WO2010112662A1 - Células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio - Google Patents

Células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio Download PDF

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WO2010112662A1
WO2010112662A1 PCT/ES2010/070205 ES2010070205W WO2010112662A1 WO 2010112662 A1 WO2010112662 A1 WO 2010112662A1 ES 2010070205 W ES2010070205 W ES 2010070205W WO 2010112662 A1 WO2010112662 A1 WO 2010112662A1
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WO
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cell
cells
multipotent stem
stroma
stem cells
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PCT/ES2010/070205
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English (en)
French (fr)
Inventor
Miguel MARTÍN HERNÁNDEZ
María Del Mar ROLDÁN ORTÍZ
Francisco TINAHONES MADUEÑO
Anton Guimera
Raúl MARTÍN HERRANZ
Original Assignee
Fundación Instituto Mediterraneo Para La Biotecnología Y La Investigación Sanitaria (Imabis)
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Publication date
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells

Definitions

  • the present invention falls within the field of biomedicine and refers to multipotent stem cells derived from mesentery stroma, and, preferably, from omentom stroma, capable of differentiating and giving rise to cells with specialized cell characteristics, and methods of obtaining them.
  • Said cells can be used in the preparation of drugs and pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases, as well as in
  • the stem cells can be a potential source of virtually unlimited amounts of cells, both undifferentiated and differentiated, for the performance of in vitro assays aimed at the search and development of new therapeutic compounds (US Patent 6,294,346), thus as to determine its activity, metabolism and toxicity.
  • ES cells embryonic stem cells
  • adult stem cells Depending on the origin of the stem cells, we can differentiate between embryonic stem cells (ES cells) and adult stem cells.
  • the ES cells come from the internal cell mass of the blastocysts and have as their main characteristic the fact that they are pluripotential, which means that they can give rise to any adult tissue derived from the three embryonic layers (Evans and Kaufman, 1981; Thomson et al., 1998; US Patent 6,200,806).
  • Adult stem cells are partially compromised cells present in adult tissues, which can remain decades in the human body, although over time they begin to be scarce (Fuchs and Segre, 2002).
  • ES cells derived from ES cells are normally the object of rejection by the immune system while adult stem cells are not rejected by the immune system if they have been obtained by autologous transplantation or heterologous transplantation of immunocompatible cells. Furthermore, the fact that they are partially compromised reduces the number of differentiation stages necessary to generate specialized cells. On the other hand, the use of this type of cells is not associated with any type of ethical or legal controversy. Finally, although this type of cells has a lower potential for differentiation than ES cells, most of them are really multipotent (Joshi and Enver, 2002), which means that they can be differentiated to more than one type of tissue.
  • bone marrow extraction is a very invasive clinical procedure, normally limited to patients with different hematological pathologies and of which the amount of cellular material obtained is very limited.
  • multipotent stem cells proliferate in vitro and it is possible to maintain them during a high number of culture passes, which is It is possible to expand its culture to obtain a high cell quantity, however, for use in replacement therapies, cells that have been maintained during a high number of culture passes should not be used, fundamentally to minimize risks of cell transformation and loss of capacity of differentiation. Therefore, it is important to find other tissues that provide a larger initial amount of multipotent stem cells, such as adipose tissue.
  • multipotent stem cells are the raw material with the greatest potential for success for use in cell replacement therapies.
  • they constitute a source of undifferentiated and differentiated cells of great utility for the performance of in vitro assays aimed at the development of therapeutic compounds.
  • the present invention relates to multipotent stem cells derived from mesentery stroma, and preferably epiploon stroma, with the ability to differentiate and give rise to cells with specialized cell characteristics, and methods of obtaining them.
  • Said cells can be used in the preparation of drugs and pharmaceutical compositions for the prevention or treatment of injuries, diseases degenerative or genetic, as well as in the evaluation of the cellular response to biological or pharmacological agents.
  • the inventors have obtained multipotent stem cell lines derived from the mesentery stroma, and specifically, from human omentum stroma. These cell lines have the capacity to be expanded for long periods of culture and have a high cellular plasticity, so they can be used in cell therapy of lesions, degenerative or genetic diseases, with the technical advantages of multipotent adult stem cells, such as the simplification of the protocol for the induction of its differentiation or the reduction of the possibility of immunological rejection in the transplant. Moreover, these cell lines can be used for the development of pharmacological, toxicological, pharmacogenomic or genetic studies.
  • a first aspect of the invention refers to an isolated multipotent stem cell derived from mammalian mesentery stroma, from now on, "multipotent stem cell of the invention", characterized by:
  • a) be positive for the following surface antigens: CD105,
  • CD90, CD73, CD29, CD49d and CD49a be negative for the following surface antigens: CD45, CD34, CD14 and HLA DR.
  • the mesentery is a term in animal anatomy, including humans, that designates a serous membrane that constitutes a flat fold of the peritoneum, mainly of connective tissue, that contains numerous blood and lymphatic vessels destined for the abdominal viscera, and that joins the stomach and intestine with the back walls of the abdomen, thus giving positioning to these digestive organs.
  • a large number of fat cells accumulates.
  • Mententens include: the mesentery, itself, that involves certain regions of the small intestine (such as, for example, the jejunum and the lion), the mesocolon, which involves certain regions of the colon (such as, for example, the mesoappendix) , which envelops the vermiform appendix; the transverse mesocolon, which retains the transverse colon; or the sigmoid mesocolon, which envelops the sigmoid colon); the broad ligament of the uterus, which envelops the uterus; and the omentum or omentum, which is a specific withdrawal of the peritoneum (which is divided into two parts: the major or gastrocolic omentum, and the minor or gastrohepatic omentum).
  • the greater or gastrocolic omentum covers the greater curvature of the stomach and joins it with the spleen and the transverse colon and continues as an apron located on the anterior aspect of the intestine. It is the place of accumulation of adipose tissue in obese people.
  • the specific peritonean junction of the greater curvature of the stomach with the spleen is also called the gastroesplenic omentum. From the spleen there is also a fold that joins with the tail of the pancreas, called the pancreatic-splenic omentum.
  • the lesser or gastrohepatic omentum covers the left edge of the liver joining it with the right edge of the stomach, duodenum and the lesser curvature of the stomach.
  • the multipotent stem cell of the invention is derived from mammalian omentum. In a more preferred embodiment, the multipotent stem cell of the invention comes from a primate and, in an even more preferred embodiment, comes from a human.
  • Stem cells can be classified according to their differentiation potential: totipotential stem cells are capable of producing embryonic and extra-embryonic tissue; pluripotential stem cells have the ability to differentiate into tissues from any of the three embryonic layers and, finally, multipotential stem cells, capable of differentiating into different cell types from the same embryonic layer (Weissman et al. Annu Rev CeII Dev Biol 2001; 17: 387-403). Therefore, the term “multipotential stem cell” or “stem cells multipotential ", as used in the present description, refers to cells capable of differentiating into different cell types from the same embryonic layer.
  • Another aspect of the invention relates to an isolated cell population constituted by, or comprising, multipotent stem cells derived from mammalian mesentery stroma ("multipotent stem cells of the invention”), characterized by:
  • a) be positive for the following surface antigens: CD105,
  • CD90, CD73, CD29, CD49d and CD49a be negative for the following surface antigens: CD45, CD34, CD14 and HLA DR.
  • this cell population is constituted by, or comprises, multipotent stem cells derived from mammalian omentom stroma.
  • this cell population constituted by, or comprising, multipotent stromal stem cells derived from a primate and, more preferably, from a human.
  • the multipotent stem cell of the invention can be characterized by the identification of surface and / or intracellular proteins, genes, and / or other indicative markers of his undifferentiated state.
  • the population of multipotent stem cells is characterized by immunocytometry.
  • Other methods that can be used for characterization include, but are not limited to: immunocytochemical analysis, northern blot analysis, RT-PCR, microarray gene expression analysis, proteomic studies or differential display analysis.
  • Multipotent stromal stem cells can be induced to differentiate in vitro to give rise to cells that express at least one characteristic of a specialized cell.
  • Such partially or totally differentiated cell types include, but are not limited to cell lines of the following tissues and organs: cartilage, bone, fat, muscle, nerve tissue, skin, liver or pancreas, for example, chondrocytes, osteocytes, adipocytes, myocytes, cardiomyocytes, neurons, astrocytes, oligodendrocytes, keratinocytes, hepatocytes or pancreatic cells.
  • Another aspect of the present invention refers to a differentiated isolated cell from the multipotent stem cell of the invention characterized in that it expresses at least one characteristic of a specialized cell.
  • the differentiated cell from the multipotent stem cell of the invention expresses at least one characteristic of a specialized cell selected from the list comprising: chondrocyte, osteocyte, adipocyte, myocyte, cardiomyocyte, neuron, astrocyte, oligodendrocyte, keratinocyte, hepatocyte or pancreatic cell.
  • the differentiated cell from the multipotent stem cell of the invention expresses at least one characteristic of a specialized cell selected from the list comprising: chondrocyte, osteocyte or adipocyte.
  • Another aspect of the invention refers to a differentiated isolated cell population from the multipotent stem cell of the invention, or from an isolated cell population constituted by, or comprising, the multipotent stem cells of the invention, characterized in that it expresses, at least, a characteristic of a specialized cell.
  • this differentiated cell population is characterized in that it expresses, at least, a characteristic characteristic of a specialized cell of the list comprising: chondrocyte, osteocyte, adipocyte, myocyte, cardiomyocyte, neuron, astrocyte, oligodendrocyte, keratinocyte, hepatocyte or pancreatic cell.
  • this differentiated cell population is characterized in that it expresses, at least, a characteristic characteristic of a specialized cell of the list comprising: chondrocyte, osteocyte or adipocyte.
  • differentiated cell or “differentiated cell population” refer to the isolated cell or to the isolated cell population obtained by culturing the cell or the multipotent stem cells of the invention under conditions that favor the induction of their differentiation to specialized cells, and that as a consequence, they express at least one characteristic of a specialized cell.
  • the differentiated cell or the differentiated cell population can be characterized by the identification of surface and / or intracellular proteins, genes, and / or other markers indicative of differentiation of the stem cells of the present invention to various lineages.
  • Methods used for characterization include, but are not limited to: immunocytometry, immunocytochemical analysis, northern blot analysis, RT-PCR, gene expression analysis in microarrays, proteomic studies or differential display analysis.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the cells or cell populations described above in this document.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the cells or cell populations described above in this document for use in somatic cell therapy.
  • Somatic cell therapy means the use of live somatic cells, both autologous (from the patient itself), as allogeneic (from another human being) or xenogeneic (from animals), whose biological characteristics they have been substantially altered as a result of their manipulation, to obtain a therapeutic, diagnostic or preventive effect, by metabolic, pharmacological or immunological means.
  • somatic cell therapy drugs are, for example, but not limited to: cells manipulated to modify their immunological, metabolic or other functional properties in qualitative or quantitative aspects; classified cells, selected and manipulated, which are subsequently subjected to a manufacturing process in order to obtain the finished product; cells manipulated and combined with non-cellular components (for example, matrices or biological or inert medical devices) that exert the intended action in principle on the finished product; autologous cell derivatives expressed ex vivo (in vitro) under specific culture conditions; or cells genetically modified or subjected to another type of manipulation to express homologous or non-homologous functional properties previously not expressed.
  • non-cellular components for example, matrices or biological or inert medical devices
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the cells or cell populations described above in this document for use in the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage, bone, muscle, heart, central or peripheral nervous system, skin, liver or pancreas.
  • a preferred embodiment of this aspect of the present invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cells or cell populations described above in this document for use in the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage or bone.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the cells or cell populations described above in this document for use in somatic cell therapy for the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage, bone, muscle, heart, central or peripheral nervous system, skin, liver or pancreas.
  • a preferred embodiment of this aspect of the present invention refers to a pharmaceutical composition comprising the cells or cell populations described above in this document for use in somatic cell therapy for the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage or bone.
  • the pharmaceutical composition comprises any of the cells or cell populations described above in this document, and also a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Another aspect of the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising any of the cells or cell populations described above in this document, and, in addition, together with a pharmaceutically acceptable carrier, another active ingredient.
  • active substance means any component that potentially provides a pharmacological activity or other different effect on the diagnosis, cure, mitigation, treatment, or prevention of a disease, or that affects the structure or function of the body of man or other animals.
  • compositions of the present invention can be formulated for administration in a variety of ways known in the state of the art.
  • compositions and / or their formulations can be administered to an animal, including a mammal and, therefore, to man, in a variety of ways, including, but not limited to, parenteral, intraperitoneal, intravenous, intradermal, epidural, intraspinal, intrastromal. , intraarticular, intrasynovial, intrathecal, intralesional, intraarterial, intracardiac, intramuscular, intranasal, intracranial, subcutaneous, intraorbital, intracapsular, topical, through transdermal patches, rectally, vaginally or urethrally, by administering a suppository, percutaneous, nasal spray, surgical implant, internal surgical paint, infusion pump or catheter.
  • the dosage to obtain a therapeutically effective amount depends on a variety of factors, such as, for example, the age, weight, sex or tolerance of the mammal.
  • therapeutically effective amount refers to the amount of the pharmaceutical composition of the invention that produces the desired effect and, in general, will be determined, among other causes, by the characteristics of said pharmaceutical composition and the therapeutic effect to be achieved.
  • pharmaceutically acceptable vehicles that can be used in said compositions are the vehicles known in the state of the art.
  • compositions of the present invention can be used in a treatment method in isolation or in conjunction with other pharmaceutical compounds.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of any of the cells or isolated cell populations described above in this document for the preparation of a medicament.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of any of the cells or cell populations described above in this document for the preparation of a somatic cell therapy drug.
  • Another aspect of the present invention refers to the use of any of the cells or cell populations described above in this document for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage, bone, muscle, heart, central or peripheral nervous system, skin, liver or pancreas.
  • a preferred embodiment of this aspect of the present invention refers to the use of any of the cells or cell populations described above in this document for the preparation of a medicament for the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage or bone
  • Another aspect of the present invention refers to the use of any of the cells or cell populations described above in this document for the preparation of a somatic cell therapy drug for the prevention or treatment of lesions, degenerative or genetic diseases of: cartilage, bone, muscle, heart, central or peripheral nervous system, skin, liver or pancreas.
  • a preferred embodiment of this aspect of the present invention refers to the use of any of the cells or cell populations described above in this document for the preparation of a somatic cell therapy drug for the prevention or treatment of lesions, degenerative diseases or genetic of: cartilage or bone.
  • any of the cells or cell populations described above in this document may be applied to the development of in vitro and in vivo assays for the following industrial purposes: drug search, pharmacological studies, toxicological studies, pharmacogenomic studies and / or genetic studies. Such tests can be used for the identification and / or characterization of a multitude of biological targets, bioactive compounds and / or pharmacological agents.
  • the multipotent stem cell of the invention provides a unique system in which this cell or these cells can be differentiated to give rise to specific lineages of the same individual .
  • the multipotent stem cell of the invention, or the constituted cell population by, or comprising, the multipotent stem cells of the invention provide a source of cells in culture from a potential variety of genetically diverse individuals that can respond differently to various biological and pharmacological agents. By comparing the responses of cells from a statistically significant population of individuals, the effects of the biological or pharmacological agents tested on the specific cell type can be determined.
  • the multipotent stem cells of the invention can be maintained in culture and in this way can be studied as time goes by. Therefore, multiple cell cultures from a single or different individuals can be treated with the agent of interest to determine if there are differences in the effect that said agent has on certain types of cells with the same genetic profile or, alternatively, in similar cell types from genetically distinct individuals.
  • any of the cells or cell populations described hereinbefore in a high-throughput screening system allows a wide range of biological and / or pharmacological agents to be analyzed, as well as combinatorial libraries thereof. , in an effective way, to thereby elucidate its effects on human cells.
  • agents include, but are not limited to: peptides, antibodies, cytokines, chemokines, growth factors, hormones, viral particles, antibiotics, inhibitory compounds, chemotherapeutic agents, cytotoxic agents, mutagens, food additives, pharmaceutical compositions or vaccine preparations.
  • a preferred embodiment of said method for evaluating in vitro the cellular response to biological or pharmacological agents, or combinatorial libraries of said agents comprises the following: a) isolating the cells provided by the present invention from an individual or a population statistically significant of individuals; b) optionally differentiate isolated cells to a specific cell type; c) expand the cells in culture; d) optionally differentiate expanded cells to a specific cell type; e) contacting the culture with one or more biological or pharmacological agents or with a combinatorial library of said agents; and f) evaluate the possible biological effects of said agents on the culture cells.
  • said biological or pharmacological agent is selected from the list comprising peptides, antibodies, cytokines, chemokines, growth factors, viral particles, hormones, antibiotics, inhibitory compounds, chemotherapeutic agents, cytotoxic agents , mutagens, food additives, pharmaceutical compositions or vaccine preparations.
  • the present invention also provides methods of obtaining the isolated cells or cell populations described hereinbefore.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of obtaining an isolated multipotent stem cell of the invention, or an isolated cell population consisting of, or comprising, multipotent stem cells, characterized in that it comprises the following steps:
  • the biological sample isolated from the mesentery is from the mammalian omentum.
  • the multipotent stem cell, or the isolated cell population constituted by, or comprising, multipotent stem cells of the invention obtained by this method comes from a primate and, more preferably, from a human.
  • Open abdominal surgery is a surgical technique that allows the abdominal cavity to be left open temporarily, using various procedures known in the state of the art, to facilitate access to the abdomen;
  • the advantage of this type of surgical intervention is that the accessibility to the tissue is complete and therefore an isolated biological sample of mesentery and, preferably, of greater omentum can be obtained.
  • Laparoscopic surgery is a surgical technique that is performed through small incisions, using the assistance of a video camera that allows the medical team to see the surgical field within the patient and act on it;
  • the advantage of this type of surgical intervention is that it is minimally invasive and allows a faster and more comfortable post-operative period.
  • multipotent stem cells derived from mesentery stroma and, preferably, from omentum can be performed by different procedures described in the state of the art, and which can include, for example, but not limited to, mechanical processing, enzymatic treatment (for example, but not limited, with a collagenase), centrifugation, erythrocyte lysis, filtration, plastic culture without any other support or extracellular matrix, culture in media that favor the proliferation of these cells or immunocytometry.
  • Example 1 of the patent The multipotent stem cell of the invention, or the isolated cell population constituted by, or comprising, multipotent stem cells of the invention, obtained by the method described above can be characterized to identify intracellular and / or surface proteins, genes, and / or other markers indicating their undifferentiated state by methods widely known in the state of the art.
  • the population of multipotent stem cells derived from stroma obtained by this method is characterized by immunocytometry.
  • Other methods that can be used for characterization include, but are not limited to: immunocytochemical analysis, northern blot analysis, RT-PCR, microarray gene expression analysis, proteomic studies or differential display analysis.
  • the multipotent stem cell of the invention or the isolated cell population constituted by, or comprising, multipotent stem cells of the invention, obtained by the method described above, is characterized by:
  • a) be positive for the following surface antigens: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d and CD49a.
  • b) be negative for the following surface antigens: CD45, CD34, CDH and HLA DR.
  • Another aspect of the present invention refers to a method of obtaining a differentiated cell or a differentiated isolated cell population from the multipotent stem cell of the invention, or from the population constituted by, or comprising, stem cells multipotent of the invention, characterized in that it comprises the following steps:
  • a) obtain an isolated biological sample of mesentery; b) select the multipotent stem cells derived from stroma from the biological sample obtained in (a); Y c) cultivate the multipotent stem cells of (b) under conditions that favor the induction of their differentiation to specialized cells.
  • the differentiated cell or the differentiated cell population obtained by the method described above can be characterized by the identification of surface and / or intracellular proteins, genes, and / or other markers indicative of differentiation of the stem cells of the present invention to various lineages .
  • Methods used for characterization include, but are not limited to: immunocytometry, immunocytochemical analysis, northern blot analysis, RT-PCR, gene expression analysis in microarrays, proteomic studies or differential display analysis. Some of them are explained in Example 2 of the patent.
  • Figure 1 Shows the adipogenic capacity of the derived cell lines obtained from the omentum stroma.
  • several cell lines derived from human epiploon stroma were grown for 21 days in an adipocyte differentiation induction culture medium (Poietics, Lonza), following the recommended protocol.
  • the cells were stained with OiI Red O
  • Figure 2 Shows the study of the osteogenic capacity of the derived cell lines obtained from the omentum stroma.
  • several cell lines derived from human epiploon stroma were cultured for 21 days in an osteogenic differentiation induction culture medium (Poietics, Lonza). To check the degree of differentiation the cells were stained with Alizarin Red (SIGMA).
  • SIGMA Alizarin Red
  • A Negative control. Cells not treated with osteogenic differentiation medium.
  • B Positive cells for staining with Alizarin Red of the extracellular calcium matrix generated as a result of osteogenic differentiation.
  • Figure 3 Shows the study of the chondrogenic capacity of the derived cell lines obtained from the omentum stroma.
  • several cell lines derived from human epiploon stroma were cultured for 21 days by means of the cell differentiation technique in micromassage (Poietics, Lonza).
  • SIGMA Alcian Blue 8G
  • A Negative control of untreated cells with the chondrogenic differentiation culture medium.
  • B Alcian stained cells Blue forming structures and with typical cartilaginous morphology.
  • C Magnification (2Ox) of the image of panel B.
  • EXAMPLE 1 Obtaining, derivation, expansion and characterization of multipotent stem cell lines from human omentom stroma:
  • omentum as a source of multipotent stem cells derived from stroma: For the realization of the present invention both omentum derived from healthy-thin donors and patients with morbid obesity are used. The omentum is obtained both by surgical interventions through laparoscopy, as bariatric surgery interventions to morbidly obese, where the amount of accessible tissue is very high.
  • Derivation of multipotent stem cell lines derived from human omentum stroma The omentum is processed immediately after obtaining the tissue sample. To ensure maximum guarantee, performance and reproducibility in the process of derivation of multipotent stem cells, the entire procedure of derivation and initiation of cell culture has been optimized to complete it within three hours after obtaining the tissue. The omentum is divided into smaller portions, to facilitate the isolation of the vascular fraction from the stroma of the tissue, which is the cellular source where multipotent stem cells reside. The fabric is washed several times with equal volumes of HBSS + 2% P / S ⁇ Hank ' s Balancee! Saline Solution + 2% Penicillin / Streptomycin) (GIBCO).
  • collagenase I a solution of 0.075% collagenase I (GIBCO) to digest the extracellular matrix and release of the same tissue stroma.
  • the stroma pellet of adipose tissue is resuspended in erythrocyte lysis buffer (BD Biosciences) and incubated at room temperature for 10 minutes.
  • the cell suspension is filtered through a 100 micron nylon mesh to remove cell debris and centrifuged again at 1200 rpm for 5 minutes. Finally, the cell pellet is directly resuspended in the initial culture medium of multipotent stem cell expansion: DMEM F12 + 10% FBS + 1% antibiotic / antifungal.
  • the cells are seeded in culture flasks and incubated for 16-18 hours at 37 0 C in the incubator at 5% CO2 in a humid atmosphere. After incubation the cells are washed several times with PBS (Phosphate Buffered Saline) (GIBCO) to remove residual non-adherent blood cells. The cells will be maintained in the initial culture medium for expansion to promote the selection and homogenization of the cultures for the mesenchymal lineage.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Expansion of multipotent stem cell lines derived from human epiploon stroma The working protocol is optimized to guarantee the obtaining of homogeneous cultures of multipotent stem cells derived from human epiploon stroma.
  • the expansion procedure has been designed taking advantage of the characteristics of multipotent stem cells, currently described by the ISCT (International Society for Cellular Therapy).
  • Multipotent stem cells exhibit adhesion to the culture plastic and are capable of proliferating undifferentiated without the need for any other extracellular support or matrix, unlike other cell lineages present in the stroma of adipose tissue, therefore these characteristics allow to initiate a selective culture to enhance the growth and generation of homogeneous lines of multipotent stem cells.
  • the mesenchymal expansion medium has a formulation composed of different growth factors and serum free (Mesempro, GIBCO). Under these culture conditions the derived cell lines can be kept in constant proliferation by a very high number of culture passes.
  • the derived cell lines show the typical mesenchymal morphology.
  • the cells are regularly subjected to an immunophenotypic analysis to confirm that they comply with the antigen expression panels described by the ISCT (Dominici et al., Cytotherapy 2007).
  • adipogenic, osteogenic and chondrogenic cell differentiation tests are performed to corroborate the multipotent nature of these cells.

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Abstract

La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina y se refiere a células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con características de células especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en la preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para la prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en la evaluación de la respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos.

Description

CÉLULAS MADRE MULTIPOTENTES DERIVADAS DE ESTROMA DE MESENTERIO.
La presente invención se encuadra en el campo de Ia biomedicina y se refiere a células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con características de células especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en Ia preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en
Ia evaluación de Ia respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos.
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
Actualmente, el desarrollo de Ia tecnología en el campo de las células madre ha hecho que éstas sean consideradas como una prometedora terapia para diversas patologías humanas, incluyendo: lesiones condrales, óseas y musculares, enfermedades neurodegenerativas, rechazo inmunológico, enfermedades cardiacas y desórdenes de Ia piel (US 5.811.094, 5.958.767, 6.328.960, 6.379.953, 6.497.875).
Por otra parte, las células madre pueden ser una fuente potencial de cantidades virtualmente ilimitadas de células, tanto indiferenciadas como diferenciadas, para Ia realización de ensayos in vitro dirigidos a Ia búsqueda y desarrollo de nuevos compuestos terapéuticos (Patente US 6.294.346), así como para determinar su actividad, metabolismo y toxicidad.
Según el origen de las células madre podemos diferenciar entre células madre embrionarias (células ES) y células madre adultas. Las células ES proceden de Ia masa celular interna de los blastocistos y tienen como característica principal el hecho de ser pluripotenciales, Io que significa que pueden dar lugar a cualquier tejido adulto derivado de las tres capas embrionarias (Evans y Kaufman, 1981 ; Thomson et al., 1998; Patente US 6.200.806). Las células madre adultas son células parcialmente comprometidas presentes en tejidos adultos, las cuales pueden permanecer décadas en el cuerpo humano, aunque con el paso del tiempo comienzan a escasear (Fuchs y Segre, 2002).
A pesar de Ia alta pluripotencialidad de las células ES, las terapias basadas en el uso de células madre adultas presentan una serie de ventajas técnicas sobre aquellas basadas en células ES. En primer lugar, las células derivadas de células ES son normalmente objeto de rechazo por parte del sistema inmunológico mientras que las células madre adultas no son rechazadas por el sistema inmune si han sido obtenidas por trasplante autólogo o transplante heterólogo de células inmunocompatibles. Además el hecho de que estén parcialmente comprometidas reduce el número de etapas de diferenciación necesarias para generar células especializadas. Por otra parte, el uso de este tipo de células no está asociado a ningún tipo de controversia ética o legal. Finalmente, aunque este tipo de células presente una menor potencialidad de diferenciación que las células ES, Ia mayoría de ellas son realmente multipotentes (Joshi y Enver, 2002) Io que significa que pueden diferenciarse a más de un tipo de tejido.
Actualmente, las dos fuentes más empleadas para derivar células madre multipotentes han sido Ia médula ósea y el tejido adiposo subcutáneo, fundamentalmente obtenido de liposucciones.
En el primer caso, Ia extracción de médula ósea es un procedimiento clínico muy invasivo, normalmente limitado a pacientes con diferentes patologías hematológicas y del cual Ia cantidad de material celular obtenido es muy limitada. Es importante destacar que para el uso potencial de células madre multipotentes en terapias celulares es muy importante partir de una cantidad celular suficiente desde Ia propia derivación de las células. Por su propia naturaleza, las células madre multipotentes proliferan in vitro y es posible mantenerlas durante un elevado numero de pases de cultivo, con Io cual es posible expandir su cultivo para obtener una cantidad celular elevada, sin embargo, para su uso en terapias de reemplazo no se debe utilizar células que han sido mantenidas durante un elevado número de pases de cultivo, fundamentalmente para minimizar riesgos de transformación celular y pérdidas de capacidad de diferenciación. Por tanto, es importante encontrar otros tejidos que proporcionen una mayor cantidad inicial de células madre multipotentes, como es el caso del tejido adiposo.
En cuanto a Ia obtención de células madre multipotentes derivadas de tejido adiposo, hasta el momento se han descrito líneas derivadas de liposucciones y grasa subcutánea, siendo en ambos casos el rendimiento de derivación más elevado que en el caso de médula ósea. No obstante, no todo el tejido adiposo humano tiene exactamente las mismas funciones endocrinas y por tanto su naturaleza y composición celular varía.
Actualmente, las células madre multipotentes son Ia materia prima con mayor potencial de éxito para su uso en terapias de reemplazo celular. Además, constituyen una fuente de células indiferenciadas y diferenciadas de gran utilidad para Ia realización de ensayos in vitro dirigidos al desarrollo de compuestos terapéuticos. Existe por tanto una necesidad de obtener células madre multipotentes con elevada plasticidad y capacidad de expansión en cultivo por periodos largos.
EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con características de células especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en Ia preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en Ia evaluación de Ia respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos.
Los inventores han obtenido líneas de células madre multipotentes derivadas del estroma de mesenterio, y concretamente, de estroma de epiplón humano. Estas líneas celulares poseen Ia capacidad para ser expandidas por periodos largos de cultivo y tienen una elevada plasticidad celular, por Io que pueden ser empleadas en terapia celular de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, con las ventajas técnicas que presentan las células madre adultas multipotentes, tales como Ia simplificación del protocolo para Ia inducción de su diferenciación o Ia reducción de Ia posibilidad de rechazo inmunológico en el transplante. Por otra parte, estas líneas celulares pueden ser utilizadas para el desarrollo de estudios farmacológicos, toxicológicos, farmacogenómicos o genéticos.
Un primer aspecto de Ia invención, se refiere a una célula madre multipotente aislada derivada de estroma de mesenterio de mamífero, de ahora en adelante, "célula madre multipotente de Ia invención", caracterizada por:
a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105,
CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.
El mesenterio, es un término en anatomía animal, incluyendo humanos, que designa a una membrana serosa que constituye un repliegue plano del peritoneo, principalmente de tejido conjuntivo, que contiene numerosos vasos sanguíneos y linfáticos con destino a las visceras abdominales, y que une al estómago y al intestino con las paredes posteriores del abdomen, dando así posicionamiento a estos órganos digestivos. En el mesenterio, en especial de personas obesas, se acumula un elevado número de células adiposas. Los mésentenos incluyen: el mesenterio, propiamente dicho, que envuelve a determinadas regiones del intestino delgado (como, por ejemplo, el yeyuno y el ¡león), el mesocolon, que envuelve a determinadas regiones del colon (como, por ejemplo, el mesoapéndice, que envuelve el apéndice vermiforme; el mesocolon transverso, que retiene al colon transverso; o el mesocolon sigmoide, que envuelve al colon sigmoideo); el ligamento ancho del útero, que envuelve al útero; y el omento o epiplón, que es un repliegue específico del peritoneo (que se divide en dos partes: el epiplón mayor o gastrocólico, y el epiplón menor o gastrohepático). El epiplón mayor o gastrocólico recubre Ia curvatura mayor del estómago y Io une con el bazo y el colon transverso y se continúa como un delantal situado en Ia cara anterior del intestino. Es el lugar de acumulación de tejido adiposo en las personas obesas. La unión específica peritoneana de Ia curvatura mayor del estómago con el bazo se Ie llama también epiplón gastroesplénico. Desde el bazo también parte un pliegue que se une con Ia cola del páncreas, llamado epiplón pancreático-esplénico. El epiplón menor o gastrohepático recubre el borde izquierdo del hígado uniéndolo con el borde derecho del estómago, duodeno y a Ia curvatura menor del estómago.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, Ia célula madre multipotente de Ia invención es derivada de epiplón de mamífero. En una realización más preferida, Ia célula madre multipotente de Ia invención procede de un primate y, en una realización aún más preferida, procede de un humano.
Las células madre se pueden clasificar según su potencial de diferenciación: las células madre totipotenciales son capaces de producir tejido embrionario y extraembrionario; las células madre pluripotenciales tienen Ia habilidad de diferenciarse en tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias y, por último, las células madre multipotenciales, capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de Ia misma capa embrionaria (Weissman et al. Annu Rev CeII Dev Biol 2001 ; 17:387-403). Por tanto, el término "célula madre multipotencial" o "células madre multipotenciales", tal y como se utiliza en Ia presente descripción, se refiere a célula capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de Ia misma capa embrionaria.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio de mamífero ("células madre multipotentes de Ia invención"), caracterizada por:
a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105,
CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, esta población celular está constituida por, o comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón de mamífero. Preferiblemente, esta población celular constituida por, o que comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma procede de un primate y, más preferiblemente, de un humano.
La célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, puede ser caracterizada mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado indiferenciado. En el Ejemplo 1 de Ia patente, Ia población de células madre multipotentes es caracterizada mediante inmunocitometría. Otros métodos que pueden ser utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. Las células madre multipotentes derivadas del estroma pueden ser inducidas a diferenciarse in vitro para dar lugar a células que expresen al menos una característica propia de una célula especializada. Tales tipos celulares parcial o totalmente diferenciados incluyen, pero no se limitan a linajes celulares propios de los siguientes tejidos y órganos: cartílago, hueso, grasa, músculo, tejido nervioso, piel, hígado o páncreas, por ejemplo, condrocitos, osteocitos, adipocitos, miocitos, cardiomiocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, queratinocitos, hepatocitos o células pancreáticas.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a una célula aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada. En una realización preferida de Ia invención, Ia célula diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada seleccionada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito, cardiomiocito, neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o célula pancreática. En una realización más preferida de Ia presente invención, Ia célula diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada seleccionada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito o adipocito.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una población celular aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención, o a partir de una población celular aislada constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada. En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, esta población celular diferenciada se caracteriza porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito, cardiomiocito, neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o célula pancreática. En una realización más preferida de este aspecto de Ia invención, esta población celular diferenciada se caracteriza porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito o adipocito.
Los términos "célula diferenciada" o "población celular diferenciada" se refieren a Ia célula aislada o a Ia población celular aislada obtenida al cultivar a Ia célula o las células madre multipotentes de Ia invención en condiciones que favorezcan Ia inducción de su diferenciación a células especializadas, y que como consecuencia de ello, expresan, al menos, una característica propia de una célula especializada.
La célula diferenciada o Ia población celular diferenciada puede ser caracterizada mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de diferenciación de las células madre de Ia presente invención a diversos linajes. Métodos utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. Algunos de los métodos que pueden emplearse para Ia caracterización se explican en el Ejemplo 2 de Ia patente.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en terapia celular somática.
Se entiende por "terapia celular somática" Ia utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas (procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos. Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran, por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas, seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado; células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que ejercen Ia acción pretendida en principio en el producto acabado; derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas anteriormente no expresadas.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
En una realización preferida de estos aspectos de Ia invención, Ia composición farmacéutica comprende cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento, y además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de Ia invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento, y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio activo", "substancia activa", "substancia farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó "ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier componente que potencialmente proporcione una actividad farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura, mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que afecta a Ia estructura o función del cuerpo del hombre u otros animales.
Las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden formularse para su administración en una variedad de formas conocidas en el estado de Ia técnica.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a, parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural, intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial, intratecal, intralesional, intraarterial, intracardiaca, intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital, intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal, vía vaginal o uretral, mediante Ia administración de un supositorio, percutanea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica interna, bomba de infusión o vía catéter.
La dosificación para obtener una cantidad terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como por ejemplo, Ia edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el sentido utilizado en esta descripción, Ia expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a Ia cantidad de Ia composición farmacéutica de Ia invención que produzcan el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dicha composición farmacéutica y el efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos en el estado de Ia técnica.
Las composiciones farmacéuticas de Ia presente invención pueden utilizarse en un método de tratamiento de forma aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares aisladas descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
Cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento pueden ser aplicadas al desarrollo de ensayos in vitro e in vivo con los siguientes propósitos industriales: búsqueda de fármacos, estudios farmacológicos, estudios toxicológicos, estudios farmacogenómicos y/o estudios genéticos. Tales ensayos pueden ser utilizados para Ia identificación y/o caracterización de una multitud de dianas biológicas, compuestos bioactivos y/o agentes farmacológicos.
La célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, proporciona un sistema único en el cual esta célula o estas células pueden diferenciarse para dar lugar a linajes específicos del mismo individuo. Además, Ia célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de Ia invención, proporcionan una fuente de células en cultivo a partir de una potencial variedad de individuos genéticamente diversos que pueden responder de distinta manera a diversos agentes biológicos y farmacológicos. Al comparar las respuestas de las células procedentes de una población estadísticamente significativa de individuos se pueden determinar los efectos de los agentes biológicos o farmacológicos ensayados sobre el tipo celular concreto. A diferencia de Ia mayoría de los cultivos primarios, las células madres multipotentes de Ia invención se pueden mantener en cultivo y de esta forma se pueden estudiar según vaya transcurriendo el tiempo. Por Io tanto, múltiples cultivos celulares procedentes de un único o de distintos individuos pueden ser tratados con el agente de interés para determinar si existen diferencias en el efecto que tiene dicho agente en ciertos tipos de células con el mismo perfil genético o, alternativamente, en tipos celulares similares procedentes de individuos genéticamente distintos.
La utilización de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento en un sistema de escrutinio de alto rendimiento (high-throughput screening) permite analizar una amplia gama de agentes biológicos y/o farmacológicos, así como bibliotecas combinatoriales de los mismos, de una forma efectiva, para de esta forma elucidar sus efectos en las células humanas. Dichos agentes incluyen, pero no están limitados a: péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, hormonas, partículas virales, antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados de vacunas.
Otro aspecto de Ia invención se refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento para evaluar in vitro Ia respuesta celular a, al menos, un agente biológico o farmacológico. Una realización preferida de dicho método para evaluar in vitro Ia respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos, o a bibliotecas combinatoriales de dichos agentes, comprende Io siguiente: a) aislar las células proporcionadas por Ia presente invención a partir de un individuo o de una población estadísticamente significativa de individuos; b) diferenciar opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto; c) expandir las células en cultivo; d) diferenciar opcionalmente las células expandidas a un tipo celular concreto; e) poner en contacto el cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos o con una biblioteca combinatorial de dichos agentes; y f) evaluar los posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células del cultivo.
En una realización preferida de este aspecto de Ia invención, dicho agente biológico o farmacológico se selecciona de Ia lista que comprende péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, partículas virales, hormonas, antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados vacunales.
La presente invención provee, además, de métodos de obtención de las células o las poblaciones celulares aisladas descritas anteriormente en este documento.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a un método de obtención de una célula madre multipotente aislada de Ia invención, o de una población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; y b) seleccionar las células madre multipotentes derivadas del estroma de Ia muestra biológica obtenida en (a). En una realización preferida de este aspecto de Ia presente invención Ia muestra biológica aislada de mesenterio es de epiplón de mamífero. Preferiblemente, Ia célula madre multipotente, o Ia población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención obtenidas mediante este método, procede de un primate y, más preferiblemente, de un humano.
Es posible obtener una muestra biológica aislada del mesenterio y, preferiblemente, del epiplón, por ejemplo, pero sin limitarse mediante intervención quirúrgica abdominal abierta o intervención quirúrgica laparoscópica. La intervención quirúrgica abdominal abierta es una técnica quirúrgica que permite que Ia cavidad abdominal sea dejada abierta temporalmente, utilizando diversos procedimientos conocidos en el estado de Ia técnica, para facilitar el acceso al abdomen; Ia ventaja de este tipo de intervención quirúrgica es que Ia accesibilidad al tejido es completa y por tanto se pueden obtener una muestra biológica aislada de mesenterio y, preferiblemente, de epiplón mayor. La cirugía laparoscópica es una técnica quirúrgica que se practica través de pequeñas incisiones, usando Ia asistencia de una cámara de video que permite al equipo médico ver el campo quirúrgico dentro del paciente y accionar en el mismo; Ia ventaja de este tipo de intervención quirúrgica es que es mínimamente invasiva y posibilita un periodo post-operatorio más rápido y confortable.
La selección de las células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio y, preferiblemente, de epiplón, puede realizarse mediante diferentes procedimientos descritos en el estado de Ia técnica, y que pueden incluir, por ejemplo, pero sin limitarse, procesado mecánico, tratamiento enzimático (por ejemplo, pero sin limitarse, con una colagenasa), centrifugación, lisis eritrocitaria, filtración, cultivo en plástico sin ningún otro soporte o matriz extracelular, cultivo en medios que favorecen Ia proliferación de estas células o inmunocitometría. Algunos de estos métodos se explican en detalle en el
Ejemplo 1 de Ia patente. La célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención, obtenida mediante el método anteriormente descrito puede ser caracterizada para identificar las proteínas intracelulares y/o de superficie, genes, y/u otros marcadores indicadores de su estado indiferenciado mediante métodos ampliamente conocidos en el estado de Ia técnica. En el Ejemplo 1 de Ia patente, Ia población de células madre multipotentes derivadas de estroma obtenidas mediante este método es caracterizada mediante inmunocitometría. Otros métodos que pueden ser utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display.
Preferiblemente, Ia célula madre multipotente de Ia invención, o Ia población celular aislada constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención, obtenida mediante el método anteriormente descrito, está caracterizada por:
a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CDH y HLA DR.
Otro aspecto de Ia presente invención, se refiere a un método de obtención de una célula diferenciada o de una población celular aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente de Ia invención, o a partir de Ia población constituida por, o que comprende, células madre multipotentes de Ia invención, caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
a) obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; b) seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de Ia muestra biológica obtenida en (a); y c) cultivar las células madre multipotentes de (b) en condiciones que favorezcan Ia inducción de su diferenciación a células especializadas.
Los métodos que se pueden usar para inducir Ia diferenciación de las células madre multipotentes de Ia invención a diversos tipos celulares especializados concretos son conocidos por los expertos en Ia materia. Algunos de estos métodos se explican en el Ejemplo 2 de Ia patente.
La célula diferenciada o Ia población celular diferenciada obtenida mediante el método anteriormente descrito puede ser caracterizada mediante Ia identificación de proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de diferenciación de las células madre de Ia presente invención a diversos linajes. Métodos utilizados para Ia caracterización incluyen, pero no se limitan a: inmunocitometría, análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot, RT-PCR, análisis de expresión génica en microarrays, estudios proteómicos o análisis por differential display. Algunos de ellos se explican en el Ejemplo 2 de Ia patente.
A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de Ia presente invención. DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1. Muestra Ia capacidad adipogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días en un medio de cultivo de inducción de diferenciación adipocítica (Poietics, Lonza), siguiendo el protocolo recomendado. Para comprobar el grado de diferenciación, las células se tiñeron con OiI Red O
(SIGMA). (A) Control negativo. Células no tratadas con el medio de diferenciación adipogénica. (B) Células diferenciadas a adipocitos que acumulan numerosas vacuolas lipídicas positivas para Ia tinción con OiI Red O.
Figura 2. Muestra el estudio de Ia capacidad osteogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días en un medio de cultivo de inducción de diferenciación osteogénica (Poietics, Lonza). Para comprobar el grado de diferenciación las células se tiñeron con Alizarin Red (SIGMA). (A) Control negativo. Células no tratadas con el medio de diferenciación osteogénica. (B) Células positivas para Ia tinción con Alizarin Red de Ia matriz extracelular de calcio generada como consecuencia de Ia diferenciación osteogénica.
Figura 3. Muestra el estudio de Ia capacidad condrogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días mediante Ia técnica de diferenciación celular de inducción en micromasa (Poietics, Lonza). Para comprobar el grado de diferenciación condrogénica las células se tiñeron con Alcian Blue 8G (SIGMA). (A) Control negativo de células no tratadas con el medio de cultivo de diferenciación condrogénica. (B) Células teñidas con Alcian Blue formando estructuras y con morfología típicas cartilaginosas. (C) Magnificación (2Ox) de Ia imagen del panel B.
EJEMPLOS
Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar Ia naturaleza de Ia presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a Ia invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran Ia invención sin limitar el campo de aplicación de Ia misma.
EJEMPLO 1. Obtención, derivación, expansión y caracterización de líneas de células madre multipotentes a partir de estroma de epiplón humano:
Obtención de epiplón humano como fuente de células madre multipotentes derivadas de estroma: Para Ia realización de Ia presente invención se utiliza tanto epiplón derivado de donantes sanos-delgados, como de pacientes con obesidad mórbida. El epiplón se obtiene tanto por intervenciones quirúrgicas mediante laparoscopia, como intervenciones de cirugía bariátrica a obesos mórbidos, donde Ia cantidad de tejido accesible es muy elevada.
Derivación de líneas de células madre multipotentes derivadas a partir de estroma de epiplón humano: El epiplón se procesa inmediatamente tras Ia obtención de Ia muestra de tejido. Para asegurar el máximo de garantía, rendimiento y reproducibilidad en el proceso de derivación de las células madre multipotentes, todo el procedimiento de derivación e inicio del cultivo celular se ha optimizado para completarlo en las tres horas posteriores a Ia obtención del tejido. El epiplón se divide en porciones menores, para facilitar el aislamiento de Ia fracción vascular del estroma del tejido, que es Ia fuente celular donde residen las células madre multipotentes. El tejido se lava varias veces con volúmenes iguales de HBSS + 2% P/S {Hank's Balancee! Saline Solution + 2% Penicilina/Streptomicina) (GIBCO). Una vez lavado el tejido se incuba, durante 30 minutos a 370C, con una solución al 0.075% de colagenasa I (GIBCO) para digerir Ia matriz extracelular del mismo y liberar el estroma del tejido. Tras Ia digestión, Ia colagenasa se neutraliza con DMEM F12 + 10% FBS + 1 % antibióticos (Dulbeco's Modified Eagle Media F12 + 10% Fetal Bovine Serum) (GIBCO) y Ia suspensión celular se centrifuga a 1200 rpm durante 10 minutos para obtener un pellet de alta densidad de Ia fracción vascular del estroma del tejido. El pellet del estroma del tejido adiposo se resuspende en tampón de lisis de eritrocitos (BD Biosciences) y se incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de Ia incubación Ia suspensión celular se filtra a través de una malla de nylon de 100 mieras para eliminar debris celulares y se vuelve a centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos. Por último, el pellet celular se resuspende directamente en el medio de cultivo inicial de expansión de células madre multipotentes: DMEM F12 + 10% FBS + 1 % antibiótico/antimicótico. Las células se siembran en frascos de cultivo y se incuban durante 16-18 horas a 370C en un incubador al 5% de CO2 en atmósfera húmeda. Tras Ia incubación las células se lavan varias veces con PBS (Phosphate Buffered Saline) (GIBCO) para eliminar células sanguíneas no adherentes residuales. Las células se mantendrán en medio de cultivo inicial de expansión para fomentar Ia selección y homogenización de los cultivos para el linaje mesenquimal.
Expansión de líneas de células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón humano: El protocolo de trabajo está optimizado para garantizar Ia obtención de cultivos homogéneos de células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón humano. Para ello, el procedimiento de expansión se ha diseñado aprovechando las propias características de las células madre multipotentes, actualmente descritas por Ia ISCT (International Society for Cellular Therapy). Las células madre multipotentes presentan adherencia al plástico de cultivo y son capaces de proliferar indiferenciadas sin necesidad de ningún otro soporte o matriz extracelular, a diferencia de otros linajes celulares presentes en el estroma del tejido adiposo, por tanto estas características permiten iniciar un cultivo selectivo para potenciar el crecimiento y generación de líneas homogéneas de células madre multipotentes. Una vez que el cultivo inicial adquiere Ia confluencia necesaria para pasar (subcultivar) las células, se procede a un cambio de medio, el cual potencia todavía más Ia expansión selectiva de las células madre multipotentes. El medio de expansión mesenquimal presenta una formulación compuesta de diferentes factores de crecimiento y libre de suero (Mesempro, GIBCO). En estas condiciones de cultivo las líneas celulares derivadas pueden ser mantenidas en constante proliferación por un número muy elevado de pases de cultivo.
EJEMPLO 2. Caracterización de las células madre multipotentes derivadas de estroma de epiplón:
Una vez en fase de expansión de los cultivos es necesario llevar acabo su caracterización para corroborar Ia derivación de líneas homogéneas de células madre multipotentes. Las líneas celulares derivadas presentan Ia morfología típica mesenquimal. Regularmente las células se someten a un análisis inmunofenotípico para corroborar que cumplen con los paneles de expresión de antígenos descritos por Ia ISCT (Dominici y cois., Cytotherapy 2007). Por último, para asegurar que las líneas de células madre derivadas de estroma de epiplón cumplen con todos los requisitos marcados por Ia ISCT, se realizan ensayos de diferenciación celular adipogénica, osteogénica y condrogénica, para corroborar Ia naturaleza multipotente de estas células.
Para asegurar el máximo control y garantía en los ensayos de diferenciación adipogénica, osteogénica y condrogénica, las células se cultivan utilizando medios de cultivo comerciales para Ia inducción de diferenciación a esos linajes celulares (Lonza) y siguiendo los protocolos de trabajo proporcionados por el distribuidor. Para corroborar Ia capacidad de diferenciación celular se realiza un estudio a tres niveles: morfológico, mediante tinciones específicas para cada tipo celular bien descritas en Ia bibliografía y análisis de expresión de marcadores de linaje celular específicos. Los resultados de estos análisis se muestran en las Figuras 1 , 2 y 3.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Célula madre multipotente aislada derivada de estroma de mesenterio de mamífero, caracterizada por:
a) ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a. b) ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CDH y HLA DR.
2. Célula madre multipotente según Ia reivindicación 1 derivada de estroma de epiplón.
3. Célula madre multipotente según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde el mamífero es un humano.
4. Célula aislada diferenciada a partir de Ia célula madre multipotente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada.
5. Célula según Ia reivindicación 4, caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada seleccionada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito, cardiomiocito, neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o célula pancreática.
6. Célula según Ia reivindicación 5, caracterizada porque expresa, al menos, una característica propia de una célula especializada seleccionada de Ia lista que comprende: condrocito, osteocito o adipocito.
7. Población celular aislada que comprende células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Composición farmacéutica que comprende Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de Ia población celular según Ia reivindicación 7.
9. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 8 para su uso en terapia celular somática.
10. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9 para su uso en Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas.
11. Composición farmacéutica según Ia reivindicación 10 para su uso en Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
12. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 que comprende, además, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 que comprende, además, otro principio activo.
14. Uso de Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de Ia población celular según Ia reivindicación 7 para Ia elaboración de un medicamento.
15. Uso de Ia célula o de Ia población celular según Ia reivindicación 14 para Ia elaboración de un medicamento de terapia celular somática.
16. Uso de Ia célula o de Ia población celular según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas.
17. Uso de Ia célula o de Ia población celular según Ia reivindicación 16 para Ia elaboración de un medicamento para Ia prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
18. Uso de Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de Ia población celular según Ia reivindicación 7 para evaluar in vitro Ia respuesta celular a, al menos, un agente biológico o farmacológico.
19. Uso de Ia célula o de Ia población celular según Ia reivindicación 18 donde dicho agente biológico o farmacológico se selecciona de Ia lista que comprende péptidos, anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento, partículas virales, hormonas, antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados vacunales.
20. Método de obtención de Ia célula madre multipotente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; y b) seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de Ia muestra biológica obtenida en (a).
21. Método de obtención de Ia célula según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 que comprende:
a) obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; b) seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de Ia muestra biológica obtenida en (a); y cultivar las células madre multipotentes de (b) en condiciones que favorezcan Ia inducción de su diferenciación a células especializadas.
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