ES2295012T3 - Poblaciones enriquecidas de celulas del sistema nervioso central. - Google Patents
Poblaciones enriquecidas de celulas del sistema nervioso central. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para la producción de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso central humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC), comprendiendo dicho procedimiento la selección a partir de una población que contiene células neurales o derivadas de células neurales, cuya población no procede de embriones humanos, para células que se unen al anticuerpo monoclonal AC133 o al anticuerpo monoclonal 5E12, para producir una población enriquecida en NS-IC.
Description
Poblaciones enriquecidas de células del sistema
nervioso central.
Esta invención se refiere de manera general a
poblaciones de células madre neurales enriquecidas y células
progenitoras, y a procedimientos para la identificación, aislamiento
y enriquecimiento de células madre neurales y células progenitoras,
particularmente células madre neurales y células progenitoras del
sistema nervioso central y, más particularmente, a poblaciones
enriquecidas de células que inician neurosferas
(NS-IC).
Las poblaciones de células madre sólo
constituyen un pequeño porcentaje del número total de células, pero
son de enorme interés debido a su capacidad para repoblar el cuerpo.
La longevidad de las células madre y la diseminación de la progenie
de las células madre son características deseables. Hay un interés
comercial importante en estos procedimientos debido a que las
células madre tienen una serie de usos clínicos. También hay
interés médico en el uso de células madre como vehículo para terapia
génica.
Las proteínas y otros marcadores de la
superficie celular encontrados en poblaciones de células madre y
células progenitoras son útiles en la preparación de reactivos para
la separación y el aislamiento de estas poblaciones. Los marcadores
de la superficie celular también son útiles en la caracterización
posterior de estas células importantes.
Por ejemplo, el documento WO 9402593 describe
células madre de la cresta neural y otras células madre neurales
pluripotenciales. Además se proporcionan procedimientos de
aislamiento, identificación, propagación, diferenciación, y
utilización de esas células. Específicamente, esta solicitud
describe el uso de anticuerpos monoclonales para el receptor del
factor de crecimiento nervioso de baja afinidad (LNGFR) para aislar
e identificar células madre de la cresta neural en un procedimiento
que se puede extender a otras poblaciones de células madre
neurales.
Yin y col., patente de EE.UU. 5.843.633 describe
un anticuerpo monoclonal denominado AC133, que se une a una
glicoproteína marcadora superficial sobre células madre y células
progenitoras hematopoyéticas. El antígeno AC133 es un antígeno de
la superficie celular 5-transmembrana con un peso
molecular de 117 kDa. La expresión de este antígeno es muy
específica de tejido, y se ha detectado en un subgrupo de células
progenitoras hematopoyéticas derivadas de médula ósea humana,
médula ósea e hígado fetales, sangre de cordón umbilical, y sangre
periférica adulta. El subgrupo de células reconocido por el
anticuerpo AC133 es CD34^{bright}, y contiene sustancialmente
toda la actividad CFU-GM presente en la población
CD34^{+}, haciendo a AC133 útil como reactiva para el aislamiento
y caracterización de células madre y células progenitoras
hematopoyéticas humanas.
No obstante, no se han identificado los
marcadores superficiales específicos para células madre y células
progenitoras no hematopoyéticas, y particularmente células madre
neurales y células progenitoras del sistema nervioso central.
Además, el anticuerpo AC133 no se ha usado en procedimientos para la
identificación, aislamiento, o enriquecimiento de células madre o
células progenitoras no hematopoyéticas, particularmente células
madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central
(SNC). Aún existe la necesidad de herramientas, tales como
anticuerpos monoclonales que sean útiles en el aislamiento y
caracterización de células madre y células progenitoras no
hematopoyé-
ticas humanas, y particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central (SNC).
ticas humanas, y particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central (SNC).
Esta invención proporciona procedimientos para
la identificación, aislamiento, y enriquecimiento de células madre
y células progenitoras no hematopoyéticas humanas, y particularmente
células madre neurales del sistema nervioso central (SNC) que
pueden iniciar neurosferas (NS-IC) y células
progenitoras. La invención también proporciona poblaciones
enriquecidas que contienen células madre neurales del SNC que pueden
iniciar neurosferas, y células progenitoras. Una "célula que
inicia neurosferas (NS-IC)" es una célula que
puede iniciar un cultivo de neurosferas a largo plazo. Una
"neurosfera", a su vez, es un agregado o grupo de células que
incluye células madre neurales y células progenitoras primitivas.
La identificación, cultivo, crecimiento, y uso de neurosferas se
describe en Weiss y col., patente de EE.UU. 5.750.376 y Weiss y
col., patente de EE.UU. 5.851.832. Aunque el término
"NS-IC" está definido por la aptitud o
capacidad de esa célula de formar una neurosfera, estas células se
pueden crecer adecuadamente en cultivos adherentes (véase, por
ejemplo, Johe, patente de EE.UU. 5.753.506), y se debe apreciar que
los procedimientos y poblaciones descritos en el presente documento
no están limitados a cultivos en suspensión de
NS-IC. Una NS-IC es nestina^{+} y
tiene la capacidad de diferenciarse, en condiciones de
diferenciación apropiadas, en neuronas, astrocitos, y
oligodendrocitos.
Según una forma de realización de esta
invención, las poblaciones enriquecidas de células madre neurales
del SNC que pueden iniciar neurosferas (NS-IC), y
el procedimiento de identificación, aislamiento, o enriquecimiento
de esas células, se consigue poniendo en contacto una población de
células que no procede de embriones humanos que contiene al menos
una célula madre o NS-IC, o una célula progenitora,
con un reactivo que se une al antígeno glicoproteína marcador
superficial ("antígeno AC133") reconocido por el anticuerpo
AC133. En una forma de realización preferida el reactivo es el
anticuerpo AC133 (el anticuerpo AC133 se denomina alternativamente
en el presente documento como "5F3"). El uso de técnicas
tradicionales para la clasificación celular, tales como la
inmunoselección (por ejemplo, FACS), permite entonces la
identificación, aislamiento y/o enriquecimiento de células en las
que se ha detectado el contacto entre el reactivo y el antígeno
AC133.
En otra forma de realización, esta invención usa
un anticuerpo, denominado en el presente documento 5E12, para
proporcionar poblaciones enriquecidas de células madre neurales del
SNC que pueden iniciar neurosferas y células progenitoras, y se
puede usar en procedimientos de identificación, aislamiento, o
enriquecimiento de tales células, poniendo en contacto una
población de células que no procede de embriones humanos que
contiene al menos una célula madre NS-IC, o una
célula progenitora, con el anticuerpo 5E12, que se une a un antígeno
glicoproteína marcador superficial distinto del antígeno AC133.
En una forma de realización preferida, las
células de esta invención, preferentemente las células madre
neurales del SNC, están caracterizadas adicionalmente como células
que carecen de marcadores superficiales para CD45 y CD34.
En una forma de realización adicional, esta
invención usa un anticuerpo, denominado en el presente documento
8G1, que se cree que reconoce CD24, que permite la subselección
entre poblaciones de células madre neurales del SNC (caracterizadas
como 8G1^{-/lo}) y poblaciones de células progenitoras del SNC
(caracterizadas como 8G1^{+}).
La invención además proporciona composiciones de
cultivos celulares in vitro que se pueden conseguir de
acuerdo con los procedimientos de la invención; y los usos de
poblaciones celulares que se pueden conseguir de acuerdo con la
invención en la producción de medicamentos para su uso en
trasplantes en un mamífero y en el tratamiento de trastornos del
sistema nervioso central humano.
La figura 1 es un diagrama que ilustra la
proliferación y diferenciación de una NS-IC.
La figura 2 es una serie de fotografías que
muestran que el cultivo de neurosferas se puede iniciar a partir de
células 5F3^{+} seleccionadas de una sola célula.
La figura 3 es una representación de puntos de
los datos de clasificación de células activada por fluorescencia
(FACS) que muestra el aislamiento de células madre neurales del SNC
humano usando marcadores de la superficie celular usando el
anticuerpo monoclonal 5E12. El eje x representa la tinción de
células para anticuerpos contra CD34 y CD45. El eje y representa la
tinción de células con el anticuerpo 5E12.
La figura 4 es una representación de puntos en
dos paneles de los datos de clasificación por FACS que muestra el
aislamiento de células madre neurales humanas mediante marcadores de
la superficie celular. Se disociaron enzimáticamente células
cerebrales fetales humanas como se describe. El panel A muestra que
las células 5F3^{+} co-expresan el antígeno para
el anticuerpo 5E12. El panel B muestra que las células 5F3^{+}
normalmente no expresan el antígeno para el anticuerpo 8G1
(CD24).
La figura 5 es un diagrama que muestra la
distribución de células 5F3^{+} en el cerebro fetal en función de
la edad de gestación.
La figura 6 es una serie de fotografías que
muestran los resultados del trasplante de células neurales humanas
en ratón NOD SCID.
La figura 7 es una serie de fotografías que
muestran que la progenie de células clasificadas 5F3^{-} migran a
través de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo
olfativo cuando son trasplantadas en un modelo de roedor.
La figura 8 es una serie de fotografías que
muestran que la progenie de células clasificadas 5F3^{-} migra a
través de la RMS hacia el bulbo olfativo cuando son trasplantadas en
un modelo de roedor.
La figura 9 muestra las características de las
células AC133^{+}. La figura 9A es una separación citométrica de
flujo de células cerebrales fetales frescas basada en la expresión
de AC133. Las células cerebrales fetales humanas se disociaron
enzimáticamente. Las células se tiñeron con mAbs contra CD34, CD45 y
AC133, y se separaron en fracciones AC133^{-} y AC133^{+}. Las
células hematopoyéticas y endoteliales residuales se excluyeron
mediante el control de CD45^{-} y CD34^{-}, respectivamente. Los
subgrupos AC133^{-} (figura 9B) y AC133^{-} (figura 9C)
clasificados se cultivaron en medio exento de suero y la
proliferación de estas células clasificadas se controló durante 15
días.
La figura 10 muestra un análisis cuantitativo de
la actividad NS-IC por dilución limitante y
clasificación de una sola célula. La figura 10A es un análisis
cuantitativo de la actividad NS-IC por análisis de
dilución limitante después de la clasificación celular. Las células
clasificadas se pusieron en placa en una serie de dosis celulares
limitantes en placas de 96 pocillos mediante el
FACS-ACDU. La figura 10B muestra la expansión clonal
de células madre/progenitoras neurales. Las neurosferas pueden
proceder de una sola célula AC133^{-} clasificada aislada
directamente de cerebro fetal o de una sola célula AC133^{-}
procedentes de neurosferas cultivadas clasificadas/expandidas. La
figura 10C muestra la capacidad de diferenciación de células de
neurosferas obtenidas por clonación. La progenie de neurosferas
procedentes de una sola célula se puede diferenciar en neuronas
(tubulina, verde) y astrocitos (GFAP, rojo).
La figura 11 (prueba no ilustrativa) muestra la
detección de células neurales humanas en sitios no neurogénicos. En
algunos casos (que no forman parte de la invención), se detectaron
células neurales humanas inyectadas en cerebro de neonato de ratones
NOD-SCID en el cuerpo calloso, en la corteza
cerebral y en el cerebelo.
La figura 12 (prueba no ilustrativa) muestra la
proliferación in vivo a largo plazo de la progenie de células
de neurosfera humanas trasplantadas en la SVZ de ratones
NOD-SCID. Las células de neurosfera humanas
AC133^{+} clasificadas/expandidas se trasplantaron en los
ventrículos laterales de ratones NOD-SCID neonatos.
El injerto de células humanas se analizó 7 meses después del
trasplante. La figura 12A es un diagrama esquemático del cerebro de
ratón adulto. Los sitios en los que se evaluó el injerto de células
humanas están indicados en el diagrama. Zona subventricular, SVZ;
corriente migratoria rostral, RMS. La figura 12B muestra la
detección de células neurales humanas en la SVZ. Una sección sagital
del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con antígeno nuclear
anti-humano (FITC, verde) y GFAP
(Cy-5, azul). La figura 12C muestra la detección de
células neurales humanas en proliferación en la SVZ. La sección
sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con antígeno
nuclear anti-humano (FITC, verde), Ki67
(Cy-3, rojo) y GFAP (Cy-5, azul). La
mayoría de células antígeno nuclear humano positivas en la SVZ
también co-expresaron el marcador de proliferación,
Ki67. El trasplante de células de neurosfera humanas en los
ventrículos laterales de ratones NOD-SCID neonatos
no forma parte de la presente invención. (Véanse también las figuras
13 y 14 a continuación).
La figura 13 (prueba no ilustrativa) muestra la
migración y diferenciación in vivo de células de neurosfera
humanas trasplantadas en la RMS y el bulbo olfativo. Las células de
neurosfera humanas AC133^{+}- clasificadas/expandidas se
trasplantaron en el ventrículo lateral de neonatos
NOD-SCID. El injerto de células humanas se analizó 7
meses después del trasplante.
La figura 13A muestra la progenie de células de
neurosfera humanas AC133^{+} clasificadas/expandidas que migra a
través de la RMS. En la RMS, el conjunto de células de antígeno
nuclear humano, también fue positivo con la tinción de recuento
Hoechst 33234 (rosa) (i). Las células antígeno nuclear humano
positivas (Cy-3, rojo) en la RMS estaban
co-localizadas con la expresión de
\beta-tubulina (Alexia 488, verde) (ii). Algunas
de estas células eran claramente dobles positivos (ii, flecha). En
una sección diferente, las células en la RMS se tiñeron con
N-CAM (FITC, verde) y GFAP (Cy-5,
azul) específicos para humano (iii) la figura 13B muestra la
migración y diferenciación de células neurales humanas en el bulbo
olfativo. En el bulbo olfativo, las células antígeno nuclear humano
positivas se distribuyeron en la capa glomerular del bulbo olfativo
(i y ii). En algunos casos, se detectaron células neuronales humanas
N-CAM^{+} (iii).
La figura 14 (prueba no ilustrativa) muestra la
proliferación y diferenciación in vivo a largo plazo de la
progenie de células de neurosfera humanas trasplantadas en la
circunvolución dentada del hipocampo. Las células de neurosfera
humanas AC133^{+} clasificadas/expandidas se trasplantaron en el
ventrículo lateral de ratones NOD-SCID neonatos.
Siete meses después del trasplante de las células de neurosfera
humanas AC133^{+} clasificadas/expandidas en los ventrículos
laterales de ratones NOD-SCID neonatos se pueden
encontrar células humanas en proliferación en el hipocampo. La
figura 14A muestra la detección de células neurales humanas en
proliferación en la zona subgranular de la circunvolución dentada.
La sección sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con
anti-núcleos humanos (FITC, verde), Ki67
(Cy-3, rojo) y GFAP (Cy-5, azul).
Algunas células de antígeno nuclear humano se
co-tiñeron con Ki67 (flecha). La figura 14B muestra
la detección de neuronas humanas en la circunvolución dentada. La
sección sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con
antígeno anti-nuclear humano (Cy-3,
rojo) y anti-tubulina (Alexia 488, verde). Una de
las dos células antígeno nuclear humano positivas también fue
positiva para tubulina (flecha).
Existe una población de células dentro del
sistema nervioso central (SNC) adulto que presenta propiedades de
células madre, en su capacidad para auto-renovarse y
producir los fenotipos celulares maduros diferenciados del SNC
adulto. Estas células madre se encuentran por todo el SNC, y
particularmente en las regiones subventriculares, y en la
circunvolución dentada del hipocampo.
Se pueden aislar células madre sensibles a
factores de crecimiento a partir de muchas regiones del neuroeje y
en diferentes fases del desarrollo, de tejidos del SNC murino, de
roedores y humano. Estas células varían en su respuesta a factores
de crecimiento tales como el EGF, el FGF básico (bFGF,
FGF-2) y el factor de crecimiento transformante
alfa (TGF-\alpha), y se pueden mantener y
expandirse en cultivos sin diferenciar durante largos periodos de
tiempo. Tanto las células progenitoras murinas adultas como
embrionarias responden al EGF y crecen en forma de esferas de
células sin diferenciar. Estas células muestran las características
de células madre en que son pluripotenciales, y en condiciones que
contienen suero se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos, así como mantener una subpoblación que permanece
sin diferenciar y continúa proliferando con la administración de
EGF. Las células progenitoras sensibles al EGF murino expresan ARNm
para el receptor EGF in vitro. También se han identificado
cultivos de células madre neurales del SNC humano. La
identificación, cultivo, crecimiento, y uso de cultivos de células
madre neurales de mamífero, incluyendo de humanos, ya sea como
cultivos en suspensión o como cultivos adherentes, se describe en
Weiss y col., patente de EE.UU. 5.750.376 y Weiss y col., patente
de EE.UU. 5.851.832. De manera similar, Johe, patente de EE.UU.
5.753.506, se refiere a cultivos de células madre neurales del SNC
adherentes. Cuando se cultivan en suspensión, los cultivos de
células madre neurales del SNC normalmente forman neurosferas.
\newpage
La figura 1 muestra la proliferación de una
NS-IC a medida que se desarrolla en una neurosfera,
y la diferenciación posterior en fenotipos neuronales y gliales,
así como la generación de una progenie de NS-IC. En
presencia de uno o más factores de crecimiento que inducen la
proliferación, la NS-IC se divide y da lugar a una
esfera de células no diferenciadas compuesta de más células madre y
células progenitoras (una "neurosfera"). Cuando la neurosfera
obtenida clonalmente se disocia y se pone en placa en forma de
células únicas, en presencia de uno o más factores de crecimiento
que inducen la proliferación, cada NS-IC puede
generar una nueva neurosfera. Las células de una sola neurosfera
son de naturaleza clonal debido a que son la progenie de una única
célula madre neural. En presencia continuada de un factor de
crecimiento que induce la proliferación tal como el EGF o similar,
las células precursoras dentro de la neurosfera continúan
dividiéndose dando como resultado un incremento en el tamaño de la
neurosfera y en el número de células neurales sin diferenciar. La
neurosfera no es inmunoreactiva para la proteína ácida fibrilar
glial (GFAP; un marcador para astrocitos), el neurofilamento (NF;
un marcador para neuronas), la enolasa específica de neuronas (NSE;
un marcador para neuronas) o la proteína básica mielina (MBP; un
marcador para oligodendrocitos). No obstante, las células dentro de
la neurosfera son inmunoreactivas para la nestina, una proteína de
los filamentos intermedios encontrada en muchos tipos de células
del SNC sin diferenciar (Lehndahl y col., 60 Cell
585-595 (1990)). Están disponibles anticuerpos para
identificar la nestina, incluyendo el anticuerpo de rata denominado
Rat401. Si las neurosferas se cultivan en condiciones que permitan
la diferenciación, las células progenitoras se diferencian en
neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los fenotipos maduros
asociados con los tipos celulares diferenciados que pueden proceder
de la progenie de células madre neurales son predominantemente
negativos para el fenotipo nestina.
La terminología usada para células neurales sin
diferenciar, pluripotenciales, auto-renovables ha
evolucionado de manera que estas células ahora se denominan
"células madre neurales". Una célula madre neural es una célula
madre pluripotencial clonogénica que es capaz de dividirse y, en
las condiciones apropiadas, tiene una capacidad de
auto-renovación para NS-IC y puede
incluir en su progenie células hijas que se pueden diferenciar
terminalmente en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Por
tanto, la célula madre neural es "pluripotencial" debido a que
la progenie de células madre tiene múltiples vías de diferenciación.
Una célula madre neural es capaz de
auto-mantenerse, que significa que con cada división
celular, una célula hija también será por término medio una célula
madre.
La progenie de células no madre de una célula
madre neural normalmente se denomina células "progenitoras",
que son capaces de dar lugar a diversos tipos celulares dentro de
una o más líneas. El término "célula progenitora neural" se
refiere a una célula sin diferenciar procedente de una célula madre
neural, y no es por sí misma una célula madre. Algunas células
progenitoras pueden producir una progenie que es capaz de
diferenciarse en más de un tipo celular. Por ejemplo, una célula
O-2A es una célula progenitora glial que da lugar a
oligodendrocitos y astrocitos tipo II, y así se puede denominar
célula progenitora "bipotencial". Una característica distintiva
de una célula progenitora es que, a diferencia de una célula madre,
no presenta auto-mantenimiento, y normalmente se
piensa que está comprometida a una vía de diferenciación particular
y, en las condiciones apropiadas, eventualmente se diferenciará en
glía o neuronas.
El término "células precursoras" se refiere
a la progenie de células madre neurales, y así incluye tanto células
progenitoras como células madre neurales hijas.
Marcadores celulares. Esta invención
proporciona la identificación, aislamiento, enriquecimiento y
cultivo de células madre neurales que son capaces de formar
neurosferas (NS-IC). Las NS-IC se
identifican o seleccionan mediante la unión de antígenos,
encontrados sobre la superficie de las NS-IC, a
reactivos que se unen específicamente al antígeno de la superficie
celular.
Uno de estos antígenos es un antígeno que se une
al anticuerpo monoclonal AC133. El anticuerpo AC133 (denominado en
el presente documento anticuerpo 5F3) es un ejemplo de formas de
realización de anticuerpos de reactivos que reconocen un marcador
celular humano denominado prominina. La prominina es una proteína de
membrana politópica expresada en diversas células epiteliales
(Weigmann y col., 94 (23) Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
12425-30 (1997); Corbeil y col., 112 (Pt 7) J.
Cell. Sci. 1023-33 (1999); Corbeil y col.,
91(7) Blood 2625-6 (1998); Miriglia y col.,
91 (11) Blood 4390-1 (1998)). En la patente de
EE.UU. 5.843.333 se describen diversos anticuerpos AC133. Se
realizó un depósito de la línea celular de hibridoma murino AC133 en
la American Type Tissue Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville
Md. 20852, el 24 de Abril de 1997, y se le dio la denominación ATCC
HB 12346. Estos anticuerpos AC133 son capaces de su inmunoselección
para el subgrupo de células humanas de interés de esta invención.
Los anticuerpos monoclonales AC133 preferidos se pueden obtener
comercialmente en Miltenyi Biotec Inc. (Auburn CA), incluyendo el
anticuerpo AC133/1-PE (Cat #808-01)
y el anticuerpo AC133/2-PE (Cat
#809-01). Para la separación MACS, se prefiere una
mezcla 50:50 de los anticuerpos monoclonales. La alta especificidad
de tejido de la expresión de AC133 es particularmente ventajosa
durante el enriquecimiento para poblaciones de NS-IC
muy purificadas.
El 5E12 es un anticuerpo monoclonal generado
contra células cerebrales fetales humanas disociadas
enzimáticamente. El anticuerpo monoclonal 5E12 se generó
sustancialmente según el procedimiento de inmunización contralateral
descrito en la patente de EE.UU. 5.843.633 de Yin. El antígeno al
cual se une 5E12 tiene un peso molecular putativo de 125 kDa, y
actualmente se cree que es un antígeno distinto de la prominina.
El CD45 es el antígeno común T200/leucocito. Los
anticuerpos para CD45 están disponibles comercialmente. En una
forma de realización preferida, las células de esta invención y los
cultivos que contienen, están caracterizados adicionalmente (además
de ser prominina positivos) como células que carecen de marcadores
superficiales tales como CD45.
El CD34 también se conoce como
gp105-120. Los anticuerpos monoclonales para CD34
están disponibles comercialmente, y los anticuerpos monoclonales
CD34 se han usado para cuantificar y purificar células
madre/progenitoras linfohematopoyéticas para el trasplante de
médula ósea para investigación y para clínica.
Se cree que el anticuerpo monoclonal 8G1
reconoce CD24 (los anticuerpos para CD24 están disponibles
comercialmente), y reacciona específicamente con la cadena de 515
kDa del LRP/A2MR humano que se expresa en un espectro restringido
de tipos celulares. Se observa una fuerte reacción
inmunohistoquímica en hepatocitos, macrófagos tisulares, subgrupos
de neuronas y astrocitos en el sistema nervioso central,
fibroblastos, células del músculo liso, y células espumosas
derivadas de monocitos en lesiones ateroescleróticas en la pared
arterial. El anticuerpo también se puede usar para la
caracterización de un subgrupo de subtipos mielomonocíticos de
leucemia crónica y aguda (CD91). Los anticuerpos para CD91 están
disponibles comercialmente.
Depósito celular. Los cultivos objeto
5E12.5 y 8G1.7 están depositados en condiciones que aseguran que
estará disponible el acceso a los cultivos durante la pendencia de
la solicitud de patente que los describe para alguien determinado
por el Comisionado de patentes y marcas nombrado por él bajo el 37
C.F.R. \NAK 1.14 y el 35 U.S.C. \NAK 122. Los depósitos están
disponibles según sea necesario por las leyes de patente
extranjeras en países en los que se presentan los homólogos de la
solicitud objeto, o su progenie. No obstante, la disponibilidad de
un depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la
presente invención en derogación de los derechos de patente
garantizados por la acción gubernamental.
Además, los depósitos de cultivo objeto 5E12.5 y
8G1.7 se almacenarán y estarán disponibles al público de acuerdo
con las previsiones del tratado de Budapest para el depósito de
microorganismos, es decir, se almacenarán con todas las
precauciones necesarias para mantenerlos viables y sin contaminar
durante un periodo de al menos 30 años después de la fecha de
depósito o para la vida útil de cualquier patente que pueda hacer
pública la descripción de los cultivos más 5 años después de la
última solicitud de una muestra del depósito. El depositante admite
el deber de reponer los depósitos si el depositario fuera incapaz de
facilitar una muestra cuando se solicite, debido a las condiciones
de los depósitos. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al
público de los depósitos de cultivo objeto serán eliminadas de
manera irrevocable tras garantizar una patente que los describa.
Aislamiento, enriquecimiento, y selección de
células. La población de células a partir de la cual se aíslan
las NS-IC puede ser un tejido neural, una población
de células que se disocia del tejido neural, o una población de
células en cultivo celular, por ejemplo, una célula de un cultivo de
neurosferas o un cultivo de células madre neurales adherentes.
La invención proporciona el aislamiento y la
identificación de NS-IC. La identificación de una
célula madre que inicia una neurosfera (NS-IC)
supone la puesta en contacto de una población de células neurales (o
que contiene células neurales o células procedentes de células
neurales) con un reactivo que se une al antígeno AC133 y que
detecta el contacto entre el reactivo que se une al antígeno AC133 y
el antígeno AC133 sobre la superficie de las células. Aquellas
células a las cuales se une el reactivo se identifican como
NS-IC. La identidad de aquellas células se puede
confirmar mediante ensayos para demostrar que las células son de
hecho NS-IC, capaces de la iniciación de
neurosferas, la auto-renovación y la
pluripotencia.
Los procedimientos de esta invención también se
pueden usar para aislar células AC133^{+} a partir de células
AC133^{-} usando un anticuerpo AC133, combinando una población de
células neurales que contiene una fracción de NS-IC
con un reactivo que se une específicamente al antígeno AC133, y a
continuación la selección de células AC133^{+}, para producir una
población seleccionada enriquecida en NS-IC
AC133^{+} comparada con la población de células neurales antes de
la selección.
Por consiguiente, la invención además
proporciona el enriquecimiento de NS-IC a partir de
tejidos neurales o de cultivos de células madre neurales (por
ejemplo, cultivos en suspensión de neurosferas o cultivos adherentes
de células madre neurales). La invención así es útil para el
enriquecimiento de NS-IC a partir de tejidos
neurales en los que las células madre y las células progenitoras se
producen con una frecuencia baja, o que se pueden haber agotado,
tales como tejido fetal, juvenil y adulto. Alguien experto en la
materia puede combinar una población de células neurales que
contienen una fracción de NS-IC con un reactivo que
se une específicamente al antígeno AC133; y seleccionar las células
AC133^{+}. De esta forma, las células AC133^{+} seleccionadas
están enriquecidas en la fracción de NS-IC
comparadas con la población de células neurales.
La selección celular puede ser mediante
cualquier medio adecuado conocido en la materia, incluyendo
citometría de flujo, tal como clasificación celular activada por
fluorescencia usando un fluorocromo conjugado con el anticuerpo
AC133. La selección también puede ser mediante selección magnética
en gradiente elevado usando anticuerpo AC133 que está conjugado a
partículas magnéticas. También está contemplado dentro del alcance
de la invención cualquier otro procedimiento adecuado que incluya
la unión a o la desunión de una fase sólida.
Alguien experto en la materia puede obtener la
población de células por inmunoselección usando un anticuerpo
AC133. La población de células debe contener al menos el 30% de
NS-IC AC133^{+}, preferentemente al menos el
50-70% de NS-IC AC133^{+}, y más
preferentemente más del 90% de NS-IC AC133^{+}. Lo
más preferible sería una población sustancialmente pura de
NS-IC AC133^{+}, que comprende al menos el 95% de
NS-IC AC133^{+}. El grado de enriquecimiento
obtenido, y usado realmente, depende de una serie de factores,
incluyendo el procedimiento de selección, el procedimiento de
crecimiento, y la dosis celular de células que se ponen en cultivo
para la iniciación de las neurosferas.
La población de células se puede obtener del
tejido fetal, juvenil o adulto del sistema nervioso central (SNC)
de un mamífero, o se puede obtener a partir de cultivos existentes
de células madre neurales, como se describe en Weiss, patente de
EE.UU. 5.750.376, o Johe, patente de EE.UU. 5.753.506. En la forma
de realización más preferida, las NS-IC son
humanas. En algunas formas de realización, las células AC133^{+}
en la población se pueden complejar a células endoteliales.
Los cultivos celulares in vitro descritos
en el presente documento que contienen una población enriquecida de
NS-IC AC133^{+} generalmente están caracterizados
porque los cultivos presentan tinción positiva para la nestina y,
en presencia de condiciones que inducen la diferenciación, producen
una progenie de células que se diferencian en neuronas, astrocitos,
y oligodendrocitos.
Alguien experto en la materia puede introducir
una célula AC133^{+} aislada a un medio de cultivo, proliferar la
célula AC133^{+} aislada en el cultivo; particularmente como una
neurosfera; cultivar la progenie de la célula AC133^{+} aislada
en condiciones en las que la célula AC133^{+} aislada se
diferencia en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos; y a
continuación detectar la presencia de neuronas, astrocitos y
oligodendrocitos. La presencia de neuronas, astrocitos, y
oligodendrocitos caracteriza la célula AC133^{+} aislada como una
NS-IC.
Normalmente la NS-IC AC133^{+}
se cultiva en un medio que permita el crecimiento y la proliferación
de neurosferas. El cultivo en el cual prolifera la célula
AC133^{+} aislada puede ser un medio exento de suero que contenga
uno o más factores de crecimiento predeterminados eficaces para
inducir la proliferación de células madre neurales
pluripotenciales. El medio de cultivo se puede suplementar con un
factor de crecimiento seleccionado entre el factor inhibidor de
leucocitos (LIF), el factor de crecimiento epidérmico (EGP), el
factor de crecimiento de fibroblastos básico
(FGF-2; bFGF) o sus combinaciones. El medio de
cultivo además se puede suplementar con un factor de supervivencia
neural (NSF) (Clonetics, CA). Las condiciones en las cuales la
célula AC133^{+} se diferencia en neuronas, astrocitos, y
oligodendrocitos puede ser cultivando la progenie de células
AC133^{+} sobre una superficie recubierta con laminina en un
medio de cultivo que contiene suero fetal bovino (FBS) sin EGF,
FGF-2 o LIF.
La invención también proporciona un
procedimiento para identificar la presencia de un factor de
crecimiento que afecta al crecimiento de NS-IC.
Alguien experto en la materia combina una composición sospechosa de
contener al menos un factor de crecimiento que afecta al
crecimiento de la NS-IC con una composición que
comprende NS-IC, y a continuación determina el
crecimiento de la NS-IC en función de la presencia
de la composición. El crecimiento alterado (incrementado,
disminuido, etc.) de NS-IC indica la presencia en la
composición de un factor de crecimiento que afecta al crecimiento
de NS-IC. A continuación uno puede identificar
posteriormente el factor de crecimiento.
Anticuerpos para AC133. Los anticuerpos
para AC133 se pueden obtener o prepararse como se describe en la
patente de EE.UU. 5.843.633. El antígeno AC133 se puede poner en
contacto con un anticuerpo, tal como diversos anticuerpos
monoclonales AC133, que presentan especificidad para el antígeno
AC133. Un anticuerpo AC133 se caracteriza por unión a la proteína
AC133 en condiciones de transferencia de Western en geles de
SDS-PAGE reductores. El antígeno AC133 tiene un
peso molecular, basado en patrones disponibles comercialmente, del
orden de 117 kDa aproximadamente. El antígeno AC133 se expresa en un
subgrupo de células progenitoras procedentes de médula ósea humana,
médula ósea e hígado fetales, sangre del cordón umbilical, y sangre
periférica adulta.
Los anticuerpos para el antígeno AC133 se pueden
obtener inmunizando un hospedador mamífero inmunocompetente
xenogénico (incluyendo murino, rodentia, lagomorfa, ovino, porcino,
bovino, etc.) con células progenitoras humanas. La elección de un
hospedador particular es principalmente por comodidad. Se puede
obtener una población de células progenitoras adecuadas para la
inmunización aislando células CD34^{+} procedentes de citoquinas
movilizadas de sangre periférica, médula ósea, hígado fetal, etc. Se
puede obtener una población de células progenitoras adecuadas para
la inmunización a partir de células madre neurales del SNC y otras
NS-IC. Las inmunizaciones se llevan a cabo de
acuerdo con técnicas convencionales, en las que las células se
inyectan subcutánea, intramuscular, intraperitoneal,
intravascularmente, etc. Normalmente, se usarán entre 10^{6} y
10^{8} células aproximadamente, que se pueden dividir en 1 o más
inyecciones, normalmente no más de 8 inyecciones aproximadamente,
durante un periodo de entre una y tres semanas aproximadamente. Las
inyecciones pueden ser con o sin adyuvante, por ejemplo, adyuvante
completo o incompleto de Freund, specol, alum, etc.
Después de completar el programa de
inmunización, se puede recoger el antisuero de acuerdo con
procedimientos convencionales para proporcionar antisuero
policlonal específico para las proteínas de la superficie de
membrana de las células progenitoras, incluyendo el antígeno AC133.
Los linfocitos se recogen del tejido linfoide apropiado, por
ejemplo, bazo, nodos linfáticos de drenaje, etc., y se funden con un
compañero de fusión apropiado, normalmente una línea celular de
mieloma, que produce un hibridoma que segrega un anticuerpo
monoclonal específico. La selección de clones de hibridomas para la
especificidad antigénica de interés se lleva a cabo de acuerdo con
procedimientos convencionales.
Los anticuerpos AC133 se pueden producir como
una cadena sencilla, en lugar de la estructura multimérica normal.
Los anticuerpos de cadena sencilla se describen en Jost y col., 269
J. Biol. Chem. 26267-73 (1994), y otros. Las
secuencias de ADN que codifican la región variable de la cadena
pesada y la región variable de la cadena ligera están ligadas a un
espaciador que codifica al menos 4 aminoácidos aproximadamente de
aminoácidos pequeños neutros, incluyendo glicina o serina. La
proteína codificada por esta fusión permite el ensamblaje de una
región variable funcional que retiene la especificidad y afinidad
del anticuerpo original.
Los anticuerpos AC133 se pueden producir
mediante el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes de
inmunoglobulinas quiméricas (Liu y col., 84 Proc. Natl. Acad. Sci.
3439 (1987) y 139 J. Immunol. 3521 (1987). El ARNm se aísla de un
hibridoma u otra célula que produzca el anticuerpo y se usa para
producir ADNc. El ADNc de interés se puede identificar mediante la
reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos
(patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202). Alternativamente, se
prepara una librería y se selecciona para aislar la secuencia de
interés. A continuación la secuencia de ADN que codifica la región
variable del anticuerpo se funde a las secuencias de la región
constante humana. Las secuencias de los genes de las regiones
constantes humanas se pueden encontrar en Kabat y col., Sequences
of Proteins of Immunological Interest. N.I.H. publicación Nº
91-3242 (1991). Los genes de la región C humana
están disponibles fácilmente de clones conocidos. A continuación el
anticuerpo humanizado quimérico se expresa mediante procedimientos
convencionales.
Los anticuerpos AC133 se pueden producir como
fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, F(ab')_{2} y Fab.
Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar por escisión de la
proteína intacta, por ejemplo, mediante proteasas o por escisión
química. Alternativamente, se diseña un gen truncado. Por ejemplo,
un gen quimérico que codifica una porción del fragmento
F(ab')_{2} incluirá secuencias de ADN que codifican el
dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido por un
codón de detención de la traducción para dar la molécula
truncada.
Inmunotinción. Las muestras biológicas se
someten a ensayo para la presencia de células AC133^{+} mediante
cualquier procedimiento de inmunoensayo conveniente para la
presencia de células que expresan la molécula de superficie unida
por los anticuerpos objeto. Los ensayos se pueden llevar a cabo
sobre lisados celulares, células intactas, secciones congeladas,
etc. Los anticuerpos disponibles en Miltenyi Biotec Inc. (Auburn CA)
son adecuados para la tinción inmunofluorescente directa de
células.
Clasificación celular. El uso de
antígenos de la superficie celular para células
NS-IC proporciona un medio para la inmunoselección
positiva de poblaciones celulares progenitoras, así como para el
análisis fenotípico de poblaciones celulares progenitoras usando
citometría de flujo. Las células seleccionadas para la expresión
del antígeno AC133 se pueden purificar posteriormente por selección
para otros marcadores de células madre y de células
progenitoras.
Para la preparación de células progenitoras y
células madre sustancialmente puras, se separa un subgrupo de
células progenitoras de otras células en base a la unión del AC133.
Las células progenitoras y células madre se pueden separar
adicionalmente mediante la unión a otros marcadores superficiales
conocidos en la materia.
Los procedimientos para la separación pueden
incluir separación magnética, usando anticuerpos recubiertos con
cuentas magnéticas, cromatografía de afinidad y "cribado" con
anticuerpos unidos a una matriz sólida, por ejemplo una placa, u
otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una
separación precisa incluyen clasificadores celulares activados por
fluorescencia, que pueden tener un grado variable de sofisticación,
tales como canales de múltiples colores, canales de detección por
dispersión de luz obtusos y de ángulo reducido, canales de
impedancia, etc. Las células muertas se pueden eliminar por
selección con colorantes asociados a las células muertas (yoduro de
propidio [PI], LDS). Se puede emplear cualquier técnica que no sea
excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células
seleccionadas.
Convenientemente, los anticuerpos están
conjugados con marcadores para facilitar la separación del tipo
celular particular, por ejemplo, cuentas magnéticas; biotina, que
se une con afinidad elevada a la avidina o estreptavidina;
fluorocromos, que se pueden usar con un clasificador celular
activado por fluorescencia; haptenos; y similares. Con el FACS se
pueden emplear análisis multi-cromáticos o en una
combinación de separación inmunomagnética y citometría de flujo. El
análisis multi-cromático es de interés para la
separación de células basada en múltiples antígenos superficiales,
por ejemplo, AC133^{+} CD45^{-}, AC133^{-} CD34^{+}, etc.
Los fluorocromos que encuentran uso en un análisis
multi-cromático incluyen ficobiliproteínas, por
ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas; fluoresceína y rojo Texas.
Una designación negativa indica que el nivel de tinción está a o
por debajo del brillo de un isótopo asociado control negativo. Una
designación tenue indica que el nivel de tinción puede estar cerca
del nivel de una tinción negativa, pero también puede ser más
brillante que un isótopo asociado control.
En una forma de realización, el anticuerpo AC133
está conjugado directa o indirectamente a un reactivo magnético,
tal como una micropartícula superparamagnética (micropartícula). La
conjugación directa a una partícula magnética se consigue mediante
el uso de diversos grupos enlazantes químicos, como es sabido en la
materia. El anticuerpo puede estar acoplado a las micropartículas a
través de los grupos amino o sulfhidrilo de la cadena lateral y
reactivos de entrecruzamiento heterofuncionales. Están disponibles
un gran número de compuestos heterofuncionales para la unión a
entidades. Un grupo de enlace preferido es el éster de
N-hidroxisuccinimida del ácido
3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) o el
éster de N-hidroxisuccinimida del ácido
4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico
(SMCC) con un grupo sulfhidrilo reactivo sobre el anticuerpo y un
grupo amino reactivo sobre la partícula magnética.
Alternativamente, el anticuerpo AC133 está
acoplado indirectamente a las partículas magnéticas. El anticuerpo
está conjugado directamente a un hapteno, y están conjugados a las
partículas anticuerpos de segunda fase específicos de haptenos. Los
haptenos adecuados incluyen digoxina, digoxigenina, FITC,
dinitrofenilo, nitrofenilo, avidina, biotina, etc. Los
procedimientos para la conjugación del hapteno a una proteína son
conocidos en la materia, y los kits para esas conjugaciones están
disponibles comercialmente.
Para llevar a la práctica el procedimiento, el
anticuerpo AC133 se añade a una muestra celular. La cantidad de
anticuerpo AC133 necesaria para unir un subgrupo celular particular
se determina empíricamente llevando a cabo una separación y
análisis de prueba. Las células y el anticuerpo AC133 se incuban
durante un periodo de tiempo suficiente para formar los complejos,
normalmente al menos 5 minutos aproximadamente, más habitualmente
al menos 10 minutos aproximadamente, y normalmente no más de 1 hora,
más habitualmente no más de 30 minutos aproximadamente.
Las células se pueden incubar adicionalmente con
anticuerpos o moléculas de unión específicas para marcadores de la
superficie celular conocidos por estar presentes o ausentes en las
células progenitoras o células madre.
Las células marcadas se separan de acuerdo con
la preparación del anticuerpo específico. Los anticuerpos marcados
con fluorocromos son útiles para la separación FACS, las partículas
magnéticas para la selección inmunomagnética, particularmente
selección magnética en alto gradiente (HGMS), etc. En los documentos
WO 90/07380, PCT/US96/00953, y EP 438,520 se describen dispositivos
de separación magnética ejemplares. El AC133 Cell Isolation Kit
(Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA) se puede usar para la selección
positiva de células AC133^{+}. El kit proporciona una herramienta
para el aislamiento en una sola etapa de células AC133^{+}. El
AC133 Cell Isolation Kit contiene reactivo que bloquea la FcR y
Microcuentas coloidales MACS conjugadas al anticuerpo monoclonal de
ratón AC133 anti-humano.
La población celular purificada se puede recoger
en cualquier medio apropiado. Diversos medios están disponibles
comercialmente y se pueden usar, incluyendo medio Modified Eagle
Medium de Dulbecco (dMEM), solución salina básica de Hank (HBSS),
tampón fosfato salino de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove
modificado de Dulbecco (IMDM), tampón fosfato salino (PBS) con EDTA
5 mM, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal bovino
(FCS), seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA),
etc.
Las poblaciones muy enriquecidas en células
progenitoras o células madre humanas se consiguen de esta forma.
Las células deseadas serán el 30% o más de la composición celular,
preferentemente el 50% o más de la población celular, más
preferentemente el 90% o más de la población celular, lo más
preferentemente el 95% o más (sustancialmente pura) de la población
celular.
Uso de células madre/células progenitoras
purificadas. Las células madre/células progenitoras AC133^{+}
son útiles de diversas formas. Las células AC133^{+} se pueden
usar para reconstituir a un hospedador cuyas células se hayan
perdido por enfermedad o lesión. Las enfermedades genéticas
asociadas a células se pueden tratar mediante modificación genética
de células madre autólogas o alogénicas para corregir un defecto
genético o se pueden tratar para proteger contra una enfermedad.
Alternativamente, las células progenitoras alogénicas normales se
pueden transplantar. También se pueden tratar enfermedades distintas
a aquellas asociadas a células, en las que la enfermedad está
relacionada con la carencia de un producto secretado particular tal
como una hormona, enzima, factor de crecimiento, o similar. Los
trastornos del SNC engloban numerosas dolencias tales como
enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de
Alzheimer y de Parkinson), lesión cerebral aguda (por ejemplo,
ictus, lesión craneal, parálisis cerebral) y un gran número de
disfunciones del SNC (por ejemplo, depresión, epilepsia, y
esquizofrenia). En los últimos años las enfermedades
neurodegenerativas se han convertido en un asunto importante debido
a una población anciana en expansión que presenta el riesgo más
elevado para estos trastornos. Estas enfermedades, que incluyen la
enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple (EM), la enfermedad
de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, y la enfermedad de
Parkinson, se han relacionado a la degeneración de las células
neurales en localizaciones particulares del SNC, dando lugar a la
incapacidad de estas células o de la región del cerebro para llevar
a cabo su función prevista. Proporcionando la maduración,
proliferación y diferenciación en uno o más linajes seleccionados
mediante factores de crecimiento específicos diferentes, las
células progenitoras se pueden usar como fuente de células
comprometidas. También se pueden usar neurosferas para producir una
variedad de tipos de células sanguíneas, incluyendo células
mieloides y células linfoides, así como células hematopoyéticas
tempranas (véase, Bjornson y col., 283 Science 534 (1999)).
Las células AC133^{+} también se pueden usar
en el aislamiento y evaluación de factores asociados a la
diferenciación y maduración de células. Así, las células se pueden
usar en ensayos para determinar la actividad del medio, tales como
un medio condicionado, evaluar fluidos para la actividad del factor
de crecimiento, la relación con la dedicación de linajes, o
similares.
Las células AC133^{+} también se pueden
congelar a la temperatura del nitrógeno líquido y almacenarse
durante periodos prolongados de tiempo, descongelarse y poderse
volver a usar. Normalmente las células se almacenarán en DMSO al 5%
y suero fetal bovino al 95%. Una vez descongeladas, las células se
expandirán mediante el uso de factores de crecimiento o células
estromales asociadas a la proliferación y diferenciación de células
madre.
Las células AC133^{+} se preparan mediante el
siguiente procedimiento: se obtuvo cerebro fetal humano (FBR
10-20 semanas de gestación ["s.g."]) de
Advanced Bioscience Resources, INC (Oakland, CA) después de obtener
el consentimiento con conocimiento de causa. Los tejidos del cerebro
fetal humano se cortaron en piezas cúbicas de 1-3
mm usando escalpelos, se transfirieron a tubos de centrífuga de 50
ml y se lavaron una vez con una disolución de EDTA/PBS al 0,2%. Los
tejidos se disociaron enzimáticamente en presencia de colagenasa y
hiuronidasa a 37ºC durante 1 hora. Los restos celulares y los
agregados se retiraron filtrando las suspensiones celulares a través
de un filtro de 70 micrómetros.
Las células de cerebro fetal humano AC133^{+}
se separaron usando el kit de aislamiento de células AC133/1 de
microcuentas de anticuerpo paramagnéticas (Cat. #
508-01, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las
separaciones MACS se llevaron a cabo basándose en las instrucciones
que acompañan al kit. En una separación MACS por citometría de
flujo representativa en un aislamiento de AC133^{+} típico, el 44%
de las células aproximadamente era AC133^{+} CD45^{-}, mientras
que el 2% aproximadamente era CD34^{+} (estas células CD34^{-}
eran células endoteliales complejadas a las
NS-IC).
NS-IC).
Las células AC133^{-} seleccionadas que
resultaron del procedimiento descrito anteriormente (usando cerebro
de 18 s.g.) aún eran heterogéneas. Las células tendían a formar un
complejo con células endoteliales. Las células endoteliales se
identificaron como CD34^{+} o CD105^{+}. La separación MACS de
AC133 también enriquece las células endoteliales CD34^{-} que
están asociadas a células AC133^{+}. (Después del paso, las
NS-IC se separan de las células endoteliales
complejadas y se pueden obtener NS-IC purificadas).
Las células separadas por MACS de AC133^{+} se cultivaron en
presencia de medio que contiene EGF, FGF-2 y LIF,
como se ha descrito anteriormente. En los ejemplos comparativos,
las células procedentes del cerebro fetal con una edad de gestación
temprana (5-12 s.g.; prueba no ilustrativa) estaban
enriquecidas para NS-IC y no fue necesario el
enriquecimiento para iniciar los cultivos de neurosferas. Por otra
parte, las células procedentes de muestras de cerebro fetal más
viejo (16-20 s.g.) contenían mucha menos actividad
NS-IC y requirieron el enriquecimiento para iniciar
los cultivos de neurosferas. En otras palabras, AC133^{-} es útil
para el enriquecimiento de NS-IC procedentes de
tejido cerebral de humano con una mayor edad de gestación. Las
células separadas por MACS de AC133^{+} procedentes de cerebro
fetal (18 s.g.) estaban enriquecidas para la actividad
NS-IC, mientras que todas las células de cerebro
fetal humano (18 s.g.) sin separación MACS de AC133^{+} fracasaron
en iniciar los cultivos de neurosferas.
Las células de neurosferas establecidas
procedentes de células MACS de AC133 expresan nestina, como se
comprueba después de \sim7 días en cultivo y se detectan mediante
anticuerpos policlonales para nestina de conejo
anti-humano. Por ejemplo, entre las células de
neurosferas disponibles en CytoTherapeutics (Sunnyvale, CA), FBR
1069 (18 s.g.) y FBR 1070 (20 s.g.) expresaban nestina. Cuando se
indujo la diferenciación, las células de neurosferas procedentes de
MACS de AC133^{+} se podían diferenciar en neuronas y astrocitos,
como se detecta mediante la tinción de
\beta-tubulina para neuronas y la tinción GFAP
para astrocitos. En este ensayo de diferenciación particular, las
células de neurosferas se cultivaron sobre una superficie recubierta
con laminina en presencia de FBS al 1% sin EGF,
FGF-2 ni LIF.
Se puede usar otro ensayo de diferenciación para
inducir la diferenciación de NS-IC en neuronas,
astrocitos y oligodendrocitos.
Se obtuvo en cultivo celular de neurosferas a
largo plazo, 8.5 FBR, de CytoTherapeutics Inc. (Providence, RI).
Las células de neurosferas 8.5 FBR expresan AC133 de manera
relativamente uniforme. Estas células 8.5 FBR también son
Thy-1^{+}, CD166^{+}, y HLADR^{+}. Cuando se
usa el Ex Vivo 15 como media basal, se inició un mayor
porcentaje de cultivos de neurosferas a partir de tejido de cerebro
primario de 18 s.g. Por tanto es posible evaluar la fracción de
células AC133^{+} en el desarrollo de cultivos de neurosferas. La
proporción de células AC133^{+} se incrementó a medida que se
desarrollaban las neurosferas. Una vez se hubieron establecido bien
las células de neurosferas, virtualmente todas las células que
forman neurosferas expresaron AC133.
El propósito de este ejemplo es probar si las
células AC133^{+} eran las únicas células en el cerebro que
tienen actividad NSC pluripotencial. Se usó mAb contra CD45 humano
para excluir la contaminación de células sanguíneas en el tejido
fetal. En algunos casos, también se usó mAb contra CD34 humano para
excluir las células endoteliales y los complejos progenitores
endotelial-neural. Así las células de cerebro fetal
se definieron como CD45^{-}CD34^{-}. Para medir las actividades
de las células madre neurales y células progenitoras primitivas, se
estableció un ensayo de NS-IC para determinar la
frecuencia de NS-IC en una población dada. Cuando
las NS-IC son raras y expresan uniformemente el
antígeno AC133, las NS-IC se pueden enriquecer
mediante la selección de AC133^{+}, y en consecuencia agotarse en
otras fracciones.
Fuente de anticuerpos monoclonales. El
antígeno AC133 se definió mediante dos mAbs AC133/1 y AC133/2,
ambos conjugados con ficoeritrina, que están disponibles a través de
Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Se obtuvieron
CD45-FITC anti-humano y glicoforina
A-FITC en CALTAG (Burlingame, CA) y Coulter (Miami,
FL) respectivamente. El CD34 anti-humano conjugado
con aloficocianina se obtuvo en BDIS (San Jose, CA).
Preparación celular. Los FBR se
disociaron mediante colagenasa y hiuronidasa, y aún contenían el
complejo progenitor endotelial, que impedía el aislamiento de una
NSC candidato en una sola suspensión celular (las células
endoteliales son CD45^{+}). Para disociar este complejo de célula
endotelial-NS-CI, las células FBR
se procesaron como se ha descrito anteriormente, se trataron
posteriormente con tripsina durante 10-15 minutos.
El antígeno AC133, el antígeno CD45 y el antígeno CD34 eran
resistentes para el tratamiento con tripsina, aunque eran sensibles
a glicoforina A.
Después de la digestión con tripsina, las
células se lavaron y se tiñeron con mAbs contra CD45, glicoforina
A, AC133 y CD34. No se usaron selecciones de cuentas
inmunomagnéticas. Las células se incubaron durante
20-60 minutos en hielo. Después del lavado final,
las células se resuspendieron en disolución HBSS que contiene 1
\mug/ml de yoduro de propidio (PI). Las células marcadas se
analizaron y se clasificaron con un FACS de láser dual (Becton
Dickinson, San Jose). Las células muertas se excluyeron del análisis
mediante sus características de tinción con PI. Después de la
clasificación se comprobó la pureza de las poblaciones celulares
clasificadas mediante un nuevo análisis FACS. Se realizaron unos
perfiles FACS representativos antes de la clasificación y después
de la clasificación de las células AC133^{+} CD45^{-}
(NS-IC, \sim5% de las células de partida) y de
las células AC133^{-} CD45^{-} (\sim87% de las células de
partida).
La actividad NS-IC está muy
enriquecida en el subgrupo AC133^{+} pero no en el subgrupo
AC133^{-}. Las células FBR (normalmente de
16-20 s.g.) normalmente se clasificaron para las
fracciones CD45^{-} CD34^{-} AC133^{-} y CD45^{-}
CD34^{-} AC133^{+}. En las poblaciones CD45^{+} o
CD45^{-}CD34^{+} en FBR no hay actividad NS-IC
significativa.
Las células clasificadas se cultivaron el medio
de neurosferas descrito anteriormente. Normalmente, se usó como
medio basal Ex Vivo 15 o una combinación de medios Ex
Vivo 15, D-MEM, F-12. Para
maximizar el desarrollo de neurosferas, las células clasificadas
normalmente se cultivaron en presencia de LIF,
FGF-2, EGF y el factor de supervivencia neural, NSF
(Cat. CC-4323, Clonetics, San Diego, CA).
Se obtuvo una sola suspensión celular después de
la clasificación celular. Después de 4-5 días de
cultivo in vitro, las células AC133^{+} comenzaron a
proliferar y se observaron pequeñas neurosferas 8-10
días después del inicio del cultivo. Las células podían iniciar las
neurosferas cuando se cultivaban en presencia de LIF,
FGF-2, EGF sin NSF. Los cultivos de neurosferas se
iniciaron en cuatro de cuatro tejidos FBR (18-20
s.g.) clasificados para AC133^{+} CD45^{-} o AC133^{+}
CD45^{-} CD34^{-}.
En contraste, cuando las células FBR AC133^{-}
CD45^{-} se pusieron en cultivo en presencia de LIF,
FGF-2, y EGF, se observaron muy pocas formaciones
de neurosferas, y el paso a un nuevo matraz fracasó. Cuando se
añadió NSF adicional al medio de crecimiento, se observó algo de
inicio de las neurosferas. Así, las células FBR AC133^{-}
CD45^{-} se agotaron en una cantidad significativa de
NS-IC.
\vskip1.000000\baselineskip
La separación de células AC133^{+} se puede
usar eficazmente para enriquecer en células NS-IC
procedentes de tejido. Además la separación de células AC133^{+}
puede enriquecer adicionalmente en células NS-IC
procedentes de preparaciones establecidas. En una prueba, la
clasificación de células AC133^{+} de neurosferas disociadas
(CytoTherapeutics, Providence, RI) proporciona un cultivo de
NS-IC enormemente enriquecido y muestra un
establecimiento de neurosferas incrementado. Usando ese cultivo, la
dosis celular necesaria para iniciar una neurosfera en cada pocillo
(es decir, 100% positivo) se puede reducir desde
3000-10.000 células a 30 células aproximadamente
(véase, Tabla 1, a continuación).
Como se muestra en la Tabla 1, el tejido del
cerebro fresco no enriquecido ("FBR") usado aquí (s.g. 20)
puede contener NS-IC en tales cantidades que
requiere una dosis celular de entre 3000 y 10.000 células para
iniciar las neurosferas en cada pocillo. Usando el procedimiento de
la invención, se pueden obtener poblaciones enriquecidas, de manera
que se requiere una dosis celular de 1000 células o menos, y más
preferentemente una población enriquecida de manera que se requiere
una dosis celular de menos de 100 células. Como se muestra en la
Tabla 1, aquí se ha conseguido el enriquecimiento de manera que se
requiere una dosis celular de sólo 30 células por pocillo
aproximadamente para establecer un cultivo de neurosferas en cada
pocillo. La Tabla 1 también muestra que cuando las poblaciones se
agotan en células AC133^{+} (FBR 1104 células seleccionadas
AC133^{-}), el establecimiento de cultivos de neurosferas a
partir de esas poblaciones está marcadamente reducido.
Ensayo de NS-IC
cuantitativo. Para someter ensayo la presencia de
NS-IC, poblaciones celulares sospechosas de
contener NS-IC pluripotenciales se someten a
desarrollo clonal. Las células se crecen en medio de proliferación
para formar neurosferas, y a continuación se induce la
diferenciación para formar neuronas, astrocitos, y
oligodendrocitos. La presencia de neuronas, astrocitos, y
oligodendrocitos se puede demostrar por inmunotinción. Por ejemplo,
las neuronas se tiñen por la presencia de
\beta-tubulina; los astrocitos se tiñen por la
presencia de GFAP; y los oligodendrocitos se tiñen por la presencia
de 04.
El análisis de NS-IC
cuantitativo se puede realizar sobre células de tejido sin
purificar, sobre células clasificadas AC133^{+}, y sobre líneas
celulares de neurosferas clonales.
Weiss y col., patente de EE.UU. 5.750.376 y
Weiss y col., patente de EE.UU. 5.851.832 describen un "medio de
cultivo que contiene uno o más factores de crecimiento
predeterminados eficaces para inducir la proliferación de células
madre neurales pluripotenciales" y "condiciones de
diferenciación-inducción". No obstante, se pueden
usar diferentes medios basales, incluyendo, pero no limitado a:
- D-MEM/F12 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD);
- Ex Vivo 15 (Bio Whittaker, Walkersville, MD);
- Medio basal progenitor neural, (Clonetics. San Diego, CA); o
- la combinación de los medios basales listados anteriormente.
En la Tabla 2 se proporciona una formulación de
medios típica para cultivar células de neurosferas humanas.
Se añade EGF a 100 ml de medio básico para
neurosferas humanas después de filtrar el medio. El EGF es
relativamente estable en el medio. Se añade FGF-2 y
LIF cuando el medio está listo para su uso. Las concentraciones
finales de los reactivos suplementarios son:
La optimización de la formulación del medio
permite establecer un mayor porcentaje de neurosferas iniciadas a
partir de tejido del cerebro primario. Nosotros preferimos el medio
Ex Vivo 15. La optimización de la formulación del medio
también permite un crecimiento de neurosferas más consistente. Para
maximizar el desarrollo de las neurosferas, las
NS-IC normalmente se cultivan en presencia de LIF,
bFGF, EGF y el factor de supervivencia neural, NSF (Cat.
CC-4323, Clonetics, San Diego, CA). En una prueba,
ambas células neurales FBR 1101 tripsinizadas y células neurales
FBR 1104 tripsinizadas (CytoTherapeutics, Sunnyvale, CA), muestran
un crecimiento incrementado cuando se cultivan en medio Ex
Vivo 15 con LIF, bFGF, EGF, y NSF.
Una fuente de células humanas injertables muy
definidas capaces de una amplia regeneración neuronal podría ser un
producto terapéutico eficaz para el tratamiento de trastornos
neurodegenerativos. Para definir procedimientos reproducibles para
el enriquecimiento de células madre neurales humanas (NSCs) hemos
desarrollado y usado anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos
contra marcadores superficiales sobre células neurales humanas para
identificar y purificar las NSCs mediante clasificación celular
activada por fluorescencia (FACS). Basándose en los análisis FACS e
inmunohistoquímicos, se identificaron dos mAbs, 5F3 y 5E12. Definían
dos pequeños subgrupos de células de cerebro fetal y presentaban
reactividad específica a células en el fondo de la placa y la capa
ependimal de la médula espinal (12 s.g.), sitios conocidos por
contener células madre del SNC. Estos mAbs, tiñen menos del 5% de
las células FBR, y más del 95% de las células procedentes de
cultivos de neurosferas a largo plazo fueron positivos.
Como ejemplo, se clasificaron y probaron dos
poblaciones celulares 5F3^{-}CD34^{-}CD45^{-} (5F3^{-}) y
5F3^{-}CD34^{-}
CD45^{-} (5F3^{-}) para su capacidad para iniciar cultivos de neurosferas. El subgrupo 5F3^{+} estaba muy enriquecido para la actividad celular que inicia las neurosferas; proliferaron para formar pequeñas neurosferas en 8-10 días de cultivo. En contraste, las células 5F3^{-} permanecieron como una suspensión de células únicas, fracasaron en iniciar neurosferas, y eventualmente murieron. Las células de neurosferas clasificadas 5F3^{+} expandidas eran positivas para la expresión de nestina, y se diferenciaron en neuronas y glía después de la exposición a condiciones de diferenciación. Usando el ratón NOD SCID, los estudios in vivo muestran que a las ocho semanas después del trasplante las células de neurosferas 5F3^{+} se pueden injertar y migrar. Estos estudios muestran que hemos identificado y enriquecido NSCs humanas en base a marcadores de la superficie celular y citometría de flujo y demostraron su actividad usando ensayos in vitro e in vivo.
CD45^{-} (5F3^{-}) para su capacidad para iniciar cultivos de neurosferas. El subgrupo 5F3^{+} estaba muy enriquecido para la actividad celular que inicia las neurosferas; proliferaron para formar pequeñas neurosferas en 8-10 días de cultivo. En contraste, las células 5F3^{-} permanecieron como una suspensión de células únicas, fracasaron en iniciar neurosferas, y eventualmente murieron. Las células de neurosferas clasificadas 5F3^{+} expandidas eran positivas para la expresión de nestina, y se diferenciaron en neuronas y glía después de la exposición a condiciones de diferenciación. Usando el ratón NOD SCID, los estudios in vivo muestran que a las ocho semanas después del trasplante las células de neurosferas 5F3^{+} se pueden injertar y migrar. Estos estudios muestran que hemos identificado y enriquecido NSCs humanas en base a marcadores de la superficie celular y citometría de flujo y demostraron su actividad usando ensayos in vitro e in vivo.
En pruebas comparativas posteriores, examinamos
tejidos del cerebro y de la espina dorsal a lo largo de diversas
fases de gestación. La edad de gestación más temprana
(5-12 semanas de gestación; prueba no ilustrativa)
tiene una mayor frecuencia de células que inician neurosferas
(NS-IC) que edades de gestación posteriores
(16-20 semanas de gestación) véase, por ejemplo,
figura 5. El cultivo directo de células procedentes de estos tejidos
da lugar al inicio de neurosferas.
Nuestros datos (mostrados en la Tabla 3 a
continuación) demuestran que la población celular de células
neurales enriquecidas para células 5F3^{+} están enriquecidas para
la actividad NS-IC, hasta 23 veces.
Además, como muestra la figura 2, las
neurosferas pueden proceder de células 5F3^{+} clasificadas a
partir de una sola célula. También hemos demostrado que la
auto-renovación de células de neurosferas
procedentes de células 5F3^{+} clasificadas se puede conseguir
mediante el reinicio de neurosferas procedentes de células únicas
(datos no mostrados). Inversamente, nuestros datos indican que las
poblaciones celulares agotadas de células 5F3^{+} también están
agotadas para la actividad NS-IC.
Como segundo ejemplo, clasificamos poblaciones
celulares usando un anticuerpo monoclonal, 5E12, descrito en el
presente documento. El subgrupo 5E12^{+} se enriqueció para la
actividad celular que inicia las neurosferas, como se muestra en la
Tabla 4 a continuación. Véase también la figura 3. Nuestros datos
sugieren que el antígeno para el anticuerpo 5E12 se
co-expresa con el antígeno AC133 sobre células
5F3^{+}.
También evaluamos el anticuerpo monoclonal 8G1
como subselector para células madre neurales, como se muestra en la
Tabla 4 a continuación. Las células que eran 5F3^{+} y
8G1^{-/lo} presentaban más propiedades de tipo célula madre,
mientras que las células que eran 5F3^{+} y 8G1^{mid/hi}
presentaban más propiedades de tipo célula progenitora.
Transplantamos NS-ICs
clasificadas 5F3^{+} (obtenidas como se ha descrito anteriormente)
en los ventrículos laterales de ratones neonatos inmunodeficientes,
usando técnicas convencionales. El injerto y la migración de las
células de neurosferas humanas se detectó entre 4-8
semanas después de la inyección usando un anticuerpo
Thy-1 específico para humanos (véase figura 6). Como
se muestra en la figura 7, la tinción con
\beta-tubulina humana (un marcador neuronal) y
antígeno nuclear humano (para la localización de células humanas)
reveló la migración de las células de neurosferas humanas a través
de la corriente migratoria rostral (RMS). Además, como se muestra
en la figura 8, la localización usando antígeno nuclear humano
demostró que las células de neurosferas humanas habían migrado a
través de la RMS al bulbo olfativo.
Introducción y resumen. Las células
madre, células clonogénicas con propiedades de
auto-renovación y diferenciación en múltiples
linajes, tienen el potencial para remplazar o reparar tejido dañado.
En este ejemplo, hemos aislado células madre clonogénicas de
cerebro humano (CNS-SC) que inician cultivos de
neurosferas y muestran tanto auto-renovación como
diferenciación en neuronas y glía. Estas CNS-SC
humanas no modificadas genéticamente están marcadas por anticuerpos
monoclonales para marcadores superficiales. Las células son 5F3
(AC133)^{+}, 5E12^{+}, CD34^{-} CD45^{-} y
CD24^{-/lo}. Las células clasificadas AC133^{+} CD34^{-}
CD45^{-} únicas iniciaron los cultivos de neurosferas y
presentaron una diferenciación en múltiples linajes. Una vez
trasplantadas en cerebros de ratones neonatos inmunodeficientes las
CNS-SC clasificadas y expandidas presentan un
injerto, proliferación, migración y diferenciación potentes de una
forma específica de sitio.
En este ejemplo, demostramos que los mAbs 5F3 y
el nuevo mAb, 5E12, detectan un subgrupo distinto de células de
cerebro fetal humano (FBr). La clasificación celular activada por
fluorescencia usando estos mAbs junto con mAbs que marcan la
contaminación con sangre y células endoteliales (CD34 y CD45) da
como resultado un subgrupo de células FBr humanas,
AC133^{+}CD34^{-}CD45^{-}. Después de la clasificación
celular, las células clasificadas son capaces al nivel de una sola
célula de iniciar las neurosferas, auto-renovación,
y diferenciación en múltiples linajes, células que proponemos como
CNS-SC humanas. Estas CNS-SC humanas
candidato se auto-renovaron y se expandieron
significativamente en cultivos de neurosferas, y se diferenciaron
in vitro en neuronas y glía. Las CNS-SC
candidato clasificadas y expandidas se pueden transplantar en los
ventrículos laterales de cerebros de ratón NOD-SCID
recién nacido, donde experimentan un injerto específico de sitio
aparentemente apropiado, auto-renovación
continuada, migración y diferenciación durante al menos 7 meses. Ese
transplante de CNS-SC humanas en cerebros de
ratones neonatos no forma parte de la invención, pero es útil para
entender la invención.
Búsqueda de marcadores de células madre
neurales del SNC; estrategia. Propusimos la hipótesis de que los
marcadores de las CNS-SC candidato sólo se debían
expresar en un pequeño subgrupo de células FBr. Puesto que había
evidencias de que los cultivos de neurosferas contienen una
población enriquecida de células madre/progenitoras, propusimos la
hipótesis de que los marcadores de células madre neurales candidato
se deben expresar más abundantemente en estas células. Así,
seleccionamos mediante los mAbs usados previamente para definir las
células madre hematopoyéticas humanas (HSC).
Las poblaciones clasificadas se probaron para
determinar si estaban enriquecidas en células que inician las
neurosferas (NS-IC). Cualquier mAb que separe
limpiamente FBr en 2 fracciones (una fracción que estableció un
cultivo de neurosferas y una que no) se consideró un mAb candidato
para ayudar a identificar NS-IC. En la selección
inicial, se buscaron mAbs que teñían positivamente una pequeña
fracción de FBr y una gran fracción de células de neurosferas
cultivadas a largo plazo, y otros mAbs (para la selección negativa)
que teñían la mayoría de células FBr pero una pequeña fracción de
células de neurosferas. Las FBr disociadas enzimáticamente y las
células de neurosferas cultivadas a largo plazo se tiñeron con más
de 50 mAbs conocidos.
Se ha descrito previamente un cultivo de
neurosferas a largo plazo 8.5 FBr, (Carpenter y col., 158 Exp.
Neurol. 265-78 (1999)). Estas células se cultivaron
en medio normal de neurosferas humanas: medio basal
D-MEM/F 12 con suplemento N-2
(Gibco), glucosa al 3%, glutamina 0,2 M y 0,2 mg/ml de heparina en
presencia de FGF-2 (20 ng/ml), EGF (20 ng/ ml), y
LIF (10 ng/ml). Las células cultivadas se recogieron y se disociaron
enzimáticamente en presencia de colagenasa durante
5-10 minutos para su paso o se tripsinizaron para
obtener una suspensión de células únicas para la tinción con
mAbs.
Las células de neurosferas no expresaron los
marcadores vasculares y hematopoyéticos CD34 o CD45. En contraste,
Thy-1, un marcador de la superficie celular crítico
que identifica tanto HSC de ratones como de humanos, estaba
expresado a niveles elevados virtualmente en todas las células FBr y
células de neurosferas, y por tanto no fue útil. De manera
interesante, la selección del anticuerpo inicial reveló que otro
marcador de HSC, AC133, se expresaba sólo en el
1-5% de las células FBr procedentes de tejido de
16-20 semanas de gestación (s.g.) y en el 90% de las
células de neurosferas cultivadas.
Anticuerpo monoclonal AC133 enriquecido en
CNS-SC humanas. Se obtuvo tejido FBr humano de
los restos de los fetos de 16-20 semanas de
gestación (s.g.) de Advanced Bioscience Resources, Inc., según las
directrices del NIH. Los tejidos FBr se cortaron en piezas de
1-3 mm usando escalpelos, se transfirieron a tubos
de centrífuga de 50 ml y se lavaron una vez con una disolución de
EDTA/PBS al 0,02%. Los tejidos se disociaron enzimáticamente en
presencia de colagenasa al 0,1% (Roche, Indianapolis, IN) y
hiuronidasa al 0,1% (Sigma, St Louis, MO) a 37ºC en HBSS
suplementado con BSA al 0,1%, HEPES 10 mM y DNasa durante 1 h. Para
obtener una suspensión de células únicas, las células FBr
disociadas se trataron posteriormente con tripsina al 0,05%, EDTA 53
mM (Gibco, Grand Island, NY) durante 10-15 minutos.
Los restos celulares y agregados se eliminaron filtrando la
suspensión celular a través de un filtro de 70 micrómetros.
Se obtuvieron suspensiones celulares únicas
después del tratamiento con colagenasa/hiuronidasa seguido de
tripsinización. Por tanto, la selección estaba limitada a epítopos
de la superficie celular resistentes a tripsina.
Los cultivos en bruto de células CD45^{+} o
CD34^{+} clasificadas procedentes de FBr fracasaron en iniciar
los cultivos de neurosferas. Así, ambos CD34 y CD45 se podrían usar
como selectores negativos para las CNS-SC
humanas.
Para probar si CNS-SC se pueden
aislar en relación a la expresión de AC133, las células FBr humanas
se tiñeron con anticuerpos para CD34, CD45 y AC133. El antígeno
AC133 estaba definido por dos mAbs AC133/1 y AC133/2, ambos
conjugados con ficoeritrina (PE), que está disponible a través de
Milteny Biotec (Auburn, CA). Se obtuvieron
CD45-FITC anti-humano, CD34
anti-humano conjugado con aloficocianina (APC) en
CALTAG (Burlingame, CA) y BDIS (San Jose, CA), respectivamente. Las
células FBR disociadas se incubaron con mAbs contra
CD45-FITC, AC133/1 AC133/2-PE y
CD34-APC durante 20-60 minutos en
hielo. Después del lavado final, las células se resuspendieron en
disolución HBSS que contiene 0,5 g/ml de yoduro de propidio (PI).
Las células marcadas se analizaron y se clasificaron con un
dual-laser Vantage SE (BDIS, San Jose). Las células
muertas se excluyeron del análisis mediante sus características de
tinción con PI. La contaminación por células sanguíneas y células
endoteliales se excluyó sacando las células CD45^{+} y las
células CD34^{+}, respectivamente. Después de la clasificación se
comprobó la pureza de las poblaciones celulares clasificadas.
Se clasificaron y cultivaron dos poblaciones
celulares, AC133^{-}CD34^{-}CD45^{-} (AC133^{-}) y
AC133^{+}CD34^{-}CD45^{-} (AC133^{+}), para su actividad
NS-IC. Aunque la expresión de AC133 inicialmente
parece ser un continuo (figura 9A), el enriquecimiento previo con
FACS de células AC133^{+} seguido por una segunda ronda de
clasificación celular reveló una población AC133^{+} distinta
(figura 9A). En todas las pruebas posteriores, ambos subgrupos
AC133^{-} y AC133^{+} se clasificaron dos veces, dando como
resultado fracciones de células FBr AC133^{-} y AC133^{+} con
una pureza elevada (figura 9A).
Las suspensiones de células únicas AC133^{+}
cultivadas en condiciones de neurosferas se volvieron de aspecto
blástico, se adhirieron sobre la placa de plástico y comenzaron a
iniciar la división celular. Después de 4-5 días en
cultivo, una gran fracción de las células AC133^{+} comenzó a
proliferar y a flotar en forma de grupo de unas pocas células. Se
observaron pequeñas neurosferas tan sólo 7-10 días
después del inicio del cultivo (figura 9C). En contraste, las
células AC133^{-} clasificadas permanecieron en forma de
suspensión de células únicas, fracasó en iniciar las neurosferas, y
eventualmente murieron (figura 9B). Así, la actividad
NS-IC se encuentra en el subgrupo AC133^{+} pero
no en el subgrupo AC133^{-} de células FBr CD45^{-}
CD34^{-}.
Sólo las células FBr humanas AC133^{+}
contienen actividad NS-IC. Puesto que el ensayo
de NS-IC cualitativo demostró una diferencia
notable en la proliferación entre subgrupos AC133^{-} y
AC133^{+}, quisimos determinar la frecuencia de
NS-IC en suspensiones de células FBr sin fraccionar
(es decir, después del procesado de las células) y diversas
suspensiones de células FBr fraccionadas. Las células FBr sin
fraccionar se pusieron en placa por dilución limitante
(100-10.000 células/pocillo) en placas de 96
pocillos usando la unidad de deposición de células automática
(ACDU) FACS. Estas placas se cultivaron durante 6-8
semanas, y los pocillos que contenían las neurosferas se marcaron
como positivos.
Las células FBr clasificadas se cultivaron en
cultivo de neurosferas en medio Ex Vivo 15 (Bio Whittaker,
Walkersvile, MD) con suplemento N2 (Gibco) en presencia de
FGF-1 (20 ng/ml), EGF (20 ng/ml), LIF (10 ng/ml), el
factor de supervivencia neural 1 (Clonetics, San Diego, CA) y 60
g/ml de N-acetilcistina (Sigma) (medio de iniciación
de las neurosferas). La formulación del medio se optimizó basándose
en análisis de la frecuencia de la dilución limitante de las
células FBr. Los cultivos se introdujeron semanalmente y se pasaron
cuando las neurosferas se volvían grandes. En algunos casos, las
células FBr clasificadas se volvieron a clasificar mediante la
unidad de deposición de células automática (ACDU) en placas de 96
pocillos para evaluar la frecuencia de los precursores para iniciar
los cultivos de neurosferas. Estas placas de 96 pocillos se
introdujeron semanalmente y la presencia de neurosferas en los
pocillos se valoró 6-8 semanas después del inicio
del cultivo. Se usó análisis por regresión lineal de la proporción
de pocillos negativos a cada concentración celular para determinar
la frecuencia de NS-IC.
Se detectaron múltiples neurosferas en los
pocillos con dosis celulares elevadas (es decir, 10.000 células por
pocillo), mientras que en los pocillos con una dosis celular
inferior (es decir, 300-1000 células/pocillo), los
pocillos positivos contenían sólo neurosferas únicas. A
100-300 células por pocillo, sólo pocillos
excepcionales contenían una única neurosfera. Cuando el log de
pocillos negativos se representa frente al número de células por
pocillo, se encuentra una función lineal recta; al 37% de pocillos
negativos se determinó un único punto para NS-IC
(figura 10A). En un tejido representativo mostrado en la figura 10A,
las células de cerebro procesado control contenían actividad
NS-IC a una frecuencia de 1/880 células. En el
subgrupo AC133^{-} hubo una reducción de la frecuencia de
NS-IC a 1/4860 células. En contraste, la actividad
NS-IC estaba muy enriquecida en el subgrupo
AC133^{+} con una frecuencia de 1/32 células (figura 10A). La
frecuencia de NS-IC en 8 tejidos FBr diferentes
(16-20 semanas de gestación) se evaluó como se
resume en la figura 10B y en la Tabla 5.
En células de cerebro fetal sin fraccionar,
aproximadamente 1 en 730 células contiene actividad
NS-IC. El subgrupo AC133^{-}, que representa >
95% de FBr contenía <1 en 4300 células con NS-IC
y por tanto se redujo \sim6 veces. En contraste, la actividad
NS-IC estaba enriquecida de media 23 veces en el
subgrupo AC133^{+} con \sim1/31 (intervalo de 1/6 a 1/72)
células FBr frescas capaces de iniciar una neurosfera. Puesto que
las células AC133^{+} representan el \sim4,6% de FBr (es decir,
1 en 22 células), el enriquecimiento de la actividad
NS-IC es virtualmente paralelo a la frecuencia de
células AC133^{+} en FBr. Así, las células AC133^{+} contenían
todas actividad NS-IC detectable en suspensiones
celulares FBr de 16-20 semanas de gestación.
Expansión clonal de neurosferas,
auto-renovación y diferenciación a partir de células
clasificadas AC133^{+} individuales. Para confirmar la
clonalidad de las neurosferas, células clasificadas AC133^{+}
procedentes de FBr únicos se pusieron directamente en placa en los
pocillos de una placa de 96 pocillos mediante el ACDU. Después de 8
semanas, algunos pocillos contenían neurosferas individuales,
confirmando que éstas procedían de células clasificadas AC133^{+}
individuales (figura 10C).
La actividad de auto-renovación
de neurosferas procedentes de AC133^{+} se probó para la capacidad
de reiniciar cultivos de neurosferas. Por ejemplo, cultivos de
neurosferas primarios iniciados mediante células FBr clasificadas
AC133^{+} se disociaron y se volvieron a poner en placa como una
sola célula por pocillo. Nueve de los 96 pocillos presentaron el
desarrollo de una sola neurosfera. En una prueba, se obtuvieron
neurosferas por clonación a partir de células de neurosferas
clasificadas AC133^{+} con una eficacia de siembra del 10%
aproximadamente. Consistentemente, las células de neurosferas que
se convirtieron en AC133^{-} fracasaron en reiniciar los cultivos
de neurosferas secundarios. Así, estos resultados cuantitativos
demostraron que la actividad NS-IC está muy
enriquecida en el subgrupo AC133^{+} y reducida en el subgrupo
AC133^{-} de células FBr.
Para probar la capacidad de diferenciación de
células de neurosferas obtenidas por clonación, se recogieron, se
pusieron en placa, y se indujo la diferenciación de neurosferas
únicas en presencia de los factores neurotrópicos, BDNF y GDNF. Las
células de neurosferas de recogieron y se disociaron con colagenasa
y se pusieron en placa sobre portaobjetos con cámara recubiertos
con poli-ornitina. Se cultivaron en el medio de
inicio de las neurosferas durante un día hasta que se sembraron en
la placa. El cultivo se sustituyó con medio de diferenciación, que
consiste en Ex Vivo-15, N2, NAC, BDNF (10 ng/ ml), GDNF (10
ng/ml) y laminina (1 g/ml). Después de 1-2 semanas,
los portaobjetos con cámara se fijaron con paraformaldehído al 4% en
PBS y se tiñeron para detectar la diferenciación en neuronas y
astrocitos, con mAbs contra tubulina y la proteína ácida fibrilar
glial (GFAP).
En estas condiciones, las neurosferas derivadas
de AC133^{+} se diferenciaron en neuronas y astrocitos (figura
10D). Juntos, los datos sugieren que el mAb AC133 es un marcador
para NS-IC y se puede usar para enriquecer las
CNS-SC humanas. Estos cultivos de neurosferas
procedentes de AC133^{+} se han pasado continuamente (> P15
antes de congelar). En una estimación grosera, el número absoluto de
células AC133^{+} se ha incrementado al menos 1000 veces en el 5º
paso (Tabla 6), y son capaces de reiniciar la reproducibilidad de
las neurosferas. Por tanto, AC133 define una población celular
neural que se expande continuamente y se
auto-regenera in vitro.
Las NS-IC también están
enriquecidas en células 5E12^{+} y 8G1^{-/lo}; generación de
nuevos mAbs. Actualmente con la selección de la utilidad de
mAbs disponibles, buscamos identificar nuevos marcadores de la
superficie celular en células neurales humanas. Las células FBr se
disociaron con una combinación de colagenasa y hiuronidasa y se
usaron para inmunizar ratones BALB/c, con una estrategia de señuelo
para aumentar los mAbs específicos de tejido. Se seleccionaron 1900
células de hibridoma aproximadamente que crecen en pocillos y los
hibridomas se seleccionaron, expandieron, y se probaron
posteriormente para su reactividad específica al cerebro humano. Se
produjeron anticuerpos monoclonales para células neurales humanas
usando una estrategia de inmunización de señuelo descrita
previamente por Yin y col., 90 Blood 5002-12 (1997).
Resumiendo, se inmunizaron ratones BALB/c en una almohadilla del
pie con sangre periférica enriquecida con leucocitos humanos
señuelo, y en la almohadilla del pie contralateral con células de
cerebro fetal humano disociadas enzimáticamente. Las células del
nodo linfático donadoras que drenan de la inmunización de las
células FBr humanas se recogieron, se procesaron para una
suspensión celular y se fundieron con una línea de mieloma de ratón.
Esta fusión a una línea de mieloma de ratón ha resultado en 1900
células de hibridoma que crecen en pocillos. Se seleccionaron 180
hibridomas aproximadamente, se expandieron, y se probaron
posteriormente para su reactividad específica a las células de
cerebro humano.
Como se ha descrito anteriormente, las
CNS-SC estaban muy enriquecidas en el subgrupo
AC133^{-}. Para caracterizar adicionalmente el fenotipo de las
CNS-SC, probamos si las células AC133^{+} son
fenotípicamente heterogéneas. Así, las células AC133^{-} se
seleccionaron para la co-expresión de otros
marcadores del plantel de nuevos mAbs. Se identificaron dos nuevos
mAbs, 5E12 y 8G1. El mAb co-tiñe las células
AC133^{+} y células de neurosferas a largo plazo. Las células FBr
5E12^{+} están enriquecidas y las células 5E12^{-} están
agotadas en la actividad NS-IC (Tabla 5).
En el desarrollo del cerebro fetal, la mayoría
de células FBr (> 90%) expresaron un nivel elevado del marcador
8G1 (figura 4). Las células AC133^{+} eran heterogéneas en la
expresión de 8G1; mayoritariamente células 8G1^{-/lo}, algunas
8G1^{mid}, y pocas 8G1^{hi} (figura 12). De manera interesante,
la expresión de 8G1 sobre células de neurosferas humanas cultivadas
a largo plazo también fue heterogénea. Los estudios por
inmunoprecipitación y bloqueo determinaron que 8G1 es un mAb
anti-CD24. Históricamente, CD24 es conocido como el
antígeno estable al calor (HSA) y se usa ampliamente como marcador
en hemato-linfopoyesis (Alterman y col., 20 Eur J
Immunol 1597-602 (1990)). HSA se expresa a niveles
bajos en ratón HSCs (Shih & Ogawa, 81 Blood
1155-60 (1993); Spangrude & Scollay, 18 Exp.
Hematol. 920-6 (1990)), y a niveles elevados en
células proB y pre-B y timocitos, y está
completamente regulado aguas abajo cuando estas células se vuelven
linfocitos maduros (Alterman y col., 20 Eur. J. Immunol.
1597-602 (1990)). Como se muestra en la Tabla 5, la
frecuencia de NS-IC es mayor en la fracción
AC133^{+}CD24^{-/lo} comparado con el subgrupo
AC133^{+}CD24^{mid/hi}.
Capacidad de injerto potente de células de
neurosferas humanas procedentes de AC133^{+} (prueba no
ilustrativa). Para probar la capacidad de injerto, migración y
diferenciación in vivo de CNS-SC
clasificadas/expandidas humanas y ayudar en la comprensión de la
presente invención, se inyectaron 10^{5} o 10^{6} células de
neurosferas (iniciadas a partir de células FBr clasificadas
AC133^{+}) en los ventrículos laterales o en los cerebros de
ratón neonato NOD-SCID. Como se ha mencionado
anteriormente, ese trasplante de células humanas en cerebros de
ratón no forma parte de la presente invención.
Las células de neurosferas clasificadas
AC133^{+} expandidas en el paso 6-10 se recogieron
y se disociaron suavemente con colagenasa para obtener pequeños
grupos de células. Las células se resuspendieron en el equivalente
de 0,25 x 10^{5} o 2,5 x 10^{5}/L. Los ratones neonatos (< 24
horas después del nacimiento) se crio-anestesiaron
usando hielo; una vez anestesiados, las crías se pusieron en un
dispositivo estereotáxico. Con una aguja se perforó un pequeño
agujero en el cartílago y las suspensiones celulares se introdujeron
con una jeringa Hamiliton en ambos espacios ventriculares
laterales. Los ratones neonatos se inyectaron con 21 de células que
abarcan 10^{5}-10^{6} células/inyección. Las
crías se reanimaron por calentamiento para controlar el resultado
de la cirugía y a continuación se devolvieron a la madre. Los
ratones inyectados se mantuvieron durante 7 meses antes de probar el
injerto de células humanas.
Los ratones NOD-SCID neonatos se
escogieron como receptores para maximizar la participación de
células inyectadas en el sistema neurológico, puesto que la génesis
celular aún está activamente en progreso en algunas partes del
cerebro del ratón neonato. Además, los ratones inmunodeficientes no
rechazan tejidos humanos, y los ratones SCID y
NOD-SCID se han usado como hospedadores para
estudios in vivo de hematopoyesis humana e injerto de tejido
(McCune y col., 241 Science 1632-9 (1988);
Kamel-Reid & Dick, 242 Science
1706-9 (1988); Larochelle y col., 2 Nat. Med.
1329-37 (1996)). Siete meses después del trasplante,
los animales se sacrificaron, y se tiñeron secciones sagitales con
mAbs específicos para humanos contra N-CAM y
Thy-1 así como el antígeno nuclear humano.
Después de 7 meses tras el trasplante, los
ratones NOD-SCID se anestesiaron profundamente con
Avertin y se perfundieron con PBS, seguido de paraformaldehído al
4% en tampón fosfato. Los cerebros se fijaron durante toda la
noche, se pusieron en una disolución de sacarosa al 30% y se
congelaron en el compuesto OCT. Los cerebros se seccionaron
sagitalmente a un grosor de 5 \mum para la inmunocitoquímica
posterior. Para detectar las células humanas en los cerebros de
ratón trasplantados, la secciones se tiñeron con anticuerpos
monoclonales de ratón contra Thy-1 humana
(Pharmingen, San Diego, CA), N-CAM, tubulina (Sigma)
o el antígeno nuclear (Chemicon) seguido de Ig de cabra
anti-ratón conjugada con Alexa 488 (Molecular Probe,
Eugene, OR).
La tinción de estos mAbs sobre controles de
cerebro de ratón no mostró reactividad cruzada. Los mAbs contra
GFAP y \beta-tubulina tiñeron ambas células
humanas y de ratón, y así se usó el marcaje doble con el anticuerpo
nuclear anti-humano para demostrar las poblaciones
celulares específicas del linaje humano. El análisis detallado se
centra particularmente en los dos sitios del cerebro que se ha
demostrado previamente que son sitios de neurogénesis activa, la
zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la
circunvolución dentada del hipocampo (figura 12A).
Se encontraron células humanas por todo el
cerebro del ratón y eran abundantes en la SVZ siete meses después
de la inyección (figura 12). Por ejemplo, en un área muchas células
con núcleos^{+} de humanos estaban rodeadas por células
GFAP^{+} (figura 12B). Los exámenes microscópicos confocales
indicaron que la mayoría de las células humanas eran GFAP^{-},
pero también se detectaron células GFAP^{+} humanas ocasionales
(figura 12B, flecha).
Los cerebros de ratón trasplantados se
seccionaron a un grosor de 40 micrómetros en un microtomo y se
tiñeron con mAbs, y se analizaron usando un microscopio de barrido
de luz confocal Bio-Rad como se ha descrito
previamente por Suhonen y col., 383 Nature 624-7
(1996).
Debido a que las células madre/progenitoras en
la SVZ se ha demostrado que proliferan continuamente, probamos si
la progenie de las células de neurosferas clasificadas/expandidas
AC133^{+} humanas trasplantadas aún estaba proliferando in
situ. Una sección del cerebro trasplantado se tiñó con Ki67, un
marcador asociado a la proliferación celular. Sorprendentemente, un
grupo de células humanas en la SVZ, anidado en células GFAP^{+},
co-expresó Ki-67, que indica que las
células humanas en la SVZ pueden, como sus homólogos de ratón,
continuar proliferando 7 meses después del trasplante en la SVZ
(figura 12C).
En el sistema olfativo de roedores, la progenie
de células madre/progenitoras que ha proliferado en la SVZ entra en
la corriente migratoria rostral (RMS) y migra al bulbo olfativo
(Lois & Alvarez-Buylla, 264 Science
1145-8 (1994)). La "cadena de neuroblastos" de
las progenitoras de roedores endógenos en la RMS expresan
\beta-tubulina y N-CAM (Fricker y
col., 19 J. Neurosci. 5990-6005 (1999); Gage &
Cristen, Isolation, characterization and utilization of CNS stem
cells (Springer, Heidelberg, 1997)). Las secciones sagitales que
contienen la RMS se examinaron para la presencia de células
neurales humanas. En ratones transplantados con células de
neurosferas clasificadas AC133^{+}, se detectaron un gran número
de células humanas, comenzando en la SVZ y que se extienden por
toda la RMS (figura 13A). Muchas de estas células humanas agrupadas
estaban colocalizadas con \beta-tubulina, pero
fue difícil identificar células doble positivo en esos grupos. El
examen cuidadoso de tejidos que contienen menos células humanas
reveló múltiples células que eran doble positivo tanto para
\beta-tubulina como para el antígeno nuclear
humano (figura 13B, flecha). Además, muchas de estas células en la
RMS expresaban el marcador específico humano, N-CAM
(figura 13C).
Después de migrar a través de la RMS, se espera
que la progenie de células madre/progenitoras entre en el bulbo
olfativo y se extienda hacia el glomérulo olfativo a las capas
periglomerulares del bulbo (Lois &
Alvarez-Buylla, 264 Science 1145-8
(1994)). Como se muestra en la figura 13D, la progenie trasplantada
de células humanas se distribuye en las capas glomerulares así como
en las capas periglomerulares. Algunas de estas células expresaban
el N-CAM humano, que indica que estaban destinadas a
linajes neuronales. Así, la progenie de las CNS-SC
humanas clasificadas/expandidas trasplantadas migra a la RMS, se
distribuyen y se diferencian en el linaje neuronal en el bulbo
olfativo. En unos pocos casos se observaron células humanas tirosina
hidroxilasa positivas.
Otro lugar donde tiene lugar la neurogénesis en
la vida del adulto es la circunvolución dentada del hipocampo (Gage
y col., 92 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11879-83
(1995)). En este ejemplo, encontramos numerosas células nucleares
humanas en la circunvolución dentada del hipocampo. Algunas de las
células humanas en la zona celular subgranular
co-expresan Ki-67, que indica que
aún son capaces de proliferar después de 7 meses tras el trasplante
(figura 14A). En un análisis diferente, algunas otras células
humanas eran \beta-tubulina^{+}, según lo
esperado para el desarrollo de neuronas granulares, con sus procesos
que se extienden hacia el hilo del hipocampo (figura 14B). Estos
resultados indican que no sólo estas CNS-SC humanas
clasificadas/expandidas se injertan, migran, continúan
proliferando, y se diferencian, sino que también su comportamiento y
su destino celular están regulados por indicaciones del hospedador
de una forma específica de sitio. En ningún caso las células
inyectadas formaron tumores.
Descripción. El propósito de este ejemplo
era encontrar marcadores superficiales en células de cerebro humano
que permitan el posible aislamiento de CNS-SC
humanas candidato. Propusimos la hipótesis de que los cultivos de
neurosferas humanas se podrían iniciar por clonación a partir de
CNS-SC, y lo asumimos para aislar las
NS-IC a partir de suspensiones celulares FBr humanas
frescas. Demostramos que las células FBr humanas de
16-20 s.g. contienen un subgrupo raro de células
clonogénicas AC133^{+}, 5E12^{+}, 8G1^{-/lo}
CD34^{-}CD45^{-} que puede iniciar los cultivos de neurosferas,
auto-renovarse considerablemente en estos cultivos,
y diferenciarse in vitro a neuronas y glía. Tras el
trasplante a los ventrículos laterales de ratones inmunodeficientes
recién nacidos estas células se injertaron durante al menos siete
meses y dieron lugar a una progenie que se diferencia, migra, y una
parte que continúa proliferando (es decir, presencia de células
neurales humanas Ki-67^{+} en la SVZ y en la
circunvolución dentada). Las células humanas injertadas se
encuentran en sitios en los que sus homólogas células neurales
endógenas de ratones experimentan los mismos procesos.
Los datos en la figura 10 y en la Tabla 5
demuestran que no hay otras células NS-IC
detectables fuera del subgrupo AC133^{+} en el cerebro fetal
humano.
Durante el análisis de los patrones de tinción
de AC133, observamos que el 0,2% de las células FBr expresan CD34 y
permanecen adheridas a células que son AC133^{+} CD34^{-}. Estas
células CD34^{+} co-expresan los marcadores
celulares endoteliales conocidos CD105 y CD31 y, después de la
tripsinización, permanecieron como complejos de células que podían
formar de manera ineficaz algunas neurosferas cuando se ponen en
placa a una densidad elevada en cultivos en bruto. Hemos observado
complejos similares después de una selección positiva para células
que expresan CD34. Así, hay una asociación frecuente de
CNS-SC AC133^{+} y células endoteliales
CD34^{+} que existe de manera natural. El hallazgo de que las
CNS-SC AC133^{+} son perivasculares, se ajusta a
la hipótesis de que la neurogénesis transcurre mano a mano con la
angiogénesis.
Es sorprendente que las CNS-SC
fetales humanas candidato se injerten después de la inyección en los
ventrículos laterales de ratones neonatos y se extiendan por todo
el cerebro del ratón. Esta es una fase de neurogénesis continuada
en el ratón, aunque el grado al cual se distribuyen estas células es
mayor que el que uno podría esperar. En particular, se encontraron
células humanas adyacentes a los espacios ventriculares, en el
hipocampo, en la corteza cerebral, en el cuerpo calloso, así como
en las áreas cerebelares del cerebro (figura 11). Además, se
encuentran células tanto en la SVZ (el área de
auto-renovación y replicación) y a lo largo de la
RMS (el área de diferenciación inmigración) así como directamente
dentro del bulbo olfativo en y cerca de los glomérulos olfativos.
Por tanto, las CNS-SC humanas inyectadas continúan
con los procesos de neurogénesis en estos sitios.
Snyder y col., usando líneas de ratón
inmortalizadas v-myc y líneas celulares neurales humanas,
demostró esta distribución amplia ("global") de células
(Yandava y col., 96 Proc Natl Acad Sci USA 7029-34
(1999)). Aquí hemos demostrado que ésta es una propiedad no sólo de
células inmortalizadas myc de origen murino sino también de
CNS-SC humanas no modificadas genéticamente.
En contraste al trasplante con células de
teratocarcinoma (Trojanowski y col., 122 Exp Neurol
283-94 (1993)), las células CNS-SC
no forman agregados neoplásticos o hiperplásticos, incluso cuando se
prueban siete meses después de la inyección en un microentorno
completamente permisivo. Por tanto las células
CNS-SC pueden revelar vías de desarrollo y
funcionales inherentes en sistemas neuronales humanos no modificados
por las funciones de oncógenes o de líneas celulares ya
transformadas neoplásticamente. El aislamiento de
CNS-SC proporciona diversas oportunidades para el
descubrimiento científico: (i) delimitar directamente los linajes
que proceden de células en una fase o diferenciación particulares;
(ii) obtener un perfil de expresión de genes de
CNS-SC, y su progenie inmediata aguas abajo in
vitro o in vivo; (iii) probar si la modificación génica
específica de las células permite su injerto, migración,
diferenciación, y/o integración funcional. El aislamiento de
células madre del SNC humano permite el trasplante de estas células
en análogos de la enfermedad humana en ratón, como pruebas
preclínicas para su capacidad de trasplante, capacidad de
diferenciación, y ausencia de tumorogénesis, ese trasplante que no
forma parte de la invención.
Claims (37)
1. Un procedimiento para la producción de una
población enriquecida en células madre del sistema nervioso central
humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC),
comprendiendo dicho procedimiento la selección a partir de una
población que contiene células neurales o derivadas de células
neurales, cuya población no procede de embriones humanos, para
células que se unen al anticuerpo monoclonal AC133 o al anticuerpo
monoclonal 5E12, para producir una población enriquecida en
NS-IC.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de enriquecimiento posterior de la
población seleccionando y eliminando de la población aquellas
células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD45.
3. El procedimiento de la reivindicación 2,
caracterizado por la selección y eliminación de la población
de aquellas células que se unen a un anticuerpo monoclonal que se
une al antígeno CD45.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de enriquecimiento posterior de la
población seleccionando y eliminando de la población aquellas
células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD34.
5. El procedimiento de la reivindicación 4,
caracterizado por la selección y eliminación de la población
de aquellas células que se unen a un anticuerpo monoclonal que se
une al antígeno CD34.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, que
comprende adicionalmente la etapa de enriquecimiento posterior de la
población seleccionando y eliminando de la población aquellas
células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD45 y
aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno
CD34.
7. El procedimiento de la reivindicación 6,
caracterizado por la selección y eliminación de la población
de aquellas células que se unen a un anticuerpo monoclonal que se
une al antígeno CD45 y aquellas células que se unen a un anticuerpo
monoclonal que se une al antígeno CD34.
8. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-7, que comprende adicionalmente
la etapa de enriquecimiento posterior de la población eliminando de
la población aquellas células que sean capaces de unirse al
anticuerpo monoclonal 8G1.
9. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que dichos anticuerpos
están conjugados a fluorocromos.
10. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que dichos anticuerpos
están conjugados a partículas magnéticas.
11. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que la selección es
mediante citometría de flujo.
12. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-8, en el que la selección es por
clasificación celular activada por fluorescencia o selección
magnética en alto gradiente.
13. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la población que
contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene
a partir de cualquier tejido que da lugar a tejido neural.
14. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la población que
contiene células neurales o derivadas de células neurales es tejido
neural.
15. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la población que
contiene células neurales o derivadas de células neurales se disocia
de tejido neural.
16. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-12, en el que la población que
contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene
a partir de un cultivo de células neurales.
17. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1-16, en el que la población que
contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene
a partir de un cultivo de neurosferas o un cultivo de células madre
neurales adherentes.
18. El procedimiento de la reivindicación 17, en
el que dicho cultivo de células madre neurales adherentes es un
cultivo monocapa adherente.
19. Un procedimiento para el aislamiento de
células madre que inician neurosferas (NS-IC), que
comprende la producción de una población enriquecida en células
AC133^{+} o 5E12^{+} según la reivindicación 1; la introducción
de al menos una de dichas células AC133^{+} o 5E12^{+} en un
medio de cultivo capaz de soportar el crecimiento de una célula
madre que inicia neurosferas (NS-IC); y la
proliferación de la célula AC133^{+} o 5E12^{+} en el medio de
cultivo.
20. El procedimiento de la reivindicación 19, en
el que el cultivo de células neurales comprende un medio de cultivo
capaz de soportar el crecimiento de NS-IC que
comprende un factor de crecimiento seleccionado del grupo
constituido por el factor inhibidor de leucocitos (LIF), factor de
crecimiento epidérmico (EGF), factor de crecimiento de fibroblastos
básico (FGF-2) y sus combinaciones.
21. El procedimiento de la reivindicación 20, en
el que el medio de cultivo capaz de soportar el crecimiento de
NS-IC comprende adicionalmente un factor de
supervivencia neural (NSF).
22. Una composición de cultivo celular in
vitro que comprende:
- (a)
- una población de células neurales obtenible según los procedimientos de cualquiera de las reivindicaciones 1-21;
- (b)
- un medio capaz de soportar el crecimiento de las células; y
- (c)
- al menos un anticuerpo monoclonal seleccionado del grupo constituido por el anticuerpo monoclonal AC133 y el anticuerpo monoclonal 5E12.
23. La composición de la reivindicación 22, en
el que la población comprende al menos el 50% de células que inician
las neurosferas (NS-IC) AC133^{+} o 5E12^{+} que
presentan tinción positiva para la nestina y, en presencia de
condiciones que inducen la diferenciación, producen una progenie que
se diferencia en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
24. La composición de la reivindicación 23, que
comprende adicionalmente un soporte sólido al cual se adhieren las
células.
25. La composición de la reivindicación 23, en
la que la población de células comprende al menos el 70% de células
que se unen al anticuerpo monoclonal AC133 o al anticuerpo
monoclonal 5E12.
26. La composición de la reivindicación 23, en
la que la población de células comprende al menos el 90% de células
que se unen al anticuerpo monoclonal AC133 o al anticuerpo
monoclonal 5E12.
27. La composición de la reivindicación 23, en
la que la población de células es una población sustancialmente
pura.
28. La composición de la reivindicación 23, en
la que el medio comprende un medio exento de suero que contiene uno
o más factores de crecimiento predeterminados eficaces para inducir
la proliferación de células madre neurales pluripotenciales.
29. La composición de la reivindicación 23, en
la que el medio contiene adicionalmente un factor de crecimiento
seleccionado del grupo constituido por el factor inhibidor de
leucocitos (LIF), factor de crecimiento epidérmico (EGF), factor de
crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2) y sus
combinaciones.
30. La composición de la reivindicación 23 en la
que el medio comprende adicionalmente un factor de supervivencia
neural.
31. La composición de la reivindicación 23 en la
que las células neurales son humanas.
32. Un procedimiento que comprende la producción
de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso
humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC) según
la reivindicación 1, y la fabricación de un medicamento para el
trasplante a un hospedador usando dicha población.
33. El procedimiento de la reivindicación 32, en
el que la población se ha hecho proliferar en un medio de
cultivo.
34. El procedimiento de la reivindicación 32, en
el que el trasplante es al sistema nervioso central.
35. El procedimiento de la reivindicación 32, en
el que el trasplante es a un área externa al sistema nervioso
central.
36. Un procedimiento que comprende la producción
de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso
humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC) según
la reivindicación 1 y la fabricación de un medicamento para el
tratamiento de un trastorno del sistema nervioso central usando
dicha población.
37. El procedimiento de la reivindicación 36, en
el que el trastorno del SNC se selecciona del grupo constituido por
enfermedades neurodegenerativas, lesiones cerebrales agudas, y
disfunciones del SNC.
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US6667176B1 (en) | 2000-01-11 | 2003-12-23 | Geron Corporation | cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells |
ATE473273T1 (de) * | 1999-02-12 | 2010-07-15 | Stemcells California Inc | Angereicherte zellpopulationen des zentralen nervensystems |
US20050042749A1 (en) | 2001-05-16 | 2005-02-24 | Carpenter Melissa K. | Dopaminergic neurons and proliferation-competent precursor cells for treating Parkinson's disease |
GB2379447B (en) | 2000-05-17 | 2004-12-29 | Geron Corp | Neural progenitor cell populations |
US7250294B2 (en) | 2000-05-17 | 2007-07-31 | Geron Corporation | Screening small molecule drugs using neural cells differentiated from human embryonic stem cells |
US20050084963A1 (en) * | 2001-06-01 | 2005-04-21 | Tailoi Chan-Ling | Purification of lineage-specific cells and uses therefor |
AUPR540301A0 (en) * | 2001-06-01 | 2001-06-28 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | A method of purification of cells |
ATE371018T1 (de) | 2001-06-22 | 2007-09-15 | Stemcells Inc | Le-zellen (liver engrafting cells), assays und verwendungen davon |
EP1540348A4 (en) * | 2002-08-27 | 2006-10-11 | Stemcells California Inc | ENRICHED CELLS OF STEM CELLS AND PROGENITORS OF THE CENTRAL NERVOUS SYSTEM, AND METHODS OF IDENTIFYING, ISOLATING AND ENRICHING SUCH POPULATIONS |
JP4481706B2 (ja) * | 2004-03-31 | 2010-06-16 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 脳梗塞疾患モデルマウス |
WO2008064408A1 (en) * | 2006-11-27 | 2008-06-05 | The University Of Queensland | Generation of enriched populations of neural progenitor cells and their progeny |
DK2114167T3 (en) * | 2007-01-16 | 2018-09-17 | Univ Rochester | NON-HUMAN ANIMALS WITH HUMAN GLIAKIMARY BRAIN |
JP5035928B2 (ja) * | 2009-12-15 | 2012-09-26 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ヒト神経幹細胞のスクリーニング方法 |
JP4997613B2 (ja) * | 2009-12-15 | 2012-08-08 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | ヒト神経幹細胞に選択的なモノクローナル抗体及びこれを用いたスクリーニング方法 |
JP6090735B2 (ja) * | 2012-03-02 | 2017-03-08 | 国立大学法人山口大学 | 消化器系がん幹細胞を培養するための無血清培地、及びそれを用いた消化器系がん幹細胞の増殖方法 |
WO2014125277A1 (en) | 2013-02-12 | 2014-08-21 | Reneuron Limited | Method of producing microparticles |
TWI482782B (zh) * | 2013-05-31 | 2015-05-01 | Univ Nat Chiao Tung | 架接抗體之雙乳化核殼奈米結構 |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683195A (en) | 1986-01-30 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5851832A (en) | 1991-07-08 | 1998-12-22 | Neurospheres, Ltd. | In vitro growth and proliferation of multipotent neural stem cells and their progeny |
US5750376A (en) | 1991-07-08 | 1998-05-12 | Neurospheres Holdings Ltd. | In vitro growth and proliferation of genetically modified multipotent neural stem cells and their progeny |
JPH08500245A (ja) * | 1992-07-27 | 1996-01-16 | カリフォルニア インスティテュート オブ テクノロジー | 哺乳動物の多能性神経幹細胞 |
IT1264903B1 (it) | 1993-06-30 | 1996-10-17 | Sniaricerche S C P A | Cristalli liquidi metallo-organici in una matrice polimerica |
US5843633A (en) * | 1996-04-26 | 1998-12-01 | Amcell Corporation | Characterization of a human hematopoietic progenitor cell antigen |
US5753506A (en) | 1996-05-23 | 1998-05-19 | Cns Stem Cell Technology, Inc. | Isolation propagation and directed differentiation of stem cells from embryonic and adult central nervous system of mammals |
CA2294737A1 (en) * | 1997-07-04 | 1999-01-14 | University Of Utah Research Foundation | Neuron-restricted precursor cells |
US5968829A (en) * | 1997-09-05 | 1999-10-19 | Cytotherapeutics, Inc. | Human CNS neural stem cells |
AU2469299A (en) * | 1998-01-23 | 1999-08-09 | Cornell Research Foundation Inc. | Purified populations of stem cells |
US6451306B1 (en) * | 1998-04-15 | 2002-09-17 | The Regents Of The University Of California | Methods for therapy of neurodegenerative disease of the brain |
EP1117765A2 (en) * | 1998-08-31 | 2001-07-25 | New York University | Stem cells bearing an fgf receptor on the cell surface |
US6468794B1 (en) * | 1999-02-12 | 2002-10-22 | Stemcells, Inc. | Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
ATE473273T1 (de) * | 1999-02-12 | 2010-07-15 | Stemcells California Inc | Angereicherte zellpopulationen des zentralen nervensystems |
US7037719B1 (en) * | 1999-02-12 | 2006-05-02 | Stemcells California, Inc. | Enriched central nervous system stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for such populations |
US7105150B2 (en) * | 1999-02-12 | 2006-09-12 | Stemcells California, Inc. | In vivo screening methods using enriched neural stem cells |
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