ES2351170T3 - Poblaciones enriquecidas de células del sistema nervioso central. - Google Patents
Poblaciones enriquecidas de células del sistema nervioso central. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para la producción de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso central humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC), comprendiendo dicho procedimiento la selección a partir de una población que contiene células neurales o derivadas de células neurales, cuya población no procede de embriones humanos, para células que se unen a un anticuerpo distinto de un anticuerpo monoclonal AC133, o un fragmento del mismo, que se une específicamente a por lo menos un epítopo del antígeno AC133 para producir una población enriquecida en NS-IC.
Description
CAMPO TÉCNICO
Esta invención se refiere de manera general a poblaciones de células madre neurales enriquecidas y células progenitoras, y a procedimientos para la identificación, aislamiento y enriquecimiento de células madre neurales y células progenitoras, particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central y, más particularmente, a poblaciones enriquecidas de células que inician neurosferas (NS-IC).
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
Las poblaciones de células madre sólo constituyen un pequeño porcentaje del número total de células, pero son de enorme interés debido a su capacidad para repoblar el cuerpo. La longevidad de las células madre y la diseminación de la progenie de las células madre son características deseables. Hay un interés comercial importante en estos procedimientos debido a que las células madre tienen una serie de usos clínicos. También hay interés médico en el uso de células madre como vehículo para terapia génica.
Las proteínas y otros marcadores de la superficie celular encontrados en poblaciones de células madre y células progenitoras son útiles en la preparación de reactivos para la separación y el aislamiento de estas poblaciones. Los marcadores de la superficie celular también son útiles en la caracterización posterior de estas células importantes.
Yin y col., patente de EE.UU. 5.843.633 describe un anticuerpo monoclonal denominado AC133, que se une a una glicoproteína marcadora superficial sobre células madre y células progenitoras hematopoyéticas. El antígeno AC133 es un antígeno de la superficie celular 5-transmembrana con un peso molecular de 117 kDa. La expresión de este antígeno es muy específica de tejido, y se ha detectado en un subgrupo de células progenitoras hematopoyéticas derivadas de médula ósea humana, médula ósea e hígado fetales, sangre de cordón umbilical, y sangre periférica adulta. El subgrupo de células reconocido por el anticuerpo AC133 es CD34bright, y contiene sustancialmente toda la actividad CFU-GM presente en la población CD34+, haciendo a AC133 útil como reactiva para el aislamiento y caracterización de células madre y células progenitoras hematopoyéticas humanas.
No obstante, no se han identificado los marcadores superficiales específicos para células madre y células progenitoras no hematopoyéticas, y particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central. Además, el anticuerpo AC133 no se ha usado en procedimientos para la identificación, aislamiento, o enriquecimiento de células madre o células progenitoras no hematopoyéticas, particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central (SNC). Aún existe la necesidad de herramientas, tales como anticuerpos monoclonales que sean útiles en el aislamiento y caracterización de células madre y células progenitoras no hematopoyéticas humanas, y particularmente células madre neurales y células progenitoras del sistema nervioso central (SNC).
RESUMEN DE LA INVENCIÓN
Esta invención proporciona procedimientos para la identificación, aislamiento, y enriquecimiento de células madre neurales del sistema nervioso central (SNC) que pueden iniciar neurosferas (NS-IC) y células progenitoras. Una "célula que inicia neurosferas (NS-IC)" es una célula que puede iniciar un cultivo de neurosferas a largo plazo. Una "neurosfera", a su vez, es un agregado o grupo de células que incluye células madre neurales y células progenitoras primitivas. La identificación, cultivo, crecimiento, y uso de neurosferas se describe en Weiss y col., patente de EE.UU. 5.750.376 y Weiss y col., patente de EE.UU. 5.851.832. Aunque el término "NS-IC" está definido por la aptitud o capacidad de esa célula de formar una neurosfera, estas células pueden crecer adecuadamente en cultivos adherentes (véase, por ejemplo, Johe, patente de EE.UU. 5.753.506), y se debe apreciar que los procedimientos y poblaciones descritos en el presente documento no están limitados a cultivos en suspensión de NS-IC. Una NS-IC es nestina+ y tiene la capacidad de diferenciarse, en condiciones de diferenciación apropiadas, en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos.
Según una forma de realización de esta invención, las poblaciones enriquecidas de células madre neurales del SNC que pueden iniciar neurosferas (NS-IC), y células progenitoras, y el procedimiento de identificación, aislamiento, o enriquecimiento de esas células, se consigue poniendo en contacto una población de células que no procede de embriones humanos que contiene al menos una célula madre o NS-IC, o una célula progenitora, con un reactivo que se une al antígeno glicoproteína marcador superficial ("antígeno AC133") reconocido por el anticuerpo AC133, en el que el reactivo es un anticuerpo que se une específicamente a por lo menos un epítopo del antígeno AC133 (distinto del anticuerpo monoclonal AC133) incluyendo un fragmento del mismo. El uso de técnicas tradicionales para la clasificación de células, tales como la inmunoselección (por ejemplo, FACS), permite entonces la identificación, el aislamiento y/o el enriquecimiento de células en las que se ha detectado el contacto entre el reactivo y el antígeno AC133.
En una forma de realización preferida, las células de esta invención, preferentemente las células madre neurales del SNC, están caracterizadas adicionalmente como células que carecen de marcadores superficiales para CD45 y CD34.
En una forma de realización adicional, esta invención usa un anticuerpo novedoso, denominado en el presente documento 8G1, que se cree que reconoce CD24, lo cual permite la subselección entre poblaciones de células madre neurales del SNC (caracterizadas como 8G1-/lo) y poblaciones de células progenitoras del SNC (caracterizadas como 8G1+).
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
La figura 1 es un diagrama que ilustra la proliferación y diferenciación de una NS-IC.
La figura 2 es una serie de fotografías que muestran que el cultivo de neurosferas se puede iniciar a partir de células 5F3+ seleccionadas de una sola célula.
La figura 3 es una representación de puntos de los datos de clasificación de células activada por fluorescencia (FACS) que muestra el aislamiento de células madre neurales del SNC humano usando marcadores de la superficie celular usando el anticuerpo monoclonal 5E12. El eje x representa la tinción de células para anticuerpos con relación a CD34 y CD45. El eje y representa la tinción de células con el anticuerpo 5E12.
La figura 4 es una representación de puntos en dos paneles de los datos de clasificación por FACS que muestra el aislamiento de células madre neurales humanas mediante marcadores de la superficie celular. Se disociaron enzimáticamente células cerebrales fetales humanas como se describe. El panel A muestra que las células 5F3+ co-expresan el antígeno para el anticuerpo 5E12. El panel B muestra que las células 5F3+ normalmente no expresan el antígeno para el anticuerpo 8G1 (CD24).
La figura 5 es un diagrama que muestra la distribución de células 5F3+ en el cerebro fetal en función de la edad de gestación.
La figura 6 es una serie de fotografías que muestran los resultados del trasplante de células neurales humanas en ratón NOD SCID.
La figura 7 es una serie de fotografías que muestran que la progenie de células clasificadas 5F3+ migran a través de la corriente migratoria rostral (RMS) hacia el bulbo olfativo cuando son trasplantadas en un modelo de roedor.
La figura 8 es una serie de fotografías que muestran que la progenie de células clasificadas 5F3+ migra a través de la RMS hacia el bulbo olfativo cuando son trasplantadas en un modelo de roedor.
La figura 9 muestra las características de las células AC133+. La figura 9A es una separación citométrica de flujo de células cerebrales fetales frescas basada en la expresión de AC133. Las células cerebrales fetales humanas se disociaron enzimáticamente. Las células se tiñeron con mAbs contra CD34, CD45 y AC133, y se separaron en fracciones AC133 -y AC133+. Las células hematopoyéticas y endoteliales residuales se excluyeron mediante el control de CD45 -y CD34 -, respectivamente. Los subgrupos AC133 -(figura 9B) y AC133+ (figura 9C) clasificados se cultivaron en medio exento de suero y la proliferación de estas células clasificadas se controló durante 15 días.
La figura 10 muestra un análisis cuantitativo de la actividad NS-IC por dilución limitante y clasificación de una sola célula. La figura 10A es un análisis cuantitativo de la actividad NS-IC por análisis de dilución limitante después de la clasificación celular. Las células clasificadas se pusieron en placa en una serie de dosis celulares limitantes en placas de 96 pocillos mediante el FACS-ACDU. La figura 10B muestra la expansión clonal de células madre/progenitoras neurales. Las neurosferas pueden proceder de una sola célula AC133+ clasificada aislada directamente de cerebro fetal o de una sola célula AC133+ procedentes de neurosferas cultivadas clasificadas/expandidas. La figura 10C muestra la capacidad de diferenciación de células de neurosferas obtenidas por clonación. La progenie de neurosferas procedentes de una sola célula se puede diferenciar en neuronas (tubulina, verde) y astrocitos (GFAP, rojo).
La figura 11 muestra la detección de células neurales humanas en sitios no neurogénicos. En algunos casos no ilustrativos, se detectaron células neurales humanas inyectadas en cerebro de neonato de ratones NOD-SCID en el cuerpo calloso, en la corteza cerebral y en el cerebelo.
La figura 12 no ilustrativa muestra la proliferación in vivo a largo plazo de la progenie de células de neurosfera humanas trasplantadas en la SVZ de ratones NOD-SCID. Las células de neurosfera humanas AC133+ clasificadas/expandidas se trasplantaron en los ventrículos laterales de ratones NODSCID neonatos. El injerto de células humanas se analizó 7 meses después del trasplante. La figura 12A es un diagrama esquemático del cerebro de ratón adulto. Los sitios en los que se evaluó el injerto de células humanas están indicados en el diagrama. Zona subventricular, SVZ; corriente migratoria rostral, RMS. La figura 12B muestra la detección de células neurales humanas en la SVZ. Una sección sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con antígeno nuclear anti-humano (FITC, verde) y GFAP (Cy-5, azul). La figura 12C muestra la detección de células neurales humanas en proliferación en la SVZ. La sección sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con antígeno nuclear anti-humano (FITC, verde), Ki67 (Cy-3, rojo) y GFAP (Cy-5, azul). La mayoría de células antígeno nuclear humano positivas en la SVZ también co-expresaron el marcador de proliferación, Ki67.
La figura 13, prueba no ilustrativa, muestra la migración y diferenciación in vivo de células de neurosfera humanas trasplantadas en la RMS y el bulbo olfativo. Las células de neurosfera humanas AC133+ clasificadas/expandidas se trasplantaron en el ventrículo lateral de neonatos NOD-SCID. El injerto de células humanas se analizó 7 meses después del trasplante. La figura 13A muestra la progenie de células de neurosfera humanas AC133+ clasificadas/expandidas que migra a través de la RMS. En la RMS, el conjunto de células de antígeno nuclear humano, también fue positivo con la tinción de recuento Hoechst 33234 (rosa) (i). Las células antígeno nuclear humano positivas (Cy-3, rojo) en la RMS estaban co-localizadas con la expresión de β-tubulina (Alexia 488, verde) (ii). Algunas de estas células eran claramente dobles positivos (ii, flecha). En una sección diferente, las células en la RMS se tiñeron con NCAM (FITC, verde) y GFAP (Cy-5, azul) específicos para humano (iii). La figura 13B muestra la migración y diferenciación de células neurales humanas en el bulbo olfativo. En el bulbo olfativo, las células antígeno nuclear humano positivas se distribuyeron en la capa glomerular del bulbo olfativo (i y ii). En algunos casos, se detectaron células neuronales humanas N-CAM+ (iii).
La figura 14 (prueba no ilustrativa) muestra la proliferación y diferenciación in vivo a largo plazo de la progenie de células de neurosfera humanas trasplantadas en la circunvolución dentada del hipo-campo. Las células de neurosfera humanas AC133+ clasificadas/expandidas se trasplantaron en el ventrículo lateral de ratones NOD-SCID neonatos. Siete meses después del trasplante de las células de neurosfera humanas AC133+ clasificadas/expandidas en los ventrículos laterales de ratones NOD-SCID neonatos se pueden encontrar células humanas en proliferación en el hipocampo. La figura 14A muestra la detección de células neurales humanas en proliferación en la zona subgranular de la circunvolución dentada. La sección sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con anti-núcleos humanos (FITC, verde), Ki67 (Cy-3, rojo) y GFAP (Cy-5, azul). Algunas células de antígeno+ nuclear humano se cotiñeron con Ki67 (flecha). La figura 14B muestra la detección de neuronas humanas en la circunvolución dentada. La sección sagital del cerebro de ratón trasplantado se tiñó con antígeno anti-nuclear humano (Cy-3, rojo) y anti-tubulina (Alexia 488, verde). Una de las dos células antígeno nuclear humano positivas también fue positiva para tubulina (flecha).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Existe una población de células dentro del sistema nervioso central (SNC) adulto que presenta propiedades de células madre, en su capacidad para auto-renovarse y producir los fenotipos celulares maduros diferenciados del SNC adulto. Estas células madre se encuentran por todo el SNC, y particularmente en las regiones subventriculares, y en la circunvolución dentada del hipocampo.
Se pueden aislar células madre sensibles a factores de crecimiento a partir de muchas regiones del neuroeje y en diferentes fases del desarrollo, de tejidos del SNC murino, de roedores y humano.
Estas células varían en su respuesta a factores de crecimiento tales como el EGF, el FGF básico (bFGF, FGF-2) y el factor de crecimiento transformante alfa (TGF-α), y se pueden mantener y expandir en cultivos sin diferenciar durante largos periodos de tiempo. Tanto las células progenitoras murinas adultas como embrionarias responden al EGF y crecen en forma de esferas de células sin diferenciar. Estas células muestran las características de células madre en que son pluripotenciales, y en condiciones que contienen suero se pueden diferenciar en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos, así como mantener una subpoblación que permanece sin diferenciar y continúa proliferando con la administración de EGF. Las células progenitoras sensibles al EGF murino expresan ARNm para el receptor EGF in vitro. También se han identificado cultivos de células madre neurales del SNC humano. La identificación, cultivo, crecimiento, y uso de cultivos de células madre neurales de mamífero, incluyendo de humanos, ya sea como cultivos en suspensión o como cultivos adherentes, se describe en Weiss y col., patente de EE.UU. 5.750.376 y Weiss y col., patente de EE.UU. 5.851.832. De manera similar, Johe, patente de EE.UU. 5.753.506, se refiere a cultivos de células madre neurales del SNC adherentes. Cuando se cultivan en suspensión, los cultivos de células madre neurales del SNC normalmente forman neurosferas.
La figura 1 muestra la proliferación de una NS-IC a medida que se desarrolla en una neurosfera, y la diferenciación posterior en fenotipos neuronales y gliales, así como la generación de una progenie de NS-IC. En presencia de uno o más factores de crecimiento que inducen la proliferación, la NS-IC se divide y da lugar a una esfera de células no diferenciadas compuesta de más células madre y células progenitoras (una "neurosfera"). Cuando la neurosfera obtenida clonalmente se disocia y se pone en placa en forma de células únicas, en presencia de uno o más factores de crecimiento que inducen la proliferación, cada NS-IC puede generar una nueva neurosfera. Las células de una sola neurosfera son de naturaleza clonal debido a que son la progenie de una única célula madre neural. En presencia continuada de un factor de crecimiento que induce la proliferación tal como el EGF o similar, las células precursoras dentro de la neurosfera continúan dividiéndose dando como resultado un incremento en el tamaño de la neurosfera y en el número de células neurales sin diferenciar. La neurosfera no es inmunoreactiva para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP; un marcador para astrocitos), el neurofilamento (NF; un marcador para neuronas), la enolasa específica de neuronas (NSE; un marcador para neuronas) o la proteína básica mielina (MBP; un marcador para oligodendrocitos). No obstante, las células dentro de la neurosfera son inmunoreactivas para la nestina, una proteína de los filamentos intermedios encontrada en muchos tipos de células del SNC sin diferenciar (Lehndahl y col., 60 Cell 585-595 (1990)). Están disponibles anticuerpos para identificar la nestina, incluyendo el anticuerpo de rata denominado Rat401. Si las neurosferas se cultivan en condiciones que permitan la diferenciación, las células progenitoras se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. Los fenotipos maduros asociados con los tipos celulares diferenciados que pueden proceder de la progenie de células madre neurales son predominantemente negativos para el fenotipo nestina.
La terminología usada para células neurales sin diferenciar, pluripotenciales, auto-renovables ha evolucionado de manera que estas células ahora se denominan "células madre neurales". Una célula madre neural es una célula madre pluripotencial clonogénica que es capaz de dividirse y, en las condiciones apropiadas, tiene una capacidad de auto-renovación para NS-IC y puede incluir en su progenie células hijas que se pueden diferenciar terminalmente en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. Por tanto, la célula madre neural es "pluripotencial" debido a que la progenie de células madre tiene múltiples vías de diferenciación. Una célula madre neural es capaz de auto-mantenerse, que significa que con cada división celular, una célula hija también será por término medio una célula madre.
La progenie de células no madre de una célula madre neural normalmente se denomina células "progenitoras", que son capaces de dar lugar a diversos tipos celulares dentro de una o más líneas. El término "célula progenitora neural" se refiere a una célula sin diferenciar procedente de una célula madre neural, y no es por sí misma una célula madre. Algunas células progenitoras pueden producir una progenie que es capaz de diferenciarse en más de un tipo celular. Por ejemplo, una célula O-2A es una célula progenitora glial que da lugar a oligodendrocitos y astrocitos tipo II, y así se puede denominar célula progenitora "bipotencial". Una característica distintiva de una célula progenitora es que, a diferencia de una célula madre, no presenta auto-mantenimiento, y normalmente se piensa que está comprometida a una vía de diferenciación particular y, en las condiciones apropiadas, eventualmente se diferenciará en glía o neuronas.
El término "células precursoras" se refiere a la progenie de células madre neurales, y así incluye tanto células progenitoras como células madre neurales hijas. Marcadores celulares. Esta invención proporciona la identificación, aislamiento, enriquecimiento y cultivo de células madre neurales que son capaces de formar neurosferas (NS-IC). Las NS-IC se identifican o seleccionan mediante la unión de antígenos, encontrados sobre la superficie de las NS-IC, a reactivos que se unen específicamente al antígeno de la superficie celular.
Uno de estos antígenos es un antígeno que se une al anticuerpo monoclonal AC133. El anticuerpo AC133 (denominado en el presente documento anticuerpo 5F3; nótese que el uso del anticuerpo AC133 no forma parte de la presente invención) es un ejemplo de formas de realización de anticuerpos de reactivos que reconocen un marcador celular humano denominado prominina. La prominina es una proteína de membrana politópica expresada en diversas células epiteliales (Weigmann y col., 94 (23) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 12425-30 (1997); Corbeil y col., 112 (pt 7) J. Cell. Sci. 1023-33 (1999); Corbeil y col., 91(7) Blood 2625-6 (1998); Miriglia y col., 91 (11) Blood 4390-1 (1998)). En la patente de EE.UU. 5.843.333 se describen diversos anticuerpos AC133. Se realizó un depósito de la línea celular de hibridoma murino AC133 en la American Type Tissue Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville Md. 20852, el 24 de Abril de 1997, y se le dio la denominación ATCC GB 12346. Estos anticuerpos AC133 (nótese que el uso del anticuerpo AC133 no forma parte de la presente invención) son capaces de su inmunoselección para el subgrupo de células humanas de interés de esta invención. Los anticuerpos monoclonales AC133 preferidos se pueden obtener comercialmente en Miltenyi Biotec Inc. (Auburn CA), incluyendo el anticuerpo AC133/1-PE (Cat #808-01) y el anticuerpo AC133/2-PE (Cat #809-01). Para la separación MACS, se prefiere una mezcla 50:50 de los anticuerpos monoclonales. La alta especificidad de tejido de la expresión de AC133 es particularmente ventajosa durante el enriquecimiento para poblaciones de NS-IC muy purificadas.
El 5E12 es un anticuerpo monoclonal generado contra células cerebrales fetales humanas disociadas enzimáticamente. El anticuerpo monoclonal 5E12 se generó sustancialmente según el procedimiento de inmunización contralateral descrito en la patente de EE.UU. 5.843.633 de Yin. El antígeno al cual se une 5E12 tiene un peso molecular putativo de 125 kDa, y actualmente se cree que es un antígeno distinto de la prominina.
El CD45 es el antígeno común T200/leucocito. Los anticuerpos para CD45 están disponibles comercialmente. En una forma de realización preferida, las células de esta invención y los cultivos que contienen, están caracterizados adicionalmente (además de ser prominina positivos) como células que carecen de marcadores superficiales tales como CD45.
El CD34 también se conoce como gp105-120. Los anticuerpos monoclonales para CD34 están disponibles comercialmente, y los anticuerpos monoclonales CD34 se han usado para cuantificar y purificar células madre/progenitoras linfohematopoyéticas para el trasplante de médula ósea para investigación y para clínica.
Se cree que el anticuerpo monoclonal 8G1 reconoce CD24 (los anticuerpos para CD24 están disponibles comercialmente), y reacciona específicamente con la cadena de 515 kDa del LRP/A2MR humano que se expresa en un espectro restringido de tipos celulares. Se observa una fuerte reacción inmunohistoquímica en hepatocitos, macrófagos tisulares, subgrupos de neuronas y astrocitos en el sistema nervioso central, fibroblastos, células del músculo liso, y células espumosas derivadas de monocitos en lesiones ateroescleróticas en la pared arterial. El anticuerpo también se puede usar para la caracterización de un subgrupo de subtipos mielomonocíticos de leucemia crónica y aguda (CD91). Los anticuerpos para CD91 están disponibles comercialmente.
Depósito celular. Los cultivos objeto 5E12.5 y 8G1.7 están depositados en condiciones que aseguran que estará disponible el acceso a los cultivos durante la pendencia de la solicitud de patente que los describe para alguien determinado por el Comisionado de patentes y marcas nombrado por él bajo el 37 C.F.R. § 1.14 y el 35 U.S.C. § 122. Los depósitos están disponibles según sea necesario por las leyes de patente extranjeras en países en los que se presentan los homólogos de la solicitud objeto,
o su progenie. No obstante, la disponibilidad de un depósito no constituye una licencia para llevar a la práctica la presente invención en derogación de los derechos de patente garantizados por la acción gubernamental.
Además, los depósitos de cultivo objeto 5E12.5 y 8G1.7 se almacenarán y estarán disponibles al público de acuerdo con las previsiones del tratado de Budapest para el depósito de microorganismos, es decir, se almacenarán con todas las precauciones necesarias para mantenerlos viables y sin contaminar durante un periodo de al menos 30 años después de la fecha de depósito o para la vida útil de cualquier patente que pueda hacer pública la descripción de los cultivos más 5 años después de la última solicitud de una muestra del depósito. El depositante admite el deber de reponer los depósitos si el depositario fuera incapaz de facilitar una muestra cuando se solicite, debido a las condiciones de los depósitos. Todas las restricciones sobre la disponibilidad al público de los depósitos de cultivo objeto serán eliminadas de manera irrevocable tras garantizar una patente que los describa.
Aislamiento, enriquecimiento, y selección de células. La población de células a partir de la cual se aíslan las NS-IC puede ser un tejido neural, una población de células que se disocia del tejido neural,
o una población de células en cultivo celular, por ejemplo, una célula de un cultivo de neurosferas o un
cultivo de células madre neurales adherentes. La invención proporciona el aislamiento y la identificación de NS-IC. La identificación de una célula madre que inicia una neurosfera (NS-IC) supone la puesta en contacto de una población de células neurales (o que contiene células neurales o células procedentes de células neurales) con un reactivo que se une al antígeno AC133 y que detecta el contacto entre el reactivo que se une al antígeno AC133 y el antígeno AC133 sobre la superficie de las células. Aquellas células a las cuales se une el reactivo se identifican como NS-IC. La identidad de aquellas células se puede confirmar mediante ensayos para demostrar que las células son de hecho NS-IC, capaces de la iniciación de neurosferas, la auto-renovación y la pluripotencia.
Los procedimientos de esta invención también se pueden usar para aislar células AC133+ a partir de células AC133 -combinando una población de células neurales que contiene una fracción de NS-IC con un reactivo que se une específicamente al antígeno AC133, y a continuación la selección de células AC133+, para producir una población seleccionada enriquecida en NS-IC AC133+ comparada con la población de células neurales antes de la selección.
Por consiguiente, la invención además proporciona el enriquecimiento de NS-IC a partir de tejidos neurales o de cultivos de células madre neurales (por ejemplo, cultivos en suspensión de neurosferas o cultivos adherentes de células madre neurales). La invención así es útil para el enriquecimiento de NS-IC a partir de tejidos neurales en los que las células madre y las células progenitoras se producen con una frecuencia baja, o que se pueden haber agotado, tales como tejido fetal, juvenil y adulto. Alguien experto en la materia puede combinar una población de células neurales que contienen una fracción de NS-IC con un reactivo que se une específicamente al antígeno AC133; y seleccionar las células AC133+. De esta forma, las células AC133+ seleccionadas están enriquecidas en la fracción de NS-IC comparadas con la población de células neurales.
La selección celular puede ser mediante cualquier medio adecuado conocido en la materia, incluyendo citometría de flujo.
También está contemplado dentro del alcance de la invención cualquier otro procedimiento adecuado que incluya la unión o la separación de la fase sólida.
La población de células debe contener al menos el 30% de NS-ICs AC133+, preferentemente al menos el 50-70% de NS-ICs AC133+, y más preferentemente por encima del 90% de NS-ICs AC133+. Lo más preferible sería una población de NS-ICs AC133+ sustancialmente pura, que comprenda al menos el 95% de NS-ICs AC133+. El grado de enriquecimiento obtenido, y usado realmente, depende de una serie de factores, incluyendo el procedimiento de selección, el procedimiento de crecimiento, y la dosis celular de células que se ponen en el cultivo de iniciación de las neurosferas.
La población de células se puede obtener del tejido fetal, juvenil o adulto del sistema nervioso central (SNC) de un mamífero, o se puede obtener a partir de cultivos existentes de células madre neurales, como se describe en Weiss, patente de EE.UU. 5.750.376, o Johe, patente de EE.UU. 5.753.506. En la forma de realización más preferida, las NS-IC son humanas. En algunas formas de realización, las células AC133+ en la población se pueden complejar a células endoteliales.
Los cultivos celulares in vitro descritos en el presente documento que contienen una población enriquecida de NS-IC AC133+ generalmente están caracterizados porque los cultivos presentan tinción positiva para la nestina y, en presencia de condiciones que inducen la diferenciación, producen una progenie de células que se diferencian en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos.
Alguien experto en la materia puede introducir una célula AC133+ aislada a un medio de cultivo, proliferar la célula AC133+ aislada en el cultivo; particularmente como una neurosfera; cultivar la progenie de la célula AC133+ aislada en condiciones en las que la célula AC133+ aislada se diferencia en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos; y a continuación detectar la presencia de neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. La presencia de neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos caracteriza la célula AC133+ aislada como una NS-IC.
Normalmente la NS-IC AC133+ se cultiva en un medio que permita el crecimiento y la proliferación de neurosferas. El cultivo en el cual prolifera la célula AC133+ aislada puede ser un medio exento de suero que contenga uno o más factores de crecimiento predeterminados eficaces para inducir la proliferación de células madre neurales pluripotenciales. El medio de cultivo se puede suplementar con un factor de crecimiento seleccionado entre el factor inhibidor de leucocitos (LIF), el factor de crecimiento epidérmico (EGP), el factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2; bFGF) o sus combinaciones. El medio de cultivo además se puede suplementar con un factor de supervivencia neural (NSF) (Clonetics, CA). Las condiciones en las cuales la célula AC133+ se diferencia en neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos puede ser cultivando la progenie de células AC133+ sobre una superficie recubierta con laminina en un medio de cultivo que contiene suero fetal bovino (FBS) sin EGF, FGF-2 o LIF.
La descripción también proporciona un procedimiento para identificar la presencia de un factor de crecimiento que afecta al crecimiento de NS-IC. Alguien experto en la materia combina una composición sospechosa de contener al menos un factor de crecimiento que afecta al crecimiento de la NS-IC con una composición que comprende NS-IC, y a continuación determina el crecimiento de la NS-IC en función de la presencia de la composición. El crecimiento alterado (incrementado, disminuido, etc.) de NS-IC indica la presencia en la composición de un factor de crecimiento que afecta al crecimiento de NSIC. A continuación uno puede identificar posteriormente el factor de crecimiento.
Anticuerpos para AC133. Los anticuerpos para AC133 pueden obtenerse o prepararse como se describe en la patente de EE.UU. 5.843.633. El antígeno AC133 se puede poner en contacto con un anticuerpo, tal como diversos anticuerpos monoclonales AC133, que presentan especificidad para el antígeno AC133. Un anticuerpo AC133 se caracteriza por unión a la proteína AC133 en condiciones de transferencia de Western en geles de SDS-PAGE reductores. El antígeno AC133 tiene un peso molecular, basado en patrones disponibles comercialmente, del orden de 117 kDa aproximadamente. El antígeno AC133 se expresa en un subgrupo de células progenitoras procedentes de médula ósea humana, médula ósea e hígado fetales, sangre del cordón umbilical, y sangre periférica adulta.
Los anticuerpos para el antígeno AC133 se pueden obtener inmunizando un hospedador mamífero inmunocompetente xenogénico (incluyendo murino, rodentia, lagomorfa, ovino, porcino, bovino, etc.) con células progenitoras humanas. La elección de un hospedador particular es principalmente por comodidad. Se puede obtener una población de células progenitoras adecuadas para la inmunización aislando células CD34+ procedentes de citoquinas movilizadas de sangre periférica, médula ósea, hígado fetal, etc. Se puede obtener una población de células progenitoras adecuadas para la inmunización a partir de células madre neurales del SNC y otras NS-IC. Las inmunizaciones se llevan a cabo de acuerdo con técnicas convencionales, en las que las células se inyectan subcutánea, intramuscular, intraperitoneal, intravascularmente, etc. Normalmente, se usarán entre 106 y 108 células aproximadamente, que se pueden dividir en 1 o más inyecciones, normalmente no más de 8 inyecciones aproximadamente, durante un periodo de entre una y tres semanas aproximadamente. Las inyecciones pueden ser con o sin adyuvante, por ejemplo, adyuvante completo o incompleto de Freund, specol, alum, etc.
Después de completar el programa de inmunización, se puede recoger el antisuero de acuerdo con procedimientos convencionales para proporcionar antisuero policlonal específico para las proteínas de la superficie de membrana de las células progenitoras, incluyendo el antígeno AC133. Los linfocitos se recogen del tejido linfoide apropiado, por ejemplo, bazo, nodos linfáticos de drenaje, etc., y se funden con un compañero de fusión apropiado, normalmente una línea celular de mieloma, que produce un hibridoma que segrega un anticuerpo monoclonal específico. La selección de clones de hibridomas para la especificidad antigénica de interés se lleva a cabo de acuerdo con procedimientos convencionales.
Los anticuerpos AC133 se pueden producir como una cadena sencilla, en lugar de la estructura multimérica normal. Los anticuerpos de cadena sencilla se describen en Jost y col., 269 J. Biol. Chem. 26267-73 (1994), y otros. Las secuencias de ADN que codifican la región variable de la cadena pesada y la región variable de la cadena ligera están ligadas a un espaciador que codifica al menos 4 aminoácidos aproximadamente de aminoácidos pequeños neutros, incluyendo glicina o serina. La proteína codificada por esta fusión permite el ensamblaje de una región variable funcional que retiene la especificidad y afinidad del anticuerpo original.
Los anticuerpos AC133 se pueden producir mediante el uso de ADNc de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulinas quiméricas (Liu y col., 84 Proc. Natl. Acad. Sci. 3439 (1987) y 139 J. Immunol. 3521 (1987). El ARNm se aísla de un hibridoma u otra célula que produzca el anticuerpo y se usa para producir ADNc. El ADNc de interés se puede identificar mediante la reacción en cadena de la polimerasa usando cebadores específicos (patentes de EE.UU. 4.683.195 y 4.683.202). Alternativamente, se prepara una librería y se selecciona para aislar la secuencia de interés. A continuación la secuencia de ADN que codifica la región variable del anticuerpo se funde a las secuencias de la región constante humana. Las secuencias de los genes de las regiones constantes humanas se pueden encontrar en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest. N.I.H. publicación No. 91-3242 (1991). Los genes de la región C humana están disponibles fácilmente de clones conocidos. A continuación el anticuerpo humanizado quimérico se expresa mediante procedimientos convencionales.
Los anticuerpos AC133 se pueden producir como fragmentos de anticuerpos, tales como Fv, F(ab’)2 y Fab. Los fragmentos de anticuerpos se pueden preparar por escisión de la proteína intacta, por ejemplo, mediante proteasas o por escisión química. Alternativamente, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab')2 incluirá secuencias de ADN que codifican el dominio CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido por un codón de detención de la traducción para dar la molécula truncada.
Inmunotinción. Las muestras biológicas se someten a ensayo para la presencia de células AC133+ mediante cualquier procedimiento de inmunoensayo conveniente para la presencia de células que expresan la molécula de superficie unida por los anticuerpos objeto. Los ensayos se pueden llevar a cabo sobre lisados celulares, células intactas, secciones congeladas, etc. Los anticuerpos disponibles en Miltenyi Biotec Inc. (Auburn CA) son adecuados para la tinción inmunofluorescente directa de células.
Clasificación celular. El uso de antígenos de la superficie celular para células NS-IC proporciona un medio para la inmunoselección positiva de poblaciones celulares progenitoras, así como para el análisis fenotípico de poblaciones celulares progenitoras usando citometría de flujo. Las células seleccionadas para la expresión del antígeno AC133 se pueden purificar posteriormente por selección para otros marcadores de células madre y de células progenitoras.
Para la preparación de células progenitoras y células madre sustancialmente puras, se separa un subgrupo de células progenitoras de otras células en base a la unión del AC133. Las células progenitoras y células madre se pueden separar adicionalmente mediante la unión a otros marcadores superficiales conocidos en la materia.
Los procedimientos para la separación pueden incluir separación magnética, usando anticuerpos recubiertos con cuentas magnéticas, cromatografía de afinidad y "cribado" con anticuerpos unidos a una matriz sólida, por ejemplo una placa, u otra técnica conveniente. Las técnicas que proporcionan una separación precisa incluyen clasificadores celulares activados por fluorescencia, que pueden tener un grado variable de sofisticación, tales como canales de múltiples colores, canales de detección por dispersión de luz obtusos y de ángulo reducido, canales de impedancia, etc. Las células muertas se pueden eliminar por selección con colorantes asociados a las células muertas (yoduro de propidio [PI], LDS). Se puede emplear cualquier técnica que no sea excesivamente perjudicial para la viabilidad de las células seleccionadas.
Convenientemente, los anticuerpos están conjugados con marcadores para facilitar la separación del tipo celular particular, por ejemplo, cuentas magnéticas; biotina, que se une con afinidad elevada a la avidina o estreptavidina; fluorocromos, que se pueden usar con un clasificador celular activado por fluorescencia; haptenos; y similares. Con el FACS se pueden emplear análisis multi-cromáticos o en una combinación de separación inmunomagnética y citometría de flujo. El análisis multi-cromático es de interés para la separación de células basada en múltiples antígenos superficiales, por ejemplo, AC133+ CD45 -, AC133 -CD34+, etc. Los fluorocromos que encuentran uso en un análisis multi-cromático incluyen ficobiliproteínas, por ejemplo, ficoeritrina y aloficocianinas; fluoresceína y rojo Texas. Una designación negativa indica que el nivel de tinción está a o por debajo del brillo de un isótopo asociado control negativo. Una designación tenue indica que el nivel de tinción puede estar cerca del nivel de una tinción negativa, pero también puede ser más brillante que un isótopo asociado control.
En una forma de realización, el anticuerpo AC133 (cuyo uso no forma parte de la presente invención) está conjugado directa o indirectamente a un reactivo magnético, tal como una micropartícula superparamagnética (micropartícula). La conjugación directa a una partícula magnética se consigue mediante el uso de diversos grupos enlazantes químicos, como es sabido en la materia. El anticuerpo puede estar acoplado a las micropartículas a través de los grupos amino o sulfhidrilo de la cadena lateral y compuestos heterofuncionales están disponibles para la unión a entidades. Un grupo de enlace preferido es el éster de N-hidroxisuccinimida del ácido 3-(2-piridilditio)propiónico (SPDP) o el éster de Nhidroxisuccinimida del ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxílico (SMCC) con un grupo sulfhidrilo reactivo sobre el anticuerpo y un grupo amino reactivo sobre la partícula magnética.
Alternativamente, el anticuerpo AC133 (cuyo uso no forma parte de la presente invención) está acoplado indirectamente a las partículas magnéticas. El anticuerpo está conjugado directamente a un hapteno, y están conjugados a las partículas anticuerpos de segunda fase específicos de haptenos. Los haptenos adecuados incluyen digoxina, digoxigenina, FITC, dinitrofenilo, nitrofenilo, avidina, biotina, etc. Los procedimientos para la conjugación del hapteno a una proteína son conocidos en la materia, y los kits para esas conjugaciones están disponibles comercialmente.
Para llevar a la práctica el procedimiento, el anticuerpo AC133 (cuyo uso no forma parte de la presente invención) se añade a una muestra celular. La cantidad de anticuerpo AC133 necesaria para unir un subgrupo celular particular se determina empíricamente llevando a cabo una separación y análisis de prueba. Las células y el anticuerpo AC133 se incuban durante un periodo de tiempo suficiente para formar los complejos, normalmente al menos 5 minutos aproximadamente, más habitualmente al menos 10 minutos aproximadamente, y normalmente no más de 1 hora, más habitualmente no más de 30 minutos aproximadamente.
Las células se pueden incubar adicionalmente con anticuerpos o moléculas de unión específicas para marcadores de la superficie celular conocidos por estar presentes o ausentes en las células progenitoras o células madre.
Las células marcadas se separan de acuerdo con la preparación del anticuerpo específico. Los anticuerpos marcados con fluorocromos son útiles para la separación FACS, las partículas magnéticas para la selección inmunomagnética, particularmente selección magnética en alto gradiente (HGMS), etc. En los documentos WO 90/07380, PCT/US96/00953, y EP 438,520 se describen dispositivos de separación magnética ejemplares. El AC133 Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA) se puede usar para la selección positiva de células AC133+. El kit proporciona una herramienta para el aislamiento en una sola etapa de células AC133+. El AC133 Cell Isolation Kit contiene reactivo que bloquea la FcR y Microcuentas coloidales MACS conjugadas al anticuerpo monoclonal de ratón AC133 anti-humano.
La población celular purificada se puede recoger en cualquier medio apropiado. Diversos medios están disponibles comercialmente y se pueden usar, incluyendo medio Modified Eagle Medium de Dulbecco (dMEM), solución salina básica de Hank (HBSS), tampón fosfato salino de Dulbecco (dPBS), RPMI, medio de Iscove modificado de Dulbecco (IMDM), tampón fosfato salino (PBS) con EDTA 5 mM, etc., frecuentemente suplementados con suero fetal bovino (FCS), seroalbúmina bovina (BSA), seroalbúmina humana (HSA), etc.
Las poblaciones muy enriquecidas en células progenitoras o células madre humanas se consiguen de esta forma. Las células deseadas serán el 30% o más de la composición celular, preferentemente el 50% o más de la población celular, más preferentemente el 90% o más de la población celular, lo más preferentemente el 95% o más (sustancialmente pura) de la población celular.
Uso de células madre/células progenitoras purificadas. Las células madre/células progenitoras AC133+ son útiles de diversas formas. Las células AC133+ se pueden usar para reconstituir a un hospedador cuyas células se hayan perdido por enfermedad o lesión. Las enfermedades genéticas asociadas a células se pueden tratar mediante modificación genética de células madre autólogas o alogénicas para corregir un defecto genético o se pueden tratar para proteger contra una enfermedad. Alternativamente, las células progenitoras alogénicas normales se pueden transplantar. También se pueden tratar enfermedades distintas a aquellas asociadas a células, en las que la enfermedad está relacionada con la carencia de un producto secretado particular tal como una hormona, enzima, factor de crecimiento, o similar. Los trastornos del SNC engloban numerosas dolencias tales como enfermedades neurodegenerativas (por ejemplo, enfermedad de Alzheimer y de Parkinson), lesión cerebral aguda (por ejemplo, ictus, lesión craneal, parálisis cerebral) y un gran número de disfunciones del SNC (por ejemplo, depresión, epilepsia, y esquizofrenia). En los últimos años las enfermedades neurodegenerativas se han convertido en un asunto importante debido a una población anciana en expansión que presenta el riesgo más elevado para estos trastornos. Estas enfermedades, que incluyen la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis múltiple (EM), la enfermedad de Huntington, la esclerosis lateral amiotrófica, y la enfermedad de Parkinson, se han relacionado a la degeneración de las células neurales en localizaciones particulares del SNC, dando lugar a la incapacidad de estas células o de la región del cerebro para llevar a cabo su función prevista. Proporcionando la maduración, proliferación y diferenciación en uno o más linajes seleccionados mediante factores de crecimiento específicos diferentes, las células progenitoras se pueden usar como fuente de células comprometidas. También se pueden usar neurosferas para producir una variedad de tipos de células sanguíneas, incluyendo células mieloides y células linfoides, así como células hematopoyéticas tempranas (véase, Bjornson y col., 283 Science 534 (1999)).
Las células AC133+ también se pueden usar en el aislamiento y evaluación de factores asociados a la diferenciación y maduración de células. Así, las células se pueden usar en ensayos para determinar la actividad del medio, tales como un medio condicionado, evaluar fluidos para la actividad del factor de crecimiento, la relación con la dedicación de linajes, o similares.
Las células AC133+ también se pueden congelar a la temperatura del nitrógeno líquido y almacenarse durante periodos prolongados de tiempo, descongelarse y poderse volver a usar. Normalmente las células se almacenarán en DMSO al 5% y suero fetal bovino al 95%. Una vez descongeladas, las células se expandirán mediante el uso de factores de crecimiento o células estromales asociadas a la proliferación y diferenciación de células madre.
Los siguientes EJEMPLOS se presentan para ilustrar con mayor profundidad las formas de realización preferidas de la invención. Estos EJEMPLOS no se deben interpretar de ninguna forma como una limitación del alcance de la invención, como se define en las reivindicaciones anexas.
EJEMPLO 1
CLASIFICACIÓN CELULAR MAGNÉTICA (MACS) DE CÉLULAS CEREBRALES FETALES SELECCIONADAS AC133 POSITIVAS QUE CONTIENEN ACTIVIDAD DE CÉLULAS QUE INICIAN NEUROSFERAS (NS-IC)
Las células AC133+ se preparan mediante el siguiente procedimiento: se obtuvo cerebro fetal humano (FBR 10-20 semanas de gestación ["s.g."]) de Advanced Bioscience Resources, INC (Oakland, CA) después de obtener el consentimiento con conocimiento de causa. Los tejidos del cerebro fetal humano se cortaron en piezas cúbicas de 1-3 mm usando escalpelos, se transfirieron a tubos de centrífuga de 50 mL y se lavaron una vez con una disolución de EDTA/PBS al 0,02%. Los tejidos se disociaron enzimáticamente en presencia de colagenasa y hialuronidasa a 37ºC durante 1 hora. Los restos celulares y los agregados se retiraron filtrando las suspensiones celulares a través de un filtro de 70 micrómetros.
Las células de cerebro fetal humano AC133+ se separaron usando el kit de aislamiento de células AC133/1 de microcuentas de anticuerpo paramagnéticas (Cat. # 508-01, Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Las separaciones MACS se llevaron a cabo basándose en las instrucciones que acompañan al kit. En una separación MACS por citometría de flujo representativa en un aislamiento de AC133+ típico, aproximadamente el 44% de las células era AC133+ CD45 -, mientras que el 2% aproximadamente era CD34+ (estas células CD34+ eran células endoteliales complejadas a las NS-IC purificadas).
Las células AC133+ seleccionadas que resultaron del procedimiento descrito anteriormente (usando cerebro de 18 s.g.) aún eran heterogéneas. Las células tendían a formar un complejo con células endoteliales. Las células endoteliales se identificaron como CD34+ o CD105+. La separación MACS de AC133 también enriquece las células endoteliales CD34+ que están asociadas a células AC133+. (Después del paso, las NS-IC se separan de las células endoteliales complejadas y se pueden obtener NS-IC purificadas).
Las células separadas por MACS de AC133+ se cultivaron en presencia de medio que contiene EGF, FGF-2 y LIF, como se ha descrito anteriormente. En los ejemplos comparativos, las células procedentes del cerebro fetal con una edad de gestación temprana (5-12 s.g.) estaban enriquecidas para NSIC y no fue necesario el enriquecimiento para iniciar los cultivos de neurosferas. Por otra parte, las células procedentes de muestras de cerebro fetal más viejo (16-20 s.g.) contenían mucha menos actividad NS-IC y requirieron el enriquecimiento para iniciar los cultivos de neurosferas. En otras palabras, AC133+ es útil para el enriquecimiento de NS-IC procedentes de tejido cerebral de humano con una mayor edad de gestación. Las células separadas por MACS de AC133+ procedentes de cerebro fetal (18 s.g.) estaban enriquecidas para la actividad NS-IC, mientras que todas las células de cerebro fetal humano (18 s.g.) sin separación MACS de AC133+ fracasaron al iniciar los cultivos de neurosferas.
Las células de neurosferas establecidas procedentes de células MACS de AC133 expresan nestina, como se comprueba después de ~7 días en cultivo y se detectan mediante anticuerpos policlonales para nestina de conejo anti-humano. Por ejemplo, entre las células de neurosferas disponibles en CytoTherapeutics (Sunnyvale, CA), FBR 1069 (18 s.g.) y FBR 1070 (20 s.g.) expresaban nestina. Cuando se indujo la diferenciación, las células de neurosferas procedentes de MACS de AC133+ se podían diferenciar en neuronas y astrocitos, como se detecta mediante la tinción de β-tubulina para neuronas y la tinción GFAP para astrocitos. En este ensayo de diferenciación particular, las células de neurosferas se cultivaron sobre una superficie recubierta con laminina en presencia de FBS al 1% sin EGF, FGF-2 ni LIF.
Se puede usar otro ensayo de diferenciación para inducir la diferenciación de NS-IC en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos.
EJEMPLO 2
AC133 ES UN MARCADOR DE LA SUPERFICIE CELULAR CRÍTICO EXPRESADO SOBRE CÉLULAS PROCEDENTES DE CULTIVOS DE NEUROSFERAS A LARGO PLAZO
Se obtuvo en cultivo celular de neurosferas a largo plazo, 8.5 FBR, de CytoTherapeutics Inc.
(Providence, RI). Las células de neurosferas 8.5 FBR expresan AC133 de manera relativamente uniforme. Estas células 8.5 FBR también son Thy-1+, CD166+, y HLADR+. Cuando se usó el Ex Vivo 15 como media basal, se inició un mayor porcentaje de cultivos de neurosferas a partir de tejido de cerebro primario de 18 s.g. Por tanto es posible evaluar la fracción de células AC133+ en el desarrollo de cultivos de neurosferas. La proporción de células AC133+ se incrementó a medida que se desarrollaban las neurosferas. Una vez se hubieron establecido bien las células de neurosferas, virtualmente todas las células que forman neurosferas expresaron AC133.
EJEMPLO 3
LAS CÉLULAS QUE INICIAN NEUROSFERAS SE PUEDEN SEPARAR USANDO ANTICUERPO MONOCLONAL, AC133; APROXIMACIÓN DE CLASIFICACIÓN CELULAR POR CITOMETRÍA DE FLUJO (FACS)
El propósito de este ejemplo es probar si las células AC133+ eran las únicas células en el cerebro que tienen actividad NSC pluripotencial. Se usó mAb contra CD45 humano para excluir la contaminación de células sanguíneas en el tejido fetal. En algunos casos, también se usó mAb contra CD34 humano para excluir las células endoteliales y los complejos progenitores endotelial-neural. Así las células de cerebro fetal se definieron como CD45 -CD34 -. Para medir las actividades de las células madre neurales y células progenitoras primitivas, se estableció un ensayo de NS-IC para determinar la frecuencia de NS-IC en una población dada. Cuando las NS-IC son raras y expresan uniformemente el antígeno AC133, las NS-IC se pueden enriquecer mediante la selección de AC133+, y en consecuencia agotarse en otras fracciones.
Fuente de anticuerpos monoclonales. El antígeno AC133 se definió mediante dos mAbs AC133/1 y AC133/2, ambos conjugados con ficoeritrina, que están disponibles a través de Miltenyi Biotec (Auburn, CA). Se obtuvieron CD45-FITC anti-humano y glicoforina A-FITC en CALTAG (Burlingame, CA) y Coulter (Miami, FL) respectivamente. El CD34 anti-humano conjugado con aloficocianina se obtuvo en BDIS (San Jose, CA).
Preparación celular. Los FBR se disociaron mediante colagenasa y hialuronidasa, y aún contenían el complejo progenitor endotelial, que impedía el aislamiento de una NSC candidato en una sola suspensión celular (las células endoteliales son CD45+). Para disociar este complejo de célula endotelial-NS-CI, las células FBR se procesaron como se ha descrito anteriormente, se trataron posteriormente con tripsina durante 10-15 minutos. El antígeno AC133, el antígeno CD45 y el antígeno CD34 eran resistentes para el tratamiento con tripsina, aunque eran sensibles a glicoforina A.
Después de la digestión con tripsina, las células se lavaron y se tiñeron con mAbs contra CD45, glicoforina A, AC133 y CD34. No se usaron selecciones de cuentas inmunomagnéticas. Las células se incubaron durante 20-60 minutos en hielo. Después del lavado final, las células se resuspendieron en disolución HBSS que contenía 1 µg/mL de yoduro de propidio (PI). Las células marcadas se analizaron y se clasificaron con un FACS de láser dual (Becton Dickinson, San Jose). Las células muertas se excluyeron del análisis mediante sus características de tinción con PI. Después de la clasificación se comprobó la pureza de las poblaciones celulares clasificadas mediante un nuevo análisis FACS. Se realizaron unos perfiles FACS representativos antes de la clasificación y después de la clasificación de las células AC133+ CD45 -(NS-IC, ~5% de las células de partida) y de las células AC133 -CD45 -(~87% de las células de partida).
La actividad NS-IC está muy enriquecida en el subgrupo AC133+ pero no en el subgrupo AC133 -. Las células FBR (normalmente de 16-20 s.g.) se clasificaron normalmente para las fracciones CD45 CD34 -AC133 -y CD45 -CD34 -AC133+. En las poblaciones CD45+ o CD45 -CD34+ en FBR no hay actividad NS-IC significativa.
Las células clasificadas se cultivaron en el medio de neurosferas descrito anteriormente. Normalmente, se usó como medio basal Ex Vivo 15 o una combinación de medios Ex Vivo 15, D-MEM, F
12. Para maximizar el desarrollo de neurosferas, las células clasificadas normalmente se cultivaron en presencia de LIF, FGF-2, EGF y el factor de supervivencia neural, NSF (Cat. CC-4323, Clonetics, San Diego, CA).
Se obtuvo una sola suspensión celular después de la clasificación celular. Después de 4-5 días de cultivo in vitro, las células AC133+ comenzaron a proliferar y se observaron pequeñas neurosferas 810 días después del inicio del cultivo. Las células podían iniciar las neurosferas cuando se cultivaban en presencia de LIF, FGF-2, EGF sin NSF. Los cultivos de neurosferas se iniciaron en cuatro de cuatro tejidos FBR (18-20 s.g.) clasificados para AC133+ CD45 -o AC133+ CD45 -CD34 -.
En contraste, cuando las células FBR AC133 -CD45 -se pusieron en cultivo en presencia de LIF, FGF-2, y EGF, se observaron muy pocas formaciones de neurosferas, y el paso a un nuevo matraz fracasó. Cuando se añadió NSF adicional al medio de crecimiento, se observó algo de inicio de las neurosferas. Así, las células FBR AC133 -CD45 -se agotaron en una cantidad significativa de NS-IC.
EJEMPLO 4
SEPARACIÓN DE CÉLULAS AC133+ PARA ENRIQUECER EN CÉLULAS NS-IC
La separación de células AC133+ se puede usar eficazmente para enriquecer en células NS-IC procedentes de tejido. Además la separación de células AC133+ puede enriquecer adicionalmente en células NS-IC procedentes de preparaciones establecidas. En una prueba, la clasificación de células AC133+ de neurosferas disociadas (CytoTherapeutics, Providence, RI) proporciona un cultivo de NS-IC enormemente enriquecido y muestra un establecimiento de neurosferas incrementado. Usando ese cultivo, la dosis celular necesaria para iniciar una neurosfera en cada pocillo (es decir, 100% positivo) se puede reducir desde 3000-10.000 células a 30 células aproximadamente (véase, Tabla 1, a continuación).
- Tabla 1
- ID tejido
- Célula Dosis celular Puntuación Nº pocillo % positivos % negativos
- FBR 1104
- Post tripsina Ex Vivo 15 1.000 3.000 6 20 24 24 25,0% 83,3% 75,0% 16,7%
LIF/EGF/ FGF-2 10.000 24 24 100,0% 0,0%
100.000 12 12 100,0% 0,0%
FBR 1104 Post tripsina 1.000 23 24 95,8% 4,2% Ex Vivo 15 3.000 24 24 100,0% 0,0% LIF/EGF/ FGF-10.000 24 24 100,0% 0,0%
2/NSF
30.000 12 12 100,0% 0,0%
100.000 12 12 100,0% 0,0%
FBR 1104 Cél. sel. AC133 -1.000 0 24 0,0% 100,0% Ex Vivo 15 3.000 1 24 4,2% 95,8% LIF/EGF/ FGF-10.000 28 48 58,3% 41,7%
2/NSF
Cél. sel. AC133+ 10 2 24 8,3% 91,7%
Ex Vivo 15 100 24 24 100,0% 0,0%
LIF/EGF/ FGF-300 24 24 100,0% 0,0%
2/NSF
1.000 24 24 100,0% 0,0%
FBR 1101 Post tripsina 1.000 9 24 37,5% 62,5% Ex Vivo 15 3.000 16 24 66,7% 33,3% LIF/EGF/ FGF-2 10.000 23 24 95,8% 4,2%
30.000 12 12 100,0% 0,0%
100.000 12 12 100,0% 0,0%
FBR 1101 Post tripsina 1.000 16 24 66,7% 33,3% Ex Vivo 15 3000 21 24 87,5% 12,5% LIF/EGF/ FGF-10.000 24 24 100,0% 0,0%
2/NSF
30.000 12 12 100,0% 0,0%
100.000 12 12 100,0% 0,0%
FBR 1104 Cél. sel. AC133+ 1 9 96 9,4% 90,6% Ex Vivo 15 10 42 60 70,0% 30,0% LIF/EGF/ 30 23 24 95,8% 4,2% FGF-2/NSF 100 11 12 91,7% 8,3%
Como se muestra en la Tabla 1, el tejido del cerebro fresco no enriquecido ("FBR") usado aquí
(s.g. 20) puede contener NS-IC en tales cantidades que requiere una dosis celular de entre 3.000 y
10.000 células para iniciar las neurosferas en cada pocillo. Usando el procedimiento de la invención, se 5 pueden obtener poblaciones enriquecidas, de manera que se requiere una dosis celular de 1.000 células
o menos, y más preferentemente una población enriquecida de manera que se requiere una dosis celular de menos de 100 células. Como se muestra en la Tabla 1, aquí se ha conseguido el enriquecimiento de manera que se requiere una dosis celular de sólo 30 células por pocillo aproximadamente para establecer un cultivo de neurosferas en cada pocillo. La Tabla 1 también muestra que cuando las poblaciones
10 se agotan en células AC133+ (FBR 1104 células seleccionadas AC133 -), el establecimiento de cultivos de neurosferas a partir de esas poblaciones está marcadamente reducido. Ensayo de NS-IC cuantitativo. Para analizar la presencia de NS-IC, se someten a desarrollo clonal las poblaciones celulares sospechosas de contener NS-IC pluripotenciales. Las células se hacen
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-18
crecer en medio de proliferación para formar neurosferas, y a continuación se induce la diferenciación para formar neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos. La presencia de neuronas, astrocitos, y oligodendrocitos se puede demostrar por inmunotinción. Por ejemplo, las neuronas se tiñen por la presencia de βtubulina; los astrocitos se tiñen por la presencia de GFAP; y los oligodendrocitos se tiñen por la presencia de 04.
El análisis de NS-IC cuantitativo se puede realizar sobre células de tejido sin purificar, sobre células clasificadas AC133+, y sobre líneas celulares de neurosferas clonales.
EJEMPLO 5
MEDIO DE CULTIVO CELULAR PARA EL CRECIMIENTO Y PASO DE NS-IC
Weiss y col., patente U.S. 5.750.376 y Weiss y col., patente U.S. 5.851.832 describen un "medio de cultivo que contiene uno o más factores de crecimiento predeterminados eficaces para inducir la proliferación de células madre neurales pluripotenciales" y "condiciones de diferenciación-inducción". No obstante, se pueden usar diferentes medios basales, incluyendo, pero no limitado a:
D-MEM/F12 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD);
Ex Vivo 15 (Bio Whittaker, Walkersville, MD);
Medio basal progenitor neural, (Clonetics. San Diego, CA); o
la combinación de los medios basales listados anteriormente.
En la Tabla 2 se proporciona una formulación de medios típica para cultivar células de neurosferas humanas.
Tabla 2
Medio de cultivo para neurosferas suplementado con N2/EGF exento de suero
Cantidad Reactivos
87 ml DMEM/F12 (Gibco lot. 1012915; No. Cat. 11330-032) 1 ml N-2 Suplemento (Gibco lot. 1017018; No. Cat. 17502-014) 1 ml 0,2 mg/ml de heparina (Sigma lot. 28H0320; No. Cat. H-3149) 1 ml Glutamina 0,2 M (JCR lot. 7N2320; No. Cat. 59202-77p)
10 ml Glucosa al 3% (Sigma, lot. 37H0841; No. Cat. G-7021)
20 µl 100 µg/ml de EGF (R&D lot. CE107091; No. Cat. 236-EG) 100 µl 20 µg /ml de FGF-2 (Gibco lot KCQ411; No. Cat. 13256-029) 100 µl 10 µg /ml de LIF (R&D lot OX038021; No. Cat. 250-L)
Se añade EGF a 100 ml de medio básico para neurosferas humanas después de filtrar el medio. El EGF es relativamente estable en el medio. Se añade FGF-2 y LIF cuando el medio está listo para su uso. Las concentraciones finales de los reactivos suplementarios son:
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5 g/ml Insulina
100 g/ml Transferrina humana
6,3 ng/ml Progesterona
16,1 g/ml Putrascina
5,2 ng/ml Selenita
20 ng/ml EGF
20 ng/ml FGF-2
10 ng/ml LIF
2 g/ml Heparina
2 mM L-glutamina
6 mg/ml Glucosa
La optimización de la formulación del medio permite establecer un mayor porcentaje de neurosferas iniciadas a partir de tejido del cerebro primario. Nosotros preferimos el medio Ex Vivo 15. La optimización de la formulación del medio también permite un crecimiento de neurosferas más consistente. Para maximizar el desarrollo de las neurosferas, las NS-IC normalmente se cultivan en presencia de LIF, bFGF, EGF y el factor de supervivencia neural, NSF (Cat. CC-4323, Clonetics, San Diego, CA). En una prueba, ambas células neurales FBR 1101 tripsinizadas y células neurales FBR 1104 tripsinizadas (CytoTherapeutics, Sunnyvale, CA), muestran un crecimiento incrementado cuando se cultivan en medio Ex Vivo 15 con LIF, bFGF, EGF, y NSF.
EJEMPLO 6
AISLAMIENTO DIRECTO DE CÉLULAS MADRE NEURALES HUMANAS A PARTIR DE CEREBRO FETAL MEDIANTE CLASIFICACIÓN CELULAR
Una fuente de células humanas injertables muy definidas capaces de una amplia regeneración neuronal podría ser un producto terapéutico eficaz para el tratamiento de trastornos neurodegenerativos. Para definir procedimientos reproducibles para el enriquecimiento de células madre neurales humanas (NSCs) hemos desarrollado y usado anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos contra marcadores superficiales sobre células neurales humanas para identificar y purificar las NSCs mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Basándose en los análisis FACS e inmunohistoquímicos, se identificaron dos mAbs, 5F3 y 5E12. Definían dos pequeños subgrupos de células de cerebro fetal y presentaban reactividad específica a células en el fondo de la placa y la capa ependimal de la médula espinal (12 s.g.), sitios conocidos por contener células madre del SNC. Estos mAbs, tiñen menos del 5% de las células FBR, y más del 95% de las células procedentes de cultivos de neurosferas a largo plazo fueron positivos.
Como ejemplo, se clasificaron y probaron dos poblaciones celulares 5F3+CD34 -CD45 -(5F3+) y 5F3 -CD34 -CD45 -(5F3 -) por su capacidad para iniciar cultivos de neurosferas. El subgrupo 5F3+ estaba muy enriquecido para la actividad celular que inicia las neurosferas; proliferaron para formar pequeñas neurosferas en 8-10 días de cultivo. En contraste, las células 5F3 -permanecieron como una suspensión
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de células únicas, fracasaron en iniciar neurosferas, y eventualmente murieron. Las células de neurosferas clasificadas 5F3+ expandidas eran positivas para la expresión de nestina, y se diferenciaron en neuronas y glía después de la exposición a condiciones de diferenciación. Usando el ratón NOD SCID, los estudios in vivo muestran que a las ocho semanas después del trasplante las células de neurosferas 5F3+ se pueden injertar y migrar. Estos estudios muestran que hemos identificado y enriquecido NSCs humanas en base a marcadores de la superficie celular y citometría de flujo y demostraron su actividad usando ensayos in vitro e in vivo.
En pruebas comparativas posteriores, examinamos tejidos del cerebro y de la espina dorsal a lo largo de diversas fases de gestación. La edad de gestación más temprana (5-12 semanas de gestación) tiene una mayor frecuencia de células que inician neurosferas (NS-IC) que edades de gestación posteriores (16-20 semanas de gestación) véase, por ejemplo, figura 5. El cultivo directo de células procedentes de estos tejidos da lugar al inicio de neurosferas.
Nuestros datos (mostrados en la Tabla 3 a continuación) demuestran que la población celular de células neurales enriquecidas para células 5F3+ están enriquecidas para la actividad NS-IC, hasta 23 veces.
Tabla 3
- Población
- % en cerebro NS-IC Intervalo
- Células cerebrales post-procesadas (n = 8)
- 100 1/819 1/304-1435
- Clasificadas 5F3 (n = 6)
- 95 1/5434 1/4224-7772
- Clasificadas 5F3+ (n = 6)
- 4,6 1/36 1/10-74
Además, como muestra la figura 2, las neurosferas pueden proceder de células 5F3+ clasificadas a partir de una sola célula. También hemos demostrado que la auto-renovación de células de neurosferas procedentes de células 5F3+ clasificadas se puede conseguir mediante el reinicio de neurosferas procedentes de células únicas (datos no mostrados). Inversamente, nuestros datos indican que las poblaciones celulares agotadas de células 5F3+ también están agotadas para la actividad NS-IC.
EJEMPLO 7
AISLAMIENTO DE NS-IC POR MARCADORES DIFERENTES
Como segundo ejemplo, clasificamos poblaciones celulares usando un anticuerpo monoclonal, 5E12, descrito en el presente documento. El subgrupo 5E12+ se enriqueció para la actividad celular que inicia las neurosferas, como se muestra en la Tabla 4 a continuación. Véase también la figura 3. Nuestros datos sugieren que el antígeno para el anticuerpo 5E12 se co-expresa con el antígeno AC133 sobre células 5F3+.
También evaluamos el anticuerpo monoclonal 8G1 como subselector para células madre neurales, como se muestra en la Tabla 4 a continuación. Las células que eran 5F3+ y 8G1-/lo presentaban más propiedades de tipo célula madre, mientras que las células que eran 5F3+ y 8G1mid/hi presentaban más propiedades de tipo célula progenitora.
Tabla 4
Enriquecimiento de NS-IC mediante anticuerpos 5F3, 5E12 y 8G1
Población % en cerebro NS-IC Intervalo
- Células cerebrales control (n = 8)
- 100 1/819 1/304-1435
- 5F3 (n = 6)
- 95 1/5434 1/4224-7772
- 5F3+ (n = 6)
- 4,6 1/36 1/10-74
- 5E12 (n = 2)
- 97 1/1335 1/1259, 1411
- 5E12+ (n = 3)
- 2,5 1/286 1/79-392
- 5F3+ 8G1-/lo (n = 3)
- 1,1 1/23 1/15-34
- 5F3+ 8G1mid/hi (n = 3)
- 1,7 1/63 1/38-105
- *Todas las poblaciones clasificadas eran CD34
- CD45
ESTUDIOS DE NS-IC in vivo
Transplantamos NS-ICs clasificadas 5F3+ (obtenidas como se ha descrito anteriormente) en los
15 ventrículos laterales de ratones neonatos inmunodeficientes, usando técnicas convencionales. El injerto y la migración de las células de neurosferas humanas se detectó entre 4-8 semanas después de la inyección usando un anticuerpo Thy-1 específico para humanos (véase figura 6). Como se muestra en la figura 7, la tinción con β-tubulina humana (un marcador neuronal) y antígeno nuclear humano (para la localización de células humanas) reveló la migración de las células de neurosferas humanas a través de
20 la corriente migratoria rostral (RMS). Además, como se muestra en la figura 8, la localización usando antígeno nuclear humano demostró que las células de neurosferas humanas habían migrado a través de la RMS al bulbo olfativo.
EJEMPLO 10
25 AISLAMIENTO DIRECTO Y TRANSPLANTE DE CÉLULAS MADRE DEL SISTEMA NERVIOSO CENTRAL DE HUMANOS
Introducción y resumen. Las células madre, células clonogénicas con propiedades de auto30 renovación y diferenciación en múltiples linajes, tienen el potencial para remplazar o reparar tejido dañado. En este ejemplo, hemos aislado células madre clonogénicas de cerebro humano (CNS-SC) que inician cultivos de neurosferas y muestran tanto auto-renovación como diferenciación en neuronas y glía. Estas CNS-SC humanas no modificadas genéticamente están marcadas por anticuerpos monoclonales para marcadores superficiales. Las células son 5F3 (AC133)+, 5E12+, CD34 -CD45 -y CD24-/lo. Las células clasificadas AC133+ CD34 -CD45 -únicas iniciaron los cultivos de neurosferas y presentaron una diferenciación en múltiples linajes. Una vez trasplantadas en cerebros de ratones neonatos inmunodeficientes las CNS-SC clasificadas y expandidas presentan un injerto, proliferación, migración y diferenciación potentes de una forma específica de sitio.
En este ejemplo, demostramos que los mAbs 5F3 y el nuevo mAb, 5E12, detectan un subgrupo distinto de células de cerebro fetal humano (FBr). La clasificación celular activada por fluorescencia usando estos mAbs junto con mAbs que marcan la contaminación con sangre y células endoteliales (CD34 y CD45) da como resultado un subgrupo de células FBr humanas, AC133+CD34 -CD45 -. Después de la clasificación celular, las células clasificadas son capaces al nivel de una sola célula de iniciar las neurosferas, auto-renovación, y diferenciación en múltiples linajes, células que proponemos como CNSSC humanas. Estas CNS-SC humanas candidato se auto-renovaron y se expandieron significativamente en cultivos de neurosferas, y se diferenciaron in vitro en neuronas y glía. Las CNS-SC candidato clasificadas y expandidas se pueden transplantar en los ventrículos laterales de cerebros de ratón NOD-SCID recién nacido, donde experimentan un injerto específico de sitio aparentemente apropiado, auto-renovación continuada, migración y diferenciación durante al menos 7 meses.
Búsqueda de marcadores de células madre neurales del SNC; estrategia. Propusimos la hipótesis de que los marcadores de las CNS-SC candidato sólo se debían expresar en un pequeño subgrupo de células FBr. Puesto que había evidencias de que los cultivos de neurosferas contienen una población enriquecida de células madre/progenitoras, propusimos la hipótesis de que los marcadores de células madre neurales candidato se deben expresar más abundantemente en estas células. Así, seleccionamos mediante los mAbs usados previamente para definir las células madre hematopoyéticas humanas (HSC).
Las poblaciones clasificadas se probaron para determinar si estaban enriquecidas en células que inician las neurosferas (NS-IC). Cualquier mAb que separe limpiamente FBr en 2 fracciones (una fracción que estableció un cultivo de neurosferas y una que no) se consideró un mAb candidato para ayudar a identificar NS-IC. En la selección inicial, se buscaron mAbs que teñían positivamente una pequeña fracción de FBr y una gran fracción de células de neurosferas cultivadas a largo plazo, y otros mAbs (para la selección negativa) que teñían la mayoría de células FBr pero una pequeña fracción de células de neurosferas. Las FBr disociadas enzimáticamente y las células de neurosferas cultivadas a largo plazo se tiñeron con más de 50 mAbs conocidos.
Se ha descrito previamente un cultivo de neurosferas a largo plazo 8.5 FBr, (Carpenter y col., 158 Exp. Neurol. 265-78 (1999)). Estas células se cultivaron en medio normal de neurosferas humanas: medio basal D-MEM/F12 con suplemento N-2 (Gibco), glucosa al 3%, glutamina 0,2 M y 0,2 mg/ml de heparina en presencia de FGF-2 (20 ng/mL), EGF (20 ng/ mL), y LIF (10 ng/mL). Las células cultivadas se recogieron y se disociaron enzimáticamente en presencia de colagenasa durante 5-10 minutos para su paso o se tripsinizaron para obtener una suspensión de células únicas para la tinción con mAbs.
Las células de neurosferas no expresaron los marcadores vasculares y hematopoyéticos CD34 o CD45. En contraste, Thy-1, un marcador de la superficie celular crítico que identifica tanto HSC de ratones como de humanos, estaba expresado a niveles elevados virtualmente en todas las células FBr y células de neurosferas, y por tanto no fue útil. De manera interesante, la selección del anticuerpo inicial reveló que otro marcador de HSC, AC133, se expresaba sólo en el 1-5% de las células FBr procedentes de tejido de 16-20 semanas de gestación (s.g.) y en el ~90% de las células de neurosferas cultivadas.
Anticuerpo monoclonal AC133 enriquecido en CNS-SC humanas. Se obtuvo tejido FBr humano de los restos de los fetos de 16-20 semanas de gestación (s.g.) de Advanced Bioscience Resources, Inc., según las directrices del NIH. Los tejidos FBr se cortaron en piezas de 1-3 mm usando escalpelos, se transfirieron a tubos de centrífuga de 50 mL y se lavaron una vez con una disolución de EDTA/PBS al 0,02%. Los tejidos se disociaron enzimáticamente en presencia de colagenasa al 0,1% (Roche, Indianapolis, IN) y hialuronidasa al 0,1% (Sigma, St Louis, MO) a 37ºC en HBSS suplementado con BSA al 0,1%, HEPES 10 mM y DNasa durante 1 h. Para obtener una suspensión de células únicas, las células FBr disociadas se trataron posteriormente con tripsina al 0,05%, EDTA 53 mM (Gibco, Grand Island, NY) durante 10-15 minutos. Los restos celulares y agregados se eliminaron filtrando la suspensión celular a través de un filtro de 70 micrómetros.
Se obtuvieron suspensiones celulares únicas después del tratamiento con colagenasa/hialuronidasa seguido de tripsinización. Por tanto, la selección estaba limitada a epítopos de la superficie celular resistentes a tripsina.
Los cultivos en bruto de células CD45+ o CD34+ clasificadas procedentes de FBr fracasaron en iniciar los cultivos de neurosferas. Así, ambos CD34 y CD45 se podrían usar como selectores negativos para las CNS-SC humanas.
Para probar si CNS-SC se pueden aislar en relación a la expresión de AC133, las células FBr humanas se tiñeron con anticuerpos para CD34, CD45 y AC133. El antígeno AC133 estaba definido por dos mAbs AC133/1 y AC133/2, ambos conjugados con ficoeritrina (PE), que está disponible a través de Milteny Biotec (Auburn, CA). Se obtuvieron CD45-FITC anti-humano, CD34 anti-humano conjugado con aloficocianina (APC) en CALTAG (Burlingame, CA) y BDIS (San Jose, CA), respectivamente. Las células FBR disociadas se incubaron con mAbs contra CD45-FITC, AC133/1 AC133/2-PE y CD34-APC durante 20-60 minutos en hielo. Después del lavado final, las células se resuspendieron en disolución HBSS que contiene 0,5 g/mL de yoduro de propidio (PI). Las células marcadas se analizaron y se clasificaron con un dual-laser Vantage SE (BDIS, San Jose). Las células muertas se excluyeron del análisis mediante sus características de tinción con PI. La contaminación por células sanguíneas y células endoteliales se excluyó sacando las células CD45+ y las células CD34+, respectivamente. Después de la clasificación se comprobó la pureza de las poblaciones celulares clasificadas.
Se clasificaron y cultivaron dos poblaciones celulares, AC133 -CD34 -CD45 -(AC133 -) y AC133+CD34 -CD45 -(AC133+), para su actividad NS-IC. Aunque la expresión de AC133 inicialmente parece ser un continuo (figura 9A), el enriquecimiento previo con FACS de células AC133+ seguido por una segunda ronda de clasificación celular reveló una población AC133+ distinta (figura 9A). En todas las pruebas posteriores, ambos subgrupos AC133 -y AC133+ se clasificaron dos veces, dando como resultado fracciones de células FBr AC133 -y AC133+ con una pureza elevada (figura 9A).
Las suspensiones de células únicas AC133+ cultivadas en condiciones de neurosferas se volvieron de aspecto blástico, se adhirieron sobre la placa de plástico y comenzaron a iniciar la división celular. Después de 4-5 días en cultivo, una gran fracción de las células AC133+ comenzó a proliferar y a flotar en forma de grupo de unas pocas células. Se observaron pequeñas neurosferas tan sólo 7-10 días después del inicio del cultivo (figura 9C). En contraste, las células AC133 -clasificadas permanecieron en forma de suspensión de células únicas, fracasó en iniciar las neurosferas, y eventualmente murieron (figura 9B). Así, la actividad NS-IC se encuentra en el subgrupo AC133+ pero no en el subgrupo AC133 de células FBr CD45 -CD34 -.
Sólo las células FBr humanas AC133+ contienen actividad NS-IC. Puesto que el ensayo de NSIC cualitativo demostró una diferencia notable en la proliferación entre subgrupos AC133 -y AC133+, quisimos determinar la frecuencia de NS-IC en suspensiones de células FBr sin fraccionar (es decir, después del procesado de las células) y diversas suspensiones de células FBr fraccionadas. Las células FBr sin fraccionar se pusieron en placa por dilución limitante (100-10.000 células/pocillo) en placas de 96 pocillos usando la unidad de deposición de células automática (ACDU) FACS. Estas placas se cultivaron durante 6-8 semanas, y los pocillos que contenían las neurosferas se marcaron como positivos.
Las células FBr clasificadas se cultivaron en cultivo de neurosferas en medio Ex Vivo 15 (Bio Whittaker, Walkersvile, MD) con suplemento N2 (Gibco) en presencia de FGF-1 (20 ng/mL), EGF (20 ng/mL), LIF (10 ng/mL), el factor de supervivencia neural 1 (Clonetics, San Diego, CA) y 60 g/mL de Nacetilcistina (Sigma) (medio de iniciación de las neurosferas). La formulación del medio se optimizó basándose en análisis de la frecuencia de la dilución limitante de las células FBr. Los cultivos se introdujeron semanalmente y se pasaron cuando las neurosferas se volvían grandes. En algunos casos, las células FBr clasificadas se volvieron a clasificar mediante la unidad de deposición de células automática (ACDU) en placas de 96 pocillos para evaluar la frecuencia de los precursores para iniciar los cultivos de neurosferas. Estas placas de 96 pocillos se introdujeron semanalmente y la presencia de neurosferas en los pocillos se valoró 6-8 semanas después del inicio del cultivo. Se usó análisis por regresión lineal de la proporción de pocillos negativos a cada concentración celular para determinar la frecuencia de NS-IC.
Se detectaron múltiples neurosferas en los pocillos con dosis celulares elevadas (es decir,
10.000 células por pocillo), mientras que en los pocillos con una dosis celular inferior (es decir, 300-1000 células/pocillo), los pocillos positivos contenían sólo neurosferas únicas. A 100-300 células por pocillo, sólo pocillos excepcionales contenían una única neurosfera. Cuando el log de pocillos negativos se representa frente al número de células por pocillo, se encuentra una función lineal recta; al 37% de pocillos negativos se determinó un único punto para NS-IC (figura 10A). En un tejido representativo mostrado en la figura 10A, las células de cerebro procesado control contenían actividad NS-IC a una frecuencia de 1/880 células. En el subgrupo AC133 -hubo una reducción de la frecuencia de NS-IC a 1/4860 células. En contraste, la actividad NS-IC estaba muy enriquecida en el subgrupo AC133+ con una frecuencia de 1/32 células (figura 10A). La frecuencia de NS-IC en 8 tejidos FBr diferentes (16-20 semanas de gestación) se evaluó como se resume en la figura 10B y en la Tabla 5.
Tabla 5
Enriquecimiento de la actividad NS-IC aislada mediante marcadores de la superficie celular
- Población
- % en cerebro NS-IC Intervalo de NS-IC
- Células cerebrales control Clasificadas AC133 -* Clasificadas AC133+* Células cerebrales control Clasificadas 5F12 -* Clasificadas 5F12+* Células cerebrales control AC133+ 8G1-/lo* AC133+ 8G1mid/hi*
- 100 95 4,6 100 97 2,5 100 1,1 1,7 1/731 1/4344 1/31 1/1132 1/1335** 1/286 1/1030 1/23 1/63 1/139-1435 1/745-4760 1/6-1/74 1/661-1435 1/1259, 1441(35672) 1/79-392 1/399-1435 1/15-34 1/38-105
*todas las poblaciones clasificadas también fueron excluidas para CD34 -CD45 -, que representa el 98-99% de FBr.
**datos que excluyen una prueba, como la frecuencia de NS-IC real calculada indicada en paréntesis. Esto fue debido a que la mayoría de los pocillos eran negativos.
En células de cerebro fetal sin fraccionar, aproximadamente 1 en 730 células contiene actividad NS-IC. El subgrupo AC133 -, que representa >95% de FBr contenía <1 en 4300 células con NS-IC y por 5 tanto se redujo ~6 veces. En contraste, la actividad NS-IC estaba enriquecida de media 23 veces en el subgrupo AC133+ con ~1/31 (intervalo de 1/6 a 1/72) células FBr frescas capaces de iniciar una neurosfera. Puesto que las células AC133+ representan el ~4,6% de FBr (es decir, 1 en 22 células), el enriquecimiento de la actividad NS-IC es virtualmente paralelo a la frecuencia de células AC133+ en FBr. Así, las células AC133+ contenían todas actividad NS-IC detectable en suspensiones celulares FBr de 16-20
10 semanas de gestación.
Expansión clonal de neurosferas, auto-renovación y diferenciación a partir de células clasificadas
+
AC133individuales. Para confirmar la clonalidad de las neurosferas, células clasificadas AC133+ procedentes de FBr únicos se pusieron directamente en placa en los pocillos de una placa de 96 pocillos mediante el ACDU. Después de 8 semanas, algunos pocillos contenían neurosferas individuales, confir
15 mando que éstas procedían de células clasificadas AC133+ individuales (figura 10C). La actividad de auto-renovación de neurosferas procedentes de AC133+ se probó para la capacidad de reiniciar cultivos de neurosferas. Por ejemplo, cultivos de neurosferas primarios iniciados mediante células FBr clasificadas AC133+ se disociaron y se volvieron a poner en placa como una sola célula por pocillo. Nueve de los 96 pocillos presentaron el desarrollo de una sola neurosfera. En una
20 prueba, se obtuvieron neurosferas por clonación a partir de células de neurosferas clasificadas AC133+ con una eficacia de siembra del 10% aproximadamente. Consistentemente, las células de neurosferas que se convirtieron en AC133 -fracasaron en reiniciar los cultivos de neurosferas secundarios. Así, estos resultados cuantitativos demostraron que la actividad NS-IC está muy enriquecida en el subgrupo AC133+ y reducida en el subgrupo AC133 -de células FBr.
25 Para probar la capacidad de diferenciación de células de neurosferas obtenidas por clonación,
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se recogieron, se pusieron en placa, y se indujo la diferenciación de neurosferas únicas en presencia de los factores neurotrópicos, BDNF y GDNF. Las células de neurosferas de recogieron y se disociaron con colagenasa y se pusieron en placa sobre portaobjetos con cámara recubiertos con poli-ornitina. Se cultivaron en el medio de inicio de las neurosferas durante un día hasta que se sembraron en la placa. El cultivo se sustituyó con medio de diferenciación, que consiste en Ex Vivo-15, N2, NAC, BDNF (10 ng/mL), GDNF (10 ng/mL) y laminina (1 g/mL). Después de 1-2 semanas, los portaobjetos con cámara se fijaron con paraformaldehído al 4% en PBS y se tiñeron para detectar la diferenciación en neuronas y astrocitos, con mAbs contra tubulina y la proteína ácida fibrilar glial (GFAP).
En estas condiciones, las neurosferas derivadas de AC133+ se diferenciaron en neuronas y astrocitos (figura 10D). Juntos, los datos sugieren que el mAb AC133 es un marcador para NS-IC y se puede usar para enriquecer las CNS-SC humanas. Estos cultivos de neurosferas procedentes de AC133+ se han pasado continuamente (> P15 antes de congelar). En una estimación grosera, el número absoluto de células AC133+ se ha incrementado al menos 1000 veces en el 5º paso (Tabla 6), y son capaces de reiniciar la reproducibilidad de las neurosferas. Por tanto, AC133 define una población celular neural que se expande continuamente y se auto-regenera in vitro.
- Tabla 6
- Expansión de células humanas clasificadas AC133+
- Expansión
- Días en cultivo Expansión del número de células entre el Paso 0 y 5
- Exp. 1
- 87 924
- Exp. 2
- 76 944
- Exp. 3
- 96 750
- Exp. 4
- 74 463
- Exp. 5
- 110 2469
- Media
- 89 1013
+ -/lo
Las NS-IC también están enriquecidas en células 5E12y 8G1; generación de nuevos mAbs. Actualmente con la selección de la utilidad de mAbs disponibles, buscamos identificar nuevos marcadores de la superficie celular en células neurales humanas. Las células FBr se disociaron con una combinación de colagenasa y hialuronidasa y se usaron para inmunizar ratones BALB/c, con una estrategia de señuelo para aumentar los mAbs específicos de tejido. Se seleccionaron 1900 células de hibridoma aproximadamente que crecen en pocillos y los hibridomas se seleccionaron, expandieron, y se probaron posteriormente para su reactividad específica al cerebro humano. Se produjeron anticuerpos monoclonales para células neurales humanas usando una estrategia de inmunización de señuelo descrita previamente por Yin y col., 90 Blood 5002-12 (1997). Resumiendo, se inmunizaron ratones BALB/c en una almohadilla del pie con sangre periférica enriquecida con leucocitos humanos señuelo, y en la almohadilla del pie contralateral con células de cerebro fetal humano disociadas enzimáticamente. Las células del nodo linfático donadoras que drenan la inmunización de las células FBr humanas se recogieron, se procesaron para una suspensión celular y se fundieron con una línea de mieloma de ratón. Esta fusión a una línea de mieloma de ratón ha resultado en 1900 células de hibridoma que crecen en pocillos. Se seleccionaron 180 hibridomas aproximadamente, se expandieron, y se probaron posteriormente para su
reactividad específica a las células de cerebro humano.
Como se ha descrito anteriormente, las CNS-SC estaban muy enriquecidas en el subgrupo AC133 -. Para caracterizar adicionalmente el fenotipo de las CNS-SC, probamos si las células AC133+ son fenotípicamente heterogéneas. Así, las células AC133+ se seleccionaron para la co-expresión de otros marcadores del plantel de nuevos mAbs. Se identificaron dos nuevos mAbs, 5E12 y 8G1. El mAb co-tiñe las células AC133+ y células de neurosferas a largo plazo. Las células FBr 5E12+ están enriquecidas y las células 5E12 -están agotadas en la actividad NS-IC (Tabla 5).
En el desarrollo del cerebro fetal, la mayoría de células FBr (> 90%) expresaron un nivel elevado del marcador 8G1 (figura 4). Las células AC133+ eran heterogéneas en la expresión de 8G1; mayoritariamente células 8G1-/lo, algunas 8G1mid, y pocas 8G1hi (figura 12). De manera interesante, la expresión de 8G1 sobre células de neurosferas humanas cultivadas a largo plazo también fue heterogénea. Los estudios por inmunoprecipitación y bloqueo determinaron que 8G1 es un mAb anti-CD24. Históricamente, CD24 es conocido como el antígeno estable al calor (HSA) y se usa ampliamente como marcador en hemato-linfopoyesis (Alterman y col., 20 Eur J Immunol 1597-602 (1990)). HSA se expresa a niveles bajos en ratón HSCs (Shih & Ogawa, 81 Blood 1155-60 (1993); Spangrude & Scollay, 18 Exp. Hematol. 920-6 (1990)), y a niveles elevados en células proB y pre-B y timocitos, y está completamente regulado aguas abajo cuando estas células se vuelven linfocitos maduros (Alterman y col., 20 Eur. J. Immunol. 1597-602 (1990)). Como se muestra en la Tabla 5, la frecuencia de NS-IC es mayor en la fracción AC133+CD24-/lo comparado con el subgrupo AC133+CD24mid/hi .
Capacidad de injerto potente de células de neurosferas humanas procedentes de AC133+ (prueba no ilustrativa). Para probar la capacidad de injerto, migración y diferenciación in vivo de CNS-SC clasificadas/expandidas humanas, se inyectaron 105 o 106 células de neurosferas (iniciadas a partir de células FBr clasificadas AC133+) en los ventrículos laterales o en los cerebros de ratón neonato NODSCID.
Las células de neurosferas clasificadas AC133+ expandidas en el paso 6-10 se recogieron y se disociaron suavemente con colagenasa para obtener pequeños grupos de células. Las células se resuspendieron en el equivalente de 0,25 x 105 o 2,5 x 105/L. Los ratones neonatos (< 24 horas después del nacimiento) se crio-anestesiaron usando hielo; una vez anestesiados, las crías se pusieron en un dispositivo estereotáxico. Con una aguja se perforó un pequeño agujero en el cartílago y las suspensiones celulares se introdujeron con una jeringa Hamiliton en ambos espacios ventriculares laterales. Los ratones neonatos se inyectaron con 2 l de células que abarcan 105-106 células/inyección. Las crías se reanimaron por calentamiento para controlar el resultado de la cirugía y a continuación se devolvieron a la madre. Los ratones inyectados se mantuvieron durante 7 meses antes de probar el injerto de células humanas.
Los ratones NOD-SCID neonatos se escogieron como receptores para maximizar la participación de células inyectadas en el sistema neurológico, puesto que la génesis celular aún está activamente en progreso en algunas partes del cerebro del ratón neonato. Además, los ratones inmunodeficientes no rechazan tejidos humanos, y los ratones SCID y NOD-SCID se han usado como hospedadores para estudios in vivo de hematopoyesis humana e injerto de tejido (McCune y col., 241 Science 1632-9 (1988); Kamel-Reid & Dick, 242 Science 1706-9 (1988); Larochelle y col., 2 Nat. Med. 1329-37 (1996)).
Siete meses después del trasplante, los animales se sacrificaron, y se tiñeron secciones sagitales con mAbs específicos para humanos contra N-CAM y Thy-1 así como el antígeno nuclear humano.
Después de 7 meses tras el trasplante, los ratones NOD-SCID se anestesiaron profundamente con Avertin y se perfundieron con PBS, seguido de paraformaldehído al 4% en tampón fosfato. Los cerebros se fijaron durante toda la noche, se pusieron en una disolución de sacarosa al 30% y se congelaron en el compuesto OCT. Los cerebros se seccionaron sagitalmente a un grosor de 5 µm para la inmunocitoquímica posterior. Para detectar las células humanas en los cerebros de ratón trasplantados, la secciones se tiñeron con anticuerpos monoclonales de ratón contra Thy-1 humana (Pharmingen, San Diego, CA), N-CAM, tubulina (Sigma) o el antígeno nuclear (Chemicon) seguido de Ig de cabra anti-ratón conjugada con Alexa 488 (Molecular Probe, Eugene, OR).
La tinción de estos mAbs sobre controles de cerebro de ratón no mostró reactividad cruzada. Los mAbs contra GFAP y β-tubulina tiñeron ambas células humanas y de ratón, y así se usó el marcaje doble con el anticuerpo nuclear anti-humano para demostrar las poblaciones celulares específicas del linaje humano. El análisis detallado se centra particularmente en los dos sitios del cerebro que se ha demostrado previamente que son sitios de neurogénesis activa, la zona subventricular (SVZ) de los ventrículos laterales y la circunvolución dentada del hipocampo (figura 12A).
Se encontraron células humanas por todo el cerebro del ratón y eran abundantes en la SVZ siete meses después de la inyección (figura 12). Por ejemplo, en un área muchas células con núcleos+ de humanos estaban rodeadas por células GFAP+ (figura 12B). Los exámenes microscópicos confocales indicaron que la mayoría de las células humanas eran GFAP -, pero también se detectaron células GFAP+ humanas ocasionales (figura 12B, flecha).
Los cerebros de ratón trasplantados se seccionaron a un grosor de 40 micrómetros en un microtomo y se tiñeron con mAbs, y se analizaron usando un microscopio de barrido de luz confocal Bio-Rad como se ha descrito previamente por Suhonen y col., 383 Nature 624-7 (1996).
Debido a que las células madre/progenitoras en la SVZ se ha demostrado que proliferan continuamente, probamos si la progenie de las células de neurosferas clasificadas/expandidas AC133+ humanas trasplantadas aún estaba proliferando in situ. Una sección del cerebro trasplantado se tiñó con Ki67, un marcador asociado a la proliferación celular. Sorprendentemente, un grupo de células humanas en la SVZ, anidado en células GFAP+, co-expresó Ki-67, que indica que las células humanas en la SVZ pueden, como sus homólogos de ratón, continuar proliferando 7 meses después del trasplante en la SVZ (figura 12C).
En el sistema olfativo de roedores, la progenie de células madre/progenitoras que ha proliferado en la SVZ entra en la corriente migratoria rostral (RMS) y migra al bulbo olfativo (Lois & Alvarez-Buylla, 264 Science 1145-8 (1994)). La "cadena de neuroblastos" de las progenitoras de roedores endógenos en la RMS expresan β-tubulina y N-CAM (Fricker y col., 19 J. Neurosci. 5990-6005 (1999); Gage & Cristen, Isolation, characterization and utilization of CNS stem cells (Springer, Heidelberg, 1997)). Las secciones sagitales que contienen la RMS se examinaron para la presencia de células neurales humanas. En ratones transplantados con células de neurosferas clasificadas AC133+, se detectaron un gran número de células humanas, comenzando en la SVZ y que se extienden por toda la RMS (figura 13A). Muchas de estas células humanas agrupadas estaban colocalizadas con β-tubulina, pero fue difícil identificar células doble positivo en esos grupos. El examen cuidadoso de tejidos que contienen menos células humanas reveló múltiples células que eran doble positivo tanto para β-tubulina como para el antígeno nuclear humano (figura 13B, flecha). Además, muchas de estas células en la RMS expresaban el marcador específico humano, N-CAM (figura 13C).
Después de migrar a través de la RMS, se espera que la progenie de células madre/progenitoras entre en el bulbo olfativo y se extienda hacia el glomérulo olfativo a las capas periglomerulares del bulbo (Lois & Alvarez-Buylla, 264 Science 1145-8 (1994)). Como se muestra en la figura 13D, la progenie trasplantada de células humanas se distribuye en las capas glomerulares así como en las capas periglomerulares. Algunas de estas células expresaban el N-CAM humano, que indica que estaban destinadas a linajes neuronales. Así, la progenie de las CNS-SC humanas clasificadas/expandidas trasplantadas migra a la RMS, se distribuyen y se diferencian en el linaje neuronal en el bulbo olfativo. En unos pocos casos se observaron células humanas tirosina hidroxilasa positivas.
Otro lugar donde tiene lugar la neurogénesis en la vida del adulto es la circunvolución dentada del hipocampo (Gage y col., 92 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 11879-83 (1995)). En este ejemplo, encontramos numerosas células nucleares humanas en la circunvolución dentada del hipocampo. Algunas de las células humanas en la zona celular subgranular co-expresan Ki-67, indicando que aún son capaces de proliferar después de 7 meses tras el trasplante (figura 14A). En un análisis diferente, algunas otras células humanas eran β-tubulina+, según lo esperado para el desarrollo de neuronas granulares, con sus procesos que se extienden hacia el hilo del hipocampo (figura 14B). Estos resultados indican que no sólo estas CNS-SC humanas clasificadas/expandidas se injertan, migran, continúan proliferando, y se diferencian, sino que también su comportamiento y su destino celular están regulados por indicaciones del hospedador de una forma específica de sitio. En ningún caso las células inyectadas formaron tumores.
Análisis. El propósito de este ejemplo era encontrar marcadores superficiales en células de cerebro humano que permitan el posible aislamiento de CNS-SC humanas candidato. Propusimos la hipótesis de que los cultivos de neurosferas humanas se podrían iniciar por clonación a partir de CNSSC, y lo asumimos para aislar las NS-IC a partir de suspensiones celulares FBr humanas frescas. Demostramos que las células FBr humanas de 16-20 s.g. contienen un subgrupo raro de células clonogénicas AC133+, 5E12+, 8G1-/lo CD34 -CD45 -que puede iniciar los cultivos de neurosferas, auto-renovarse considerablemente en estos cultivos, y diferenciarse in vitro a neuronas y glía. Tras el trasplante a los ventrículos laterales de ratones inmunodeficientes recién nacidos estas células se injertaron durante al menos siete meses y dieron lugar a una progenie que se diferencia, migra, y una parte que continúa proliferando (es decir, presencia de células neurales humanas Ki-67+ en la SVZ y en la circunvolución dentada). Las células humanas injertadas se encuentran en sitios en los que sus homólogas células neurales endógenas de ratones experimentan los mismos procesos.
Los datos en la figura 10 y en la Tabla 5 demuestran que no hay otras células NS-IC detectables fuera del subgrupo AC133+ en el cerebro fetal humano.
Durante el análisis de los patrones de tinción de AC133, observamos que el ~0,2% de las células FBr expresan CD34 y permanecen adheridas a células que son AC133+ CD34 -. Estas células CD34+ coexpresan los marcadores celulares endoteliales conocidos CD105 y CD31 y, después de la tripsinización, permanecieron como complejos de células que podían formar de manera ineficaz algunas neurosferas cuando se ponen en placa a una densidad elevada en cultivos en bruto. Hemos observado complejos similares después de una selección positiva para células que expresan CD34. Así, hay una asociación frecuente de CNS-SC AC133+ y células endoteliales CD34 -que existe de manera natural. El hallazgo de que las CNS-SC AC133+ son perivasculares, se ajusta a la hipótesis de que la neurogénesis transcurre mano a mano con la angiogénesis.
Es sorprendente que las CNS-SC fetales humanas candidato se injerten después de la inyección en los ventrículos laterales de ratones neonatos y se extiendan por todo el cerebro del ratón. Esta es una fase de neurogénesis continuada en el ratón, aunque el grado al cual se distribuyen estas células es mayor que el que uno podría esperar. En particular, se encontraron células humanas adyacentes a los espacios ventriculares, en el hipocampo, en la corteza cerebral, en el cuerpo calloso, así como en las áreas cerebelares del cerebro (figura 11). Además, se encuentran células tanto en la SVZ (el área de auto-renovación y replicación) y a lo largo de la RMS (el área de diferenciación inmigración) así como directamente dentro del bulbo olfativo en y cerca de los glomérulos olfativos. Por tanto, las CNS-SC humanas inyectadas continúan con los procesos de neurogénesis en estos sitios.
Snyder y col., usando líneas de ratón inmortalizadas v-myc y líneas celulares neurales humanas, demostró esta distribución amplia ("global") de células (Yandava y col., 96 Proc Natl Acad Sci USA 702934 (1999)). Aquí hemos demostrado que ésta es una propiedad no sólo de células inmortalizadas myc de origen murino sino también de CNS-SC humanas no modificadas genéticamente.
En contraste al trasplante con células de teratocarcinoma (Trojanowski y col., 122 Exp Neurol 283-94 (1993)), las células CNS-SC no forman agregados neoplásticos o hiperplásticos, incluso cuando se prueban siete meses después de la inyección en un microentorno completamente permisivo. Por tanto las células CNS-SC pueden revelar vías de desarrollo y funcionales inherentes en sistemas neuronales humanos no modificados por las funciones de oncógenes o de líneas celulares ya transformadas neo-plásticamente. El aislamiento de CNS-SC proporciona diversas oportunidades para el descubrimiento científico: (i) delimitar directamente los linajes que proceden de células en una fase o diferenciación particulares; (ii) obtener un perfil de expresión de genes de CNS-SC, y su progenie inmediata aguas abajo in vitro o in vivo; (iii) probar si la modificación génica específica de las células permite su injerto, migración, diferenciación, y/o integración funcional. El aislamiento de células madre del SNC humano permite el trasplante de estas células en análogos de la enfermedad humana en ratón, como pruebas preclínicas para su capacidad de trasplante, capacidad de diferenciación, y ausencia de tumorogénesis.
Claims (15)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Un procedimiento para la producción de una población enriquecida en células madre del sistema nervioso central humano que puede iniciar neurosferas (NS-IC), comprendiendo dicho procedimiento la selección a partir de una población que contiene células neurales o derivadas de células neurales, cuya población no procede de embriones humanos, para células que se unen a un anticuerpo distinto de un anticuerpo monoclonal AC133, o un fragmento del mismo, que se une específicamente a por lo menos un epítopo del antígeno AC133 para producir una población enriquecida en NS-IC.
-
- 2.
- El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente la etapa de enriquecimiento posterior de la población seleccionando y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD45.
-
- 3.
- El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de enriquecimiento posterior de la población seleccionando y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD34.
-
- 4.
- El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de enriquecimiento posterior de la población seleccionando y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD45 y eliminando de la población aquellas células que se unen a un anticuerpo que se une al antígeno CD34.
-
- 5.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo se une a por lo menos un epítopo de la Prominina.
-
- 6.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo es monoclonal o policlonal.
-
- 7.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo comprende un anticuerpo de cadena sencilla.
-
- 8.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está conjugado a un fluorocromo.
-
- 9.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el anticuerpo está conjugado a una partícula magnética.
-
- 10.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la selección se lleva a cabo por citometría de flujo.
-
- 11.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la selección se lleva a cabo por clasificación
celular activada por fluorescencia o separación magnética de alto gradiente. -
- 12.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la población que contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene a partir de un cultivo de neurosferas o de un cultivo de monocapa adherente.
-
- 13.
- El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la población que contiene células neurales o derivadas de células neurales se obtiene a partir de tejido neural o cualquier tejido que da lugar a tejido neural.
-
- 14.
- Un procedimiento para el aislamiento de una célula madre que inicia neurosferas (NS-IC), que comprende:
- (a)
- la selección a partir de una población de células neurales o derivadas de células neurales de al menos una célula seleccionada que se une a un anticuerpo que se une específicamente al antígeno AC133 distinto del anticuerpo monoclonal AC133;
- (b)
- la introducción de dicha al menos una célula seleccionada en un medio de cultivo exento de suero que contiene uno o más factores de crecimiento seleccionados del grupo constituido por el factor inhibidor de la leucemia (LIF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF), el factor básico de crecimiento de fibroblastos (FGF-2) y sus combinaciones; y
- (c)
- la proliferación de dicha al menos una célula seleccionada en el medio de cultivo.
-
- 15.
- El procedimiento de las reivindicaciones 1 ó 14, que además comprende las etapas de: enriquecer adicionalmente una población en CNS-SC eliminando de la población aquellas células que son capaces de unirse al anticuerpo monoclonal 8G1.
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