ES2345867A1 - Celulas madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio. - Google Patents
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Abstract
La presente invención se encuadra en el campo de la biomedicina y se refiere a células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con características de células especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en la preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para la prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en la evaluación de la respuesta celular a agentes biológicos o farmacológicos.
Description
Células madre multipotentes derivadas de estroma
de mesenterio.
La presente invención se encuadra en el campo de
la biomedicina y se refiere a células madre multipotentes derivadas
de estroma de mesenterio, y, preferiblemente, de estroma de epiplón,
con capacidad para diferenciarse y dar lugar a células con
características de células especializadas, y a los métodos de
obtención de las mismas. Dichas células pueden usarse en la
preparación de medicamentos y composiciones farmacéuticas para la
prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas
o genéticas, así como en la evaluación de la respuesta celular a
agentes biológicos o farmacológicos.
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Actualmente, el desarrollo de la tecnología en
el campo de las células madre ha hecho que éstas sean consideradas
como una prometedora terapia para diversas patologías humanas,
incluyendo: lesiones condrales, óseas y musculares, enfermedades
neurodegenerativas, rechazo inmunológico, enfermedades cardiacas y
desórdenes de la piel (US 5.811.094, 5.958.767, 6.328.960,
6.379.953, 6.497.875).
Por otra parte, las células madre pueden ser una
fuente potencial de cantidades virtualmente ilimitadas de células,
tanto indiferenciadas como diferenciadas, para la realización de
ensayos in vitro dirigidos a la búsqueda y desarrollo de
nuevos compuestos terapéuticos (Patente US 6.294.346), así como para
determinar su actividad, metabolismo y toxicidad.
Según el origen de las células madre podemos
diferenciar entre células madre embrionarias (células ES) y células
madre adultas. Las células ES proceden de la masa celular interna de
los blastocistos y tienen como característica principal el hecho de
ser pluripotenciales, lo que significa que pueden dar lugar a
cualquier tejido adulto derivado de las tres capas embrionarias
(Evans y Kaufman, 1981; Thomson et al., 1998; Patente US
6.200.806). Las células madre adultas son células parcialmente
comprometidas presentes en tejidos adultos, las cuales pueden
permanecer décadas en el cuerpo humano, aunque con el paso del
tiempo comienzan a escasear (Fuchs y Segre, 2002).
A pesar de la alta pluripotencialidad de las
células ES, las terapias basadas en el uso de células madre adultas
presentan una serie de ventajas técnicas sobre aquellas basadas en
células ES. En primer lugar, las células derivadas de células ES son
normalmente objeto de rechazo por parte del sistema inmunológico
mientras que las células madre adultas no son rechazadas por el
sistema inmune si han sido obtenidas por trasplante autólogo o
transplante heterólogo de células inmunocompatibles. Además el hecho
de que estén parcialmente comprometidas reduce el número de etapas
de diferenciación necesarias para generar células especializadas.
Por otra parte, el uso de este tipo de células no está asociado a
ningún tipo de controversia ética o legal. Finalmente, aunque este
tipo de células presente una menor potencialidad de diferenciación
que las células ES, la mayoría de ellas son realmente multipotentes
(Joshi y Enver, 2002) lo que significa que pueden diferenciarse a
más de un tipo de tejido.
Actualmente, las dos fuentes más empleadas para
derivar células madre multipotentes han sido la médula ósea y el
tejido adiposo subcutáneo, fundamentalmente obtenido de
liposucciones.
En el primer caso, la extracción de médula ósea
es un procedimiento clínico muy invasivo, normalmente limitado a
pacientes con diferentes patologías hematológicas y del cual la
cantidad de material celular obtenido es muy limitada. Es importante
destacar que para el uso potencial de células madre multipotentes en
terapias celulares es muy importante partir de una cantidad celular
suficiente desde la propia derivación de las células. Por su propia
naturaleza, las células madre multipotentes proliferan in
vitro y es posible mantenerlas durante un elevado numero de
pases de cultivo, con lo cual es posible expandir su cultivo para
obtener una cantidad celular elevada, sin embargo, para su uso en
terapias de reemplazo no se debe utilizar células que han sido
mantenidas durante un elevado número de pases de cultivo,
fundamentalmente para minimizar riesgos de transformación celular y
pérdidas de capacidad de diferenciación. Por tanto, es importante
encontrar otros tejidos que proporcionen una mayor cantidad inicial
de células madre multipotentes, como es el caso del tejido
adiposo.
En cuanto a la obtención de células madre
multipotentes derivadas de tejido adiposo, hasta el momento se han
descrito líneas derivadas de liposucciones y grasa subcutánea,
siendo en ambos casos el rendimiento de derivación más elevado que
en el caso de médula ósea. No obstante, no todo el tejido adiposo
humano tiene exactamente las mismas funciones endocrinas y por tanto
su naturaleza y composición celular varía.
Actualmente, las células madre multipotentes son
la materia prima con mayor potencial de éxito para su uso en
terapias de reemplazo celular. Además, constituyen una fuente de
células indiferenciadas y diferenciadas de gran utilidad para la
realización de ensayos in vitro dirigidos al desarrollo de
compuestos terapéuticos. Existe por tanto una necesidad de obtener
células madre multipotentes con elevada plasticidad y capacidad de
expansión en cultivo por periodos largos.
La presente invención se refiere a células madre
multipotentes derivadas de estroma de mesenterio, y,
preferiblemente, de estroma de epiplón, con capacidad para
diferenciarse y dar lugar a células con características de células
especializadas, y a los métodos de obtención de las mismas. Dichas
células pueden usarse en la preparación de medicamentos y
composiciones farmacéuticas para la prevención o el tratamiento de
lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas, así como en la
evaluación de la respuesta celular a agentes biológicos o
farmacológicos.
Los inventores han obtenido líneas de células
madre multipotentes derivadas del estroma de mesenterio, y
concretamente, de estroma de epiplón humano. Estas líneas celulares
poseen la capacidad para ser expandidas por periodos largos de
cultivo y tienen una elevada plasticidad celular, por lo que pueden
ser empleadas en terapia celular de lesiones, enfermedades
degenerativas o genéticas, con las ventajas técnicas que presentan
las células madre adultas multipotentes, tales como la
simplificación del protocolo para la inducción de su diferenciación
o la reducción de la posibilidad de rechazo inmunológico en el
transplante. Por otra parte, estas líneas celulares pueden ser
utilizadas para el desarrollo de estudios farmacológicos,
toxicológicos, farmacogenómicos o genéticos.
Un primer aspecto de la invención, se refiere a
una célula madre multipotente aislada derivada de estroma de
mesenterio de mamífero, de ahora en adelante, "célula madre
multipotente de la invención", caracterizada por:
- a)
- ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a.
- b)
- ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.
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El mesenterio, es un término en anatomía animal,
incluyendo humanos, que designa a una membrana serosa que constituye
un repliegue plano del peritoneo, principalmente de tejido
conjuntivo, que contiene numerosos vasos sanguíneos y linfáticos con
destino a las vísceras abdominales, y que une al estómago y al
intestino con las paredes posteriores del abdomen, dando así
posicionamiento a estos órganos digestivos. En el mesenterio, en
especial de personas obesas, se acumula un elevado número de células
adiposas.
Los mesenterios incluyen: el mesenterio,
propiamente dicho, que envuelve a determinadas regiones del
intestino delgado (como, por ejemplo, el yeyuno y el ileón), el
mesocolon, que envuelve a determinadas regiones del colon (como, por
ejemplo, el mesoapéndice, que envuelve el apéndice vermiforme; el
mesocolon transverso, que retiene al colon transverso; o el
mesocolon sigmoide, que envuelve al colon sigmoideo); el ligamento
ancho del útero, que envuelve al útero; y el omento o epiplón, que
es un repliegue específico del peritoneo (que se divide en dos
partes: el epiplón mayor o gastrocólico, y el epiplón menor o
gastrohepático). El epiplón mayor o gastrocólico recubre la
curvatura mayor del estómago y lo une con el bazo y el colon
transverso y se continúa como un delantal situado en la cara
anterior del intestino. Es el lugar de acumulación de tejido adiposo
en las personas obesas. La unión específica peritoneana de la
curvatura mayor del estómago con el bazo se le llama también epiplón
gastroesplénico. Desde el bazo también parte un pliegue que se une
con la cola del páncreas, llamado epiplón
pancreático-esplénico. El epiplón menor o
gastrohepático recubre el borde izquierdo del hígado uniéndolo con
el borde derecho del estómago, duodeno y a la curvatura menor del
estómago.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, la célula madre multipotente de la invención es
derivada de epiplón de mamífero. En una realización más preferida,
la célula madre multipotente de la invención procede de un primate
y, en una realización aún más preferida, procede de un humano.
Las células madre se pueden clasificar según su
potencial de diferenciación: las células madre totipotenciales son
capaces de producir tejido embrionario y extraembrionario; las
células madre pluripotenciales tienen la habilidad de diferenciarse
en tejidos procedentes de cualquiera de las tres capas embrionarias
y, por último, las células madre multipotenciales, capaces de
diferenciarse en distintos tipos celulares procedentes de la misma
capa embrionaria (Weissman et al. Annu Rev Cell Dev Biol
2001;17:387-403). Por tanto, el término "célula
madre multipotencial" o "células madre multipotenciales",
tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a
célula capaces de diferenciarse en distintos tipos celulares
procedentes de la misma capa embrionaria.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
población celular aislada constituida por, o que comprende, células
madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio de mamífero
("células madre multipotentes de la invención"), caracterizada
por:
- a)
- ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a.
- b)
- ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.
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En una realización preferida de este aspecto de
la invención, esta población celular está constituida por, o
comprende, células madre multipotentes derivadas de estroma de
epiplón de mamífero. Preferiblemente, esta población celular
constituida por, o que comprende, células madre multipotentes
derivadas de estroma procede de un primate y, más preferiblemente,
de un humano.
La célula madre multipotente de la invención, o
la población celular constituida por, o que comprende, las células
madre multipotentes de la invención, puede ser caracterizada
mediante la identificación de proteínas de superficie y/o
intracelulares, genes, y/u otros marcadores indicativos de su estado
indiferenciado. En el Ejemplo 1 de la patente, la población de
células madre multipotentes es caracterizada mediante
inmunocitometría. Otros métodos que pueden ser utilizados para la
caracterización incluyen, pero no se limitan a: análisis
inmunocitoquímico, análisis por northern blot,
RT-PCR, análisis de expresión génica en
microarrays, estudios proteomícos o análisis por
differential display.
Las células madre multipotentes derivadas del
estroma pueden ser inducidas a diferenciarse in vitro para
dar lugar a células que expresen al menos una característica propia
de una célula especializada. Tales tipos celulares parcial o
totalmente diferenciados incluyen, pero no se limitan a linajes
celulares propios de los siguientes tejidos y órganos: cartílago,
hueso, grasa, músculo, tejido nervioso, piel, hígado o páncreas, por
ejemplo, condrocitos, osteocitos, adipocitos, miocitos,
cardiomiocitos, neuronas, astrocitos, oligodendrocitos,
queratinocitos, hepatocitos o células pancreáticas.
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere a una célula aislada diferenciada a partir de la célula
madre multipotente de la invención caracterizada porque expresa, al
menos, una característica propia de una célula especializada. En una
realización preferida de la invención, la célula diferenciada a
partir de la célula madre multipotente de la invención expresa, al
menos, una característica propia de una célula especializada
seleccionada de la lista que comprende: condrocito, osteocito,
adipocito, miocito, cardiomiocito, neurona, astrocito,
oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o célula pancreática. En
una realización más preferida de la presente invención, la célula
diferenciada a partir de la célula madre multipotente de la
invención expresa, al menos, una característica propia de una célula
especializada seleccionada de la lista que comprende: condrocito,
osteocito o adipocito.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
población celular aislada diferenciada a partir de la célula madre
multipotente de la invención, o a partir de una población celular
aislada constituida por, o que comprende, las células madre
multipotentes de la invención, caracterizada porque expresa, al
menos, una característica propia de una célula especializada. En una
realización preferida de este aspecto de la invención, esta
población celular diferenciada se caracteriza porque expresa, al
menos, una característica propia de una célula especializada de la
lista que comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito,
cardiomiocito, neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito,
hepatocito o célula pancreática. En una realización más preferida de
este aspecto de la invención, esta población celular diferenciada se
caracteriza porque expresa, al menos, una característica propia de
una célula especializada de la lista que comprende: condrocito,
osteocito o adipocito.
Los términos "célula diferenciada" o
"población celular diferenciada" se refieren a la célula
aislada o a la población celular aislada obtenida al cultivar a la
célula o las células madre multipotentes de la invención en
condiciones que favorezcan la inducción de su diferenciación a
células especializadas, y que como consecuencia de ello, expresan,
al menos, una característica propia de una célula especializada.
La célula diferenciada o la población celular
diferenciada puede ser caracterizada mediante la identificación de
proteínas de superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros
marcadores indicativos de diferenciación de las células madre de la
presente invención a diversos linajes. Métodos utilizados para la
caracterización incluyen, pero no se limitan a: inmunocitometría,
análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot,
RT-PCR, análisis de expresión génica en
microarrays, estudios proteómicos o análisis por
differential display. Algunos de los métodos que pueden
emplearse para la caracterización se explican en el Ejemplo 2 de la
patente.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en
terapia celular somática.
Se entiende por "terapia celular somática"
la utilización de células somáticas vivas, tanto autólogas
(procedentes del propio paciente), como alogénicas (de otro ser
humano) o xenogénicas (de animales), cuyas características
biológicas han sido alteradas sustancialmente como resultado de su
manipulación, para obtener un efecto terapéutico, de diagnóstico o
preventivo, por medios metabólicos, farmacológicos o inmunológicos.
Entre los medicamentos de terapia celular somática se encuentran,
por ejemplo, pero sin limitarse: células manipuladas para modificar
sus propiedades inmunológicas, metabólicas o funcionales de otro
tipo en aspectos cualitativos o cuantitativos; células clasificadas,
seleccionadas y manipuladas, que se someten posteriormente a un
proceso de fabricación con el fin de obtener el producto terminado;
células manipuladas y combinadas con componentes no celulares (por
ejemplo, matrices o productos sanitarios biológicos o inertes) que
ejercen la acción pretendida en principio en el producto acabado;
derivados de células autólogas expresadas ex vivo (in
vitro) en condiciones específicas de cultivo; o células
modificadas genéticamente o sometidas a otro tipo de manipulación
para expresar propiedades funcionales homologas o no homologas
anteriormente no expresadas.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en
la prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades
degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón,
sistema nervioso central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una
realización preferida de este aspecto de la presente invención, se
refiere a una composición farmacéutica que comprende las células o
las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento
para su uso en la prevención o el tratamiento de lesiones,
enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento para su uso en
terapia celular somática para la prevención o el tratamiento de
lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago,
hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico,
piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto
de la presente invención, se refiere a una composición farmacéutica
que comprende las células o las poblaciones celulares descritas
anteriormente en este documento para su uso en terapia celular
somática para la prevención o el tratamiento de lesiones,
enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
En una realización preferida de estos aspectos
de la invención, la composición farmacéutica comprende cualquiera de
las células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en
este documento, y además, un vehículo farmacéuticamente
aceptable.
Otro aspecto de la invención se refiere a una
composición farmacéutica que comprende cualquiera de las células o
las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento,
y, además, junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable, otro
principio activo.
Como se emplea aquí, el término "principio
activo", "substancia activa", "substancia
farmacéuticamente activa", "ingrediente activo" ó
"ingrediente farmacéuticamente activo" significa cualquier
componente que potencialmente proporcione una actividad
farmacológica u otro efecto diferente en el diagnóstico, cura,
mitigación, tratamiento, o prevención de una enfermedad, o que
afecta a la estructura o función del cuerpo del hombre u otros
animales.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden formularse para su administración en una variedad
de formas conocidas en el estado de la técnica.
Tales composiciones y/o sus formulaciones pueden
administrarse a un animal, incluyendo un mamífero y, por tanto, al
hombre, en una variedad de formas, incluyendo, pero sin limitarse a,
parenteral, intraperitoneal, intravenosa, intradérmica, epidural,
intraespinal, intraestromal, intraarticular, intrasinovial,
intratecal, intralesional, intraarterial, intracardiaca,
intramuscular, intranasal, intracraneal, subcutánea, intraorbital,
intracapsular, tópica, mediante parches transdérmicos, vía rectal,
vía vaginal o uretral, mediante la administración de un supositorio,
percutanea, espray nasal, implante quirúrgico, pintura quirúrgica
interna, bomba de infusión o vía catéter.
La dosificación para obtener una cantidad
terapéuticamente efectiva depende de una variedad de factores, como
por ejemplo, la edad, peso, sexo o tolerancia, del mamífero. En el
sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad
terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de la
composición farmacéutica de la invención que produzcan el efecto
deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por
las características propias de dicha composición farmacéutica y el
efecto terapéutico a conseguir. Los "adyuvantes" y "vehículos
farmacéuticamente aceptables" que pueden ser utilizados en dichas
composiciones son los vehículos conocidos en el estado de la
técnica.
Las composiciones farmacéuticas de la presente
invención pueden utilizarse en un método de tratamiento de forma
aislada o conjuntamente con otros compuestos farmacéuticos.
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones
celulares aisladas descritas anteriormente en este documento para la
elaboración de un medicamento.
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento para la
elaboración de un medicamento de terapia celular somática.
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento para la
elaboración de un medicamento para la prevención o el tratamiento de
lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago,
hueso, músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico,
piel, hígado o páncreas. Una realización preferida de este aspecto
de la presente invención, se refiere al uso de cualquiera de las
células o las poblaciones celulares descritas anteriormente en este
documento para la elaboración de un medicamento para la prevención o
el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas
de: cartílago o hueso.
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere al uso de cualquiera de las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento para la
elaboración de un medicamento de terapia celular somática para la
prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas
o genéticas de: cartílago, hueso, músculo, corazón, sistema nervioso
central o periférico, piel, hígado o páncreas. Una realización
preferida de este aspecto de la presente invención, se refiere al
uso de cualquiera de las células o las poblaciones celulares
descritas anteriormente en este documento para la elaboración de un
medicamento de terapia celular somática para la prevención o el
tratamiento de lesiones, enfermedades degenerativas o genéticas de:
cartílago o hueso.
Cualquiera de las células o las poblaciones
celulares descritas anteriormente en este documento pueden ser
aplicadas al desarrollo de ensayos in vitro e in vivo
con los siguientes propósitos industriales: búsqueda de fármacos,
estudios farmacológicos, estudios toxicológicos, estudios
farmacogenómicos y/o estudios genéticos. Tales ensayos pueden ser
utilizados para la identificación y/o caracterización de una
multitud de dianas biológicas, compuestos bioactivos y/o agentes
farmacológicos.
La célula madre multipotente de la invención, o
la población celular constituida por, o que comprende, las células
madre multipotentes de la invención, proporciona un sistema único en
el cual esta célula o estas células pueden diferenciarse para dar
lugar a linajes específicos del mismo individuo. Además, la célula
madre multipotente de la invención, o la población celular
constituida por, o que comprende, las células madre multipotentes de
la invención, proporcionan una fuente de células en cultivo a partir
de una potencial variedad de individuos genéticamente diversos que
pueden responder de distinta manera a diversos agentes biológicos y
farmacológicos. Al comparar las respuestas de las células
procedentes de una población estadísticamente significativa de
individuos se pueden determinar los efectos de los agentes
biológicos o farmacológicos ensayados sobre el tipo celular
concreto. A diferencia de la mayoría de los cultivos primarios, las
células madres multipotentes de la invención se pueden mantener en
cultivo y de esta forma se pueden estudiar según vaya transcurriendo
el tiempo. Por lo tanto, múltiples cultivos celulares procedentes de
un único o de distintos individuos pueden ser tratados con el agente
de interés para determinar si existen diferencias en el efecto que
tiene dicho agente en ciertos tipos de células con el mismo perfil
genético o, alternativamente, en tipos celulares similares
procedentes de individuos genéticamente distintos.
La utilización de cualquiera de las células o
las poblaciones celulares descritas anteriormente en este documento
en un sistema de escrutinio de alto rendimiento
(high-throughput screening) permite analizar
una amplia gama de agentes biológicos y/o farmacológicos, así como
bibliotecas combinatoriales de los mismos, de una forma efectiva,
para de esta forma elucidar sus efectos en las células humanas.
Dichos agentes incluyen, pero no están limitados a: péptidos,
anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento,
hormonas, partículas virales, antibióticos, compuestos inhibitorios,
agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos
alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados de
vacunas.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
de cualquiera de las células o las poblaciones celulares descritas
anteriormente en este documento para evaluar in vitro la
respuesta celular a, al menos, un agente biológico o
farmacológico.
Una realización preferida de dicho método para
evaluar in vitro la respuesta celular a agentes biológicos o
farmacológicos, o a bibliotecas combinatoriales de dichos agentes,
comprende lo siguiente: a) aislar las células proporcionadas por la
presente invención a partir de un individuo o de una población
estadísticamente significativa de individuos; b) diferenciar
opcionalmente las células aisladas a un tipo celular concreto; c)
expandir las células en cultivo; d) diferenciar opcionalmente las
células expandidas a un tipo celular concreto; e) poner en contacto
el cultivo con uno o más agentes biológicos o farmacológicos o con
una biblioteca combinatorial de dichos agentes; y f) evaluar los
posibles efectos biológicos de dichos agentes sobre las células del
cultivo.
En una realización preferida de este aspecto de
la invención, dicho agente biológico o farmacológico se selecciona
de la lista que comprende péptidos, anticuerpos, citoquinas,
quimioquinas, factores de crecimiento, partículas virales, hormonas,
antibióticos, compuestos inhibitorios, agentes quimoterapéuticos,
agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos alimentarios, composiciones
farmacéuticas o preparados vacunales.
La presente invención provee, además, de métodos
de obtención de las células o las poblaciones celulares aisladas
descritas anteriormente en este documento.
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Otro aspecto de la presente invención, se
refiere a un método de obtención de una célula madre multipotente
aislada de la invención, o de una población celular aislada
constituida por, o que comprende, células madre multipotentes,
caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; y
- b)
- seleccionar las células madre multipotentes derivadas del estroma de la muestra biológica obtenida en (a).
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En una realización preferida de este aspecto de
la presente invención la muestra biológica aislada de mesenterio es
de epiplón de mamífero. Preferiblemente, la célula madre
multipotente, o la población celular aislada constituida por, o que
comprende, células madre multipotentes de la invención obtenidas
mediante este método, procede de un primate y, más preferiblemente,
de un humano.
Es posible obtener una muestra biológica aislada
del mesenterio y, preferiblemente, del epiplón, por ejemplo, pero
sin limitarse mediante intervención quirúrgica abdominal abierta o
intervención quirúrgica laparoscópica. La intervención quirúrgica
abdominal abierta es una técnica quirúrgica que permite que la
cavidad abdominal sea dejada abierta temporalmente, utilizando
diversos procedimientos conocidos en el estado de la técnica, para
facilitar el acceso al abdomen; la ventaja de este tipo de
intervención quirúrgica es que la accesibilidad al tejido es
completa y por tanto se pueden obtener una muestra biológica aislada
de mesenterio y, preferiblemente, de epiplón mayor. La cirugía
laparoscópica es una técnica quirúrgica que se practica través de
pequeñas incisiones, usando la asistencia de una cámara de video que
permite al equipo médico ver el campo quirúrgico dentro del paciente
y accionar en el mismo; la ventaja de este tipo de intervención
quirúrgica es que es mínimamente invasiva y posibilita un periodo
post-operatorio más rápido y confortable.
La selección de las células madre multipotentes
derivadas de estroma de mesenterio y, preferiblemente, de epiplón,
puede realizarse mediante diferentes procedimientos descritos en el
estado de la técnica, y que pueden incluir, por ejemplo, pero sin
limitarse, procesado mecánico, tratamiento enzimático (por ejemplo,
pero sin limitarse, con una colagenasa), centrifugación, lisis
eritrocitaria, filtración, cultivo en plástico sin ningún otro
soporte o matriz extracelular, cultivo en medios que favorecen la
proliferación de estas células o inmunocitometría. Algunos de estos
métodos se explican en detalle en el Ejemplo 1 de la patente.
La célula madre multipotente de la invención, o
la población celular aislada constituida por, o que comprende,
células madre multipotentes de la invención, obtenida mediante el
método anteriormente descrito puede ser caracterizada para
identificar las proteínas intracelulares y/o de superficie, genes,
y/u otros marcadores indicadores de su estado indiferenciado
mediante métodos ampliamente conocidos en el estado de la técnica.
En el Ejemplo 1 de la patente, la población de células madre
multipotentes derivadas de estroma obtenidas mediante este método es
caracterizada mediante inmunocitometría. Otros métodos que pueden
ser utilizados para la caracterización incluyen, pero no se limitan
a: análisis inmunocitoquímico, análisis por northern blot,
RT-PCR, análisis de expresión génica en
microarrays, estudios proteómicos o análisis por
differential display.
Preferiblemente, la célula madre multipotente de
la invención, o la población celular aislada constituida por, o que
comprende, células madre multipotentes de la invención, obtenida
mediante el método anteriormente descrito, está caracterizada
por:
- a)
- ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a.
- b)
- ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.
Otro aspecto de la presente invención, se
refiere a un método de obtención de una célula diferenciada o de una
población celular aislada diferenciada a partir de la célula madre
multipotente de la invención, o a partir de la población constituida
por, o que comprende, células madre multipotentes de la invención,
caracterizado porque comprende los siguientes pasos:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada de mesenterio;
- b)
- seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de la muestra biológica obtenida en (a); y
- c)
- cultivar las células madre multipotentes de (b) en condiciones que favorezcan la inducción de su diferenciación a células especializadas.
Los métodos que se pueden usar para inducir la
diferenciación de las células madre multipotentes de la invención a
diversos tipos celulares especializados concretos son conocidos por
los expertos en la materia. Algunos de estos métodos se explican en
el Ejemplo 2 de la patente.
La célula diferenciada o la población celular
diferenciada obtenida mediante el método anteriormente descrito
puede ser caracterizada mediante la identificación de proteínas de
superficie y/o intracelulares, genes, y/u otros marcadores
indicativos de diferenciación de las células madre de la presente
invención a diversos linajes. Métodos utilizados para la
caracterización incluyen, pero no se limitan a: inmunocitometría,
análisis inmunocitoquímico, análisis por northem blot,
RT-PCR, análisis de expresión génica en
microarrays, estudios proteómicos o análisis por
differential display. Algunos de ellos se explican en el
Ejemplo 2 de la patente.
A lo largo de la descripción y las
reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no
pretenden excluir otras características técnicas, aditivos,
componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos,
ventajas y características de la invención se desprenderán en parte
de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las
siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración,
y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1. Muestra la capacidad adipogénica de
las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de estroma de
epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas celulares
derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron durante 21 días
en un medio de cultivo de inducción de diferenciación adipocítica
(Poietics, Lonza), siguiendo el protocolo recomendado. Para
comprobar el grado de diferenciación, las células se tiñeron con Oil
Red O (SIGMA). (A) Control negativo. Células no tratadas con el
medio de diferenciación adipogénica. (B) Células diferenciadas a
adipocitos que acumulan numerosas vacuolas lipídicas positivas para
la tinción con Oil Red O.
Figura 2. Muestra el estudio de la capacidad
osteogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de
estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas
celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron
durante 21 días en un medio de cultivo de inducción de
diferenciación osteogénica (Poietics, Lonza). Para comprobar el
grado de diferenciación las células se tiñeron con Alizarin Red
(SIGMA). (A) Control negativo. Células no tratadas con el medio de
diferenciación osteogénica. (B) Células positivas para la tinción
con Alizarin Red de la matriz extracelular de calcio generada como
consecuencia de la diferenciación osteogénica.
Figura 3. Muestra el estudio de la capacidad
condrogénica de las líneas celulares derivadas obtenidas a partir de
estroma de epiplón. En tres experimentos diferentes varias líneas
celulares derivadas de estroma de epiplón humano se cultivaron
durante 21 días mediante la técnica de diferenciación celular de
inducción en micromasa (Poietics, Lonza). Para comprobar el grado de
diferenciación condrogénica las células se tiñeron con Alcian Blue
8G (SIGMA). (A) Control negativo de células no tratadas con el medio
de cultivo de diferenciación condrogénica. (B) Células teñidas con
Alcian Blue formando estructuras y con morfología típicas
cartilaginosas. (C) Magnificación (20x) de la imagen del panel
B.
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes ejemplos específicos que se
proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la
naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen
solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como
limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los
ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el
campo de aplicación de la misma.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
1
Obtención de epiplón humano como fuente de
células madre multipotentes derivadas de estroma: Para la
realización de la presente invención se utiliza tanto epiplón
derivado de donantes sanos-delgados, como de
pacientes con obesidad mórbida. El epiplón se obtiene tanto por
intervenciones quirúrgicas mediante laparoscopia, como
intervenciones de cirugía bariátrica a obesos mórbidos, donde la
cantidad de tejido accesible es muy elevada.
Derivación de líneas de células madre
multipotentes derivadas a partir de estroma de epiplón humano:
El epiplón se procesa inmediatamente tras la obtención de la muestra
de tejido. Para asegurar el máximo de garantía, rendimiento y
reproducibilidad en el proceso de derivación de las células madre
multipotentes, todo el procedimiento de derivación e inicio del
cultivo celular se ha optimizado para completarlo en las tres horas
posteriores a la obtención del tejido. El epiplón se divide en
porciones menores, para facilitar el aislamiento de la fracción
vascular del estroma del tejido, que es la fuente celular donde
residen las células madre multipotentes. El tejido se lava varias
veces con volúmenes iguales de HBSS + 2% P/S (Hank's Balanceó
Saline Solution + 2% Penicilina/Streptomicina) (GIBCO). Una vez
lavado el tejido se incuba, durante 30 minutos a 37ºC, con una
solución al 0.075% de colagenasa I (GIBCO) para digerir la matriz
extracelular del mismo y liberar el estroma del tejido. Tras la
digestión, la colagenasa se neutraliza con DMEM F12 + 10% FBS + 1%
antibióticos (Dulbeco's Modified Eagle Media F12 + 10%
Fetal Bovine Serum) (GIBCO) y la suspensión celular se
centrifuga a 1200 rpm durante 10 minutos para obtener un
pellet de alta densidad de la fracción vascular del estroma
del tejido. El pellet del estroma del tejido adiposo se
resuspende en tampón de lisis de eritrocitos (BD Biosciences) y se
incuba a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la
incubación la suspensión celular se filtra a través de una malla de
nylon de 100 mieras para eliminar debris celulares y se vuelve a
centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos. Por último, el
pellet celular se resuspende directamente en el medio de
cultivo inicial de expansión de células madre multipotentes: DMEM
F12 + 10% FBS + 1% antibiótico/antimicótico. Las células se siembran
en frascos de cultivo y se incuban durante 16-18
horas a 37ºC en un incubador al 5% de CO2 en atmósfera húmeda. Tras
la incubación las células se lavan varias veces con PBS
(Phosphate Buffered Saline) (GIBCO) para eliminar células
sanguíneas no adherentes residuales. Las células se mantendrán en
medio de cultivo inicial de expansión para fomentar la selección y
homogenización de los cultivos para el linaje mesenquimal.
Expansión de líneas de células madre
multipotentes derivadas de estroma de epiplón humano: El
protocolo de trabajo está optimizado para garantizar la obtención de
cultivos homogéneos de células madre multipotentes derivadas de
estroma de epiplón humano. Para ello, el procedimiento de expansión
se ha diseñado aprovechando las propias características de las
células madre multipotentes, actualmente descritas por la ISCT
(International Society for Cellular Therapy). Las células
madre multipotentes presentan adherencia al plástico de cultivo y
son capaces de proliferar indiferenciadas sin necesidad de ningún
otro soporte o matriz extracelular, a diferencia de otros linajes
celulares presentes en el estroma del tejido adiposo, por tanto
estas características permiten iniciar un cultivo selectivo para
potenciar el crecimiento y generación de líneas homogéneas de
células madre multipotentes. Una vez que el cultivo inicial adquiere
la confluencia necesaria para pasar (subcultivar) las células, se
procede a un cambio de medio, el cual potencia todavía más la
expansión selectiva de las células madre multipotentes. El medio de
expansión mesenquimal presenta una formulación compuesta de
diferentes factores de crecimiento y con un porcentaje reducido del
2% de suero (Mesempro, GIBCO). En estas condiciones de cultivo las
líneas celulares derivadas pueden ser mantenidas en constante
proliferación por un número muy elevado de pases de cultivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo
2
Una vez en fase de expansión de los cultivos es
necesario llevar acabo su caracterización para corroborar la
derivación de líneas homogéneas de células madre multipotentes. Las
líneas celulares derivadas presentan la morfología típica
mesenquimal. Regularmente las células se someten a un análisis
inmunofenotípico para corroborar que cumplen con los paneles de
expresión de antígenos descritos por la ISCT (Dominici y cols.,
Cytotherapy 2007). Por último, para asegurar que las líneas de
células madre derivadas de estroma de epiplón cumplen con todos los
requisitos marcados por la ISCT, se realizan ensayos de
diferenciación celular adipogénica, osteogénica y condrogénica, para
corroborar la naturaleza multipotente de estas células.
Para asegurar el máximo control y garantía en
los ensayos de diferenciación adipogénica, osteogénica y
condrogénica, las células se cultivan utilizando medios de cultivo
comerciales para la inducción de diferenciación a esos linajes
celulares (Lonza) y siguiendo los protocolos de trabajo
proporcionados por el distribuidor. Para corroborar la capacidad de
diferenciación celular se realiza un estudio a tres niveles:
morfológico, mediante tinciones específicas para cada tipo celular
bien descritas en la bibliografía y análisis de expresión de
marcadores de linaje celular específicos. Los resultados de estos
análisis se muestran en las Figuras 1, 2 y 3.
Claims (18)
1. Célula madre multipotente aislada derivada de
estroma de mesenterio de mamífero, caracterizada por:
- a)
- ser positiva para los siguientes antígenos de superficie: CD105, CD90, CD73, CD29, CD49d y CD49a.
- b)
- ser negativa para los siguientes antígenos de superficie: CD45, CD34, CD14 y HLA DR.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Célula madre multipotente según la
reivindicación 1 derivada de estroma de epiplón.
3. Célula madre multipotente según cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2 donde el mamífero es un humano.
4. Célula aislada diferenciada a partir de la
célula madre multipotente según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 3, caracterizada porque expresa, al menos, una
característica propia de una célula especializada.
5. Célula según la reivindicación 4,
caracterizada porque expresa, al menos, una característica
propia de una célula especializada seleccionada de la lista que
comprende: condrocito, osteocito, adipocito, miocito, cardiomiocito,
neurona, astrocito, oligodendrocito, queratinocito, hepatocito o
célula pancreática.
6. Célula según la reivindicación 5,
caracterizada porque expresa, al menos, una característica
propia de una célula especializada seleccionada de entre:
condrocito, osteocito o adipocito.
7. Población celular aislada que comprende
células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
8. Composición farmacéutica que comprende la
célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de la
población celular según la reivindicación 7.
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 8 que comprende, además, un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
10. Composición farmacéutica según cualquiera de
las reivindicaciones 8 ó 9 que comprende, además, otro principio
activo.
11. Uso de la célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 o de la población celular según la
reivindicación 7 para la elaboración de un medicamento.
12. Uso de la célula o de la población celular
según la reivindicación 11 para la elaboración de un medicamento de
terapia celular somática.
13. Uso de la célula o de la población celular
según cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12 para la elaboración
de un medicamento para la prevención o el tratamiento de lesiones,
enfermedades degenerativas o genéticas de: cartílago, hueso,
músculo, corazón, sistema nervioso central o periférico, piel,
hígado o páncreas.
14. Uso de la célula o de la población celular
según la reivindicación 13 para la elaboración de un medicamento
para la prevención o el tratamiento de lesiones, enfermedades
degenerativas o genéticas de: cartílago o hueso.
15. Uso de la célula según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6 o de la población celular según la
reivindicación 7 para evaluar in vitro la respuesta celular
a, al menos, un agente biológico o farmacológico.
16. Uso de la célula o de la población celular
según la reivindicación 15 donde dicho agente biológico o
farmacológico se selecciona de la lista que comprende péptidos,
anticuerpos, citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento,
partículas virales, hormonas, antibióticos, compuestos inhibitorios,
agentes quimoterapéuticos, agentes citotóxicos, mutágenos, aditivos
alimentarios, composiciones farmacéuticas o preparados
vacunales.
\vskip1.000000\baselineskip
17. Método de obtención de la célula madre
multipotente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que
comprende:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada de mesenterio; y
- b)
- seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de la muestra biológica obtenida en (a).
\vskip1.000000\baselineskip
18. Método de obtención de la célula según
cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6 que comprende:
- a)
- obtener una muestra biológica aislada de mesenterio;
- b)
- seleccionar las células madre multipotentes derivadas de estroma de la muestra biológica obtenida en (a); y
- c)
- cultivar las células madre multipotentes de (b) en condiciones que favorezcan la inducción de su diferenciación a células especializadas.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200901046A ES2345867B1 (es) | 2009-04-03 | 2009-04-03 | Celulas madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio. |
| PCT/ES2010/070205 WO2010112662A1 (es) | 2009-04-03 | 2010-03-31 | Células madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| ES200901046A ES2345867B1 (es) | 2009-04-03 | 2009-04-03 | Celulas madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio. |
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| Publication Number | Publication Date |
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| ES2345867A1 true ES2345867A1 (es) | 2010-10-04 |
| ES2345867B1 ES2345867B1 (es) | 2011-07-28 |
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| ES200901046A Withdrawn - After Issue ES2345867B1 (es) | 2009-04-03 | 2009-04-03 | Celulas madre multipotentes derivadas de estroma de mesenterio. |
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| CN108883135A (zh) * | 2016-03-14 | 2018-11-23 | 泰根尼克斯独资有限公司 | 用于治疗克罗恩病的难治性、复杂性肛周瘘的脂肪组织来源的基质干细胞 |
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| US20060045872A1 (en) | 2004-08-25 | 2006-03-02 | Universidad Autonoma De Madrid Ciudad Universitaria de Cantoblanco | Use of adipose tissue-derived stromal stem cells in treating fistula |
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2009
- 2009-04-03 ES ES200901046A patent/ES2345867B1/es not_active Withdrawn - After Issue
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2010
- 2010-03-31 WO PCT/ES2010/070205 patent/WO2010112662A1/es active Application Filing
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| CN108883135A (zh) * | 2016-03-14 | 2018-11-23 | 泰根尼克斯独资有限公司 | 用于治疗克罗恩病的难治性、复杂性肛周瘘的脂肪组织来源的基质干细胞 |
| CN108883135B (zh) * | 2016-03-14 | 2022-11-04 | 武田药品工业株式会社 | 用于治疗克罗恩病的难治性、复杂性肛周瘘的脂肪组织来源的基质干细胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2010112662A1 (es) | 2010-10-07 |
| ES2345867B1 (es) | 2011-07-28 |
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