JP4477461B2 - 皮膚幹／前駆性細胞のマーカー、分析、精製方法 - Google Patents

Description

皮膚幹／前駆性細胞をin vitro およびin vivoの両方で陽性認識するマーカーおよびこのマーカー陽性を指標とする皮膚幹／前駆性細胞の検出、測定および精製方法、これにより純化された皮膚幹／前駆性細胞および増殖率の高い表皮細胞、医薬品に関する。

皮膚表皮は、自己再生能および恒常的な細胞分化能のある少数の幹細胞を持ち、継続的に再生する組織である（非特許文献１参照）。この皮膚表皮中の幹細胞（ケラチノサイト幹細胞：ＫＳＣ）は、［^３Ｈ］−チミジンを長期保持することによる標識保持性細胞としてin vivo で同定されている（非特許文献２〜３参照）。ＫＳＣのin vivoでの検定法として、培養したヒトケラチノサイトおよび皮膚繊維芽細胞をＢＡＬＢ／c nu／scidマウスに皮下注射し、ヒト表皮シスト（嚢腫）を形成する方法が確立されている。該シストはin vivo で２４週以上保持されたことが報告されている（非特許文献４参照）。また、lac-Ｚ標識したヒトケラチノサイトシートをＮＩＨスイスnu／nuマウスに移植してin vivoで４０週間保持した試験例もあり、in vivoでの検定法として有用である（非特許文献５参照）。

ヒトＫＳＣは、in vitroで、ホロクローン、および終末分化細胞を９５％超で含むパラクローンとなる一過性増幅（ＴＡ）細胞を誘発する（非特許文献６〜７参照）。
ヒトＫＳＣを識別同定するマーカーを模索する観点から従来の報告を遡ると、いくつかの可能性が示唆されている。たとえばｐ６３は、ｐ５３遺伝子ファミリーのメンバーの細胞核たんぱく質であるが、正常ヒト表皮および毛包基底細胞での発現が報告され（非特許文献８参照）、またｐ６３が表皮形成における再生のための増殖に必須であるとの報告もある（非特許文献９参照）。このｐ６３発現の弱い細胞は成熟したメロクローンを誘発するのに対し、ｐ６３を高レベルで発現する細胞は未熟なホロクローンを形成したとの最近の報告がある（非特許文献１０参照）。これらから、ｐ６３はin vivo におけるヒトＫＳＣの特異的なマーカーであることが示唆されるが、ｐ６３は細胞核たんぱく質であり、生細胞集団の分離に利用しうる適切なマーカーとはいえない。

皮膚細胞表面での細胞マーカーもいくつか見い出されている。たとえば、マウスでは造血幹細胞マーカーとして知られているＣＤ３４（特許文献１参照）の毛包バルジ領域での発現が報告されている（非特許文献１１〜１２参照）。ヒトＫＳＣおよびＴＡ細胞中のα２β１インテグリンおよびα３β１インテグリンの発現パターンの研究が報告されているが、ヒトＫＳＣの同定のために効果的な方法ではない（非特許文献１３参照）。また、トランスフェリン受容体（ＣＤ７１）およびα６インテグリン（ＣＤ４９ｆ）の発現によるヒトＫＳＣの濃縮についてLiらの報告がある（非特許文献１４参照）。Liらは、in vitroでＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１の発現に基づいて、ＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化上皮細胞を別種のコロニーに分類している。ここには、ＣＤ４９ｆ^briＣＤ７１^dim細胞はゆっくりと増殖、分化するＫＳＣ、一方、ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１ ^bri細胞は速やかに増殖、分化するＴＡ細胞として示されている。
従来、ＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化上皮細胞は、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１を用いて分類している（非特許文献１５〜１６参照）。

これまで報告された細胞表面分子をマーカーとするＫＳＣないしはＴＡ細胞の同定は、上記のようにほとんどin vitroでのコロニー形成法または細胞周期分析によるものである。ＫＳＣまたはＴＡ細胞のin vitroおよびin vivo動態の関係の詳細な研究は数少ないが、そのうちに、上記Liらによるin vivo での報告がある（非特許文献１７参照）。Liらは、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１の発現により分別したＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化上皮細胞を、不活化したラット気管支に接種し、次いで各細胞断片をＳＣＩＤマウスに移植している。先報のin vitroの研究では、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１の発現により、ＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化上皮細胞の細胞集団を別々のコロニーとして分別しているのに対し、この報告では、ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１の発現に基づいてＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化上皮細胞として分別した各細胞集団のin vivo可移植性は、これらの間で差がなかったと結論づけている。
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生体のメカニズムを理解するためには、自己再生能および恒常的な細胞分化能をもつ幹細胞についての充分な情報を得ることが重要である。その典型例として血液学における造血幹細胞（ＨＳＣ）に関する膨大な知識の蓄積があるが、これを実現できた背景には、ＨＳＣが均質な幹細胞集団を同定・純化するための細胞マーカーをもつことにあり、in vitroでもin vivo でも有効な検定系を用いたＨＳＣの精製が可能になったことによる。同様に、皮膚表皮の研究においても、ＫＳＣの同定および純化は、生物学的および臨床的両方の見地から重要であり、そのためin vitroおよびin vivo の両方の検定で有効なＫＳＣを識別しうるマーカーが必要とされている。
しかしながら細胞核たんぱく質ｐ６３あるいはＣＤ４９ｆ，ＣＤ７１などの従来マーカーとして公知の細胞表面分子は、in vitroおよびin vivo 両方での、幹細胞の性質を示す細胞のマーカーとして有効とはいえない。

本発明者らは、in vitroおよびin vivo 両方の検定で有効なＫＳＣマーカーを模索する過程において、まず正常ヒト皮膚上皮細胞（ＮＨＥＫ）での細胞表面分子の発現を検討し、表１に後述するように多くの細胞マーカーの発現を確認した。さらに表皮連続層全域の分析により、ＣＤ９０の発現が基底層中に局在するという知見を得た。表皮基底層は皮膚幹および／または前駆（以下、幹／前駆と略記）性の細胞層である（非特許文献１参照）。これらから、皮膚幹／前駆細胞の性質を示す細胞（以下、皮膚幹／前駆性細胞とも記す）ないしはその近辺にＣＤ９０が高濃度に存在すると考えられ、皮膚幹／前駆性細胞とＣＤ９０との相関性が示唆された。ＣＤ９０を検出すれば皮膚幹／前駆性細胞を高い確率で検出しうる、すなわちＣＤ９０は皮膚幹／前駆性細胞のマーカーとなりうることが示唆された。

この知見に基づいて、ＣＤ９０陽性細胞（ＣＤ９０^＋細胞）を分離し、純化してＣＤ９０陰性細胞（ＣＤ９０⁻細胞）との生物学的差異を、新生児ＮＨＥＫの培養において、in vitroおよびin vivo で検証したところ、純化したＣＤ９０^＋細胞は、ＣＤ９０⁻細胞に比べ、in vitroで６倍速い増殖能力と、９倍高い未熟コロニー形成能力を示した。また上記ＣＤ９０^＋細胞およびＣＤ９０⁻細胞を強化型緑色蛍光たんぱく質（ＥＧＦＰ）で標識し、ヒト表皮シスト形成試験法によりin vivo で定量的に評価したところ、ＣＤ９０^＋細胞は、マウス皮膚下に形成したヒト表皮シストの基底層で優先選択的に（ＣＤ９０⁻細胞に比べ６倍多く）同定された。すなわちＣＤ９０^＋細胞として純化された細胞集団は、in vivo においても表皮の幹／前駆性細胞の性質を示すことが実証された。これらから、本発明では、in vitro およびin vivoの両方で有効な皮膚幹／前駆性細胞の検出マーカーとしてのＣＤ９０の使用、このＣＤ９０陽性を指標とする皮膚幹／前駆性細胞の検出方法、測定および分離・純化方法、さらにこれにより純化された皮膚幹／前駆性細胞を高濃度で含む増殖率の高い表皮細胞を提供する。

本発明に従えば、未熟コロニー形成能力が高く、細胞増殖性の高い、皮膚幹／前駆細胞の性質をもつ細胞集団をin vitroでＣＤ９０陽性として検出することができ、また、この方法に基づいて分別・純化された細胞集団は、in vivoで表皮シストを再構築することができるとともに、構築された表皮シストの基底層中に存在する。これらから、ＣＤ９０^＋細胞分画は、皮膚幹／前駆性の細胞集団であり、かつこのＣＤ９０^＋細胞分画にＫＳＣが存在すると考えられる。
このようにin vitroおよびin vivoの両方で有効な、皮膚幹／前駆性細胞のマーカーは、生物学的および臨床的両方の見地から重要であり、表皮の細胞機能、遺伝子治療および再生医療の研究に大きな進歩をもたらすであろう。

正常ヒト皮膚上皮細胞（ＮＨＥＫ）での細胞表面分子の発現を分析した。
分析はＮＨＥＫに対して既知の細胞表面分子に対する蛍光標識モノクローナル抗体を反応させ、フローサイトメトリーにて行った。
上記試験で測定されたＮＨＥＫにおける細胞表面分子の発現率を表１に示す。正常ヒト皮膚上皮細胞には、主に造血系の細胞表面に見られる多くの表面マーカーが発現している。

ＮＨＥＫに発現が確認されたＣＤ９０（別称Ｔｈｙ-１）は、免疫グロブリン様スーパー遺伝子ファミリーに属する細胞表面の糖たんぱく質（Williams, A. F.，“Immunoglobulin-related domains for cell surface recognition”Nature，1985，314:579-580）であり、ヒト骨髄細胞および臍帯血細胞に発現しているＧＰＩ結合たんぱく質である。ＨＳＣおよび早期ＴおよびＢ細胞集団に発現し（Ritter, M.A.ら,“Human Thy-1 antigen:cell surface expression on early T and B lymphoctyes”Immunology，1983，49:555-564）、ＨＳＣのマーカーとして使用されている（米国特許第５０６１６２０号；Baum, C.M.ら,“Isolation of a candidate human hematopoietic stem-cell population”Proc. Natl. Acad. Sci，USA，1992，89:2804-2808；Craig, W. R.ら，“Expression of Thy-1 on human hematopoietic progenitor cells” J. Exp. Med，1993，177: 1331-1342）。ＣＤ９０は、神経、腎臓、内皮、平滑筋、結合組織などの非造血組織でも見られ（Gordon J. W.ら,“Regulation of Thy-1 gene expression in transgenic mice”Cell，1987，445-452）、最近、神経幹／前駆細胞での発現も報告されている（Schwartzら，“Isolation and characterization of neural progenitor cell from post-mortem human cortex”J. Neurosci. Res，2003，74:831-851；Vourc'h, P,M.ら，“Isolation and characterization of cells with neurogenic potential from adult skeletal muscle”Biochem. Biophys. Res. Commun，2004 317:893-901）。表皮での発現はこれまで具体的に報告されていない。ＣＤ９０はＨＳＣのマーカーとしての使用は知られているが、皮膚系での幹細胞のマーカーを示唆する報告もない。また、たとえばＣＤ３４のＮＨＥＫでの発現がほとんど観察されない（表１参照）ことからも、造血幹細胞のマーカーであっても必ずしも皮膚幹細胞のマーカーとはなりえない。

本発明では、上記ＣＤ９０の皮膚幹／前駆性細胞のマーカーとしての使用を提供するが、該ＣＤ９０がin vitroおよびin vivo の両方で皮膚幹／前駆性細胞のマーカーとして有効であることを、以下に、in vitroでの初代および培養ＮＨＥＫにおけるＣＤ９０の発現、in vivo での表皮シストの構築を、高感度免疫組織化学およびフローサイトメトリの分析結果に基づいて説明する。これらは、実施例としても実証される。

＜初代ＮＨＥＫにおけるＣＤ９０の発現＞
ＣＤ９０のin vitroでの発現は、抗ヒトＣＤ９０抗体による細胞染色およびフローサイトメトリで検定することができる。
（１）ＣＤ９０^＋細胞の局在性
初代ＮＨＥＫでのＣＤ９０発現評価を図１に示す。従来ＫＳＣマーカーとされているＣＤ４９ｆも同様に評価した。
初代ＮＨＥＫにおけるＣＤ９０の発現（ＣＤ９０^＋細胞）は、ほぼ例外なくＮＨＥＫの基底層で認められた（図１Ａ,Ｃ,Ｅ）。ＣＤ９０^＋細胞の局在する基底層は、表皮の幹／前駆性の細胞層とされている。ＣＤ４９ｆの発現は基底層だけでなく、有棘層部分でもいくらか認められた（図１Ｆ）。

（２）ＣＤ９０^＋細胞のサイトメトリ
発現したＣＤ９０のサイトメトリ分析（図２参照）では、初代ＮＨＥＫのＣＤ９０発現は弱く、ＣＤ９０陽性に分類された細胞はわずか４.２±３.７％（ｎ＝５）であり（図２Ｃ）、初代ＮＨＥＫのＣＤ９０陽性率はほぼ１〜１０％であった。
一方、同様な評価におけるＣＤ４９ｆの発現は広く、初代ＮＨＥＫの７５.０±９.８％がＣＤ４９ｆ陽性であった（ｎ＝５）（図２Ｄ）。

（３）ＣＤ４９ｆ、ＣＤ７１およびＣＤ９０の発現
初代ＮＨＥＫで発現したＣＤ９０^＋細胞がＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化した上皮細胞のいずれに該当するかを分析するため、ＣＤ９０を、従来の細胞分別方法に使用されているＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１と共に検定し、これらＣＤ４９ｆ、ＣＤ７１およびＣＤ９０を発現する各細胞の関連性を３色フローサイトメトリ法により検討した。なおＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１による細胞類別方法では、ＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化細胞は以下のように同定される。
ＫＳＣ：ＣＤ４９ｆ^ｂｒｉＣＤ７１^ｄｉｍ
ＴＡ細胞：ＣＤ４９ｆ^ｂｒｉＣＤ７１^ｂｒｉ
分化細胞：ＣＤ４９ｆ^ｄｉｍ
ここでの肩添字は、フローサイトメトリによる検出レベルであり、bri：bright“検出”、dim：diminished“弱検出”を意味する。

上記ＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１の識別によりＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化細胞と同定される３種それぞれの細胞断片でＣＤ９０の発現が認められた（図２Ｅ，Ｆ，Ｇ）。ＣＤ９０が発現したＣＤ４９ｆ ^dim 細胞（分化細胞と同定される）は約４％であった（図２Ｅ）が、ＫＳＣおよびＴＡ細胞にそれぞれ同定される細胞は、約半分がＣＤ９０を発現した。具体的に、ＫＳＣと同定されるＣＤ４９ｆ^briＣＤ７１^dim細胞の約５０％（図２Ｇ）、ＴＡ細胞と同定されるＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１ ^bri細胞の約６５％（図２Ｆ）で、ＣＤ９０の発現が明らかになった。
この結果は、ＣＤ９０の発現を調べることにより、従来の方法で識別されるＫＳＣ、ＴＡ細胞および分化細胞の各細胞集団を一層厳密に特定することができるか、あるいはＣＤ９０^＋分画が従来のＣＤ４９ｆおよびＣＤ７１による方法では分離できない細胞集団を含むことを示唆している。

＜培養したＮＨＥＫでのＣＤ９０発現＞
培養時におけるＮＨＥＫＣＤ９０発現の変化を図３に示す。
解凍直後の初代培養の終了したＮＨＥＫでは、ＣＤ９０陽性は２７〜４０％（３４.０±６.８％）であった。なおＣＤ４９ｆについての同様の評価では、ＣＤ４９ｆ陽性が９８〜９９％（９８.６ ±０.６％）であった（ｎ＝５）。
培養中、幹細胞は、そのフェノタイプが変化し、生物学的活性を失うのがしばしば観察された。未熟な幹／前駆細胞を保持・増殖するために、公知の共培養法を広く用いることができる。たとえば、マウスの繊維芽細胞株３Ｔ３ Ｊ２は、増殖能力をもつ未分化細胞の保持に効果的であり、ケラチノサイトの増殖につながる（Rheinwald, J.G.ら,“Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocyte: the formation of keratinizing colonies from single cell”Cell，1975，6:331-343；Barrandonら（非特許文献６参照）； Zhu, AJ.ら, “Signaling via β1 integrins and mitogen-activaed protein kinase determines human epidermal stem cell fate in vitro”Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，1999，96:6728-6733）。これら支持細胞は、ＫＳＣがin vivo で存在する際の幹細胞ニッチェ（幹細胞のための居場所）を疑似化するものである（Tumbarら（非特許文献１２参照））。コロニー形成能力とともにＣＤ３４発現を保持することが確められている、マウス間質細胞株ＨＥＳＳ-５を用いるＣＤ３４^＋臍帯血造血幹／前駆細胞の増殖方法（Kawada, H.ら,“Rapid ex vivo expansion of human umbilical cord hematopoietic progenitors using a novel culture system”Exp. Hematol.，1999，27:904-915）を参照することもできる。

本発明では、ＮＨＥＫを照射した正常ヒト真皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）と共培養したところ、表面マーカーのＣＤ９０が保持された。この共培養は、皮膚細胞をマウス繊維芽細胞株３Ｔ３Ｊ２と共培養して皮膚細胞の幼弱な特徴が保持されたという上記Rheinwald, J.G.らの報告に基づいて、幼若な皮膚細胞の特徴を保持する条件とされるものである。なおRheinwaldらの報告に記載された共培養の説明を本明細書にも記載されているものとすることができる。

６代継代時、ＮＨＤＦと共培養したＮＨＥＫの２７.２±８.６％が依然ＣＤ９０を発現したのに対し、ＮＨＤＦなしの培養では８.２±３.４％であった。ＮＨＤＦなしのＣＤ９０の発現は、１０代継代では、陽性細胞はわずかに５.１±１.６％であった。
一方、培養中のＣＤ４９ｆ^briの発現は、支持細胞の存在による影響はなかった。
ＣＤ９０が培養中に急速に消失したことおよび支持細胞の存在下では維持された事実は、ＣＤ９０^＋細胞の幹／前駆性の反映といえる。ＣＤ４９ｆの発現がＮＨＤＦの有無に影響されなかったことも考慮に入れれば、ＣＤ９０は増殖培養におけるＮＨＥＫ条件をモニターするために使用できるであろうことを示唆している。

＜培養したＣＤ９０^＋ＮＨＥＫの増殖性＞
６代継代のＣＤ９０^＋およびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫを、ＦＡＣＳ Vantageセルソータ（細胞分取機）を用いて、それぞれ純度９７％超で分取し、ＣＤ９０^＋、ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫの間の生物学的差異を調べた（図４〜６参照）。
６代継代のＣＤ９０^＋ＮＨＥＫは、ＳＳＣ（側方散乱光）の低チャネル側に現れた（図４Ｄ）。これらのＣＤ９０を発現する細胞はわずかな顆粒しか細胞質に認められず、これらの形態的な特徴は、一般的には未熟な細胞の特徴と一致する。

ＣＤ９０^＋およびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫは、照射済みのＮＨＤＦとともに、ＫＢＭ-２無血清の培地中で共培養し、細胞増殖率を調べた（図５参照）。１３日間培養後、ＣＤ９０^＋、ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫ各の細胞増殖は、播種細胞数に対し、それぞれ約６００倍、２５００倍および１９００倍であった。
ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫは、培養の初期、他の細胞集団に比べて増殖が速かったが、２１日後に増殖が止まった。これとは対照的に、ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫの増殖は、２６日後加速した。培養４１日目までに、ＣＤ９０^＋，ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫの細胞は、それぞれ約２.１×１０^５倍、０.４×１０^５倍、１.１×１０^５倍に増加した。
これらのデータは、ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫが、培地中で活性化するまで長時間要するが、高い増殖能力をもつ休止期細胞集団であることを示していた。

＜ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫのコロニー形成＞
ケラチノサイトは、その成熟過程に応じてさまざまなタイプのコロニーを形成し、各コロニーは、それが包含する分化細胞の量に準じて分類されている。未熟なホロクローン、成熟したメロクローンおよび終末分化細胞を９５％超で含むパラクローンに分類される。一般に、未分化細胞集団であるほど、より多数のコロニーを生じさせる。そこでＣＤ９０^＋ＮＨＥＫおよびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫのコロニー形成能力を評価したところ、ＣＤ９０^＋細胞は、未熟フェノタイプのコロニーを、９倍（ＣＤ９０⁻細胞との対比において）多くもたらすことが確認された（図６参照）。
具体的には、１０００個のＣＤ９０^＋細胞播種により生じたコロニー数は平均で１２５.９であり、同数のＣＤ９０⁻細胞播種によるコロニー数は６５.３であった（各５検体ずつ）。また、ＣＤ９０^＋細胞から形成されるコロニーの約３８％（４８±１０.６）はほとんどが未熟なホロクローンであった。これに対して、ＣＤ９０⁻細胞から形成されるコロニーの中のホロクローン量は、わずかに８％（５.３±４.６）であった。

＜ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫのin vivo 検定＞
ヒト表皮シスト形成法を用いて、ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫまたはＣＤ９０⁻ＮＨＥＫをin vivo で検定できる。この方法では、ＮＨＥＫをＥＧＦＰで遺伝学的に標識する。ＥＧＦＰをコードする組換えレンチウィルスに感染させて形質導入した細胞（ＥＧＦＰ陽性）を、ＡＰＣ標識した抗ＣＤ９０モノクローナル抗体（ｍＡｂ)で染色し、ＥＧＦＰ^＋ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫおよびＥＧＦＰ^＋ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫを分取した（図７）。

分別した細胞を、材料および方法欄の記載に準じてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射する。なお分別した各細胞は、９７％超がＥＧＦＰ陽性で、それらの増殖能力およびコロニー形成能力は非標識ＮＨＥＫと等しい。
注射したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻細胞から誘導されるＥＧＦＰ陽性領域は、ＥＧＦＰ^＋領域が基底層に含まれる場合をタイプIとし（図８Ｂ）、ＥＧＦＰ^＋細胞が角質層、有棘または顆粒層に含まれる場合をタイプIIとした（図８Ｃ）。

ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ＥＧＦＰ標識したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻細胞を皮下投与移植してから６週間後、ヒト表皮シスト中のＥＧＦＰ^＋領域を免疫組織化学的三次元マップ化することにより数えた（ｎ＝４）。連続組織全域の詳細な三次元分析情報によるＥＧＦＰ^＋領域の観察では、ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫを注射した場合には、ＥＧＦＰ^＋領域はほとんどがタイプIIに属し７００.３±２８３.１で（図９Ｂ）、タイプIに属するものはわずかに５３.５±３２.２であった（図９Ａ）。
これに対し、同数のＣＤ９０^＋ＮＨＥＫは、３２７.８±１９６.７と、ほぼ６倍以上のタイプI領域を含む基底層をもたらし（図９Ａ）、タイプII領域は少なめの２３１.０±１２９.６（ 図９Ｂ）であった。

これらの結果は、ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫがＣＤ９０⁻ＮＨＥＫに比べて、より未分化な細胞集団であることを示している。これらのＥＧＦＰ^＋領域を抗サイトケラチン抗体で染色したところ、in vivoにおいて正常な分化が進行したことを確認できた。すなわち、基底層内に挿入したＥＧＦＰ^＋細胞はサイトケラチン１４を発現し（図１０Ａ）、一方、基底層以外の表皮層中のＥＧＦＰ^＋細胞はサイトケラチン１０を発現した（図１０Ｂ）。

上記in vivo 検定において、ＥＧＦＰ標識したＣＤ９０^＋ＮＨＥＫは、マウス皮膚下で形成されたヒト表皮シストの基底層中で特異的に検出される。また基底層中、ＥＧＦＰ^＋ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫ注射によるＥＧＦＰ^＋領域数は、ＥＧＦＰ^＋ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫ注射によるＥＧＦＰ^＋領域数よりも６倍多かった。これらのことより、ＣＤ９０はヒトケラチノサイトに含まれる幹／前駆性細胞を特異的に認識するといえる。

上記のようにヒトＮＨＥＫにおけるＣＤ９０発現の生物学的意味をより理解するために行った実験において、ＣＤ９０^＋細胞およびＣＤ９０⁻細胞の生物学的能力をin vitroおよびin vivo の両方で検討し、第１にＣＤ９０^＋細胞の増殖能力は、ＣＤ９０⁻細胞より高いことがわかった。
第２に、ＣＤ９０^＋細胞は、同数のＣＤ９０⁻細胞に対し２倍のコロニーをもたらす。さらに、１０００個のＣＤ９０^＋細胞から、ＫＳＣが通常誘発する未熟型のコロニーを４８個形成する。一方、同数のＣＤ９０⁻細胞が形成する未熟型のコロニーは、わずかに５個であった。
第３に、ＥＧＦＰ標識したＣＤ９０^＋細胞を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに移植した場合には、基底層中のＥＧＦＰ^＋領域数は、ＣＤ９０⁻細胞のそれに比べ、６倍多かった。

このように、ＣＤ９０がin vitroおよびin vivo のいずれでも皮膚幹／前駆性を示す集団のマーカーであることが確認できた。換言すれば、ＣＤ９０を検出すれば、皮膚幹／前駆性細胞を高い確率で検出することができる。また従来より血液系のＣＤ３４^＋分画に造血幹細胞が存在すると考えられていると同様に、純化したＣＤ９０^＋ＮＨＥＫの移植により速やかな表皮組織の再構築が得られることや、ＮＨＥＫにおけるＣＤ９０^＋細胞の比率と従来のＫＳＣまたはＴＡ細胞の同定法であるコロニー形成検定法の成績とがよく相関することなどから、ＣＤ９０^＋分画に皮膚幹／前駆性細胞（ＫＳＣまたはＴＡ細胞）が存在するといえる。ＣＤ９０をマーカーとして用いれば、皮膚幹／前駆性細胞集団を高度に純化、たとえば３％以上、通常３〜１０％に精製することができる。

本発明では、上記によりＣＤ９０^＋細胞として純化された皮膚幹／前駆性細胞を有効成分とする増殖率の高い表皮細胞を提供することができ、この表皮細胞の培養方法として、ＣＤ９０^＋細胞として純化された皮膚幹／前駆性細胞を正常ヒト真皮繊維芽細胞と共培養する培養方法も提供できる。
さらにこのような増殖率の高い表皮細胞を含む医薬品を提供できる。この医薬品の形態は特に限定されず、たとえば注射、塗布薬などの形態でよく、また人体に害を及ぼさない範囲であれば、皮膚再生医薬品に通常含ませる添加剤を特に制限なく含ませることができる。

次に本発明を実施例により具体的に説明する。
＜材料および方法＞
＜細胞培養＞
ヒト正常皮膚は、東海大学医学部倫理委員会により承認された書式によりインフォームドコンセントを得て整形外科手術を受けた患者から採取した。
初代ヒト正常皮膚（ＮＨＥＫ）の単一細胞懸濁液を調製するため、皮膚組織を４ｍｇ／ｍＬのDispase（合同酒精社）と４℃で１２時間反応させることにより表皮シートを得た。
凍結した初代培養終了後の新生児ＮＨＥＫおよび正常ヒト真皮繊維芽細胞（ＮＨＤＦ）はCambrex Bio Science社より入手した。
２０％ＦＣＳ添加αＭＥＭ（Life Technologies社）中で培養したＮＨＤＦは、１５Ｇｙの放射線で照射し、長期ケラチノサイト無血清培養用支持細胞として使用した。
ＮＨＥＫの培養は、２〜４×１０^５のＮＨＥＫを０.５〜１×１０^６のＮＨＤＦと混合し、５ｍＬのケラチノサイト用基本培地-２（ＫＢＭ-２；Cambrex Bio Science）を加えてＴ-２５ｃｍ^２培養フラスコにて行った。

＜細胞染色および純化＞
初代ＮＨＥＫまたは５〜６代継代したＮＨＥＫを、ＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ９０ｍＡｂ（クローン；５Ｅ１０）またはＦＩＴＣ結合抗ヒトＣＤ４９ｆｍＡｂ（インテグリンα６鎖、クローン；ＧｏＨ３）（以上いずれもBD Bioscience社）、またはＰＥ結合抗ヒトＣＤ７１ｍＡｂ（クローン；ＹＤＪ１.２.２）（Beckman Coulter社）で染色した。
細胞分別は、４８８ｎｍおよび６３３ ｎｍ に設定したアルゴンおよびヘリウムネオンレーザーを備えたＦＡＣＳ Vantage セルソータ（Becton Dickinson社）を用いて行った。

＜コロニー分析＞
分別したＣＤ９０^＋ＮＨＥＫまたはＣＤ９０⁻ＮＨＥＫを３５ｍｍの培養ディッシュ
にそれぞれ１０００個播種し、２０％ＦＣＳおよび１００ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素（List Biological Laboratories社）を含むαＭＥＭ中、３７℃／５％ＣＯ_２条件下で培養した。
コロニーのタイプを判別するため、２週間の培養で形成されたコロニーを、１０％ホルマリンで固定し、ローダミンＢ（Sigma社）で染色した。
コロニーは、各コロニー中の最終分化細胞の量に準じて、ホロクローン、メロクローンおよびパラクローンに分類される（Barrandonら（非特許文献６），Rochatら（非特許文献７）参照，Pellegriniら（非特許文献１０）参照）。

＜ＮＨＥＫのレンチウィルス形質導入＞
５〜６代継代で増殖したＮＨＥＫを、Okiら（“Efficient lentiviral transduction of human cord blood CD34⁺cells followed by their expansion and differentiation into dendritic cells”Exp. Hematol，2001，29:1210-1217）の方法に準じてＥＧＦＰをコードした遺伝子を組み込んだレンチウィルスの高濃度溶液と共に、ＭＯＩ１０で培養した。２４時間の培養後、ＮＨＥＫをＫＢＭ-２培地で２回洗浄した後、さらに２４時間培養した。ＥＧＦＰ標識したＮＨＥＫを、ＡＰＣ結合抗ＣＤ９０ｍＡｂで染色し、分取した。

＜動物および移植手順＞
実験は、東海大学動物ケア委員会により承認された手順にしたがって行った。７〜９週齢雄または雌ＮＯＤ／Shi-scid（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスはCLEA Japanから入手した。ＥＧＦＰ標識したＣＤ９０^＋ＮＨＥＫまたはＣＤ９０⁻ＮＨＥＫ（いずれも４×１０^４）を、非標識の２×１０^６ＮＨＥＫおよび２×１０^６ＮＨＤＦと混合した。１００μＬの細胞ＰＢＳ懸濁液を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの脇腹領域に皮下注射した。移植６週後、マウスをエーテル麻酔して屠殺し、皮下ヒト表皮シストを切除した。シストは、４％パラホルムアルデヒドで固定し、組織構造を調べるための試料を調製した。

＜免疫組織化学＞
免疫染色はMugurumaら（“In vivo and in vitro differentiation of myocytes from human bone marrow-derived multipotent progenitor cells”Exp. Hematol.，2003，31:1323-1330）に準じて行なった。
表皮における細胞表面分子を試験するため、６μｍの凍結したヒト皮膚部分をウサギポリクロナール抗ヒトＣＤ９０抗体（１：５００）またはウサギポリクロナールＣＤ４９ｆ抗体（１：２００）（いずれもSanta Cruz Biotechnology）で染色した。ＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻細胞誘導ＫＳＣの３次元解析のため、無傷の表皮シストを分割し（シストあたり４００〜５００個の連続分画）、ビオチン化ウサギポリクロナール抗ＥＧＦＰ ｍＡｂ（１：５００，ＭＢＬ）で染色した。全染色領域を、顕微鏡下で分析し、注射したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻細胞の子孫細胞を示すＥＧＦＰ^＋領域を、基底膜または表皮に対する立体的な位置関係に基づいて類別した。ケラチンを免疫染色するために、凍結した分画を、マウス抗ヒトサイトケラチン１４（クローンＲＣＫ１０７；１：４００）ｍＡｂまたはマウス抗ヒトサイトケラチン１０（クローンＤＥ-Ｋ１０；1：１０）ｍＡｂ（いずれもMONOSAN社）と反応させた。

＜正常ヒト皮膚におけるＣＤ９０およびＣＤ４９ｆの局在性＞
細胞表面マーカーの検索のため、正常ヒト皮膚でのＣＤ９０発現およびＣＤ４９ｆ発現の局在性を調べた。正常ヒト皮膚検体を、抗ヒトＣＤ９０またはＣＤ４９ｆ抗体で染色した結果を図１に示す。
ＣＤ９０の発現は、正常ヒト皮膚の基底層で認められた（図１Ａ，Ｃ，Ｅ）。
図１Ａ（高倍率）および図１Ｃ（低倍率）は、ＣＤ９０^＋細胞が概ね専ら基底層に存在することを示す染色画像である。図１ＢおよびＤは、各コントロールである。基底細胞は褐色メラニン顆粒をいくらか含む。
図１Ｆは、抗ヒトＣＤ４９ｆ抗体により染色した正常ヒト皮膚の画像である。ＣＤ４９ｆの発現は、基底層だけでなく、基底以外の細胞（有棘層部分）でもいくらか発現した。
図１Ｅは、図１Ｆの隣接部分の抗ヒトＣＤ９０抗体の染色を示す画像である。
各図中のバーの長さＡ，Ｂ，Ｅ，Ｆ：２５μｍ
Ｃ，Ｄ：５０μｍ

＜ＮＨＥＫにおけるＣＤ９０、ＣＤ７１およびＣＤ４９ｆのフローサイトメトリ分析＞
初代ＮＨＥＫをＦＩＴＣ標識した抗ヒトＣＤ４９ｆｍＡｂ、ＰＥ標識した抗ヒトＣ７１ｍＡｂおよびＡＰＣ標識した抗ヒトＣＤ９０ｍＡｂで染色した。各５検体のうちの代表的なフローサイトメトリ染色プロファイルをそれぞれ図２に示す。
図２Ａ〜Ｂは、各コントロールプロファイルに相当する。
図２Ｃは、ＮＨＥＫのＣＤ９０単独染色プロファイルである。初代ＮＨＥＫにおけるＣＤ９０発現は弱く、陽性に分類された細胞は、わずか４.２±３.７％（ｎ＝５での平均発現頻度）であった。
図２Ｄ〜Ｇは、ＮＨＥＫのＣＤ４９ｆ、ＣＤ７１およびＣＤ９０による３色染色プロファイルである。ｎ＝５での平均発現頻度を以下に示す。
図２Ｄに示されるように、ＣＤ４９ｆの発現は広く、ＣＤ４９ｆ陽性細胞はＮＨＥＫの７５.０±９.８％であった。詳細には、
（Ｄ-(1)）ＣＤ４９ｆ ^dimは、５６.４±１０.４％
（Ｄ-(2)）ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１ ^briは、４.６±３.８％
（Ｄ-(3)）ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１^dimは、２.７±１.８％であった。
各細胞でのＣＤ９０共発現の平均頻度は、以下のとおりであった。
図２Ｅ：ＣＤ４９ｆ^dim細胞の３.８±２.６％
図２Ｆ：ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１ ^bri細胞の５２.５±４.７％
図２Ｇ：ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１^dim細胞の６５.０±５.５％

＜細胞増殖培養したＮＨＥＫにおけるＣＤ９０およびＣＤ４９ｆ^bri 発現＞
ＮＨＥＫの培養過程におけるＣＤ９０およびＣＤ４９ｆ^bri の発現の変化を試験した。初代培養の終了した新生児ＮＨＥＫを放射線照射したＮＨＤＦの存在下あるいは非存在下で培養した。フローサイトメトリで測定した各継代時のＣＤ９０およびＣＤ４９ｆ^briの発現量を図３に示す。
ＮＨＥＫは、培養開始時は３４.０±６.８％がＣＤ９０陽性であり、９８.６ ±０.６％がＣＤ４９ｆ^briであった（ｎ＝５）。
ＣＤ９０の発現は、６代継代以降激減し、１０代目では、陽性細胞はわずかに５.１±１.６％であったが、ＣＤ４９ｆ^briの発現は変化がなかった。
ＮＨＥＫを、ＫＳＣの未分化フェノタイプを保持する条件（幼若な皮膚細胞の特徴を保持する条件として前記したRheinwald, J.G.らの報告：“Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocyte: the formation of keratinizing colonies from single cell”Cell，1975，6:331-343））に準じて、照射済みＮＨＤＦと共培養したところ、ＣＤ９０の発現も保持された。６代継代後では、ＮＨＤＦ非存在下で ８.２±３.４％であるのに対し、ＮＨＤＦと共培養したＮＨＥＫは、２７.２±８.６％が依然ＣＤ９０を発現した。
一方、ＣＤ４９ｆ^briの発現は、ＮＨＤＦの有無に関係なく高く維持され、支持細胞の存在による影響はなかった。

＜ＣＤ９０^＋およびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫのin vitro反応速度＞
初代培養終了後の新生児ＮＨＥＫのフローサイトメトリ染色プロファイルを図４に示す。図４Ａは対照プロファイル、図４Ｂは未分別のＮＨＥＫプロファイルである。ＮＨＥＫをＣＤ９０の発現に基づいて分別した。分別した細胞の純度はＣＤ９０⁻細胞で９９.３％（図４Ｃ）、ＣＤ９０^＋細胞で９７.８％（図４Ｄ）であった。
ＣＤ９０^＋，ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫの増殖速度を図５に示す。またＣＤ９０^＋，ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫの形成したコロニーの類別を図６に示す。

＜ＣＤ９０^＋およびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫのin vivo アッセイ＞
ヒト表皮シストの形成におけるＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻ＮＨＥＫの寄与をin vivo で分析するため、ＮＨＥＫをＥＧＦＰで遺伝学的に標識した。ＥＧＦＰをコードする組換えレンチウィルスに２日間感染させると、９０％超の細胞がＥＧＦＰ陽性となった。形質導入した細胞を、ＡＰＣ標識した抗ＣＤ９０ｍＡｂで染色し、ＥＧＦＰ^＋ＣＤ９０^＋およびＥＧＦＰ^＋ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫに分別した（図７）。
ＥＧＦＰで標識したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻ＮＨＥＫの分別プロファイルを図７Ａ〜Ｃに示す。
形質導入効率は９０％以上であり、分別したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻ＮＨＥＫの純度は９７％以上であった。
分別した細胞は、９７％以上がＥＧＦＰ陽性で、増殖性およびコロニー形成能力は非標識ＮＨＥＫとかわりがない。

分別された細胞は、材料および方法欄の記載に準じてＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した。
ＥＧＦＰ標識したＮＨＥＫ（４×１０^４）を、非標識のＮＨＥＫ（２×１０^６）および同数（２×１０^６）のＮＨＤＦとともにマウスの脇腹領域に皮下注射した。移植６週後、皮下に形成されたヒト表皮シストを取出し、６μｍの凍結薄切切片を作成した。
投与したＥＧＦＰ導入細胞から誘導されたＥＧＦＰ^＋領域は免疫組織化学的手法により視覚化した。ＥＧＦＰ標識したＮＨＥＫのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植の細胞染色を図８Ａ〜Ｃに示す。Ｂ，ＣはＡの一部を高倍率で示す。
投与したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻細胞から誘導されるＥＧＦＰ陽性領域は、ＥＧＦＰ^＋細胞が基底層に含まれる場合をタイプIとし（図８Ｂ）、ＥＧＦＰ^＋細胞が基底層以外、すなわち角質層、有棘または顆粒層に含まれる場合をタイプIIとした（図８Ｂ）。
各図中のバーの長さＢ：３００μｍ
Ｃ，Ｄ：２５μｍ

全ての連続した組織を分析し、詳細な３次元情報を得た。ＥＧＦＰ^＋領域を定量および分類するため連続組織の全てを分析したフローサイトメトリの結果を図９Ａ〜Ｂに示す。４検体の全てにおいて、タイプIの形成は、ＣＤ９０^＋細胞（９８-５０８）が、ＣＤ９０⁻細胞（１５−９７）よりも多かった（図９Ａ）が、タイプIIの形成は、ＣＤ９０⁻細胞（３１２−９６０）がＣＤ９０^＋細胞（４７-３６８）よりも多かった（図９Ｂ）。
より具体的には、ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫを注射した場合には、ＥＧＦＰ^＋領域はほとんど（７００.３±２８３.１）がタイプIIに属し（図９Ｂ）、タイプIに属するものはわずかに５３.５±３２.２であった（図９Ａ）。これに対し、同数のＣＤ９０^＋は、３２７.８±１９６.7と、ほぼ６倍以上のタイプI領域を含む基底層をもたらし（図９Ａ）、タイプII領域は２３１.０±１２９.６（ 図９Ｂ）と少なかった。これらの結果は、ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫがＣＤ９０⁻細胞に比べて、より未分化な細胞集団であることを示している。

これらのＥＧＦＰ^＋領域を抗サイトケラチン抗体で染色し、正常な分化が進行したことをin vivo で確認した。凍結部分のサイトケラチン１０ｍＡｂまたはサイトケラチン１４ｍＡｂによる染色を図１０に示す。基底層内に挿入したＥＧＦＰ^＋細胞は、サイトケラチン１４を発現した（図１０Ａ）。一方、基底層以外の表皮層中のＥＧＦＰ^＋細胞は、サイトケラチン１０を発現した（図１０Ｂ）。すなわち予想どおり、サイトケラチン１４^＋ＥＧＦＰ^＋細胞が基底層中に局在（図１０Ａ）し、基底層以外の細胞中にはサイトケラチン１４の陽性反応は見られなかった。角質および有棘層中のＥＧＦＰ^＋細胞は、サイトケラチン１０を発現するが、基底層は発現しない（図１０Ｂ）。
図１０Ａ中、赤：サイトケラチン１４、緑：ＥＧＦＰ、白：lanminin。白矢印の先端：サイトケラチン１４およびＥＧＦＰの二重陽性。
図１０Ｂ中、赤：サイトケラチン１０、緑：ＥＧＦＰ、白：lanminin。白矢印の先端：サイトケラチン１０およびＥＧＦＰの二重陽性。
各図中のバーの長さＡ：１０μｍ
Ｂ：２５μｍ

正常ヒト皮膚検体の抗ヒトＣＤ９０抗体または抗ヒトＣＤ４９ｆ抗体による染色画像を示す図である。Ａ、ＣおよびＥ：抗ヒトＣＤ９０抗体による染色写真、ＢおよびＤ：ＡおよびＣの各コントロール、Ｆ：正常ヒト皮膚の抗ヒトＣＤ４９ｆ抗体による染色写真。 ＦＩＴＣ標識した抗ヒトＣＤ４９ｆ ｍＡｂ、ＰＥ標識した抗ヒトＣＤ７１ ｍＡｂおよびＡＰＣ標識した抗ヒトＣＤ９０ ｍＡｂで染色した初代ＮＨＥＫのフローサイトメトリによる染色プロファイルを示す図である。Ａ，Ｂ：コントロールプロファイル、Ｃ：ＮＨＥＫのＣＤ９０単独染色、Ｄ〜Ｇ：ＮＨＥＫのＣＤ４９ｆ、ＣＤ７１およびＣＤ９０による３色染色、Ｄ：ＣＤ９０のない系：Ｄ- (1)：ＣＤ４９ｆ ^dim、Ｄ- (2)：ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１ ^bri、Ｄ-（3）：ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１^dim、Ｅ〜Ｇ：ＣＤ９０との共発現系、Ｅ：ＣＤ４９ｆ ^dim、Ｆ：ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１ ^bri、Ｇ：ＣＤ４９ｆ^bri ＣＤ７１^dim。 初代ＮＨＥＫを、放射線照射したＮＨＤＦの存在下または非存在下で継代培養した時の各継代におけるＣＤ９０およびＣＤ４９ｆ^bri の発現変化を示す図である。 培養ＮＨＥＫ（初代培養終了後）のフローサイトメトリ染色プロファイルを示す図である。 Ａは対照、Ｂは未分別のＮＨＥＫ、ＣはＣＤ９０⁻細胞、ＤはＣＤ９０^＋細胞の各プロファイルを示す。 培養ＮＨＥＫの増殖速度を示す図である。ＣＤ９０^＋，ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫの増殖速度を示し、枠内はその部分拡大図を示す。 ＣＤ９０^＋，ＣＤ９０⁻および未分別ＮＨＥＫのコロニー形成を示す図である。 ＥＧＦＰ標識したＣＤ９０^＋およびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫのin vivo アッセイを示すフローサイトメトリプロファイル。Ａ：未分別ＮＨＥＫのプロファイル、Ｂ：ＣＤ９０^＋ＮＨＥＫの分別プロファイル、Ｃ：ＣＤ９０⁻ＮＨＥＫの分別プロファイル。 ＥＧＦＰ^＋標識したＣＤ９０^＋およびＣＤ９０⁻ＮＨＥＫのＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスへの移植によるin vivo 検定の免疫組織化学的画像を示す図である。Ａ：ＥＧＦＰ標識したＮＨＥＫ、Ｂ：タイプI、Ｃ：タイプII。 ＥＧＦＰで標識したＣＤ９０^＋またはＣＤ９０⁻細胞を皮下投与移植したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおけるヒト表皮シスト中のＥＧＦＰ^＋領域の免疫組織化学的三次元マップ化による定量分析結果を示す図である。Ａ:タイプI、Ｂ:タイプII。 ＥＧＦＰ^＋領域の抗サイトケラチン抗体による染色画像を示す図である。Ａ：サイトケラチン１４^＋ＥＧＦＰ^＋細胞、Ｂ：サイトケラチン１０^＋ＥＧＦＰ^＋細胞。

Claims (5)

1. 皮膚幹／前駆性細胞を陽性認識するためのＣＤ９０からなるマーカー。
2. ＣＤ９０陽性であることを指標とする皮膚幹／前駆性細胞の検出方法。
3. 標識された抗ＣＤ９０抗体によりＣＤ９０^＋細胞を染色する請求項２に記載の検出方法。
4. 請求項２または３の検出方法により、皮膚幹／前駆性細胞をＣＤ９０^＋細胞として測定する皮膚幹／前駆性細胞の測定方法。
5. 皮膚幹／前駆性細胞をＣＤ９０^＋細胞として分離する皮膚幹／前駆性細胞の精製方法。

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