KR20190039965A - 신경 줄기 세포용 마커 - Google Patents

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Abstract

본원은 마커 인테그린 α10β1의 발현에 기초하는 신경 줄기 세포(NSC) 또는 신경 전구 세포(NPC)의 집단을 검출 및 단리시키는 방법 뿐만 아니라 CNS의 질환 및 손상의 치료, 진단 및 예후를 위한 상기 NSC 또는 NPC 집단의 용도에 관한 것이다.

Description

신경 줄기 세포용 마커
본 발명은 포유류 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 동정 및 단리용 마커 뿐만 아니라 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 농축된 세포 집단을 제조하기 위한 이의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 질환 및 손상을 치료할 뿐만 아니라 신경계의 손상을 예방 및 보호하기 위한 신경 줄기 세포, 신경 전구 세포 및 중간엽 줄기 세포의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 손상을 검출 및 진단하고 예후 마커로서 마커를 사용하는 것에 관한 것이다.
신경계- 뇌, 척수 및 말초 신경-를 구성하는 복잡하고 섬세한 구조는 외상으로부터 점진적 악화를 유도하는 신경퇴행성 질환에 이르는 다양한 유형의 손상에 영향을 받기 쉽다. 불행하게도, 손상 후 자발적 재생, 회복 또는 치유는 거의 일어나지 않는다. 따라서, 뇌 손상, 척수 손상으로 인한 마비 및 말초 신경 손상은 종종 영구적이며 무능력하다. 심각한 신경계의 손상 또는 뇌졸중 환자는 종종 평생 도움을 필요로 한다. 뇌졸중은 특히 선진국에서 사망 및 성인 장애의 가장 빈번한 원인 중 하나이다. 그러나, 현재까지 치료 옵션은 매우 제한적이다. 따라서, 신경학적 손상 및 뇌졸중의 치료를 진전시키기 위해서 혁신적이고 새로운 전략이 필요하다.
신경 줄기 세포(NSC)는 뉴런 및 신경교세포 모두의 다수의 전구체를 증식하고, 자체 재생하며 생성하는 능력을 갖는 중추신경계(CNS)의 세포이다. 성인 신경발생 과정 동안, NSC는 NSC 자체 재생, 일시적 증폭 전구체, 신경아세포 및 말단 성숙 뉴런, 성상 세포 및 희소돌기아교세포를 포함하는 다수의 단계를 경험한다(Gage F. H. and Temple S., 2013). NSC는 배아 마우스, 래트 및 인간 CNS의 거의 모든 영역에서 동정되었다. 성인 CNS에서, 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포는 특정 줄기 세포 적소에서 신경발생에 기여하는 것으로 나타났다. 따라서, NSC는 질환 및 손상 후 신경 조직의 재생에 유용하다.
신경 줄기 세포(NSC) 및 전구 세포(NPC)는 중추 신경계의 모든 주요 세포 유형을 형성하여 뇌 손상 및 신경퇴행성 장애에서 세포 기반 요법을 위한 후보이도록 하는 능력을 갖는다. 그러나, 두 가지 이유는 임상 적용을 위한 세포 요법의 개발을 방해했다. 하나는 인간 조직으로부터 NSC를 단리시키고 치료를 위해 충분한 양으로 세포를 확장시키는 어려움이다. 다른 하나는 더 분화된 세포 유형 및 다른 오염 세포로부터 NSC를 정제하는 불능이다. 따라서, 신경 줄기 세포/신경 전구 세포(NSC)의 특정 세포 마커는 치료적 적용을 위한 인간 NSC의 동정, 단리 및 선별에 중요하다.
수년 동안 상이한 세포 유형 및 분화 단계를 확인하기 위해 다수의 마커가 사용되어 왔다:
Sox 계열 전사 인자의 구성원인 Sox2 (SRY box 2), 및 세포내 필라멘트 단백질인 네스틴은 배아 및 성인 뇌 모두에서 NSC의 마커로서 종종 사용된다. 그러나, 두 마커 모두 세포내에서 발견되기 때문에, 그들은 기능적 NSC를 단리시키고 선택하는데 쉽게 사용할 수 없다.
폴리시알릴화 신경 세포 부착 분자인 PSA-NCAM은 뇌 발생 동안 신경 전구 세포에서 고도로 발현된다. 그러나, 그것은 또한 분화된 신경 세포에서 발견된다(Kim HS et al. 2014; Butenschon J et al. 2016).
중간 필라멘트 단백질인 신경교 섬유질 산성 단백질인 GFAP는 신경 전구 세포에서 발견되지만, 또한 성숙한 성상 세포에서 주요 중간 필라멘트 단백질로서 주로 볼 수 있다(Zhang QB et al. 2006).
CD133(프로미닌-1)은 NSC를 포함하는 상이한 유형의 줄기 세포에 존재하지만, 분화된 세포에서도 발현된다(Kania G, Corbeil D, Fuchs J et al. 2005; Zhang QB et al. 2006).
PDGFR-α는 성인 CNS 전반에서 발견되고, 심실 벽을 따라 균일하게 분포된다(Chojnacki et al. 2011). 성인 뇌실하 영역(SVZ) 내에서, PDGFR-α는 유형 B 신경 줄기 세포이고(Jackson et al. 2006), 주로 희소돌기아교세포(Chojnacki et al. 2011)를 생성하는 특정 세포 집단을 표지하는 것으로 밝혀졌다. 연구는, PDGFR-α가 신경 세포와 희소돌기아교세포 생산 사이의 균형을 조절함을 시사한다(Farahani and Xaymardan 2015). 따라서, PDGFR-α는 일부 분화된 신경 세포에 의해 발현되지만 주로 희소돌기아교세포 전구체에서 발견된다.
RNA 결합 단백질인 무사시-1(Msi-1)은 그것이 증식 및 유지를 조절하는 CNS 줄기 및 전구 세포에서 추정적으로 발현된다(검토를 위해, 문헌(참조: MacNicol et al. 2008)을 참조한다). 그러나, 그것은 세포질 및 세포의 핵에, 즉 세포내로 국한되고, 따라서 기능적 NSC를 단리시키고 선별하기 위해 쉽게 사용될 수 없다.
CD24는 면역 세포 및 CNS의 세포에서 발견되는 세포 부착 분자이다. 뇌에서, CD24는 젊은 성체 마우스의 신경성 영역 내에서 발견되고, PSA-NCAM과 함께 공편재되고, 따라서 신경아세포(유형 A NSC) 마커로서 인식된다(Calaora et al. 1996). 그것은 유동 세포 계측법에 의해 마우스 뇌에서 NSC를 단리시키는데 사용되었고(Rietze et al. 2001; Panchision et al. 2009), 다른 세포 표면 마커(예: CD15 및 CD29)와 함께 신경 세포 배양물을 농축시키는데 사용되어 왔다(Pruszak et al. 2009). 그러나, CD24의 수준이 신경 세포의 성숙시 증가하기 때문에, 그것은 또한 초기 신경 세포 분화의 마커로 간주된다(Pruszak et al. 2009).
SSEA-1 또는 CD15로서 또한 공지된 LeX는 성인 CNS에서 심실을 라이닝하는 미성숙 신경 상피 세포 및 유사분열후 뉴런을 분화하는 마커이다(Calaora et al. 1996; Capela and Temple, 2002). 그것의 발현은 GFAP와 중첩되는 반면, SVZ로부터 단리된 소수의 세포(4%)만이 LeX-양성이다. LeX가 세포외 적소에서 SVZ 세포에 의해 발산된다는 사실은 이러한 낮은 수준의 유리 LeX를 설명할 수 있다. 또한, LeX는 성체 마우스 SVZ의 유형 B 및 C 세포 모두에 의해 발현되지만, 유형 A (신경아세포) 세포에 의해서는 발현되지 않는다(Capela and Temple, 2006).
비멘틴은 초기 뇌 발달 동안 주로 방사상-신경교 및 미성숙 성상 세포로 발현되는 주요 중간 필라멘트 단백질 중 하나이다.
β-III 투불린 또는 Tuj1은 미성숙 뉴런의 세포내 필라멘트 마커이다. 그것은 축삭 안내 및 유지에 관련된다.
최종적으로, 인테그린 계열의 일부 구성원은 상이한 α-하위단위가 인테그린 β1과 결합하여 다른 기능을 갖는 독특한 수용체를 형성하는 12개의 상이한 인테그린으로 구성되는 β1 하위계열의 일부 인테그린을 포함하여 인간 신경 줄기 세포의 마커로서 제안되었다. 인테그린 하위단위 β1은 태아 뇌 조직으로부터 NSC를 선택하는데 사용되었지만, β1 하위단위를 기반으로 하는 선택은 β1 하위계열의 인테그린이 분화된 세포를 포함하는 대부분의 세포에 존재하기 때문에 특이적이지 않다. β1과 파트너가 되는 NSC 상의 α-인테그린이 어느 것인지는 명확하지 않다. α2, α3, α5, α6 및 α7의 발현은 모두 NSC 상에서 검출되었지만(Flanagan et al., 2006), 이들 인테그린은 또한 다양한 세포 유형에 존재한다. 문헌(참조: Hall PE et al. (2006))은 인간 NSC의 가능한 마커로서 이량체 인테그린 α6β1을 사용함을 시사했다. 이 인테그린은 혈관 라미닌의 수용체이고, 혈소판 부착, 활성화 및 동맥 혈전증에서 역할을 하는 것으로 공지되어 있다.
결론적으로, 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 동정 및 단리에 적합한 특정 마커에 대한 충족되지 않은 요구가 있다.
인테그린 α10β1은 연골 세포에서 발견되는 콜라겐 II형 결합 수용체이다(Camper et al., 1998). 인테그린 α10β1은 발달 동안 및 성인 조직 모두에서 연골에서 고도로 발현되는 연골 세포 상의 주요 콜라겐 결합 인테그린이다(Camper et al., 2001). 인테그린 α10β1은 또한 간엽(mesenchymal) 줄기 세포(MSC)에 의해 발현된다(Varas et al., 2007). 또한, 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)가 인테그린 α10β1의 발현을 상향조절하고, MSC의 연골 형성 가능성을 향상시키는 것으로 나타났다(Varas et al., 2007). 문헌(참조: Bengtsson et al (2005))은 인테그린 α10β1이 결핍된 마우스가 연골 성장판에 결함을 가지고 있으며, 결과적으로, 긴 뼈의 성장 지연을 발달시킨다는 것을 입증했다. 최근 연구는, 개과 α10 인테그린 유전자에서 자연 발생 돌연변이가 사냥 개 품종의 연골 이형성증에 책임이 있어(Kyoostila et al., 2013) 골격 발달에서 α10β1의 중요한 역할을 지지한다는 것을 나타냈다.
본 발명자들은 놀랍게도 신경 줄기 세포 및 신경 조직 유래 신경 전구 세포에 대한 인테그린 이종이량체(heterodimer) α10β1의 발현을 검출했고, 포유류 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 동정 및 단리를 위한 선택 마커로서의 이의 용도를 본원에서 개시한다. 상기 언급된 NSC 표면 마커와 대조적으로, 인테그린 α10β1이 다른 공지된 마커와 비교하여 뇌 줄기 세포 적소의 상이한 하위유형을 커버하는 더 광범위한 줄기 및 전구 세포 마커임을 시사하는 공편재화 연구(도 3, 6, 7, 8, 9,10, 11 및 12)에 의해 도시된 바와 같이 인테그린 α10β1이 성체 마우스 SVZ 줄기 세포 적소(참조: 이하 표 1)의 3개의 NSC/NPC 세포 유형 모두에 존재한다.
[표 1]
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본 발명의 한 양태는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 하위단위(subunit)를 포함하는 마커의, 포유류 신경 줄기 세포 및 포유류 신경 전구 세포의 마커로서의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 동정하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 신경 조직, 예를 들어, 신경 세포를 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 샘플에 포함된 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
c) 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록(scoring)하는 단계 및
d) 단계 c)의 기록에 따라 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 동정하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 단리시키는 방법으로서, 상기 방법이
a) 신경 조직을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 샘플에 포함된 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
c) 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록하는 단계 및
d) 단계 c)의 기록에 따라 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 시험 화합물이 시험관내에서 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포 분화를 조절하는지의 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제공하는 단계,
b) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및
c) 시험 화합물이 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 분화를 조절하는지표로서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 분화 속도 또는 패턴의 변화를 검출하는 단계를 포함하고,
상기 분화 속도 또는 패턴이 본원에 기재된 방법에 따르는 세포에 의한 인테그린 알파10 발현을 검출함으로써 결정되는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 참조 집단에 비해 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한 시험관내 포유류 세포의 단리된 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 CNS로부터의 세포의 집단의 적어도 일부, 또는 참조 집단의 일부를 제공하는 단계,
b) 상기 단계 a)의 세포 집단에 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 하위단위를 동정하는 화합물을 도입하는 단계 및
c) 상기 단계 b)의 세포 집단으로부터 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 선택하고 단리시킴으로써 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 미분화된 포유류 세포의 시험관내 세포 배양물로서, 상기 세포가 신경 조직으로부터 유래되고,
a) 배양물 중 세포가 혈청 및 증식 유도 성장 인자 둘 다를 실질적으로 함유하지 않는 배양 배지에서 분화될 때 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포로 분화하는 능력을 갖고;
b) 배양물 중 세포가 혈청 대체물, 예를 들어, B27 및 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 증식하고;
c) 배양물 중 세포가 혈청 대체물 B27 및 증식 유도 성장 인자 둘 다의 회수시 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포로 분화하는, 시험관내 세포 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 시험관내 세포 배양물로서,
a) 혈청 대체물, 예를 들어, B27 및 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지; 및
b) 포유동물의 중추 신경계로부터 유도된 미분화된 포유류 세포를 포함하고, 상기 세포의 적어도 30%, 예를 들어, 적어도 40%, 예를 들어, 적어도 50%, 예를 들어, 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 70%, 예를 들어, 적어도 80%, 예를 들어, 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95%가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 시험관내 세포 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 미분화 세포의 현탁 배양물에 관한 것으로서, 상기 세포는 실질적으로 세포 응집체로 형성되고, 상기 세포 응집체는 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 유지된다.
본 발명의 또 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체(subject)에서 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 CNS 손상을 예방하고 보호하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 중추 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 정신 증상을 갖는 신경 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 간엽 줄기 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 간엽 줄기 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 중추 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 간엽 줄기 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 간엽 줄기 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 정신 증상을 갖는 신경 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상을 예방하고 보호하고/하거나 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 쇄 하위단위를 포함하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 마커에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 신경계의 질환 또는 손상 및/또는 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 단리된 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
도 1. 인테그린 α10β1은 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역으로부터 단리된 세포의 하위집단에 의해 발현된다.
상기 도는 세포 유동 계측법에 의해 평가된 바와 같이 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역으로부터 단리된 세포에서 인테그린 α10β1의 발현을 도시한다. 비염색된 세포(A)의 분석. 세포는 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 모노클로날 항체(B) 및 대조군 마우스 IgG2a 항체(C)로 염색하고, 양성 세포의 백분율을 후속적으로 분석했다. 결과는 단리된 세포의 하위집단이 인테그린 α10β1을 발현함을 보여준다.
도 2. 인테그린 α10β1은 뇌실하 영역으로부터 단리된 세포의 하위집단에 의해 발현되고 신경구 또는 단층으로서 배양된다.
상기 도는 유동 세포 계측법에 의해 평가된 단층(A-D) 및 신경구(E-H)로서 배양된 세포에 의한 인테그린 α10β1, PDFGRα, Lex 및 CD24의 발현을 도시한다. 세포는 인테그린 알파10 하위단위(A, E)에 지시된 모노클로날 항체, PDFGRα(B, F)에 지시된 모노클로날 항체, CD24(C,G)에 지시된 모노클로날 항체 및 Lex(D,H)에 지시된 항체로 염색하고, 양성 세포의 백분율은 유동 세포 계측법으로 분석했다. 결과는 단층 또는 신경구로서 배양된 세포의 하위집단이 인테그린 α10β1, PDGFRα, Lex 및 CD24를 발현함을 나타낸다.
도 3. 신경구는 인테그린 α10β1 및 다른 신경 줄기/전구 줄기 세포 마커를 발현한다.
상기 도는 마우스의 SVZ로부터 단리되고 인테그린 α10β1 및 다른 신경 줄기/전구 세포 마커를 위해 면역염색된 신경구에서 세포의 이중 면역표지화를 도시한다. 염색물을 가시화하고, 이미지는 공초점 현미경에 의해 획득했다. 전체 신경구는 α10 및 신경 줄기/전구 세포 마커인 네스틴 (A), PDGFRα (B), GFAP (C), PSA-NCAM (D), 비멘틴 (E) 모두의 발현을 나타낸다. 생체내 SVZ의 세포 조성(Doetsch et al. 1997)과 일치하여, 시험관내 신경구는 또한 Olig2 염색 (F)에 의해 입증된 바와 같이, 유형 C 세포의 낮은 풍부함을 나타낸다.
도 4. SVZ로부터 단리되고 줄기 세포 조건하에 배양된 신경 줄기/전구 세포는 신경 및 신경교 세포로 분화하는 잠재력을 보유한다. 신경 줄기/전구 세포를 분화시키고, 신경(Map2, β- III Tub) 및 신경교(Gfap, O4) 유전자의 발현을 측정했다. Gapdh는 표준화용 하우스키핑 유전자로서 사용했다. 유전자 발현은 삼중 샘플의 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로서 나타낸다.
도 5. 인테그린 α10β1은 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역(SVZ)의 세포에 의해 발현된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 공초점 현미경에 의해 평가된 바와 같은 성체 마우스 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 인테그린 알파10 하위단위 (A) 및 세포 핵 DNA를 가시화하는 DAPI(B)에 지시된 래빗 폴리클로날 항체로 염색했다. A 및 B의 복합 이미지는 C에 도시된다.
도 6. 인테그린 α10β1 및 신경 줄기/전구 세포 마커 네스틴은 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역(SVZ)에서 부분적으로 공편재된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 공초점 현미경에 의해 평가된 성체 마우스 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 네스틴의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 인테그린 알파10 하위단위 (A)에 지시된 래빗 폴리클로날 항체, 네스틴 (B)에 지시된 마우스 모노클로날 항체 및 세포 핵 DNA를 가시화하는 DAPI(C)로 염색했다.
도 7. 인테그린 α10β1 및 신경아세포 마커 PSA-NCAM은 부분적으로 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역(SVZ) 중의 세포 상에 공편재된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 공초점 현미경에 의해 평가된 성체 마우스 뇌 조직의 SVC에서 인테그린 α10β1 및 PSA-NCAM의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 래빗 폴리클로날 항체(C), PSA-NCAM에 지시된 마우스 모노클로날 항체(B) 및 세포 핵 DNA를 가시화하는 DAPI(A)로 염색했다. A, B 및 C의 복합 이미지는 D에 도시한다.
도 8. 인테그린 α10β1 및 신경교 세포 마커 GFAP는 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역(SVZ) 중의 세포 상에 부분적으로 공편재된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 공초점 현미경에 의해 평가된 성체 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 GFAP의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 래빗 폴리클로날 항체 (A), GFAP에 지시된 염소 폴리클로날 항체 (B)로 염색했다. A 및 B의 복합 이미지는 C에 도시한다.
도 9. 인테그린 α10β1 및 신경 줄기 세포 마커 SOX2는 부분적으로 신생 마우스 뇌의 뇌실하 영역(SVZ) 중의 세포 상에서 공편재된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 에피형광 현미경에 의해 평가된 신생 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 신경 줄기 세포 마커 SOX2의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 세포 핵 DNA를 가시화하기 위한 DAPI (A), SOX2에 지시된 마우스 모노클로날 항체 (B) 및 인테그린 알파 10 하위단위에 지시된 래빗 폴리클로날 항체 (C)로 염색했다. A, B 및 C의 복합 이미지는 D에 도시한다.
도 10. 인테그린 α10β1 및 PDFGRα는 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역으로부터 단리된 세포의 하위집단 상에서 공편재된다.
상기 도는 유동 세포 계측법에 의해 평가된 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역으로부터 단리된 세포에 의한 인테그린 α10β1 및 PDFGRα의 발현을 도시한다. 세포는 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 모노클로날 항체 (A) 및 PDFGRα에 지시된 모노클로날 항체 (B)로 염색하고, 양성 세포의 백분율을 분석했다. 유동 세포 계측법 분석은 단리된 세포의 하위집단이 인테그린 α10β1 및 PDFGRα 둘 다를 발현함(C)을 입증한다.
도 11. 인테그린 α10β1은 신생 마우스 뇌에서 해마의 과립하 영역(SGZ)에서 발현되고, 신경 줄기 세포 마커 SOX2와 함께 부분적으로 공편재된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 에피형광 현미경에 의해 평가된 바와 같이, 신생 마우스 뇌 조직의 SGZ에서 인테그린 α10β1 및 신경 줄기 세포 마커 SOX2의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 세포 핵 DNA를 가시화하는 DAPI (A), SOX2에 지시된 마우스 모노클로날 항체 (B) 및 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 래빗 폴리클로날항체 (C)로 염색했다. A, B 및 C의 복합 이미지는 D에 도시한다.
도 12. 인테그린 α10β1은 신생 마우스 뇌의 뇌막에서 발현되고, 신경교 세포/희소돌기아교세포 전구체의 마커인 PDGFRα와 함께 부분적으로 공편재된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 에피형광 현미경에 의해 평가된 바와 같이, 신생 마우스 뇌 조직의 뇌막에서 인테그린 α10β1 및 PDGFRα의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 세포 핵 DNA를 가시화하는 DAPI(A), PDGFRα에 지시된 염소 폴리클로날 항체 (B) 및 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 래빗 폴리클로날 항체 (C)로 염색했다. A, B 및 C의 복합 이미지는 D에 도시한다.
도 13. 인테그린 α10β1은 뇌졸중 후 마우스 뇌에서 상향조절된다.
상기 도는 면역형광 염색 및 에피형광 현미경에 의해 평가된 바와 같이 마우스 뇌의 뇌졸중 영역 대 무손상 영역에서 인테그린 α10β1의 고발현을 도시한다. 뇌졸중 영역은 점선의 오른쪽 영역이다.
도 14. 인테그린 α10β1, 신경 마커 NeuN, 및 성상 세포 마커 GFAP의 발현.
상기 도는 면역형광 염색 및 공초점 현미경에 의해 평가된 마우스 뇌에서 인테그린 α10β1, NeuN, GFAP 및 Iba1의 발현을 도시한다. 뇌 조직은 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 래빗 폴리클로날 항체, NeuN에 지시된 기니 피그 폴리클로날 항체, GFAP에 지시된 염소 폴리클로날 항체 및 Iba1 (소교세포 마커)로 염색했다. 대조군 마우스 뇌의 복합 이미지는 A, D에 도시하고, 인테그린 α10β1 및 NeuN의 발현 (B 및 C), 인테그린 α10β1 및 GFAP의 발현 (E 및 F) 및 인테그린 α10β1 및 Iba1의 발현 (H 및 I)에 관한 뇌졸중 뇌의 복합 이미지를 도시하고, 공편재화는 화살표로 도시한다. 결과는 인테그린 α10β1이 각각 뉴런 및 성상 세포 상에서 NeuN 및 GFAP의 발현이 증가함에 따라 공편재되지만, 소교세포 마커 Iba1로는 그렇지 않았음을 나타낸다.
정의
본원에 사용된 용어 "설치류" 및 "설치류들"은 계통발생 설치목 로덴시아(Rodentia)의 모든 구성원을 의미한다.
본원에 사용된 "인테그린 알파 10" 또는 "인테그린 알파 10 하위단위"는 이종이량체 단백질 인테그린 알파 10 베타 1의 알파 10 하위단위를 의미한다. 이 표시는 알파 10 하위단위에 결합된 베타 1 하위단위의 존재를 배제하지 않고, 따라서 인테그린 알파 10 베타 1 이종이량체의 4차 구조를 형성한다.
본원에 사용된 "항-인테그린 알파 10 항체" 또는 "항-인테그린 알파 10 하위단위 항체"는 적어도 이종이량체 단백질 인테그린 알파 10 베타 1의 알파 10 하위단위를 인식하고 이에 결합할 수 있는 항체를 의미한다. 이러한 항체는 이종이량체 단백질 인테그린 알파10 베타 1의 에피토프를 인식하는 항체일 수 있고, 이때 상기 에피토프는 알파10 및 베타1 하위단위 둘 다의 아미노산 잔기를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "동정하는"은 특정 유형의 세포인 세포, 예를 들어, 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포를 인식하는 작용을 의미한다. 동정하는의 대안적인 용어는 동일한 의미로 본원에 사용되는 "검출하는"이다. 세포는, 예를 들어, 세포에 의한 특정 마커의 발현을 검출함으로써 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포로서 동정된다.
본원에 사용된 용어 "단리하는", "분류하는" 및 "선택하는"은 특정 유형의 세포로서 세포를 동정하고 동일한 세포 유형 또는 분화 상태에 속하지 않은 세포로부터 이를 분리하는 작용을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "기록하는"은 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록함을 의미한다. 기록하는은, 예를 들어, 샘플 집단에서 면역검정, 유동 세포 계측법(flow cytometry), 면역형광, 웨스턴 블롯 또는 면역침전을 통해 인테그린 알파10 하위단위 발현을 측정하고, 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 참조 세포 집단 뿐만 아니라 인테그린 알파10 하위단위를 발현하지 않는 세포 집단에서 수행된 측정과 측정을 비교함일 수 있다. 인테그린 알파10을 발현하는 참조 세포의 예는 인테그린 서열로 형질감염된 C2C12 세포, HEK293 세포이다. 알파10을 발현하지 않는 참조 세포의 예는 형질감염되지 않은 C2C12 세포 및 HEK293 세포이다.
용어 "뮤린(murine)"은 래트 및 마우스를 포함하는 쥣과(Muridae) 계통의 모든 구성원을 의미한다.
용어 "실질적으로 함유하지 않는"은 본원에서 사용된 검정의 검출 한계 이하를 의미함으로써 음성, 즉 함유하지 않음을 나타내고자 한다.
용어 "헌신적인(committed)"은 본원에서 전념하거나 집중하는 것을 의미한다. 따라서, 헌식적인 세포는 특정 분화 경로에 전념하거나 집중되는 세포이다. 이로부터, 헌신되지 않은 세포는 임의의 특정 분화 경로에 전념하거나 집중하지 않고 몇 가지 옵션을 갖는다는 것을 따른다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 세포의 표면 상 또는 세포 중 세포간 인테그린 알파10 발현의 검출에 기초하는, 본원에 개시된 방법에 따라 동정되고/되거나 단리된 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 및/또는 간엽 줄기 세포가 투여될 수 있는 임의의 포유동물을 의미하는 것으로 간주된다. 본 발명의 방법에 의한 치료용으로 구체적으로 의도된 대상체는 인간 뿐만 아니라 비인간 영장류, 양(ovine), 말, 소, 염소, 돼지, 개, 고양이, 래빗, 기니피크, 햄스터, 게르빌루스쥐, 래트 및 마우스, 뿐만 아니라 이들 숙주로부터 유도되거나 유래하는 기관, 종양 및 세포를 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 마커로서 인테그린 알파10
본 발명자들은 놀랍게도 인테그린 알파10베타1이 인간 신경 줄기 세포(NSC) 및/또는 신경 전구 세포(NPC)에 존재함을 밝혀냈다. 따라서, 이 인테그린은 혼합된 세포 집단으로부터 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포를 동정하고 선택하고 특이적으로 단리시키는데 사용될 수 있고, 예를 들어, 신경계의 손상 결과로서 손상된 조직을 회복하기 위한 세포 요법에서 또는 신경퇴행성 질환의 치료용으로 유용한 도구일 것이다. 상기한 NSC 표면 마커와 비교하여, 인테그린 α10β1은 모두 3개 세포 유형의 성체 마우스 SVZ(참조: 상기 표 1)를 동정하여 인테그린 α10β1이 다른 공지된 마커와 비교하여 뇌 줄기 세포 적소의 상이한 세포 하위유형을 커버하는 광범위한 줄기 및 전구 세포 마커임을 시사한다.
인간 인테그린 알파10 쇄 서열은 GenBank ™/EBI Data Bank 수탁 번호 AF074015로 공지되고 공개적으로 이용 가능하다. 따라서, 인테그린 알파10 쇄의 새로운 용도 및 방법이 본 발명에 개시된다.
상기에서 밝혀진 바와 같이, 본 발명의 한 양태는 포유류 신경 줄기 세포 및 포유류 전구 세포의 마커로서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현되는 인테그린 알파10 하위단위를 포함하는 마커의 용도에 관한 것이다.
하나의 구현예에서, 인테그린 알파10 하위단위는 인테그린 베타1 쇄와 함께 이종이량체로서 발현된다.
하나의 구현예에서, 인테그린 알파10 하위단위는 포유류 NSC 및/또는 NPC의 세포 표면에서 발현된다.
하나의 구현예에서, 인테그린 알파10 하위단위는 포유류 NSC 및/또는 NPC에서 세포내로 발현된다.
신경 줄기 세포(NSC) 및 신경 전구 세포(NPC)를 동정하는 방법
본 발명의 하나의 양태는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 동정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은
a) 신경 조직을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 샘플에 포함된 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
c) 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록하는 단계 및
d) 단계 c)의 기록에 따라 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 동정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 단리시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은
a) 신경 조직을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
b) 단계 a)의 샘플에 포함된 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
c) 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록하는 단계 및
d) 단계 c)의 기록에 따라 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 선택하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 포유류 NSC 및/또는 NPC를 동정하는 방법 및 포유류 NSC 및/또는 NPC를 단리시키는 방법은 샘플을 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 검출하기 전에 인테그린 알파10 하위단위에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함한다.
보다 상세히, 본 발명에 따르는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 동정하고/하거나 단리시키는 방법은
e) NSC 및/또는 NPC를 포함하는 세포 현탁액을 제공하는 단계,
f) 단계 e)의 세포 현탁액을 상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편이 인테그린 알파10베타1의 세포외 도메인과 항체-항원 복합체를 형성하는 조건하에 인테그린 알파10베타1에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편과 접촉시키는 단계,
g) 단계 f)의 상기 모노클로날 항체 또는 이의 단편에 결합하는 세포를 분리하여 포유류 NSC 및/또는 NPC의 순수한 집단을 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 동정하고/하거나 단리시키는 방법은 상기 항체 또는 이의 단편으로부터 모노클로날 항체 또는 이의 단편에 결합하는 세포를 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
포유류 NSC 및/또는 NPC를 포함하는, 상기 단계 e)에 제공된 세포 현탁액은 이하 "신경 조직" 단락에서 상세하게 기재된 바와 같은 신경 조직으로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 본 발명에 따르는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 동정하고/하거나 단리시키는 방법은 시험관내에서 수행된다.
신경 조직
포유류 NSC 및 NPC의 주 공급원은 신경 조직이다. 실제로, NSC 및 NPC는 태아 또는 성인 포유류 중추신경계(CNS) 및 신경발생이 일어나는 태아 또는 성인 포유류 뇌 또는 척수로부터 적소에서 발견된다.
뇌의 신경 줄기 세포 적소는 신경 전구 세포를 호스팅하고 유지시킬 수 있는 조직 미세환경이다. 최근까지, 단지 두 개의 뇌 적소, 전외측 뇌실의 뇌실하 영역(SVZ) 및 해마 치아이랑의 과립하 영역(SGZ)이 포유동물에서 인식되었다. 증가하는 증거는 특히 손상 후 성인 뇌의 다른 부분에서 또한 신경발생 및 신경교발생을 나타내어 추가의 줄기 세포 적소가 성인 뇌에 존재함을 시사한다(Lin and Iacovitti, 2015). 최근에, 연뇌막이 네스틴 및 SOX2를 제시하는 미분화 증식성 및 분화성 신경 전구체의 마커를 발현하는 세포의 하위세트를 호스팅하고, 이 세포 세트가 성인기에 지속함을 나타내었다. 따라서, 뇌막은 배아 발달 동안 및 성인기에 전구체를 위한 또 다른 기능적 적소를 나타낼 수 있다.
따라서, 본 발명의 일부 구현예에서, 신경 조직은 NSC 및 NPC를 포함한다.
일부 구현예에서, 신경 조직은 뇌 조직으로부터 수득되거나 유래된다.
일부 구현예에서, 신경 조직은 성인 뇌 조직이다.
일부 구현예에서, 신경 조직은 태아 뇌 조직이다.
일부 구현예에서, 신경 조직은 포유동물의 뇌실하 영역(SVZ), 과립하 영역(SGZ) 또는 뇌막으로부터 유래되거나 수득된다.
모든 포유동물이 신경 조직을 수득하기에 적합하다. 일부 구현예에서, 신경 조직은 인간, 개과, 말과, 소, 고양잇과, 뮤린, 양 또는 돼지 신경 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 필요하다면 다른 포유류 신경 조직이 수득될 수 있다.
일부 구현예에서, 포유류 NSC 및 NPC는 인간 NSC 및 NPC이다.
하나의 추가의 구현예에서, 포유류 NSC 및 NPC는 뮤린 NSC 및 NPC이다.
일부 구현예에서, 신경 조직은 인간 배아로부터 유래되지 않는다.
인테그린 알파10 발현의 검출
포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 동정 방법 뿐만 아니라 그들의 단리 방법에서 핵심 단계는 인테그린 알파10 단백질 발현의 검출이다.
하나의 구현예에서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출은 유동 세포 계측법에 의해 결정된다. 예를 들어, 알파10의 발현은 유동 세포 계측법, 또는 높은 특이성을 갖는 임의의 다른 방법으로 분석될 수 있다. 다색 분석은 특히 편리한 유동 세포 계측법과 함께 사용될 수 있다. 따라서, NSC 및/또는 NPC는 특정 항원에 대한 염색 수준에 기초하여 다른 세포로부터 분리될 수 있다.
하나의 구현예에서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출은 인테그린 알파10 단백질 발현을 측정함으로써 결정된다. 예를 들어, 유동 세포 계측법, 면역형광, 면역침전 및/또는 웨스턴 블롯팅이 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출은 인테그린 알파10 mRNA 발현을 측정함으로써 결정된다. 특정 단백질의 mRNA 발현의 검출은 당업자에게 익히 공지되어 있고, 일반적으로 프로브가 다른 mRNA 분자로 하이브리드화되지 않는 하이브리드화 조건하에 관심 있는 mRNA에 특이적인 DNA 또는 RNA 프로브로 mRNA를 프로빙함으로써 수행된다. 당업자에게 명백한 상이한 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 또한 사용될 수 있다.
적합한 PCR-방법은 이하 제시된다. 간략하게, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)이 사용될 수 있다.
RNA는 표준 방법, 예를 들어, RNeasy 미니 키트(Qiagen Germany)를 사용하여 인간 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포로부터 제조될 수 있다.
cDNA는 올리고 d(T)-프라이머 또는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 제조업자의 권고에 따라 역전사 효소 반응, Superscript II(Invitrogen, USA)를 사용하여 생성될 수 있다.
PCR은 이후 cDNA를 증폭시키기 위해 수행된다. α10에 대한 특이적 프라이머, 전방 5'GCT CCA GGA AGG CCC CAT TTG TG 3’및 역방향 5'GTG TTT TCT TGA AGG GTG CCA TTT 3'를 cDNA에 첨가하고, 특정 생성물은 40회 사이클에 대해 65°에서 제조업자의 권고에 따라 백금 Taq DNA 폴리머라제(Invitrogen, USA)에 의해 증폭시킨다.
마커의 발현 검출을 위한 기술 분야의 당업자에게 몇 가지 방법이 공지되어 있다. 따라서, 본 발명의 하나의 구현예에서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출은 면역검정, 유동 세포 계측법, 면역형광, 면역침전 및 웨스턴 블롯으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법에 의해 결정된다.
추가의 구현예에서, 인테그린 쇄 알파10 발현은 본 발명에 따르는 방법에서 NSC 및/또는 NPC의 세포 표면에서 또는 NSC 및/또는 NPC에서 세포내로 검출된다. 상기 제시된 방법, 예를 들어, 유동 세포 계측법 및 면역침전이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 유동 세포 계측법이 사용된다.
추가의 구현예에서, 인테그린 알파10 하위단위의 발현은 면역검정, 예를 들어, 면역화학적 프로토콜에 기재된 방법(Methods in molecular biology, Humana Press Inc)에 의해 검출된다. 검출은 다양한 방법, 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 면역 방법, 예를 들어, 면역침전, 웨스턴 블롯팅, 자기 활성화 세포 분류(MACS) 또는 유동 세포 계측법, 예를 들어, 형광 활성화 세포 분류(FACS)에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현은 항체를 통해 검출되고, 이때 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체 또는 이의 단편이다.
항체, 예를 들어, 모노클로날 항체 또는 이의 단편은 특정 세포계통 및/또는 분화 단계와 관련된 마커, 세포 표면 단백질 뿐만 아니라 세포내 마커를 동정하는 데 특히 유용하다. 따라서, 그것은 인테그린 알파10의 동정에 적합하다.
하나의 구현예에서, 항체는 모노클로날 항체 또는 폴리클로날 항체이다.
추가의 구현예에서, 항체는 비인간 항체(non-human antibody), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체이다.
여전히, 동정은 또한 인테그린 알파10 분자에 특이적으로 결합하는 임의의 특이적 분자, 예를 들어, 단백질 또는 펩티드에 의해 수행될 수 있다. 이러한 단백질 또는 펩티드의 예는 인테그린 알파10 분자에 결합하는 천연 리간드이다. 이러한 천연 리간드는 재조합되거나 화학적으로 합성되거나 천연 공급원으로부터 정제될 수 있다.
인테그린 알파10 분자에 특이적으로 결합하는 항체, 단백질 또는 펩티드가 검출가능한 잔기(moiety)에 결합될 경우 검출이 촉진된다.
일부 구현예에서, 항체는 인테그린 알파10 하위단위의 발현 검출용으로 사용되고, 항체는 형광단, 효소 또는 방사성 추적자(radioactive tracer) 또는 방사성 동위 원소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 검출 가능한 잔기와 같은 검출가능한 잔기에 공유 결합된다.
일부 구현예에서, 항체는 형광단에 결합하고, 형광단은 플루오레세인 이소티오시아네이트, 피코에리트린 및 피코에리트린 접합체, 알로피코시아닌 및 알로피코시아닌 접합체, 텍사스 레드(Texas Red) 및 텍사스 레드 접합체, 형광색소의 알렉사(Alexa) 시리즈, 형광색소의 브릴리언트(Brilliant) 바이올렛 및 브릴리언트 블루 시리즈로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
많은 다른 형광단이 사용될 수 있고, 당업자는 특정 검출 방법 및 또한 사용된 항체의 특성에 따라 가장 적합한 것을 선택할 것이다.
추가의 구현예에서, 항체는 IgA, IgD, IgG 및 IgM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동형(isotype)을 갖는다.
추가의 구현예에서, 항체는 다음과 같다:
a) Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH에 수탁 번호 DSM ACC2583으로 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체; 또는
b) Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH에 수탁 번호 DSM ACC2583으로 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체; 또는
c) a) 또는 b)의 단편으로서, 상기 단편이 인테그린 알파 10 하위단위 쇄의 세포외 I-도메인에 특이적으로 결합할 수 있는, 단편.
인테그린 알파10 분자에 특이적으로 결합하는 항체, 단백질 또는 펩티드가 고체 지지체에 결합될 때 검출이 또한 촉진될 수 있다. 따라서, 하나의 구현예에서, 항체는 인테그린 알파10 하위단위의 발현 검출용으로 사용되고, 항체는 고체 지지체에 부착된다.
NSC 및 NPC의 단리 및 배양
본 발명의 방법에 따라 포유류 신경 줄기 세포(NSC) 및/또는 포유류 신경 전구 세포(NPC)의 단리는 플라스틱 배양 접시에 부착하고 특정 배양 조건하에 콜로니를 형성하는 세포 능력에 기초할 수 있다. 본 발명에 따르는 마커를 포함하지 않고 포유류 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 단리에 적합한 프로토콜은 문헌[참조: Giachino et al. 2009, Guo W et al., (2012) 및 Oliver-De la Cruz and Ayuso-Sacido (2012)]에 상세히 추가로 제시된다. 따라서, 본 발명에 따르는 마커를 도입하면서 공지된 방법이 사용될 수 있다.
분리 절차는, 예를 들어, 항체 코팅된 자기 비드, 친화도 크로마토그래피, 모노클로날 항체에 결합되거나 모노클로날 항체와 함께 사용되는 제제, 예를 들어, 보체 및 세포독소를 사용하는 자기 분리, 및 고체 매트릭스, 예를 들어, 플레이트에 부착된 항체를 사용하는 "패닝(panning)", 또는 다른 편리한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 당업자에게 공지된 다양한 정도의 정교성, 예를 들어, 복수의 컬러 채널, 광산란 검출 채널, 임피던스 채널 등을 가질 수 있는 형광 활성화 세포 분류기를 포함한다.
본 발명에 따르는 방법에 사용되기에 적합한 분리 방법을 위한 추가의 프로토콜은 문헌[참조: Orfao, A and Ruiz-Arguelles, A ((1996) General Concepts about Cell Sorting Techniques. Clin Biochem. 29(1):5-9), and by Herzenberg, LA, De Rose, SC and Herzenberg, LA ((2000) Monoclonal Antibodies and FACS: complementary tools for immunobiology and medicine. Immunol. Today. 21(8):383-390)]에 기재되어 있다.
포유류 NSC 및 NPC는 먼저 신경 조직으로부터 수집된 세포의 혼합물로부터 정제된다. 일반적으로, 음성 마커를 사용하여 분화된 세포로부터 NSC 및 NPC를 분리한다.
신경 조직에 존재하는 다른 세포, 예를 들어, 헌신적인 신경 세포로부터 NSC 및 NPC의 단리는 NSC 및 NPC가 먼저 동정된 다음 다른 세포로부터 분리되는 선택 및 분류 단계를 포함한다. 당업자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 NSC 및 NPC보다 다른 계통에 전념되는 세포를 초기에 제거함으로써 세포를 분리할 수 있다.
제1 분리에서, 하나 이상의 형광 색소(들)로 표지된 다른 마커용 항체가 사용될 수 있다.
NSC 및 NPC는 죽은 세포와 관련된 염료(요오드화프로피듐, LDS)를 사용하여 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 세포는 그들의 배양 배지 또는 바람직하게는 임의로 존재하는 태아 소 혈청(1% FCS) 또는 소 혈청 알부민(1% BSA)으로 완충된 임의의 생리 식염수 용액, 예를 들어, 인산염 완충 생리 식염수(PBS)에서 수집될 수 있다.
NSC 및 NPC 상에서 발현되지 않는 마커는, 예를 들어, CD326, CD34 및 CD45이고, 그들의 발현 및 발현의 결핍은 특정 구현예에서 NSC 또는 NPC가 아닌 세포의 음성 선택을 위한 마커로서 사용될 수 있다.
NSC 또는 NPC가 아닌 추가의 계통 또는 세포 집단이 한 단계에서 제거되어야 하는 경우, 이러한 계통 특이적 마커에 대한 다양한 항체가 포함될 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 다른 덜 특이적이고 비독특한 포유류 NSC 및/또는 NPC 마커가 본 발명에 따르는 마커와 함께 분석될 수 있다. 실제로, CNS 발달의 다른 단계에서 검출된 NSC 및 NPC 하위세트는 네스틴, GFAP, CD15, CD24, Sox2, 무사시(Musashi), CD133, EGFR, PDGFRα, 더블코르틴(DCX), Pax6, FABP7 및 GLAST와 같은 마커를 발현하는 것으로 나타났다. 이들 마커는 실시예에 나타낸 바와 같이 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 세포 중 일부에 의해 공발현된다. 그러나, 이들 마커 중 어떤 것도 NSC 및/또는 NPC에 의해 독특하게 발현되지 않고, 다수는 실제로 신경 분화 세포 및 다른 비신경 세포 유형에 의해 발현된다.
대조적으로, 단리 및 확장 프로토콜에서 본 발명에 따르는 인테그린 알파10 마커의 사용은 뇌 및 척수의 상이한 세포로 분화하는 능력을 갖는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 균질한 집단을 제공함으로써 뇌 또는 척수 조직(spinal cord tissue) 재생용으로 유용할 것이다.
따라서, 공지된 단리 및 확장 프로토콜에서 인테그린 알파10 하위단위를 포함하는 본 발명에 따르는 마커를 포함할 뿐만 아니라 마커(들)만을 사용하는 것은 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포 집단의 추가의 평가 및 농축화에 매우 유용할 것이다. 특히, 포유류 신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포에 대한 본 발명에 따르는 마커로서 다른 특이적이고 독특한 마커는 공지되어 있지 않다.
NSC 및 NPC는 또한 광 산란 특성 및 본 발명에 따르는 방법을 사용하는 동정과 함께 다양한 세포 표면 항원의 발현에 기초하여 선택될 수 있다.
일반적으로, 세포 표면에 또는 세포내 존재하는 마커는 형광 색소의 도움으로 검출된다. 다색 분석에서 용도를 찾을 수 있는 형광 색소는 피코빌리단백질, 예를 들어, 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플로우레세인, 텍사스 레드 및 많은 다른 것들을 포함하고, 이들 모두는 당업자에게 익히 공지되어 있고 시판된다.
세포 표면에 존재하는 마커의 용도에 기초하여 세포의 검출 및 선택을 위해 통상적으로 사용되는 기술은 유동 세포 계측법 및 면역침전이다.
일부 구현예에서, NSC 및 NPC는 유동 세포 계측법 또는 면역침전에 의해 분석되어 인테그린 알파10 하위단위 발현을 검출하고 동정할 수 있다. 당업자는 세포의 검출 및/또는 선택용으로 사용되는 유동 세포 계측법 및 면역침전에 적합한 프로토콜에 친숙할 것이다.
세포 집단이 전체 마우스 뇌로부터 수집되는 경우, 작은 분획만, 예를 들어, 전체 세포 수의 2% 미만이 NSC 또는 NPC이다.
항체 또는 이의 단편이 사용될 경우, 이는 고체 지지체에 부착되어 매우 특이적 분리를 가능하게 할 수 있다. 사용된 분리용 특정 절차, 예를 들어, 원심분리, 기계적 분리, 예를 들어, 컬럼, 막 또는 자기 분리는 수집되는 분획의 생존력을 최대화해야 한다. 당업자에게 공지된 상이한 효능의 다양한 기술이 사용될 수 있다. 사용된 특정 기술은 분리 효율, 방법론의 세포독성, 성능의 용이성 및 속도, 및 정교한 장비 및/또는 전문적 기술에 대한 필요성에 의존한다.
본 발명에 따르는 방법에 의해 보조된 세포 현탁액으로부터 NSC 및/또는 NPC의 분리 절차는, 예를 들어, 항체 코팅된 자기 비드를 사용하는 자기 분리, 본 발명에 따르는 항체 또는 이의 단편을 기초로 하는 친화도 크로마토그래피, 및 고체 매트릭스, 예를 들어, 플레이트에 부착된 항체 또는 이의 단편을 사용하는 "패닝", 또는 다른 편리한 기술을 포함할 수 있다.
정확한 분리를 제공하는 기술은 형광 활성화 세포 분류기, 자기 비드 분류(magnetic bead sorting) 및 당업자에게 공지된 임의의 적합한 방법을 포함한다.
추가의 구현예에서, 본 발명의 방법의 제1 농축(enrichment) 단계는 NSC 또는 NPC의 목적하는 순도가 달성될 때까지 반복될 수 있는 NSC 또는 NPC의 양성 선택이다.
포유류 NSC 및/또는 NPC가 풍부한 세포의 단리된 집단을 생성하는 방법
본 발명의 한 양태는 참조 집단에 비해 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한 시험관내 포유류 세포의 단리된 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 세포 집단의 적어도 일부, 또는 참조 집단의 일부를 제공하는 단계,
b) 상기 단계 a)의 세포 집단에 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 하위단위를 동정하는 화합물을 도입하는 단계,
c) 상기 단계 b)의 세포 집단으로부터 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 선택하고 단리시켜 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 제조 방법에 관한 것이다.
집단을 제공하는 단계는 상기 상세하게 기재된 NSC 및 NPC의 동정 방법과 유사한 방식으로 수행될 수 있다. 세포 집단은 적어도 하나의 NSC 및/또는 적어도 하나의 NPC를 포함할 수 있거나, NSC도 아니고 NPC도 아닌 세포만을 포함할 수 있다. 예를 들어, 신경 조직으로부터 수득되거나 유래된 세포 집단이 제공될 수 있고, 또는 인테그린 알파10으로 형질감염된 HEK 세포 또는 C2C12 세포와 같은 참조 세포 집단이 제공될 수 있다.
NSC 및/또는 NPC를 동정하기 위해 도입된 화합물은 단백질, 펩티드, 모노클로날 항체, 또는 이의 일부, 또는 NSC 및/또는 NPC를 동정하는 폴리클로날 항체일 수 있다.
NSC 및/또는 NPC를 동정하기 위해 도입된 화합물은 단백질, 펩티드, 모노클로날 항체, 또는 이의 일부, 또는 인테그린 알파10을 검출할 수 있는 폴리클로날 항체일 수 있다.
하나의 구현예에서, NSC 및/또는 NPC는 상기한 NSC 및/또는 NPC를 동정하는 방법에 따라 상기 NSC 및/또는 상기 NPC의 세포 표면에서 인테그린 쇄 알파10의 발현을 검출함으로써 NSC 및/또는 NPC로서 동정된다.
모노클로날 또는 폴리클로날 항체, 또는 이의 일부는 마커, 예를 들어, 무손상 생존 가능 세포의 세포 표면에서 발현된 마커를 동정하는데 특히 유용하다. NSC 및/또는 NPC를 동정하는데 사용되는 화합물은 또한 분리 단계를 위해 사용될 수 있다. 따라서, 상기 화합물(들), 예를 들어, 항체 또는 이의 일부는 고체 지지체에 부착되어 제1 조악한 분리를 가능하게 할 수 있다. 고체 지지체의 예는 비드, 예를 들어, 자기 비드, 아가로스 또는 당업자에게 공지된 다른 유사한 유형의 비드이다. 세포의 분리에 적합한 임의의 수단이 분리가 세포의 생존력에 과도하게 유해하지 않은 조건에서 사용될 수 있다.
사용된 분리 기술은 수집될 분획의 생존력의 유지를 최대화해야 한다. 생존력의 평가는 이하 기재된다.
요약하면, 세포 생존력의 평가는, 예를 들어, 유동 세포 계측법을 사용하여 수행될 수 있다. 적절한 세포의 염색 후, 생존력 염료는 생존 세포와 비생존 세포를 구별하기 위해 첨가될 수 있다. 이러한 염료가 다수 존재하고, 이의 예 및 그들을 사용하는 전형적인 방법이 기재된다. 원리는 이들 염료 대부분의 경우 동일하고: 이들 염료는 세포막이 손상되면 세포로 들어가고; 그 자체로, 이들 염료로 염색되는 세포는 생존가능하지 않고, 염색되지 않은 세포는 생존 가능한 것으로 간주된다.
염료의 예는 요오드화프로피듐(PI), 7-아미노악티노마이신 D(7 AAD), To-Pro3, 및 에티듐 모노아지드(EMA)이다. 다른 방법은 문헌[참조: A. Radbruch (Springer Verlag, 2nd edition, January 2000)]의 유동 세포 계측법 및 세포 분류(Springer Lab Manual)에 기재되어 있다.
수집된 분획의 세포 생존력은 전형적으로 > 90%, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.9%, 또는 심지어 100%이다.
본 발명에 따르는 방법에서 세포 분리에 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 방법론의 세포독성, 성능의 용이성 및 속도, 및 정교한 장비 및/또는 전문적인 기술에 대한 필요성에 좌우될 것이다.
본 발명에 따르는 방법의 하나의 구현예에서, 포유류 NSC 및/또는 NPC의 적어도 하나의 농축 단계가 포함된다.
본 발명에 따르는 방법의 하나의 구현예에서, 포유류 NSC의 적어도 하나의 농축 단계가 포함된다.
본 발명에 따르는 방법의 하나의 구현예에서, 포유류 NPC의 적어도 하나의 농축 단계가 포함된다.
또 추가의 구현예에서, NSC 및/또는 NPC의 제1 농축 단계는 NSC 및/또는 NPC의 음성 선택이다, 즉 다른 계통 헌신적 세포가 초기 세포 집단으로부터 고갈되거나 제거된다. 예를 들어, CD34, CD45 및 CD326과 같은 마커를 발현하는 세포는 음성적으로 선택된다.
또 추가의 구현예에서, 본 발명의 방법은 인테그린 알파11 하위단위의 발현 검출에 기초하는 추가 단계 음성 선택을 포함하고, 예를 들어, 마커 인테그린 알파11을 발현하는 세포는 세포 집단으로부터 고갈되거나 제거된다.
또 추가의 구현예에서, 제1 농축은 NSC 및/또는 NPC의 목적하는 순도가 달성될 때까지 반복될 수 있는 NSC 및/또는 NPC의 양성 선택이다. 양성 또는 음성 선택의 경우, 단백질, 펩티드, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체가 상기한 바와 같은 인테그린 알파10 분자를 동정하기 위한 화합물로서 사용될 수 있다. 화합물은 직접 분리를 가능하게 하는 자기 비드와 같은 분리 수단; 아비딘으로 제거될 수 있는 비오틴; 또는 지지체에 결합된 스트렙타비딘; 형광 활성화 세포 분류기와 함께 사용될 수 있는 형광 색소; 상기 단락에서 예시된 바와 같은 특정 세포 유형의 용이한 분리를 가능하는 것과 접합될 수 있다. 관심 있는 세포, 즉 NSC 및 NPC의 생존력에 과도하게 유해하지 않는 임의의 기술이 사용될 수 있다.
하나의 구현예에서, 선택은, 예를 들어, FACS®과 같은 유동 세포 계측법 기반 세포 분류기를 사용하는 형광 세포 분류, 또는 높은 특이성을 갖는 임의의 다른 유사한 방법론에 의해 수행된다. 다색 분석은 특히 편리한 유동 세포 계측법 및 유동 세포 계측법 분야의 당업자에게 익히 공지된 기술인 유동 세포 계측법과 함께 사용될 수 있다. 세포는 특정 항원에 대한 염색 수준에 기초하여 분리될 수 있다. 제1 분리에서, 하나의 형광 색소로 표지된 다른 마커용 항체가 사용될 수 있는 반면, 전용 계통, 즉 인테그린 알파10에 대한 항체는 (a) 상이한 형광 색소(들)에 접합될 수 있다. 다른 마커는 추가의 구현예에서 NSC 및/또는 NPC가 발현할 수 있는 네스틴, GFAP, CD15, CD24, Sox2, 무사시, CD133, EGFR, PDGFRα, 더블코르틴(DCX), Pax6, FABP7 및 GLAST일 수 있다. NSC 및 NPC 상에서 발현되지 않는 마커의 예는 CD326, CD34, CD45 및 인테그린 알파11이고, 그들의 발현 또는 결핍은 추가의 구현예에서 본 발명에 따르는 또한 마커, 예를 들어, 인테그린 알파10 발현과 함께 평가될 수 있다.
추가의 계통 또는 세포 집단이 이 단계에서 제거되어야 하는 경우, 이러한 계통 특이적 마커에 대한 다양한 항체가 포함될 수 있다. 다색 분석에서 용도를 찾을 수 있는 형광 색소는 피코빌리단백질, 예를 들어, 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레세인, 텍사스 레드, 및 당업자에게 공지된 임의의 적합한 형광 색소를 포함한다.
세포는 죽은 세포와 관련된 염료, 예를 들어, 요오드화프로피듐 또는 LDS-75 1(레이저 염료 스티릴-75 1(6-디메틸아미노-2-14-[4-(디메틸아미노)페닐]-1,3-부타디에닐-1-에틸 퀴놀리니우른 퍼클로레이트))를 사용함으로써 죽은 세포에 대해 선택될 수 있다. 세포는 임의의 적합한 세포 배양 배지, 예를 들어, 아이스코베 변형된 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium; IMDM), 또는 바람직하게는 임의로 존재하는 태아 소 혈청(FCS) 또는 소 혈청 알부민(BSA)으로 완충된 임의의 생리학적 식염수 용액, 예를 들어, 인산염 완충 생리 식염수(PBS)에서 수집될 수 있다. 문헌[참조: Silvestri F, Wunder E, Sovalat H, Henon P, Serke S in Positive selection of CD34+ cells: a short review of the immunoadsorption methods currently available for experimental and clinical use (Report on the "2nd European Workshop on stem Cell Methodology", Mulhouse, France, May 3-7, 1993. J Hematother. 1993 Winter;2(4):473-81) and by Basch RS, Berman JW, Lakow E.in Cell separation using positive immunoselective techniques (J Immunol Methods. 1983 Feb 11;56(3):269-80)]에 추가로 기재된 정확한 분리를 허용하는 양성 또는 음성 선택을 위한 다른 기술, 예를 들어, 친화도 컬럼 등이 사용될 수 있다.
세포는 광 산란 특성 뿐만 아니라 다양한 세포 표면 항원의 발현에 기초하여 선택될 수 있다.
분리의 특정 순서는 본 발명에 중요하지 않다고 간주되지만, 지시된 순서는 작동하는 것으로 공지된 본 발명을 수행하는 한 방법이다. 따라서, 시사적으로, 세포는 초기에 조악한 분리, 바람직하게는 음성 세포 마커, 예를 들어, CD326, CD34 및 CD45를 사용하여 NSC 및 NPC에 헌신되지 않은 세포를 제거하는 음성 선택에 의해 분리된다. 음성 선택은 전형적으로 양성 선택에 이어지고, 이때 양성 선택은 NSC 및/또는 NPC와 관련된 마커의 경우이고, 음성 선택은 계통 헌신된 세포 및 NSC 및/또는 NPC가 아닌 다른 줄기 세포 집단과 관련된 마커의 경우이다. 이어서, 이 분리는 세포 집단, 또는 NSC 및/또는 NPC로서 다중 계통 잠재력 및 향상된 자기 재생 능력을 갖는 상기 집단을 포함하는 세포 조성물의 선택에 이어진다. 상기 조성물은 이하 추가로 기재된다.
추가의 구현예에서, 이러한 집단의 농축은 약 70, 80, 90, 95, 98, 99, 99.9, 또는 심지어 100%이다. 이러한 세포의 생존력은 상기 상세하게 논의된다.
농축된 집단은 추가로 확대된 다음, 표피 성장 인자(EGF) 및 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2)와 같은 정의된 인자로 유도되어 특정 신경 세포로 분화될 수 있다. 예를 들어, FGF-2는 일반적으로 성장 인자의 수용체에 대한 결합을 매개하는 헤파린과 함께 사용된다. 세포 배양을 지지하는 것으로 보고된 다른 성장 인자는 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 백혈병 언제 인자(LIF) 및 이의 등가의 섬모 향신경성 인자(CNTF), 또는 뇌 유래된 향신경성 인자(BDNF)이다. PDGFα는 희소돌기아교세포 전구 세포의 유지 배지에 자주 사용된다. 대안으로서 또는 특정 성장 인자를 사용하는 것 이외에, NPC 및 NSC는 물리적 접촉에 의해 NPC 및 NSC 성장을 선호하는 것으로 보이는 성상 세포, 또는 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 생산을 통해 세포 증식을 증가시킬 수 있는 내피 세포와 같은 다른 지지 세포의 존재하에 공배양될 수 있다.
NSC 및/또는 NPC의 조절
본 발명의 추가의 양태는 시험 화합물이 시험관내에서 포유류 NSC 및/또는 NPC 분화를 조절하는지를 결정하는 방법에 관한 것이다. 이러한 방법은
a) 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제공하는 단계,
b) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계, 및
c) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 분화 속도 또는 패턴의 변화를 시험 화합물이 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 분화를 조절하는지의 지표로서 검출하는 단계를 포함하고,
이때, 분화 속도 또는 패턴은 본원에 개시된 방법에 따르는 세포에 의한 인테그린 알파10 발현을 검출함으로써 결정되고, 상기 단락 "인테그린 알파10 발현의 검출"을 참조한다.
제공된 NSC 및 NPC는 본원에 개시된 임의의 방법에 따라 달성된 농축된 세포 집단, 본 발명에 따르는 단리된 NSC 및/또는 NPC 또는 본 발명에 따르는 세포 조성물일 수 있다.
시험 화합물은 NSC 및/또는 NPC에 영향을 미치는 것으로 공지되거나 영향을 미치는 것으로 의심되는 임의의 화합물, 예를 들어, 약제학적 조성물, 약물, 폴리클로날 또는 모노클로날 항체 또는 이의 일부, 예를 들어, 인테그린 알파10 또는 NSC 및/또는 NPC 상의 임의의 다른 분자에 결합하는 항체, NSC 및/또는 NPC의 성장을 촉진시키는데 사용되는 인자, 예를 들어, PDGFRα, EGF 및 FGF-2일 수 있다.
시험 화합물이 NSC 및/또는 NPC 분화를 조절하는지의 지표로서, 예를 들어, NSC 및/또는 NPC의 분화 속도 또는 패턴의 변화의 검출은 인테그린 알파10 발현을 상기 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 세포 표면에서 또는 본원에 개시된 방법에 따르는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에서 세포내로 검출함으로써 수행될 수 있다.
시험 화합물이 NSC 및/또는 NPC 분화를 조절하는지의 지표로서, 예를 들어, NSC 및/또는 NPC의 분화 속도 또는 패턴의 변화의 검출은 유동 세포 계측법 또는 임의의 다른 적합한 방법, 예를 들어, 당업자에게 공지된 임의의 면역-방법을 통해 수행될 수 있다. 분화 속도 또는 패턴의 변화는 미처리되거나 모의 처리된 NSC 및/또는 NPC 집단에 비해 시험 화합물로 조절된 NSC 및/또는 NPC의 운동, 기능 또는 표현형 연구를 통해 검출될 수 있다.
세포 조성물
본 발명의 하나의 양태는 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 미분화된 포유류 세포의 시험관내 세포 배양물로서, 상기 세포가 신경 조직으로부터 유도되고,
a) 배양물 중 세포가 혈청 및 (b)에서 정의된 바와 같은 증식 유도 성장 인자를 모두 실질적으로 함유하지 않는 배양 배지에서 분화되어 적어도 10% 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포의 세포 배양물을 생산할 경우 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포로 분화하는 능력을 갖고;
b) 세포 배양물이 혈청 대체물, 예를 들어, B27 및 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지로 나뉘고;
c) 배양물 중 세포가 혈청 대체물 및 증식 유도 성장 인자 둘 다의 회수시 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포로 분화하는, 시험관내 세포 배양물에 관한 것한다.
하나의 구현예에서, 단계 c)는 태아 소 혈청의 첨가를 포함한다.
본 발명의 추가의 양태는
a) 혈청 대체물, 예를 들어, B27 및 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지; 및
b) 포유류의 중추신경계로부터 유래된 미분화된 포유류 세포를 포함하는 시험관내 세포 배양물로서, 상기 세포의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 시험관내 세포 배양물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양태는 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 미분화 세포의 현택 배양물에 관한 것으로서, 상기 세포는 실질적으로 세포 응집체로 형성되고, 상기 세포 응집체는 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 유지된다.
일부 구현예에서, 인테그린 알파10 발현은 상기 단락 "신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포를 위한 마커로서 인테그린 알파10"에 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%의 미분화된 포유류 세포는 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포이다.
일부 구현예에서, 미분화된 포유류 세포는 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포이다.
일부 구현예에서, 미분화된 포유류 세포는 상기 단락 "신경 조직"에서 상세히 기재된 성인 또는 태아 포유류, 예를 들어, 인간 또는 뮤린 신경 조직으로부터 수득되거나 유도된다.
일부 구현예에서, 미분화된 포유류 세포는 인간 배아 세포 또는 인간 배아로부터 수득되거나 유래되지 않는다.
일부 구현예에서, 미분화된 포유류 세포의 일부는 네스틴, PSA-NCAM, GFAP, SOX2 및 PDGFRα로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 추가로 발현한다.
인간 NSC 또는 NPC 세포를 50% 초과, 예를 들어, 60% 초과, 예를 들어, 70% 초과, 예를 들어, 80% 초과, 예를 들어, 90% 초과, 예를 들어, 95% 초과, 예를 들어 96%, 97%, 98%, 또는 99.9% 갖는 조성물은 NSC 또는 NPC의 농축을 위한 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다. 이러한 NSC 및/또는 NPC는 뉴런, 성상 세포 및 희소돌기아교세포 및 다른 세포와 같은 NSC의 다양한 계통 모두의 구성원의 세포 재생 및 발생을 제공할 수 있다.
궁극적으로, 단일 세포 유형은 NSC 또는 NPC 조성물로부터 수득될 수 있고, 포유류 신경 조직의 재구성 또는 재생에 사용될 수 있다. NSC 또는 NPC 조성물은 바람직하게는 치료적 유효량으로 투여되어야 하고, 이때 투여량은 인간과 같은 상기 포유동물을 재생시킬 수 있는 특정 세포 수이다. 세포 수는 공여자마다 다를 수 있고, 당업자에 의해 경우에 따라 경험적으로 결정될 수 있다.
세포 증식 유도 인자는 각 세포 유형에 특이적이고, 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자는 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자-2(FGF-2), 형질전환 성장 인자 알파(TGF-α), 백혈병 억제 인자(LIF), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 뇌 유도 향신경성 인자(BDNF), PDGFα, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
신경계의 손상 및 신경퇴행성 질환의 치료
본원에 기재된 방법에 따라 동정되고 단리된 인간 또는 마우스 NSC 및/또는 NPC와 같은 포유류 NSC 및/또는 NPC는 손상 및 상해를 치료하고/하거나 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하고/하거나 이를 필요로 하는 대상체에서 신경퇴행성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 신경퇴행성 장애에 관해서, 이는 특히 신경 조직의 손실 또는 손상과 관련된 신경퇴행성 질환에 적용된다. 본 발명은 손실되거나 손상된 조직을 재생시킴으로써 이러한 신경퇴행성 질환을 치료한다.
또한, 예를 들어, WO 03/106492에 개시된 방법에 따라 동정되고 단리된 간엽 줄기 세포(MSC)는 또한 문헌(참조: Steinberg G.K. et al (2016) Stroke 47:1817-1824)에 의해 입증된 바와 같이 중추신경계의 손실되거나 손상된 조직을 재생시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 한 양태에서, 본 발명은 중추신경계의 손실되거나 손상된 조직을 재생시키는 방법 및 이를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 정신 증상을 갖는 신경 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 간엽 줄기 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 간엽 줄기 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 중추신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 이를 필요로 하는 대상체에서 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
a) 포유류 간엽 줄기 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
b) 포유류 간엽 줄기 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 정신 증상을 갖는 신경 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법에 관한 것이다.
상기 간엽 줄기 세포는, 예를 들어, 골수, 지방 조직, 제대혈, 와튼 젤리(Wharton's jelly), 치과용 펄프, 양수, 양막, 치과 조직, 자궁내막, 사지, 혈액, 태반 및 태아 막, 타액선, 피부 또는 포피, 양막하 탯줄 라이닝 막 또는 활막으로부터 단리될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하고/하거나 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 쇄 하위단위를 포함하는, 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포용 마커에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경계의 질환 또는 손상 및/또는 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 단리된 집단을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 구현예에서, 인테그린 알파10 발현은 상기 단락 "신경 줄기 세포 및 신경 전구 세포의 마커로서 인테그린 알파10"에 기재된 바와 같다.
일부 구현예에서, 세포 집단은, 예를 들어, 상기 단락 "세포 조성물" 및 "포유류 NSC 및/또는 NPC가 풍부한 세포의 단리된 집단을 생산하는 방법"에 기재된 바와 같이 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포가 풍부하다.
본원에 개시된 방법에 따르는 상기 세포의 세포 표면에서 인테그린 알파10 하위단위 발현을 검출함으로써 단리된 간엽 줄기 세포와 같은 신경 전구 세포와 같은 신경 줄기 세포는 대상체의 신경계의 손상된 부분에 이식될 수 있고, 따라서 신경 조직의 성장을 촉진시키고 신경계의 손상 및 신경퇴행성 질환을 회복할 수 있다.
본원에 개시된 방법에 따르는 상기 세포의 세포 표면에서 인테그린 알파10 하위단위 발현을 검출함으로써 단리되고 이를 필요로 하는 대상체에게 이식되거나 이식된 간엽 줄기 세포와 같은 신경 전구 세포와 같은 신경 줄기 세포는 신경 줄기 세포 이동 및 분화 및 손상된 세포에 대한 영양 지지(trophic support)를 제공하는 세포외 매트릭스 인자의 생산을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 방법에 따르는 상기 세포의 세포 표면에서 인테그린 알파10 하위단위 발현을 검출함으로써 단리된 간엽 줄기 세포와 같은 신경 전구 세포와 같은 신경 줄기 세포는 이를 필요로 하는 대상체에게 뇌내, 동맥내, 정맥내 또는 뇌실내 경로를 통해 투여된다.
세포는 하나 이상의 경우에 상기 대상체에게 투여될 수 있다.
일단 대상체에게 투여되거나 이식되면, 세포는 그들이 옮겨지는 환경에 따라 다르게 거동하고, 모든 유형의 신경 세포로 분화될 수 있다.
특성화되어 치료되는 질환, 손상 및 장애
몇몇 질환 및 장애는 본 발명의 마커 및/또는 세포 및 방법을 사용하여 특성화되고 치료될 수 있다.
본 발명의 하나의 구현예에서, 신경계의 질환 또는 손상은 중추 또는 말초 신경계의 손상 또는 신경퇴행성 질환이다. 상기 질환, 손상 또는 상해는 손실되거나 손상된 신경 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예에서, 신경계의 손상은 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에 대한 손상을 포함하여 뇌졸중, 외상성 뇌 손상(TBI), 척수 손상(SCI), 확산성 축삭 손상(DAI), 간질, 신경병증, 말초 신경병증 및 이들 증후군을 유발할 수 있는 관련 통증 및 다른 증상과 같은 상태를 유도한다.
뇌졸중은 뇌로의 불량한 혈류가 세포사를 초래하는 의학적 상태이다. 두 가지 주요 유형의 뇌졸중이 있다: 허혈성 및 출혈성. 뇌 허혈(뇌 허혈, 뇌혈관 허혈로도 공지됨)은 대사 요구를 충족시키기 위한 뇌로의 혈류가 불충분한 상태이다. 이는 불량한 산소 공급 또는 뇌 저산소증을 유도하고, 따라서 뇌 조직의 사망 또는 뇌 경색/허혈성 뇌졸중을 초래한다. 국소 뇌 허혈은 특정 뇌 영역으로의 혈류를 감소시켜 그 특정 영역에 대한 세포사의 위험을 증가시키는 반면, 전반적인 뇌 허혈은 뇌 전체에 영향을 미친다. 국소 뇌 허혈의 설치류 모델은 실험적 뇌졸중 연구에 자주 사용된다.
문헌(참조: Fairbairn et al, 2015)에 기재된 바와 같이, NSC는 급성 말초 신경 손상의 결과로서 말초 신경 손상 부위에 이식될 수 있다. NSC는 또한 형태학적 및 전기생리학적 회복을 향상시키기 위해 만성적으로 신경이 제거된 신경에 이식될 수 있다.
본 발명자들은 인테그린 알파 10 베타 1을 발현하는 신경 줄기 세포가 뇌졸중으로 고통받는 부위에서 모집됨을 입증했다(예: 도 13 내지 14). 하나의 구현예에서, 본 발명은 따라서 뇌졸중과 같은 허혈성 손상으로 고통받는 부위의 크기 및 위치를 특성화하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 CNS의 질환 또는 손상 후 진단적 및 예후적 도구로서 의학 전문가에게 유용하다. 예를 들어, 뇌졸중의 특성화를 평가하기 위한 나노입자 접합된 항체의 사용을 입증하는 문헌(참조: Panagiotou et al (2015) Frontiers in Neuroscience Vol. 9, Article 182)을 참조한다. 또한, 신경 줄기 세포(예: 자가 신경 줄기 세포 또는 전구 세포)는 공여자, 예를 들어, 환자 자신으로부터 수득될 수 있고 신경 줄기 또는 전구 세포로서 특성화되고, 확대되고, CNS의 손상되거나 병에 걸린 영역으로 이식될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다수의 CNS 질환 및 장애뿐만 아니라 신경 조직의 손실 또는 손상을 포함하는 손상 및 외상을 치료하는데 유용하다.
다른 구현예에서, 신경계의 질환 또는 손상은 뉴런의 변성 및 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 그들의 과정을 포함하는 신경퇴행성 질환, 예를 들어, 파킨슨병, 알츠하이머병, 노인성 치매, 헌팅톤병, 근위축성 측상 경화증(ALS), 다발성 경화증(MS)과 관련된 신경/축삭 손상, 및 관련 증상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 신경퇴행성 장애이다.
다른 구현예에서, 신경계의 손상 및/또는 신경퇴행성 질환은 기능장애 및/또는 뇌, 뇌간, 척수 및/또는 말초 신경에서의 뉴런의 손실, 예를 들어, 대사 질환, 영양 결핍, 독성 손상, 악성 종양 및/또는 유전적 또는 특발성 상태에 의해 유발되는 기능장애 및/또는 손실을 포함하고, 당뇨병, 신장 기능장애, 알코올 중독, 화학요법, 화학적 제제, 약물 남용, 비타민 결핍, 감염 및 관련 증상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 신경계의 손상 및/또는 신경퇴행성 질환은 뇌, 뇌간, 척수 및 말초 신경계에서 신경교, 예를 들어, 희소돌기아교세포, 성상 세포 및 슈완 세포의 퇴행 또는 경화를 포함하며, 다발성 경화증(MS), 시신경염, 뇌 경화증, 감염후 뇌척수염 및 간질, 및 관련 증상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 신경계의 손상 및/또는 신경퇴행성 질환은 망막, 광수용체 및 관련 신경을 포함하고, 색소성 망막염, 황반 변성, 녹내장 및 관련 증상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
다른 구현예에서, 신경계의 손상 및/또는 신경퇴행성 질환은 전정 청각적 복합체의 감각 상피 및 관련된 신경절을 포함하고, 소음 유발성 청각 손실, 난청, 이명, 중이염, 미로염, 유전성 및 와우전정 위축증, 메니에르병, 및 관련 증상을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
일부 구현예에서, 신경계의 손상은 척수 손상(SCI), 외상성 뇌 손상(TBI), 뇌졸중 및 뇌암으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 신경계의 손상은 뇌졸중이다.
일부 구현예에서, 신경 조직의 손상을 포함하는 정신 및 행동 장애는 본 발명의 NCS 또는 NPC에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 문헌(참조: Ladran et al (2013) Interdiscip Rev Syst Biol Med. 5(6): 701-715 and Kalman et al (2016) Stem Cells Int. 7909176)을 참조한다.
특정 구현예에서, 정신 및 행동 장애는 레트 증후군(Rett syndrome), 정신분열증, 우울증, 자폐증 스펙트럼 장애(ASD) 및 양극성 장애(BPD)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 사실, 일부 정신 및 행동 장애는 형태 및/또는 기능이 변경된 신경 세포와 관련된다. 따라서, 건강한 NSC 및/또는 NPC의 이식은 형태학적 및 기능적으로 건강한 헌신적인 신경 세포의 생성 및 정신 및 행동 장애의 퇴화를 초래할 수 있다.
본 발명에 따르는 세포 조성물은 또한 유전 질환의 치료에 사용될 수 있다. NSC 및/또는 NPC와 관련된 유전 질환은 유전적 결함을 교정하기 위해 자가 또는 동종 NSC의 유전자 변형에 의해 치료될 수 있다. 예를 들어, 헌팅톤병(HD)은 유전적 질환이고, 감염된 부모를 둔 어린이는 질환을 유발하는 유전적 결함을 물려받을 확률이 50%이다. 이 결함은 헌팅틴이라는 단백질에 대한 코드를 보유하는 유전자에서 발생한다. 결함 유전자는 신체가 헌팅틴 단백질의 결함이 있고 유독한 버전을 만들도록 하고, 이것은 결국 중간 가시 뉴런(MSN) 및 다른 뉴런의 손실을 초래한다. 건강한 NSC 및/또는 NPS를 포함하는 세포 조성물을 세포가 결함 유전자를 포함하는 대상체에게 투여하면 대상체가 건강한 헌팅틴을 생산할 수 있게 한다.
동종 NSC 및/또는 NPC의 경우, 유전적 결함이 없는 동일한 종의 포유동물의 정상 세포가 치료법으로 사용될 수 있다.
단리된 세포를 결함, 예를 들어, 뇌 또는 골수에 대한 손상 부위에 주입하고, 단리된 세포를 적합한 겔에서 배양하고 이식하고 생체재흡수성 스캐폴드와 함께 배양하거나 전신 주입 등을 포함하는 NSC 및/또는 NPC 및/또는 MSC, NSC 및/또는 NPC 및/또는 MSC를 포함하는 조성물을 전달 및 고정시키기 위한 다양한 절차가 고려될 수 있다. 상이한 절차는 당업자에게 공지되어 있다.
임의로, NSC 및/또는 NPC 및/또는 MSC는 세포를 적소에 유지시키기 위해 인테그린 알파10에 대한 항체와 함께 배양할 수 있다. 따라서, 항체는 생체재흡수성 스캐폴드에 접합되어 손상되거나 결함이 있는 부위, 예를 들어, 신경 결함 부위로 이식되기 전에 세포의 고정을 가능하게 할 수 있다. 스캐폴드는 NSC 및/또는 NPC 및/또는 MSC의 3D 고정을 가능하게 한다. 적합한 생체 재료 스캐폴드는 이하 예시된다. 제공된 예는 특정 용도에 보다 적합한지를 선택하는 당업자에게 명백한 다른 적합한 스캐폴드의 사용을 제한하지 않는다.
스캐폴드의 유형은 생체재흡수성 폴리(α-하이드록시 에스테르) 스캐폴드, 예를 들어, 폴리락트산(PLLA), 폴리글리콜산(PGA) 및 공중합체(PLGA)를 포함한다.
추가의 구현예는 히알루론산, 콜라겐, 알기네이트 및 키토산과 같은 중합체 겔로부터 유래된 스캐폴드를 포함한다.
실시예
실시예 1: 마우스 뇌실하 영역(SVZ)으로부터의 세포의 단리 및 유동 세포 계측법 분석
SVZ 단리
신경 줄기/전구 세포는 마우스 새끼 및 성체의 SVZ로부터 단리시켰다. 마우스를 처치하고, 뇌를 제거하고, 항체와 함께 빙냉 PBS에 위치시키고, SVZ를 함유하는 절편(1mm 두께)을 수집했다. SVZ는 측뇌실의 전각의 외벽으로부터 해부되었다. 조직을 37℃에서 20분 동안 StemPro Accutase (ThermoFisher Scientific) 용액으로 소화시켰다. P200 및 P20 팁으로 연마한 후, 세포 현탁액을 여과하고(50㎛ 필터, BD Biosciences), 5% CO2와 함께 37℃에서 1x B27(Gibco), 1x N2(Gibco), 100 U/mL 항생제-항진균제(Gibco), bFGF (20ng/ml)(Gibco) 및 EGF (20ng/ml)(Gibco)가 보충된 NSP 배지: DMEM/F12 w/Glutamax 및 Neurobasal 배지(1:1)(Gibco)에 플레이팅했다, 구는 약 5일 후에 나타나기 시작했다. 셀은 Accutase를 사용하여 5 내지 7일마다 계대시켰다.
유동 세포 계측법 절차
1. 항체: 인테그린 알파10 하위단위에 지시된 모노클로날 항체를 사용했다. 세포를 원심분리시키고, 100μL의 분액을 에펜도르프 튜브당 첨가했다. 1㎍/mL 대조군 마우스 IgG2a 항체를 0.2mg/mL 스톡으로부터 대조군으로 사용했다.
2. 세포를 얼음 위에서 60분 동안 1차 항체와 함께 배양했다.
3. 세포를 500㎕ 염색 완충제(2% FBS를 갖는 PBS+/+)로 2회 세척했다.
4. 2차 항체를 첨가하고, 세포를 45분 동안 얼음 위에서 배양했다.
5. 세포를 500μL 염색 완충제로 2 내지 3회 세척했다.
6. 500μL 염색 완충제를 최종 펠렛에 첨가하고 세포를 재현탁시켰다.
7. 세포를 유동 세포 계측법으로 분석했다.
결론: 이 실시예는 성체 마우스 뇌의 뇌실하 영역으로부터 단리된 세포가 인테그린 α10β1을 발현함을 나타낸다(참조: 도 1b).
실시예 2: 면역형광에 의한 마우스 뇌 조직에서 인테그린 α10β1 및 다른 마커의 공발현의 분석
새로 냉동된 마우스 뇌 조직을 TissueTek(Sakura, Japan)에 매립시켰다. 절편 10㎛(MICROM HM 500 OM Cryostat에서 제조됨)를 SuperFrost Plus 슬라이드(Menzel-Glaser, GmbH)에서 수집했다. 절편을 아세톤으로 고정 후(10분 동안 -20℃에서 100%) 면역표지화용으로 사용했다.
냉동 절편을 약 20분 동안 37℃에서 통풍 건조시켰다. 절편이 실온에 도달되면, 그들을 5분 동안 PBS(인산염 완충된 생리 식염수, 0.1M, pH 7.4)로 2회 세정했다. 실리콘 장벽("PAP 펜")을 절편 주위에 적용했다. 절편을 실온에서 30분 동안 0.05% (0.1-0.001) 트리톤 X-100 및 1% BSA를 함유하는 PBS에서 배양한 다음, PBS 1 x 2분으로 세정했다. 절편을 상이한 항원에 대한 상이한 종에서 제조된 1차 항체의 혼합물과 함께 배양했다(먼저, 특이성 및 최적의 작업 희석을 위해 개별적으로 평가됨). 배양은 4 내지 8℃에서 16 내지 18시간 동안 α10 pAb 1.2㎍/ml(0.6-1.2㎍/ml)(0.05% 트리톤 X-100 및 1% BSA를 함유하는 PBS에서 희석됨)를 사용하여 수행했다. 두 에피토프의 자발적 형광 가시화를 위해, 1차 및 2차 항체를 각각 혼합물("칵테일")로서 적용했다. 절편을 PBS에서, 1분에 이어, 2 x 5분 세정하고, 혼합물로 2차 Ab/Ab가 접합된 형광단과 함께 배양하고, 실온에서 30 내지 45분 동안 1:150 희석했다.
래빗, 마우스 또는 염소 IgG'에 대해 또는 치킨 IgY(Jackson, USA 또는 Invitrogen, USA)에 대해 당나귀 또는 염소에서 다중 표지화를 위한 2차 항체(고친화도 정제됨, 주로 Fab2 단편)를 제조하고, 1% BSA를 함유하는 PBS에서 희석시켰다. 두 에피토프의 자발적 형광 가시화를 위해, 1차 및 2차 항체를 혼합물인 "칵테일"로서 적용했다. 절편을 먼저 2분 동안 PBS-트리톤 X100에서, 이어서 PBS 1 x 5분으로 세정했다. 절편을 세포기관(핵) 염색 DAPI, 0.1μM로 배양하고, PBS로 15분 동안 희석시키고, PBS로 2 x 5분 세정했다. 절편을 탑재하고, 커버를 "안티-페이딩 용액" ProLong Gold(Invitrogen, USA)에 활주시켰다. 본 연구에 사용된 항체는 표 2에 제시된다.
[표 2]
Figure pct00002
분석:
분석은 공초점 레이저 주사 현미경 및 에피형광에 의해 수행되었다.
시험편은 305 내지 633nm 사이의 여기 및 420 내지 650nm의 방출 검출용 레이저를 사용하여 Zeiss LSM 510 META 공초점 현미경으로 시험했다. 이미지는 3개의 면역형광 채널, 하나의 DAPI 채널 및 하나의 밝은 필드 DIC 채널과 함께 20x/0,8 Plan Apochromate 및 40x/1,3 오일 침지 Plan Apochromate 대물렌즈를 사용하여 획득했다.
연속 공초점 평면의 Z-스택(DIC 부재)은 최대 해상도를 위해 1024x1024 px 프레임 크기(픽셀 너비 0.22㎛) 또는 "줌"(더 작은 영역 스캐닝) 및 Nyquist 최적 샘플링 주파수(픽셀 너비 0,115㎛)와 함께 40x/1,3 대물렌즈로 수득했다. 연속 공초점 평면 사이의 스텝 크기는 Nyquist 최적 샘플링 주파수(0.48㎛)에 따랐다.
결과 : 면역형광 염색 및 공초점 현미경으로부터의 이미지는 성체 마우스 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1의 발현(도 5), 성체 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 네스틴의 발현 및 공편재화(도 6), 성체 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 PSA-NCAM의 발현 및 부분적 공편재화(도 7); 성체 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 GFAP의 발현 및 부분적 공편재화(도 8) 뿐만 아니라 신생 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 SOX2의 발현 및 부분적 공편재화(도 9)를 나타낸다. 성체 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1 및 PDFGRα의 부분적 공편재화도 또한 도 10에 도시된 바와 같이 유동 세포 계측법을 사용하여 관찰되었다.
면역형광 염색, 공초점 현미경 및 에피형광으로부터 이미지는 신생 마우스 뇌 조직의 과립하 영역에서 인테그린 α10β1 및 SOX2의 발현 및 부분적 공편재화(도 11) 및 신생 마우스 뇌 조직의 뇌막에서 인테그린 α10β1 및 PDFGRα의 발현 및 부분적 공편재화(도 12)를 나타낸다.
결론: 이 실시예에서, 다양한 마커가 발현되고 성체 마우스 뇌 조직의 SVZ에서 인테그린 α10β1과 함께 공편재되는 것으로 나타난다.
실시예 3: 단리된 마우스 NSP/NSP 세포의 분화 및 유전자 발현 분석
특정 신경 세포 계통을 확인하기 위해, 정량적 PCR 검정을 사용하여 유전자 발현을 측정했다.
RNA 추출 및 정량적 PCR
총 RNA를 RNeasy Plus 마이크로 키트(Qiagen)를 사용하여 세포 또는 조직으로부터 추출한 다음, SuperScript cDNA 합성 키트(Life Technologies)를 사용하여 cDNA로 역전시켰다. 정량적 PCR을 위해, TaqMan 유전자 발현 마스터 혼합물(Life Technologies) 및 TaqMan 프로브(ThermoFisher Scientific)를 사용했다. 표적 유전자의 주기 임계 값을 ΔCt를 수득하기 위해 하우스키핑 유전자 Gapdh의 기하 평균으로 정규화했다. 2 내지 -ΔCt의 배율(2-ΔCt)을 최종 분석을 위해 계산했다(참조: 도 4). qPCR 분석에 사용된 Taqman 프로브를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
Figure pct00003
결론: 결과는 Map2, β-투불린 III, Gfap 및 O4에 대한 유전자 발현의 상향조절을 나타냈다(도 4). 이는 단리된 NSC/NSP의 뉴런, 성상 세포 및 희소돌기아교세포로의 효과적인 분화를 나타낸다.
실시예 4: 인테그린 알파10 하위단위 양성 신경 줄기 세포는 신경구로서 배양된다
신경 줄기/전구 세포는 출생후 및 성체 마우스(C57Bl/6)의 SVZ로부터 단리시켰다. 뇌를 단리시키고, 측면 심실 벽을 해부하고, 37℃에서 20분 동안 StemPro Accutase(ThermoFisher Scientific)에서 소화시켰다. 조직을 P200 및 p20 팁으로 연마하고, 세포 현택액을 여과시키고(50㎛ 필터, BD Biosciences), B27(Gibco), N2 (Gibco), 100U/mL 항생제-항진균제(Gibco), bFGF(20ng/ml)(Gibco) 및 EGF(20ng/ml)(Gibco)가 보충된 NSP 배지(DMEM/F12 w/Glutamax 및 Neurobasal 배지(1:1)(Gibco)에 플레이팅했다. 세포를 Accutase를 사용하여 5일 마다 계대시켰다.
결과: 유동 세포 계측법 및 면역형광 염색 이후 공초점 현미경으로부터 이미지는 신경구로서 배양된 세포의 하위집단이 다른 줄기 세포 마커와 함께 인테그린 α10β1을 발현함을 보여준다(도 2 및 도 3).
실시예 5: 인테그린 알파10 하위단위 발현의 검출에 의해 동정되고 단리된 NSC의 농축된 집단을 투여함으로써 마우스의 뇌졸중 치료
마우스 NSC의 단리 및 배양
인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 신경 줄기 세포는 실시예 1에 기재된 절차에 따라 전체 마우스 뇌로부터 단리된다.
단리 후, 신경 줄기 세포를 실시예 4에 기재된 바와 같은 신경구 형태로 배양한다.
계대는 1:3의 분할비로 4 내지 6일 마다 수행한다. 일반적으로, 계대 3에서 세포는 실험에 용이하게 이용 가능하다. 계대 3에서 NSC도 또한 특성화용으로 사용된다. 신경 줄기 세포 마커 CD133 및 PDFGRα뿐만 아니라 인테그린 α10β1은 유동 세포 계측법에 의해 검사된다.
영구적인 중간 대뇌 동맥 폐쇄(pMCAO)
마우스의 pMCAO는, 예를 들어, 문헌[참조: Engel et al. (2011)]에 기재된 절차에 따라 외과적으로 생성된다.
α10β1 세포를 안정하게 발현하는 상이한 수의 NSC의 뇌졸중 감염된 마우스 뇌로의 이식
마우스는 2.5x106, 5x106 또는 10x106 NSC-α10 세포의 단일 용량을 투여한다. 인테그린 α10β1 양성 NSC는 잔류 뇌졸중 용적을 둘러싸는 표적 부위를 정의하는 자기 공명 영상(imaging) 정위 기법을 사용하여 이식한다.
결론적으로, 이 연구는 뇌졸중 치료를 위한 NSC-α10 발현 세포를 사용하는 뇌내 줄기 세포 이식이 일반적으로 안전하고 마우스에 의해 충분히 허용되고, 개선된 신경학적 기능을 초래함을 입증한다.
마우스 BM-MSC의 단리 및 배양
4주령 또는 8주령 마우스는 자궁경부 전위에 의해 종결시키고, 100mm 세포 배양 접시(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA)에 위치시키고, 여기서 전신은 2분 동안 70% (v/v) 에탄올에 침지시킨 다음, 마우스를 새로운 접시로 옮긴다. 네 발톱은 발목 및 손목 관절에서 해부하고, 뒷다리와 몸통, 앞다리 및 몸통 사이의 연결 부위 주위에서 절개한다. 이후 전체 피부를 발톱의 절단 부위 쪽으로 당김으로써 뒷다리와 앞다리로부터 제거한다. 근육, 인대 및 힘줄은 미세절단 가위 및 수술용 메스를 사용하여 경골, 대퇴골 및 상완골로부터 조심스럽게 분리시킨다. 경골, 대퇴골 및 상완골은 관절에서 절단에 의해 해부되고, 뼈는 멸균 거즈로 옮겨진다. 뼈를 조심스럽게 문질러서 잔류 연조직을 제거하고, 얼음 위 10mL 완전 α-MEM 배지와 함께 100-mm 멸균 배양 접시로 옮긴다. 모든 샘플은 높은 세포 생존력을 보장하기 위해 동물 사망 후 30분 이내에 처리한다. 연조직은 오염을 피하기 위해 뼈에서 완전히 분리시킨다.
생물안전 캐비닛에서, 1% PSN을 함유하는 PBS로 뼈를 2회 세척하여 혈액 세포 및 잔류 연조직을 플러슁한 다음, 뼈를 10mL 완전 α-MEM 배지와 함께 새로운 100-mm 멸균 배양 접시로 옮긴다. 뼈는 겸자로 잡고 두 말단을 미세절단 가위를 사용하여 골수강의 끝 바로 아래에서 잘라냈다. 5mL 주사기에 부착된 23-게이지 바늘을 사용하여 접시로부터 5mL 완전 α-MEM 배지를 인출한 다음; 바늘을 골강에 삽입한다. 골수는 서서히 풀러슁하고, 골강은 뼈가 엷어질 때까지 다시 2회 세척했다. 모든 뼈 조각은 겸자를 사용하여 접시에서 제거하고, 배지에 고형 질량을 남기고, 접시를 5% CO2 배양기에서 37℃에서 5일 동안 배양한다. 충분한 골수 세포를 수득하기 위해, 골강은 뼈가 엷어질 때가지 반복적으로 플러슁한다.
초기 스핀들형 세포는 위상차 현미경 검사에서 3일째에 나타나고, 이어서 배양물은 더욱 합류되어 단지 2일 이내에 70 내지 90% 합류에 도달한다. 세포를 PBS로 2회 세척하고, 37℃에서 2분 동안 2.5mL의 0.25% 트립신으로 소화시킨 다음, 트립신은 7.5mL의 완전 α-MEM 배지로 중화시킨다. 플레이트의 바닥은 피펫-원조를 사용하여 플러슁하고, 세포를 15mL 팔콘 튜브(Becton Dickinson)로 옮기고, 이를 5분 동안 800g에서 원심분리하고, 세포를 1:3의 분할비로 75cm2 세포 배양 플라스크(Corning Inc, Corning, NY, USA)에 재현탁시킨다.
계대는 1:3의 분할비로 4 내지 6일 마다 수행한다. 일반적으로, 계대 3의 세포는 적은 수의 대식세포와 혈액 세포를 함유하고, 계대 1 및 2의 것보다 적은 지방을 함유하고, 따라서 실험에 용이하게 이용 가능하다.
계대 3의 BM-MSC는 특성화에 사용된다. 간엽 줄기 세포 마커 CD44 및 CD90, 내피 세포 마커 CD31 및 조혈 마커 CD45는 유동 세포 계측법에 의해 검사된다.
인테그린 α10β1의 BM-MSC로의 렌티바이러스 형질도입
1일: 신선한 배지 중의 1.6 x 104 BM-MSC 세포를 96-웰 플레이트에서 각 작제물에 필요한 다수의 웰에 첨가한다. 각 렌티바이러스 작제물 및 대조군을 위한 이중 또는 삼중 웰을 사용해야 한다. 가습된 배양기에서 5 내지 7% CO2의 대기에서 37℃에서 18 내지 20시간 동안 배양한다.
2일: 배지를 웰에서 제거한다. 110μl 배지 및 헥사디메트린 브로마이드(최종 농도 8㎍/ml)를 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 완만하게 와동시켜 혼합한다. 2 내지 15㎕의 α10β1 또는 대조군 렌티바이러스 입자를 적합한 웰이 첨가한다. 플레이트를 완만하게 와동시켜 혼합한다. 가습된 배양기에서 5 내지 7% CO2의 대기에서 37℃에서 18 내지 20시간 동안 배양한다.
3일: 렌티바이러스 입자를 함유하는 배지를 웰로부터 제거한다. 새로운 배지를 각 웰에 120μl의 용적으로 첨가한다.
4일: 배지를 웰로부터 제거한다. 퓨로마이신을 함유하는 새로운 배지를 첨가한다.
5일 이후: 배지를 내성 콜로니가 동정될 수 있을 때까지 3 내지 4일 마다 신선한 퓨로마이신 함유 배지로 대체시킨다.
영구적인 중간 대뇌 동맥 폐색(pMCAO)
마우스의 pMCAO는, 예를 들어, 문헌[참조: Engel et al. (2011)]에 기재된 절차에 따라 외과적으로 생성된다.
α10β1 세포를 안정하게 과발현하는 상이한 수의 BM-MSC의 마우스 뇌의 뇌졸중 영역으로의 이식
마우스는 2.5x106, 5x106 또는 10x106 BM-MSC-α10 세포의 단일 용량을 투여한다. NSC-α10β1은 잔여 뇌졸중 용적을 둘러싸는 표적 부위를 정의하는 자기 공명 영상 정위 기법을 사용하여 이식한다.
결론: 결론적으로, 이 연구는 뇌졸중의 치료를 위한 BM-MSC-α10 발현 세포에 의한 대뇌 줄기 세포 이식이 일반적으로 안전하고 마우스에 의해 충분히 허용되고, 개선된 신경학적 기능을 초래함을 입증한다.
실시예 6: 뇌졸중 마우스 모델에서 인테그린 α10β1의 발현
뇌졸중 모델
절차는 C57BL/6 마우스(25-30g, Charles River, Germany)에서 수행했다. 요약하면, 광혈전증(PT)에 의한 영구적 국소 허혈 모델이 사용되었다. 수술 동안 체온은 37℃로 유지시켰다. 마우스를 이소플루란(자발적 환기하의 O2 중 2%)으로 마취시켰다. 감광성 로즈 벵갈 염료(10mg/ml, Sigma)를 꼬리 정맥에 정맥내 주사했다. 두개골 위의 피부를 절개했다. 뇌는 정위적으로 정의된 위치(브레그마에 대해 측면으로 1mm 및 전방/후방 +2/-2mm)에서 20분 동안 차거운 빛(Kl 1500 LCD, Schott) 및 그린 필터(510 nm)로 노출된 두개골을 통해 조명되었다. 대조군으로서, 마우스 뇌를 제거하고 동결시켰다.
뇌졸중에 반응하여, 인테그린 α10β1의 발현은 7일째까지 현저하게 증가했다(도 13). 공초점 분석은 뉴런 상의 NeuN 발현이 또한 뇌졸중 영역에서 증가되었고, 인테그린 α10β1 및 NeuN의 부분적 공편재화가 존재했음을 나타낸다(도 14b 및 c). 또한, 성숙한 성상 세포 상의 GFAP의 발현은 뇌졸중 영역에서 증가되었고(도 14e 및 f), 인테그린 α10β1과 함께 공편재되는 것으로 밝혀졌다. 소교세포 마커 Iba1도 또한 대조군 뇌 조직(도 14g)에서가 아니라 뇌졸중 영역(도 14h 및 i) 내에서 발견되었다. 그러나, 그것은 인테그린 α10β1과 함께 공편재되지 않았다. 이는, 인테그린 α10β1이 뇌졸중 후 뇌 조직을 재생시키는데 관련될 수 있는 세포 유형을 동정함을 시사한다.
결론: 뇌졸중에 대한 반응으로서, 인테그린 α10β1의 증가된 발현은 단독으로 또는 다른 마커(NeuN, GFAP 및 Iba1)와 함께 뇌졸중 영역을 결정하고, 뇌졸중 환자의 손상의 심각성 및 결과를 예측하는 바이오마커(biomarker)로서 사용될 수 있다.
참조문헌
Figure pct00004
Figure pct00005

Claims (83)

  1. 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파 10 하위단위(subunit)를 포함하는 마커의, 포유류 신경 줄기 세포 및 포유류 신경 전구 세포용 마커로서의 용도.
  2. 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 동정하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 신경 조직을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
    b) 단계 a)의 샘플에 포함된 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
    c) 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록(scoring)하는 단계 및
    d) 단계 c)의 기록에 따라 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 단리시키는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 신경 조직을 포함하는 샘플을 제공하는 단계,
    b) 단계 a)의 샘플에 포함된 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
    c) 단계 b)의 인테그린 알파10 하위단위 발현을 기록하는 단계 및
    d) 단계 c)의 기록에 따라 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파 10 하위단위가 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 세포 표면에서 발현되는, 방법 또는 용도.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파 10 하위단위가 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에서 세포내로 발현되는, 방법 또는 용도.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파10이 인테그린 베타1 하위단위와 함께 이종이량체(heterodimer)로서 발현되는, 방법 또는 용도.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플을 단계 b)의 검출 이전에 인테그린 알파10 하위단위에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법 또는 용도.
  8. 제1항 내제 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 네스틴, PSA-NCAM, GFAP, PDFGRα, SOX-2, CD133 (프로미닌-1), CD15, CD24, 무사시(Musashi), EGFR, 더블코르틴 (DCX), Pax6, FABP7, LeX, 비멘틴 및 GLAST로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 마커의 발현을 검출하는 단계를 추가로 포함하는, 방법 또는 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 시험관내에서 수행되는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직이 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직이 뇌 조직으로부터 수득되거나 유래되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직이 성인 뇌 조직인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직이 태아 뇌 조직인, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직이 뇌실하 영역(SVZ) 또는 과립하 영역(SGZ) 또는 뇌막으로부터 유래되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 조직이 인간, 개과, 말, 소, 고양이과, 뮤린(murine), 양(ovine) 또는 돼지 신경 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출 단계가 유동 세포 계측법(flow cytometry)에 의해 결정되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출 단계가 인테그린 알파10 단백질 발현을 측정함으로써 결정되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출 단계가 인테그린 알파10 mRNA 발현을 측정함으로써 결정되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 검출 단계가 면역검정, 면역침전, 유동 세포 계측법, 면역형광및 웨스턴 블롯으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 방법에 의해 결정되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의한 인테그린 알파10 하위단위의 발현 검출용으로 사용된 항체가 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메라 항체, 단일 쇄 항체 또는 이의 단편인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 모노클로날 항체인, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 비인간 항체(non-human antibody), 키메라 항체, 이중특이적 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 검출가능한 잔기(moiety), 예를 들어, 형광단, 효소 또는 방사성 추적자(radioactive tracer) 또는 방사성 동위원소로 이루어진 그룹으로부터 선택된 검출가능한 잔기에 공유 결합된, 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 IgA, IgD, IgG 및 IgM으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 동형(isotype)을 갖는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가
    a) 수탁 번호 DSM ACC2583하에 Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생성된 모노클로날 항체; 또는
    b) 수탁 번호 DSM ACC2583하에 Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH에 기탁된 하이브리도마에 의해 생성된 모노클로날 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 대한 결합에 대해 경쟁하는 항체; 또는
    c) a) 또는 b)의 단편이고, 상기 단편이 인테그린 알파 10 하위단위 쇄의 세포외 I-도메인에 특이적으로 결합할 수 있는, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 고체 지지체에 부착되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 하나 이상의 형광단(들)으로 표지되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형광단이 피코에리트린, 알로피코시아닌, 플루오레세인, 텍사스 레드(Texas red), 또는 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647, 브릴리언트 염료(brilliant dye)인, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 검출에 적합한 잔기를 추가로 포함하는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 검출에 적합한 상기 잔기가 나노입자 및 방사성 동위원소로부터 선택되는, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노입자가 미셀(micelle), 비탄성 쉘(inelastic shell), 나노관형 입자, 리포솜, 금 나노입자 및 중합체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방사성 동위원소가 베타-방출체(beta-emitter), 오거-방출체(auger-emitter), 전환 전자-방출체, 알파-방출체 및 저광자 에너지 방출체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 잔기가 상자성 동위원소를 포함하거나 이로 이루어지는, 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 상자성 동위원소가 157Gd, 55Mn, 162Dy, 52Cr 및 56Fe로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출가능한 잔기가 SPECT, PET, MRI, 광학 또는 초음파 이미징(imaging)과 같은 이미징 기술에 의해 검출가능한, 방법.
  36. 시험 화합물이 시험관내에서 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포 분화를 조절하는지의 여부를 결정하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 인테그린 알파10 하위단위를 발현시키거나 발현하는 능력을 갖는 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 제공하는 단계,
    b) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 시험 화합물과 접촉시키는 단계 및
    c) 시험 화합물이 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포 분화를 조절하는지의 지표로서 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 분화 속도 또는 패턴의 변화를 검출하는 단계를 포함하고,
    상기 분화 속도 또는 패턴이 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 따르는 세포에 의한 인테그린 알파10 발현을 검출함으로써 결정되는, 방법.
  37. 참조 집단에 비해 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한 시험관내 포유류 세포의 단리된 집단을 제조하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는 세포 집단의 적어도 일부, 또는 참조 집단의 일부를 제공하는 단계,
    b) 상기 단계 a)의 세포 집단에 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 하위단위를 동정하는 화합물을 도입하는 단계,
    c) 상기 단계 b)의 세포 집단으로부터 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 선택하고 단리시키거나, 단리시키고 선택하거나, 단리시키거나, 또는 선택함으로써 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한 세포 집단을 생성하는 단계를 포함하는, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포 및/또는 상기 신경 전구 세포가 제2항 내지 제35항 중 어느 한 항에 정의된 방법에 의해 동정되고/되거나 단리되는, 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 단계 c)에서의 상기 선택이 형광 세포 분류 또는 자기 비드 분류(magnetic bead sorting)에 의해 수행되는, 방법.
  40. 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 미분화된 포유류 세포의 시험관내 세포 배양물로서, 상기 세포가 신경 조직으로부터 유래되고,
    a) 상기 배양물 중 세포가 혈청 및 (b)에서 정의된 바와 같은 증식 유도 성장 인자 둘 다를 실질적으로 함유하지 않는 배양 배지에서 분화되어 적어도 10% 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포의 세포 배양물을 생성할 때 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포로 분화되는 능력을 갖고;
    b) 상기 세포 배양물이 혈청 대체물, 예를 들어, B27 및 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 나뉘고;
    c) 상기 배양물 중 세포가 혈청 대체물 및 증식 유도 성장 인자 둘 다의 회수시 뉴런 및/또는 희소돌기아교세포 및/또는 성상 세포로 분화되는, 시험관내 세포 배양물.
  41. 시험관내 세포 배양물로서,
    a) 혈청 대체물, 예를 들어, B27 및 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지; 및
    b) 포유동물의 중추 신경계로부터 유도된 미분화된 포유류 세포를 포함하고, 상기 세포의 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 시험관내 세포 배양물.
  42. 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 미분화 세포의 현탁 배양물로서, 상기 세포가 실질적으로 세포 응집체로 형성되고, 상기 세포 응집체가 증식 유도 성장 인자를 함유하는 배양 배지에서 유지되는, 현탁 배양물.
  43. 제3항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따르는 방법에 의해 수득가능한 세포 배양물.
  44. 제40항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파10이 인테그린 베타1 쇄와 함께 이종이량체로서 발현되는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  45. 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파 10 하위단위가 미분화된 포유류 세포의 세포 표면에서 발현되는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  46. 제40항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파 10 하위단위가 미분화된 포유류 세포에서 세포내로 발현되는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  47. 제40항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%의 미분화된 포유류 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포인, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  48. 제40항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 미분화된 포유류 세포가 신경 줄기 세포 또는 신경 전구 세포인, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  49. 제40항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중 세포의 일부가 네스틴, PSA-NCAM, GFAP, SOX2, PDGFRα, CD133, CD15, CD24, 무사시, EGFR, 더블코르틴(DCX), Pax6, FABP7 및 GLAST로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 마커를 추가로 발현하는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  50. 제40항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 증식 유도 성장 인자가 표피 성장 인자(EGF), 섬유아세포 성장 인자-2 (FGF-2), 형질전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 백혈병 억제 인자(LIF), 섬모 향신경성 인자(CNTF), 뇌 유도 향신경성 인자(BDNF), PDGFα 또는 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  51. 제40항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중 세포가 포유류 뇌의 뇌실하 영역(SVZ) 또는 과립하 영역(SGZ) 또는 뇌막으로부터 수득되거나 유래되는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  52. 제40항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중 세포가 뮤린인, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  53. 제40항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중 세포가 인간인, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  54. 제40항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중 세포가 인간 태아 또는 인간 성인 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포로부터 유래되는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  55. 제40항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배양물 중 세포가 인간 배아 세포 또는 인간 배아로부터 유래되지 않는, 세포 배양물 또는 현탁 배양물.
  56. 이를 필요로 하는 대상체에서 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
    b) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 중추 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 단계를 포함하는, 방법.
  57. 이를 필요로 하는 대상체에서 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
    b) 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 정신 증상을 갖는 신경 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 이를 필요로 하는 대상체에서 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 포유류 간엽(mesenchymal) 줄기 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
    b) 포유류 간엽 줄기 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 중추 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 중추 신경계의 손상으로부터 예방하고 보호하는 단계를 포함하는, 방법.
  59. 이를 필요로 하는 대상체에서 정신 또는 행동 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이
    a) 포유류 간엽 줄기 세포의 농축된 집단을 포함하는 조성물을 제공하는 단계로서, 상기 세포가 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는, 단계;
    b) 포유류 간엽 줄기 세포의 단리된 집단의 치료적 유효량을 대상체에게 투여함으로써 정신 증상을 갖는 신경 장애를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 포유류 간엽 줄기 세포가 골수 또는 지방 조직 또는 제대혈 또는 와튼 젤리(Wharton's jelly) 또는 치과용 펄프 또는 코드 조직(cord tissue) 또는 혈액 또는 양수 또는 양막 또는 자궁내막 또는 사지 또는 타액선 또는 피부 또는 포피 또는 활막으로부터 단리되는, 방법.
  61. 이를 필요로 하는 환자에서 CNS의 손상되거나 병에 걸린 영역의 특징을 결정하기 위한 시험관내 방법으로서, 상기 방법이
    a) 항-인테그린 알파 10 하위단위를 대상체에게 투여하는 단계,
    b) 상기 대상체의 CNS의 손상되거나 병에 걸린 영역에서 인테그린 알파10 하위단위의 발현을 검출하는 단계,
    c) 상기 CNS의 손상되거나 병에 걸린 영역의 위치 및 크기와 같은 특성을 결정하는 단계를 포함하는, 시험관내 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 신경 조직이 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포를 포함하는, 방법.
  63. 제61항에 있어서, 상기 특성이 뇌졸중 후 CNS 조직의 재생 정도를 예측하는데 사용되는, 방법.
  64. 제61항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린 알파10 하위단위의 발현의 높은 값이 수정된 랜킨 척도(modified Rankin Scale; mRS)의 낮은 값에 상응하는, 방법.
  65. 제61항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파10 하위단위가 바이오마커 패널(biomarker panel)에 사용되는, 방법.
  66. 신경계의 질환 또는 손상을 치료하고/하거나 신경계의 손상을 예방하고 보호하고/하거나 정신 및 행동 장애를 치료하거나, 질환 또는 손상을 진단하고/하거나 특성화하는 방법에 사용하기 위한, 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에 의해 발현된 인테그린 알파10 쇄 하위단위를 포함하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 마커.
  67. 신경계의 질환 또는 손상 및/또는 정신 및 행동 장애를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 포유류 신경 전구 세포의 단리된 집단을 포함하는 조성물.
  68. 제56항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파10이 인테그린 베타1 쇄와 함께 이종이량체로서 발현되는, 방법, 마커 또는 조성물.
  69. 제56항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파10 하위단위가 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포의 세포 표면에서 발현되는, 방법, 마커 또는 조성물.
  70. 제56항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인테그린 알파10 하위단위가 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포에서 세포내로 발현되는, 방법, 마커 또는 조성물.
  71. 제56항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 집단이 인테그린 알파10 하위단위를 발현하는 포유류 신경 줄기 세포 및/또는 신경 전구 세포가 풍부한, 방법, 마커 또는 조성물.
  72. 제56항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경계의 질환 또는 손상이 중추 또는 말초 신경계의 손상 또는 신경퇴행성 질환인, 방법, 마커 또는 조성물.
  73. 제56항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경계의 손상이 척수 손상(SCI), 외상성 뇌 손상(TBI), 말초 신경 손상, 뇌졸중 및 뇌암으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법, 마커 또는 조성물.
  74. 제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경계의 손상이 뇌졸중인, 방법, 마커 또는 조성물.
  75. 제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경퇴행성 질환이 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측삭 경화증(ALS), 헌팅톤병(HD), 다발성 경화증(MS) 및 다중 계 위축증(multiple system atrophy)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법, 마커 또는 조성물.
  76. 제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 정신 또는 행동 장애가 레트 증후군(Rett syndrome), 정신분열증, 우울증, 자폐증 스펙트럼 장애(ASD) 및 양극성 장애(BPD)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  77. 제56항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포가 제2항 내지 제55항 중 어느 한 항에 정의된 방법을 사용하여 단리되거나, 상기 신경 줄기 세포가 제2항 내지 제55항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  78. 제1항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포가 동종 신경 줄기 세포인, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  79. 제1항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 줄기 세포가 자가 신경 줄기 세포인, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  80. 제1항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 전구 세포가 동종 신경 전구 세포인, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  81. 제1항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 신경 전구 세포가 자가 신경 전구 세포인, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  82. 제1항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽 줄기 세포가 동종 간엽 줄기 세포인, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
  83. 제1항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간엽 줄기 세포가 자가 간엽 줄기 세포인, 방법, 사용용 마커 또는 조성물.
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