adicionales, se pueden incluir diversos anticuerpos contra tales marcadores específicos de linaje. Los fluorocromos que pueden encontrar uso en un análisis multicolor incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas, fluoresceína, rojo de Texas y cualquier fluorocromo adecuado conocido por los expertos en la materia.

Las células pueden seleccionarse frente a células muertas, empleando tintes asociados con células muertas tales como yoduro de propidio o LDS-75 1 (Laser Dye Styryl-75 1 (perclorato de 6-dimetilamino-2-14--1,3-butadienil-1-etilquinolinio)). Las células se pueden recolectar en cualquier medio de cultivo celular adecuado, tal como el medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM), o en cualquier solución salina fisiológica, preferiblemente tamponada, tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS), opcionalmente con suero de ternera fetal (FCS) o albúmina de suero bovino (BSA) presente. Se pueden emplear otras técnicas para la selección positiva o negativa, que permiten una separación precisa, tales como columnas de afinidad y similares, descritas con más detalle por Silvestri F, Wunder E, Sovalat H, Henon P, Serke S en Positive selection of CD34+ cells: a short review of the immunoadsorption methods currently available for experimental and clinical use (Informe del "2nd European Workshop on stem Cell Methodology", Mulhouse, Francia, 3-7 de mayo, 1993. J Hematother. 1993 Winter;2(4):473-81) y por by Basch RS, Berman JW, Lakow E. en Cell separation using positive immunoselective techniques (J Immunol Methods. 11 de feb de 1983; 56(3):269-80).

Las células pueden seleccionarse basándose en las propiedades de dispersión de la luz, así como en su expresión de diversos antígenos de la superficie celular.

Si bien se cree que el orden particular de separación no es fundamental para esta divulgación, el orden indicado es una forma de realizar la divulgación que se sabe que funciona. Por tanto, indicativamente, las células se separan inicialmente mediante una separación cruda, preferiblemente una selección negativa que retira las células no comprometidas con CMN y CPN usando marcadores celulares negativos tales como CD326, CD34 y CD45. La selección negativa suele ir seguida de una selección positiva, donde la selección positiva es de un marcador asociado con CMN y/o CPN y la selección negativa para marcadores asociados con células comprometidas con el linaje y otras poblaciones de células madre que no son CMN y/o CPN. Luego, esta separación es seguida por la selección de una población celular, o una composición celular que comprende dicha población, que tiene potencial de linaje múltiple como CMN y/o CPN y capacidad potenciada de autorregeneración. La composición se describe adicionalmente más adelante.

En realizaciones adicionales de la presente divulgación, el enriquecimiento de tal población es de aproximadamente 70, 80, 90, 95, 98, 99, 99,9 o incluso 100 %. La viabilidad de tales células se analiza en detalle anteriormente.

La población enriquecida puede expandirse aún más y luego inducirse con factores definidos, tal como el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y el factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2), para diferenciarse en células neurales específicas. Por ejemplo, FGF-2 generalmente se usa en combinación con heparina, que media en la unión del factor de crecimiento a su receptor. Otros factores de crecimiento que se ha informado que respaldan el cultivo celular son el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a), el factor inhibidor de la leucemia (LIF) y su equivalente, el factor neurotrópico ciliar (CNTF) o el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF). El PDGFa se usa con frecuencia en los medios de mantenimiento de las células progenitoras de oligodendrocitos. Como alternativa o además del uso de factores de crecimiento específicos, las CMN y las CPN se pueden cocultivar en presencia de otras células de apoyo como los astrocitos, que parecen favorecer el crecimiento de las CMN y las CPN por contacto físico, o células endoteliales, que pueden potenciar la proliferación celular a través de la producción del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGf ).

Modulación de CMN y/o CPN

Otro aspecto de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para determinar si un compuesto de prueba modula la diferenciación de CMN y/o CPN de mamífero in vitro. Tal procedimiento comprende las etapas de a) proporcionar una célula madre neural y/o una célula progenitora neural que expresa la subunidad de integrina alfa10,

b) poner en contacto la célula madre neural y/o la célula progenitora neural con un compuesto de prueba, y c) detectar un cambio en la tasa o patrón de diferenciación de la célula madre neural y/o célula progenitora neural como una indicación de que el compuesto de prueba modula la diferenciación de una célula madre neural y/o una célula progenitora neural,

donde la tasa o patrón de diferenciación se determina detectando la expresión de integrina alfa10 por la célula según el procedimiento divulgado en el presente documento, véase también la sección anterior "Detección de la expresión de integrina alfa10".

Las CMN y CPN proporcionadas pueden ser una población celular enriquecida lograda según cualquiera de los procedimientos divulgados en el presente documento, la CMN y/o CPN aislada según la divulgación, o la composición celular según la divulgación.

El compuesto de prueba puede ser cualquier compuesto que se sepa o se sospeche que afecte a CMN y/o CPN, por ejemplo, composiciones farmacéuticas, fármacos, anticuerpos policlonales o monoclonales, o partes de los mismos, tales como anticuerpos que se unen a la integrina alfa10 o cualquier otra molécula en CMN y/o CPN, factores usados para promover el crecimiento de CMN y/o de CPN, por ejemplo, PDGFRa, EGF y FGF-2.

La detección de un cambio en la tasa o patrón de, por ejemplo, diferenciación de CMN y/o CPN como una indicación de que el compuesto de prueba modula la diferenciación de CMN y/o NPC se puede realizar detectando la expresión de integrina alfa10 en la superficie celular de dicha célula madre neural y/o célula progenitora neural o intracelular en una célula madre neural y/o una célula progenitora neural según los procedimientos divulgados en el presente documento.

La detección de un cambio en la tasa o patrón de, por ejemplo, la diferenciación de CMN y/o CPN como una indicación de que el compuesto de prueba modula la diferenciación de CMN y/o CPN se puede realizar mediante citometría de flujo o cualquier otro procedimiento adecuado, tal como cualquier inmunoprocedimiento conocido por un experto en la materia. El cambio en la tasa o el patrón de diferenciación puede detectarse mediante estudios cinéticos, funcionales o fenotípicos de CMN y/o CPN moduladas con el compuesto de prueba, en relación con una población de CMN y/o CPN sin tratar o con tratamiento simulado.

Una composición celular

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a un cultivo celular in vitro de células de mamífero indiferenciadas que expresan una subunidad de integrina alfa10, donde las células derivan de tejido neural y donde

a) las células en el cultivo tienen la capacidad de diferenciarse en neuronas y/u oligodendrocitos y/o astrocitos cuando se diferencian en un medio de cultivo sustancialmente libre tanto de suero como de un factor de crecimiento inductor de proliferación como se define en (b) para producir un cultivo celular de al menos 10 % de neuronas y/u oligodendrocitos y/o astrocitos;

b) el cultivo celular se divide en un medio de cultivo que contiene un reemplazo de suero tal como B27 y al menos un factor de crecimiento inductor de proliferación;

c) las células en el cultivo se diferencian en neuronas y/u oligodendrocitos y/o astrocitos tras la retirada tanto del reemplazo de suero como de los factores de crecimiento inductores de proliferación.

En una realización de la presente divulgación, la etapa c) comprende la adición de suero de ternero fetal.

b) células de mamífero indiferenciadas derivadas del sistema nervioso central de un mamífero, donde al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, preferiblemente al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 60 %, preferiblemente al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 % de las células expresan una subunidad de integrina alfa10.

Otro aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un cultivo en suspensión de células indiferenciadas de mamíferos que expresan una subunidad de integrina alfa10, donde dichas células se forman sustancialmente en agregados celulares y donde los agregados celulares se mantienen en un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento inductor de proliferación.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la expresión de la integrina alfa10 es como se describe en la sección anterior "La integrina alfa10 como marcador para las células madre neurales y las células progenitoras neurales".

En algunas realizaciones de la presente divulgación, al menos un 10 %, preferiblemente al menos un 20 %, preferiblemente al menos un 30 %, preferiblemente al menos un 40 %, preferiblemente al menos un 50 %, preferiblemente al menos un 60 %, preferiblemente al menos un 70 %, preferiblemente al menos un 80 %, preferiblemente al menos un 90 % de las células de mamífero indiferenciadas son células madre neurales de mamífero que expresan una subunidad de integrina alfa10.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la célula de mamífero indiferenciada es una célula madre neural o una célula progenitora neural.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la célula de mamífero indiferenciada se obtiene o deriva de un mamífero fetal o adulto, por ejemplo tejido neural humano o murino, que se describe en detalle en la sección anterior "Tejido neural".

En algunas realizaciones de la presente divulgación, algunas de las células de mamífero indiferenciadas expresan además al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en nestina, PSA-NCAM, GFAP, SOX2 y PDGFRa.

Se pueden lograr composiciones que tienen más de un 50 %, tal como más de un 60 %, por ejemplo más de un 70 %, tal como más de un 80 %, por ejemplo más de un 90 %, tal como más de un 95 %, tal como 96 %, 97 %, 98 %, o 99,9 % de células CMN o CPN humanas según los procedimientos divulgados para el enriquecimiento de CMN o CPN. Tales CMN y/o CPN pueden proporcionar regeneración celular y el desarrollo de miembros de todos los diversos linajes de c Mn , tales como neuronas, astrocitos y oligodendrocitos y otras células.

En última instancia, se puede obtener un solo tipo de célula a partir de una composición de CMN o CPN y usarse para la reconstitución o regeneración de un tejido neural de mamífero. La composición de CMN o CpN debe administrarse preferiblemente en una dosificación terapéuticamente eficaz, donde la dosificación es un número de células específico capaz de repoblar dicho mamífero, tal como un ser humano. El número de células puede ser diferente de un donante a otro y puede ser determinado empíricamente de un caso a otro por un experto en la materia.

Los factores inductores de la proliferación celular son específicos para cada tipo de célula y son conocidos por el experto en la materia. En algunas realizaciones de la presente divulgación, el al menos un factor de crecimiento inductor de proliferación se selecciona del grupo que consiste en factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos-2 (FGF-2), factor de crecimiento transformante alfa (TGF-a ), factor inhibidor de la leucemia (LIF), factor neurotrópico ciliar (CNTF), factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), PDGFa y combinaciones de los mismos.

Tratamiento de lesiones del sistema nervioso y enfermedades neurodegenerativas

Las CMN y/o CPN de mamífero, tales como CMN y/o CPN humanas o de ratón identificadas y aisladas según los procedimientos divulgados en este documento se pueden usar para tratar daños y lesiones y/o prevenir y proteger del daño del sistema nervioso y/o tratar una enfermedad neurodegenerativa en un sujeto que lo necesite. En cuanto a los trastornos neurodegenerativos, esto se aplica en particular a las enfermedades neurodegenerativas que están asociadas con la pérdida o daño del tejido neuronal. La presente divulgación trata tales enfermedades neurodegenerativas mediante la regeneración del tejido perdido o dañado.

Además, las células madre mesenquimales (CMM) identificadas y aisladas según los procedimientos divulgados, por ejemplo, en el documento WO 03/106492, también se pueden usar para regenerar tejido perdido o dañado del sistema nervioso central como lo demuestra Steinberg GK et al (2016) Stroke 47: 1817-1824. Por tanto, en un aspecto, la presente divulgación se refiere a procedimientos para regenerar tejido perdido o dañado del sistema nervioso central, y a procedimientos para tratar enfermedades o daños y/o prevenir y proteger del daño del sistema nervioso central en un sujeto que lo necesite, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos, donde las células expresan una subunidad de integrina alfa10; b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células madre neurales y/o células progenitoras neurales de mamífero al sujeto, tratando así la enfermedad o el daño y/o previniendo y protegiendo del daño del sistema nervioso central.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar un trastorno mental y del comportamiento en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar una composición que comprende una población enriquecida de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos, donde las células expresan una subunidad de integrina alfa10; b) administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la población aislada de células madre neurales y/o células progenitoras neurales de mamífero al sujeto, tratando así los trastornos neurológicos con síntomas psiquiátricos.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un procedimiento para tratar enfermedades o daños en el sistema nervioso y/o prevenir y proteger del daño del SNC en un sujeto que lo necesita, comprendiendo el procedimiento:

tratando así los trastornos neurológicos con síntomas psiquiátricos.

Dichas células madre mesenquimales pueden aislarse, por ejemplo, de médula ósea, tejido adiposo, sangre de cordón umbilical, gelatina de Wharton, pulpa dental, líquido amniótico, membrana amniótica, tejidos dentales, endometrio, yema de extremidades, sangre, placenta y membrana fetal, glándula salival, piel y prepucio, membrana de revestimiento del cordón umbilical subamniótico o membrana sinovial.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a un marcador para células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos, que comprende una subunidad de la cadena de integrina alfa10 expresada por la célula madre neural y/o células progenitoras neurales, para su uso en un procedimiento para tratar una enfermedad o daño y/o prevenir y proteger del daño del sistema nervioso y/o tratar un trastorno mental y del comportamiento.

Un aspecto adicional de la presente divulgación se refiere a una composición que comprende una población aislada de células madre neurales de mamíferos y/o células progenitoras neurales de mamíferos que expresan una subunidad de integrina alfa10 para su uso en un procedimiento para tratar enfermedades o daños del sistema nervioso y/o un trastorno mental y del comportamiento.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la población de células se enriquece en células madre neurales de mamífero y/o células progenitoras neurales de mamífero que expresan una subunidad de integrina alfa10, por ejemplo, como se describe en la sección anterior "Una composición celular" y "Un procedimiento para producir una población aislada de células enriquecidas en CMN y/o CPN de mamífero".

Las células madre neurales, tales como una célula progenitora neural, tales como las células madre mesenquimales aisladas mediante la detección de la expresión de la subunidad alfa10 de la integrina en la superficie celular de dichas células según los procedimientos divulgados en el presente documento, pueden implantarse en un área dañada del sistema nervioso de un sujeto y pueden así promover el crecimiento de tejidos neurales y reparar lesiones del sistema nervioso y enfermedades neurodegenerativas.

Las células madre neurales, tales como una célula progenitora neural, tales como las células madre mesenquimales aisladas mediante la detección de la expresión de la subunidad alfa10 de la integrina en la superficie celular de dichas células según los procedimientos divulgados en el presente documento e implantadas o trasplantadas a un sujeto que lo necesita, pueden promover la migración y diferenciación de células madre neurales y la producción de factores de matriz extracelular que proporcionan apoyo trófico a las células dañadas.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, las células madre neurales, como la célula progenitora neural, como las células madre mesenquimales aisladas mediante la detección de la expresión de la subunidad alfa10 de la integrina en la superficie celular de dichas células según los procedimientos divulgados en el presente documento, se administran a un sujeto que lo necesita por vía intracerebral, intraarterial, intravenosa o intracerebroventricular.

Las células pueden administrarse a dicho sujeto en una o más ocasiones.

Una vez que se han administrado o trasplantado a un sujeto, las células se comportarán de manera diferente según el entorno al que se transfieran y pueden diferenciarse en todo tipo de células neurales.

Enfermedades, daños y trastornos a caracterizar y tratar

Varias enfermedades y trastornos se pueden caracterizar y tratar usando los marcadores y/o células y procedimientos de la presente divulgación.

En una realización de la presente divulgación, la enfermedad o daño del sistema nervioso es una lesión del sistema nervioso central o periférico o una enfermedad neurodegenerativa. Dicha enfermedad, daño o lesión puede implicar células neurales perdidas o dañadas.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso implica lesiones en el cerebro, el tronco encefálico, la médula espinal y/o nervios periféricos, lo que da como resultado afecciones tales como accidente cerebrovascular, lesión cerebral traumática (LCT), lesión de la médula espinal (LME), lesión axonal difusa (LAD), epilepsia, neuropatía, neuropatía periférica y dolor asociado y otros síntomas que estos síndromes pueden causar.

El accidente cerebrovascular es una afección médica en la que el flujo sanguíneo deficiente al cerebro da como resultado la muerte celular. Hay dos tipos principales de accidente cerebrovascular: isquémico y hemorrágico. La isquemia cerebral (también conocida como isquemia cerebral, isquemia cerebrovascular) es una afección en la que no hay suficiente flujo de sangre al cerebro para satisfacer la demanda metabólica. Esto conduce a un suministro deficiente de oxígeno o hipoxia cerebral y, por tanto, a la muerte del tejido cerebral o infarto cerebral/ictus isquémico. La isquemia cerebral focal reduce el flujo de sangre a una región específica del cerebro, lo que aumenta el riesgo de muerte celular en esa área en particular, mientras que la isquemia cerebral global afecta al cerebro de forma global. Los modelos de roedores de isquemia cerebral focal se emplean con frecuencia en la investigación experimental de accidentes cerebrovasculares.

Como se describe en (Fairbairn et al, 2015), las CMN se pueden implantar en sitios de lesión de nervio periférico como consecuencia de una lesión aguda de nervio periférico. Las CMN también se pueden implantar en nervios crónicamente denervados para mejorar la recuperación morfológica y electrofisiológica.

Los presentes inventores han demostrado (p. ej., figuras 13-14) que las células madre neurales que expresan la integrina alfa 10 beta 1 se reclutan en áreas afectadas por accidentes cerebrovasculares. En una realización, la presente divulgación es útil por tanto para caracterizar el tamaño y la ubicación de un área afectada por un daño isquémico tal como un accidente cerebrovascular. La divulgación es, por tanto, útil para el profesional médico como herramienta de diagnóstico y pronóstico posterior a la enfermedad o daño al SNC. Véase, por ejemplo Panagiotou et al (2015) Frontiers in Neuroscience vol. 9, artículo 182, que demuestra el uso de anticuerpos conjugados con nanopartículas para evaluar la caracterización del accidente cerebrovascular. Además, las células madre neurales (por ejemplo, células madre neurales autólogas o células progenitoras) pueden obtenerse de un donante, tal como el propio paciente, y caracterizarse como células madre neurales o progenitoras, expandirse y trasplantarse en el área dañada o enferma del SNC. Por tanto, la divulgación es útil para tratar una multitud de enfermedades y trastornos del SNC, así como lesiones y traumatismos que implican pérdida o daño de tejido nervioso.

En otras realizaciones de la presente divulgación, la enfermedad o daño del sistema nervioso es una enfermedad neurodegenerativa que implica la degeneración de las neuronas y sus procesos en el cerebro, tronco encefálico, médula espinal y/o nervios periféricos, tales como trastornos neurodegenerativos que incluyen, pero sin limitación, la enfermedad de Parkinson, la enfermedad de Alzheimer, la demencia senil, la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), lesión neuronal/axonal asociada con la esclerosis múltiple (EM) y los síntomas asociados.

En otras realizaciones de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso y/o la enfermedad neurodegenerativa implica disfunción y/o pérdida de neuronas en el cerebro, el tronco encefálico, la médula espinal y/o nervios periféricos, tales como disfunción y/o pérdida causada por enfermedades metabólicas, deficiencia nutricional, lesiones tóxicas, malignidad y/o afecciones genéticas o idiopáticas, que incluyen, pero sin limitación, diabetes, disfunción renal, alcoholismo, quimioterapia, agentes químicos, abuso de drogas, deficiencias vitamínicas, infección y síntomas asociados.

En otra realización de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso y/o la enfermedad neurodegenerativa implica la degeneración o esclerosis de la glía, tales como oligodendrocitos, astrocitos y células de Schwann en el cerebro, el tronco encefálico, la médula espinal y el sistema nervioso periférico, incluidos, pero sin limitación, esclerosis múltiple (EM), neuritis óptica, esclerosis cerebral, encefalomielitis posinfecciosa y epilepsia, y síntomas asociados.

En otras realizaciones de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso y/o la enfermedad neurodegenerativa implica la retina, los fotorreceptores y los nervios asociados, incluidos, pero sin limitación, retinitis pigmentosa, degeneración macular, glaucoma y síntomas asociados.

En otra realización de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso y/o la enfermedad neurodegenerativa implica el epitelio sensorial y los ganglios asociados del complejo vestibuloacústico, que incluye, pero sin limitación, pérdida de audición inducida por ruido, sordera, tinnitus, otitis, laberintitis, atrofia cocleovestibular y hereditaria, enfermedad de Meniere y síntomas asociados.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso se selecciona de un grupo que consiste en lesiones de la médula espinal (LME), lesiones cerebrales traumáticas (LCT), accidente cerebrovascular y cáncer cerebral. En una realización preferida de la presente divulgación, la lesión del sistema nervioso es un accidente cerebrovascular.

En algunas realizaciones de la presente divulgación, las CMN o CPN de la presente divulgación pueden tratar los trastornos mentales y del comportamiento que implican daños en el tejido neural. Véanse, p.ej.

Ladran et al (2013) Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5(6): 701-715 y Kalman et al (2016) Stem Cells Int. 7909176.

En ciertas realizaciones de la presente divulgación, los trastornos mentales y del comportamiento se seleccionan del grupo que consiste en síndrome de Rett, esquizofrenia, depresión, trastornos del espectro autista (TEA) y trastorno bipolar (TBP). De hecho, algunos trastornos mentales y del comportamiento están asociados con células neurales que tienen una morfología y/o función alterada. Por lo tanto, el trasplante de CMN y/o CPN sanos puede dar como resultado la generación de células neurales comprometidas morfológica y funcionalmente sanas y en una regresión del trastorno mental y del comportamiento.

La composición celular según la divulgación también puede usarse para el tratamiento de enfermedades genéticas. Las enfermedades genéticas asociadas con CMN y/o CPN pueden tratarse mediante modificación genética de CMN autólogas o alogénicas para corregir el defecto genético. Por ejemplo, la enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad hereditaria y los niños con un progenitor afectado tienen un 50 % de posibilidades de heredar la falla genética que causa la enfermedad. Esta falla ocurre en el gen que contiene el código de una proteína llamada huntingtina. El gen defectuoso causa que el cuerpo produzca una versión defectuosa y tóxica de la proteína huntingtina y esto eventualmente da como resultado la pérdida de neuronas espinosas medianas (NEM) y otras neuronas. La administración de una composición celular que comprende CMN y/o CPN sanas a un sujeto cuyas células comprenden el gen defectuoso puede dar como resultado que el sujeto sea capaz de producir huntingtina saludable.

Con CMN y/o CPN alogénicas, las células normales de un mamífero de la misma especie sin el defecto genético se pueden usar como terapia.

Se pueden contemplar diversos procedimientos para la transferencia e inmovilización de CMN y/o CPN y/o las CMM, y la composición que comprende las CMN y/o CPN y/o CMM, incluida la inyección de las células aisladas en el sitio del defecto, por ejemplo, daño en el cerebro o la médula ósea, la incubación de células aisladas en un gel adecuado y la implantación y la incubación con un armazón biorreabsorbible o la infusión sistémica, etc. El experto en la materia conoce diferentes procedimientos.

Opcionalmente, las CMN y/o CPN y/o CMM se pueden incubar con un anticuerpo contra la integrina alfa10 para mantener las células en su lugar. Por tanto, los anticuerpos se pueden conjugar con un armazón biorreabsorbible que permite la inmovilización de las células antes de la implantación en el sitio dañado o defectuoso, por ejemplo, en el sitio de un defecto neural. El armazón permite la inmovilización 3D de CMN y/o CPN y/o CMM. Los armazones de biomaterial adecuados se ejemplifican a continuación. Los ejemplos dados no limitan el uso de otros armazones adecuados obvios para elegir por un experto en la materia si es más adecuado para la aplicación particular.

Los tipos de armazones incluyen andamios de poli(a-hidroxiésteres) biorreabsorbibles tales como ácido poliláctico (APL), ácido poliglicólico (APG) y copolímero (APLG).

Realizaciones adicionales de la presente divulgación incluyen armazones derivados de geles poliméricos tales como ácido hialurónico, colágeno, alginato y quitosano.

Ejemplos

Los ejemplos que no se encuentran dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención.

Ejemplo 1: Aislamiento de células de la zona subventricular de ratón (ZSV) y análisis de citometría de flujo

Aislamiento de la ZSV

Se aislaron células madre/progenitoras neurales de la ZSV de crías y adultos de ratón. Se decapitaron los ratones, se extrajeron los cerebros, se colocaron en PBS helado con antibióticos y se recogieron secciones (1 mm de espesor) que contenían la ZSV. La ZSV se diseccionó de la pared lateral del cuerno anterior del ventrículo lateral. El tejido se digirió en solución StemPro Accutase (ThermoFisher Scientific) durante 20 min a 37 °C. Después de la trituración con puntas P200 y P20, la suspensión celular se filtró (filtro de 50 |jm, BD Biosciences) y se sembró en medio NSP: DMEM/F12 con Glutamax y medios neurobasales (1:1) (Gibco) complementado con 1* B27 (Gibco), 1* N2 (Gibco), 100 U/ml de antibiótico-antimicótico (Gibco), bFGF (20 ng/ml) (Gibco) y EGF (20 ng/ml) (Gibco) a 37 °C con 5 % de CO². Las esferas comenzaron a aparecer después de aproximadamente 5 días. Las células se sometieron a pases cada 5-7 días usando Accutase.

Análisis de citometría de flujo

1. Anticuerpos: se usó un anticuerpo monoclonal dirigido a la subunidad alfa10 de la integrina. Se centrifugaron las células y se añadió una alícuota de 100 j l por tubo Eppendorf. Se usó 1 jg/m l de anticuerpo de IgG2a de ratón de control como control de valor 0,2 mg/ml.

2. Se incubaron las células con anticuerpos primarios durante 60 min en hielo.

3. Se lavaron las células dos veces en 500 j l de tampón de tinción (PBS+/+ con 2 % de SFB).

4. Se añadieron los anticuerpos secundarios y las células se incubaron en hielo durante 45 minutos.

5. Se lavaron las células en 500 j l de tampón de tinción 2-3 veces.

6. Se añadieron 500 j l de tampón de tinción al sedimento final y se resuspendieron las células.

7. Se analizaron las células por citometría de flujo.

Conclusión: Este ejemplo muestra que las células aisladas de la zona subventricular del cerebro de un ratón adulto expresan la integrina a10p1, véase la Figura 1B.

Ejemplo 2: Análisis de la coexpresión de integrina a io p i y otros marcadores en tejido cerebral de ratón por inmunofluorescencia

Se embebieron tejidos de cerebro de ratón recién congelados en TissueTek (Sakura, Japón). Se recolectaron secciones de 10 jm (hechas en un criostato MICROM HM 500 OM) sobre portaobjetos SuperFrost Plus (Menzel-Gláser, GmbH). Se usaron las secciones para el inmunomarcaje, después de la fijación posterior con acetona (100 % a -20 °C, durante 10 min).

Se secaron al aire las criosecciones a 37 °C durante aproximadamente 20 min. Cuando las secciones alcanzaron la temperatura ambiente, se enjuagaron dos veces en PBS (solución salina tamponada con fosfato, 0,1 M, pH 7,4) durante 5 min. Se aplicó una barrera de silicona ("rotulador PAP") alrededor de las secciones. Se incubaron las secciones en PBS que contenía Triton X-100 al 0,05 % (0,1-0,001) y 1 % de BSA, durante 30 min a temperatura ambiente y luego se enjuagaron en PBS 1 * 2 min. Las secciones se incubaron con una mezcla de anticuerpos primarios elaborados en diferentes especies contra diferentes antígenos (primero evaluados individualmente para determinar la especificidad y la dilución de trabajo óptima). Se realizaron las incubaciones durante 16-18 horas a 4-8 °C, con a10 pAb 1,2 jg/m l (0,6-1,2 jg/m l) (diluido en PBS que contiene 0,05 % de Triton X-100 y 1 % de BSA). Para la visualización de fluorescencia simultánea de dos epítopos, los anticuerpos primario y secundario, respectivamente, se aplicaron como una mezcla ("cóctel"). Se enjuagaron las secciones en PBS 1 min seguido de 2 * 5 min y se incubaron con anticuerpo o anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo en una mezcla, diluida 1:150, durante 30-45 min, a temperatura ambiente.

Se elaboraron anticuerpos secundarios para marcaje múltiple (altamente purificados por afinidad, principalmente fragmentos Fab2) en burro o cabra contra IgG de conejo, ratón o cabra o contra IgY de pollo (Jackson, EE. UU. o Invitrogen, EE. UU.) y se diluyeron en PBS que contenía 1 % de BSA. Para la visualización de fluorescencia simultánea de dos epítopos, los anticuerpos primario y secundario se aplicaron como una mezcla, un "cóctel". Se enjuagaron las secciones primero en PBS-Triton X100 durante 2 min y luego en PBS 1 * 5 min. Las secciones se incubaron con tinción de orgánulo (nuclear) DAPI 0,1 jM , se diluyeron en PBS durante 15 min y se enjuagaron en PBS, 2 * 5 min. Las secciones se montaron y se cubrieron con cubreobjetos con la "solución antidecoloración" ProLong Gold (Invitrogen, EE. UU.). Los anticuerpos usados en el presente estudio se dan en la Tabla 2.

Tabla 2. Anticuerpos usados en el presente estudio.

Análisis:

El análisis se realizó mediante microscopía de barrido láser confocal y epifluorescencia.

Se examinaron las muestras en un microscopio confocal Zeiss LSM 510 META, utilizando láseres para excitación entre 305-633 nm y para detección de emisión entre 420-650 nm. Se adquirieron las imágenes con un Plan Apochromate de 20x/0,8 y un objetivo Plan Apochromate de 40x/1,3 de inmersión en aceite, con tres canales de inmunofluorescencia, un canal de DAPI y un canal de DIC de campo claro.

Se obtuvieron apilamientos Z (sin DIC) de planos confocales consecutivos con el objetivo de 40x/1,3, ya sea con un tamaño de fotograma de 1024 * 1024 px (ancho de píxel 0,22 |jm), o con "acercamiento" (barrido de un área más pequeña) y frecuencia de muestreo óptima de Nyquist (ancho de píxel 0,115 jm ) para una resolución máxima. El tamaño de paso entre los planos confocales consecutivos era según la frecuencia de muestreo óptima de Nyquist (0,48 jm ).

Resultados: Las imágenes de tinción de inmunofluorescencia y microscopía confocal indican expresión de integrina a10p1 en la ZSV de tejido de ratón adulto (Figura 5), expresión y colocalización de integrina a10p1 y nestina en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto (Figura 6), expresión y colocalización parcial de integrina a10p1 y PSA-NCAM en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto (Figura 7); expresión y colocalización parcial de integrina a10p1 y GFAP en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto (Figura 8), así como expresión y colocalización parcial de integrina a10p1 y SOX2 en la ZSV de tejido cerebral de ratón recién nacido (Figura 9) . La colocalización parcial de la integrina a10p1 y PDFGRa en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto también se observó usando citometría de flujo, como se muestra en la Figura 10.

Las imágenes de tinción de inmunofluorescencia, microscopía confocal y epifluorescencia indican expresión y colocalización parcial de integrina a10p1 y SOX2 en la zona subgranular del tejido cerebral de ratón recién nacido (Figura 11) y expresión y colocalización parcial de integrina a10p1 y PDFGRa en las meninges de tejido cerebral de ratón recién nacido (Figura 12).

Conclusión: En este Ejemplo, se muestra que diversos marcadores se expresan y colocalizan parcialmente con la integrina a10p1 en la ZSV de tejido cerebral de ratón adulto.

Ejemplo 3: Diferenciación de células NSP/NSP de ratón aisladas y análisis de expresión génica

Para confirmar linajes de células neurales específicos, se usó un ensayo de PCR cuantitativo para medir la expresión génica.

Extracción de ARN y PCR cuantitativa

Se extrajo el ARN total de células o tejidos usando un microkit RNeasy Plus (Qiagen), y luego se revirtió a ADNc usando un kit de síntesis de ADNc SuperScript (Life Technologies). Para la PCR cuantitativa, se usaron la mezcla maestra de expresión génica TaqMan (Life Technologies) y las sondas TaqMan (ThermoFisher Scientific). Los valores de umbral de ciclo de los genes diana se normalizaron a la media geométrica del gen constitutivo Gapdh para obtener ACt. Se calculó 2 elevado a -ACt (2'ACt) para el análisis final, véase la Figura 4. Las sondas Taqman usadas para el análisis de qPCR se dan en la Tabla 3.

Tabla 3. Sondas Taqman usadas para el análisis de qPCR.

Conclusión: Los resultados mostraron una regulación positiva de la expresión génica de Map2, p-tubulina III, Gfap y O4 (Figura 4). Esto indica la diferenciación efectiva de CMN/NSP aisladas en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.

Ejemplo 4: Las células madre neurales positivas de la subunidad alfa10 de la integrina se cultivan como neuroesferas

Se aislaron células madre/progenitoras neurales de la ZSV de ratones posnatales y adultos (C57BI/6). Se aislaron los cerebros, se disecaron las paredes laterales de los ventrículos y se digirieron en StemPro Accutase (ThermoFisher Scientific) durante 20 min a 37 °C. Se trituró el tejido con puntas P200 y P20 y la suspensión celular se filtró (filtro de 50 |jm, BD Biosciences) y se sembró en medio NSP (DMEM/F12 con Glutamax y medios neurobasales (1:1) (Gibco) complementado con B27 (Gibco), N2 (Gibco), 100 U/ml de antibiótico-antimicótico (Gibco), bFGF (20 ng/ml) (Gibco) y EGF (20 ng/ml) (Gibco). Las células se sometieron a pases cada 5 días usando Accutase.

Resultados: La citometría de flujo y las imágenes de tinción de inmunofluorescencia seguidas de microscopía confocal muestran que una subpoblación de células cultivadas como neuroesferas expresa integrina a10p1 junto con otros marcadores de células madre (Figura 2 y Figura 3).

Ejemplo 5: Tratamiento del accidente cerebrovascular en ratones mediante la administración de una población enriquecida en CMN identificadas y aisladas mediante la detección de la expresión de la subunidad de integrina alfa10

Aislamiento y cultivo de CMN de ratón.

Las células madre neurales que expresan una subunidad de integrina alfa10 se aíslan de todo el cerebro de ratón según el procedimiento descrito en el Ejemplo 1.

Después del aislamiento, las células madre neurales se cultivan en forma de neuroesferas como se describe en el Ejemplo 4.

Se realiza el pase cada 4 a 6 días a una proporción de división de 1:3. Normalmente, las células del Pase 3 se pueden usar fácilmente para experimentos. Las CMN en el Pase 3 también se usan para la caracterización. Los marcadores de células madre neurales CD133 y PDFGRa, así como la integrina a10p1, se examinan mediante citometría de flujo.

Oclusión permanente de la arteria cerebral media (OACMp)

Se genera OACMp en ratones quirúrgicamente, por ejemplo siguiendo el procedimiento descrito en Engel et al. (2011).

Trasplante de diferentes números de CMN que expresan establemente células a10p1 en cerebro de ratón afectado por accidente cerebrovascular

Los ratones reciben dosis únicas de 2,5 * 106, 5 * 106 o 10 * 106células CMN-a10. Las CMN positivas de integrina a10p1 se implantan mediante el uso de técnicas estereotácticas de formación de imágenes por resonancia magnética para definir los sitios diana que rodean el volumen de accidente cerebrovascular residual.

En conclusión, este estudio demuestra que el trasplante intracerebral de células madre con células que expresan CMN-a10 para el tratamiento de accidente cerebrovascular es generalmente seguro y bien tolerado por ratones y da como resultado una función neurológica mejorada.

Aislamiento y cultivo de CMM-MO de ratón

Se sacrifican ratones de 4 u 8 semanas de edad por dislocación cervical y se colocan en una placa de cultivo celular de 100 mm (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EE. UU.), donde todo el cuerpo se empapa en 70 % (v/v) de etanol durante 2 minutos, y luego el ratón se transfiere a una nueva placa. Se diseccionan las cuatro garras en las articulaciones del tobillo y del carpo, y se hacen incisiones alrededor de la conexión entre las extremidades posteriores y el tronco, las extremidades anteriores y el tronco. Posteriormente, se retira toda la piel de las extremidades posteriores y anteriores tirando hacia el lugar de corte de la garra. Se disocian los músculos, ligamentos y tendones cuidadosamente de tibias, fémures y húmeros usando tijeras de microdisección y bisturí quirúrgico. Se diseccionan las tibias, los fémures y los húmeros cortando las articulaciones y los huesos se transfieren a una gasa estéril. Se frotan los huesos cuidadosamente para retirar los tejidos blandos residuales y se transfieren a una placa de cultivo estéril de 100 mm con 10 ml de medio a-MEM completo en hielo. Todas las muestras se procesan dentro de los 30 minutos posteriores a la muerte del animal para garantizar una alta viabilidad celular. Los tejidos blandos están completamente disociados de los huesos para evitar la contaminación.

En una cabina de bioseguridad, se limpian por lavado los huesos dos veces con PBS que contiene 1 % de PSN para eliminar por lavado las células sanguíneas y los tejidos blandos residuales, luego los huesos se transfieren a una nueva placa de cultivo estéril de 100 mm con 10 ml de medio a-MEM completo. Se sujeta el hueso con pinzas y los dos extremos se extirpan justo por debajo del extremo de la cavidad de la médula usando unas tijeras de microdisección. Se usa una aguja de calibre 23 fijada a una jeringa de 5 ml para extraer 5 ml de medio a-MEM completo de la placa; luego la aguja se inserta en la cavidad ósea. Se limpia la médula lentamente por lavado y las cavidades óseas se lavan dos veces de nuevo hasta que los huesos se vuelven pálidos. Se retiran todas las piezas de hueso de la placa con unas pinzas, dejando la masa sólida en el medio, y se incuba la placa a 37 °C en una incubadora de 5 % de CO2 durante 5 días. Para obtener suficientes células de la médula, las cavidades óseas se limpian por lavado repetidamente hasta que los huesos parecen pálidos.

Las células fusiformes iniciales aparecen el día 3 en microscopía de contraste de fase, y luego el cultivo se vuelve más confluente y alcanza un 70-90 % de confluencia en solo 2 días. Las células se lavan dos veces con PBS y se digieren con 2,5 ml de tripsina al 0,25 % durante 2 minutos a 37 °C, luego se neutraliza la tripsina con 7,5 ml de medio a-MEM completo. Se limpia el fondo de la placa por lavado con ayuda de pipeta y las células se transfieren a un tubo Falcon de 15 ml (Becton Dickinson), que se centrifuga a 800 g durante 5 minutos, y las células se resuspenden en un matraz de cultivo celular de 75 cm2 (Corning Inc. , Corning, NY, EE. UU.) con una proporción de división de 1:3.

Se realizan pases cada 4 a 6 días a una proporción de división de 1:3. Normalmente, las células del Pase 3 contienen menos macrófagos y glóbulos, y menos grasa que las de los Pases 1 y 2 y, por tanto, se pueden usar fácilmente para experimentos.

Las CMM-MO en el Pase 3 se usan para la caracterización. Se examinan los marcadores de células madre mesenquimales CD44 y CD90, el marcador de células endoteliales CD31 y el marcador hematopoyético CD45 se examinan citometría de flujo

Transducción lentivírica de integrina a1üpi en CMM-MO

Día 1: Se añaden 1,6 * 104 células CMM-MO en medio fresco al número de pocillos necesarios para cada constructo en una placa de 96 pocillos. Deben usarse pocillos duplicados o triplicados para cada constructo lentivírico y control. Se incuba 18-20 horas a 37 °C en una incubadora humidificada en una atmósfera de 5-7 % de CO².

Día 2: Se retira el medio de los pocillos. Se añaden 110 pl de medio y bromuro de hexadimetrina (concentración final 8 pg/ml) a cada pocillo. Se da vueltas suavemente la placa para mezclar. Se añaden de 2 a 15 pl de a10p1 o partículas lentivíricas de control a los pocillos apropiados. Se da vueltas suavemente la placa para mezclar. Se incuba 18-20 horas a 37 °C en una incubadora humidificada en una atmósfera de 5-7 % de CO².

Día 3: Se retira el medio que contiene partículas lentivíricas de los pocillos. Se añade medio fresco a un volumen de 120 pl a cada pocillo.

Día 4: Se retira el medio de los pocillos. Se añade medio fresco que contiene puromicina.

Día 5 en adelante: Se reemplaza el medio con medio fresco que contiene puromicina cada 3-4 días hasta que se puedan identificar colonias resistentes.

Oclusión permanente de la arteria cerebral media (OACMp)

Trasplante de números diferentes de células a10p1 que sobreexpresan establemente CMM-MO en el área de accidente cerebrovascular del cerebro de ratón

Los ratones reciben dosis únicas de 2,5 * 106, 5 * 106 o 10 * 106 células CMM-MO-a10. Las CMN-a10p1 se implantan mediante el uso de técnicas estereotácticas de formación de imágenes por resonancia magnética para definir los sitios diana que rodean el volumen de accidente cerebrovascular residual.

Conclusión: En conclusión, este estudio demuestra que el trasplante intracerebral de células madre con células que expresan CMM-MO-a10 para el tratamiento de accidente cerebrovascular es generalmente seguro y bien tolerado por ratones y da como resultado una función neurológica mejorada.

Ejemplo 6: Expresión de integrina a io p i en un modelo de ratón con accidente cerebrovascular

Modelo de accidente cerebrovascular

Se llevaron a cabo procedimientos en ratones C57BL/6 (25-30 g, Charles River, Alemania). En resumen, se usó el modelo de isquemia focal permanente por fototrombosis (FT). La temperatura corporal durante la cirugía se mantuvo a 37 °C. Los ratones fueron anestesiados con isoflurano (2 % en O2 bajo ventilación espontánea). Se inyectó el tinte fotosensible Rosa de Bengala (10 mg/ml, Sigma) por vía intravenosa en la vena de la cola. Se hizo una incisión en la piel sobre el cráneo. Se iluminó el cerebro a través del cráneo expuesto con luz fría (Kl 1500 LCD, Schott) y filtro verde (510 nm) durante 20 min en una posición definida estereotácticamente (1 mm lateralmente y 2/-2 mm anterior/posterior al bregma). Como control, se extrajo el cerebro del ratón y se congeló.

En respuesta al accidente cerebrovascular, la expresión de la integrina a10p1 aumentó notablemente el día siete (Figura 13). El análisis confocal muestra que la expresión de NeuN en las neuronas también aumentó en el área del accidente cerebrovascular y había una colocalización parcial de la integrina a10p1 y NeuN (Figura 14 B y C). Además, la expresión de GFAP, en astrocitos maduros, aumentó en el área del accidente cerebrovascular (Figura 14 E y F) y se encontró que se colocaliza con la integrina a10p1. El marcador microglial Iba1 también se encontró dentro del área del accidente cerebrovascular (Figura 14 H e I) pero no en el tejido cerebral de control (Figura 14G)). Sin embargo, no se colocalizaba con la integrina a10p1. Esto sugiere que la integrina a10p1 identifica los tipos de células que pueden participar en la regeneración del tejido cerebral después de un accidente cerebrovascular.

Conclusión: Como respuesta al accidente cerebrovascular, el aumento de la expresión de la integrina a10p1, sola o junto con otros marcadores (NeuN, GFAP e Iba1) puede usarse como biomarcador para determinar el área del accidente cerebrovascular y predecir la gravedad y el resultado de la lesión en pacientes con accidente cerebrovascular.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Uso in vitro de un marcador que comprende una subunidad de integrina alfa10 expresada por una célula neural como marcador para células madre neurales de mamífero y células progenitoras neurales de mamífero, donde la subunidad de integrina alfa 10 se expresa en la superficie celular de la célula madre neural y/o célula progenitora neural de mamífero.

2. Un procedimiento in vitro para identificar una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

b) puntuar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de a), y

c) identificar la célula madre neural y/o la célula progenitora neural de mamífero según la puntuación en b), donde dicha puntuación comprende comparar la medición con una medición realizada en una población celular de referencia que expresa la subunidad de integrina alfa10, así como con una población celular que no expresa la subunidad de integrina alfa10, y donde la subunidad de integrina alfa 10 se expresa en la superficie celular de la célula madre neural y/o célula progenitora neural de mamífero.

3. Un procedimiento in vitro para aislar una célula madre neural de mamífero y/o una célula progenitora neural de mamífero, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

b) puntuar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 de a), y

c) seleccionar la célula madre neural y/o la célula progenitora neural según la puntuación en b), donde dicha puntuación comprende comparar la medición con una medición realizada en una población celular de referencia que expresa la subunidad de integrina alfa10, así como con una población celular que no expresa la subunidad de integrina alfa10, y donde la subunidad de integrina alfa 10 se expresa en la superficie celular de la célula madre neural y/o célula progenitora neural de mamífero,

obteniendo así una célula madre neural y/o célula progenitora neural aislada.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, que comprende además la etapa de poner en contacto la muestra con un anticuerpo que se une específicamente a la subunidad de integrina alfa10 antes de la detección de a).

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, donde el tejido neural deriva del tejido cerebral, tal como el tejido neural es tejido cerebral adulto o tejido cerebral fetal, y donde el tejido neural se selecciona del grupo que consiste en tejido neural humano, canino, equino, bovino, felino, murino, ovino o porcino.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde el tejido neural deriva de la zona subventricular (ZSV) o de la zona subgranular (ZSG) o de las meninges.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, donde la detección de la expresión de una subunidad de integrina alfa10 por una célula se determina midiendo la expresión de proteína integrina alfa10 o midiendo la expresión de ARNm de integrina alfa10.

8. El procedimiento uso según una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde el anticuerpo es:

9. Un procedimiento para fabricar in vitro una población aislada de células de mamífero que están enriquecidas en células madre neurales y/o células progenitoras neurales con respecto a una población de referencia, comprendiendo el procedimiento las etapas de

a) proporcionar al menos una parte de una población de células que comprende una célula madre neural y/o una célula progenitora neural,

c) seleccionar y aislar, o aislar y seleccionar, o aislar, o seleccionar, las células madre neurales y/o las células progenitoras neurales de la población de células en la etapa b) anterior,

10. Un cultivo celular in vitro de células de mamíferos indiferenciadas, donde las células derivan de tejido neural, que comprende al menos un 90 % de células madre neurales de mamífero que expresan una subunidad de integrina alfa10, donde la subunidad de integrina alfa10 se expresa en la superficie celular de las células de mamífero indiferenciadas y donde

c) las células en el cultivo se diferencian en neuronas y/u oligodendrocitos y/o astrocitos tras la retirada tanto del reemplazo de suero como del factor de crecimiento inductor de proliferación.

11. Un cultivo en suspensión de células indiferenciadas de mamíferos, donde que al menos el 90 % de dichas células expresan una subunidad de integrina alfa10, donde dichas células derivan de tejido neural, donde la célula indiferenciada de mamífero es una célula madre neural o una célula progenitora neural, donde la subunidad de integrina alfa10 se expresa en la superficie celular de la célula indiferenciada de mamífero, donde dichas células forman agregados celulares, y donde los agregados celulares se mantienen en un medio de cultivo que contiene un factor de crecimiento inductor de proliferación.

12. Un procedimiento in vitro para determinar las características de un área dañada o enferma del SNC en un paciente que lo necesite, comprendiendo el procedimiento las etapas de:

a) administrar un anticuerpo anti-subunidad alfa10 de integrina a una muestra de un área dañada o enferma del SNC del paciente,

b) detectar la expresión de la subunidad de integrina alfa10 en la muestra del área dañada o enferma del SNC del sujeto, c) determinar características tales como ubicación y tamaño del área dañada o enferma del SNC.

13. Un marcador de subunidad de cadena alfa10 de integrina para células madre neurales de mamífero y/o células progenitoras neurales de mamífero, para su uso en un procedimiento de diagnóstico y/o caracterización de una enfermedad o daño del sistema nervioso, donde el marcador es una subunidad de cadena alfa10 de integrina expresada en la superficie celular de la célula madre neural y/o células progenitoras neurales.

14. Una composición que comprende una población aislada de células madre neurales de mamífero y/o células progenitoras neurales de mamífero para su uso en un procedimiento de tratamiento de enfermedades o daños del sistema nervioso donde la población aislada se enriquece en células madre neurales de mamífero y/o células progenitoras neurales de mamífero que expresan una subunidad de integrina alfa10, y en donde la subunidad de integrina alfa10 se expresa en la superficie celular de la célula madre neural y/o célula progenitora neural de mamífero.

15. El procedimiento, el marcador para uso o la composición para uso según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, donde la enfermedad o daño del sistema nervioso es una lesión del sistema nervioso central o periférico o una enfermedad neurodegenerativa, tal como una lesión del sistema nervioso seleccionada de un grupo que consiste en lesiones de la médula espinal (LME), lesiones cerebrales traumáticas (LCT), lesiones de los nervios periféricos, accidente cerebrovascular y cáncer cerebral; tal como una enfermedad neurodegenerativa seleccionada de un grupo que consiste en enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis múltiple (EM) y atrofia multisistémica.