CN117568257A - 食蟹猴肝胆类器官模型体外构建方法 - Google Patents
食蟹猴肝胆类器官模型体外构建方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了食蟹猴肝胆类器官模型体外构建方法以及用于体外培养食蟹猴肝胆类器官的培养基，所述培养基包括基础培养基、GlutaMax、B27、Primocin抗生素、HEPES缓冲液、青霉素‑链霉素双抗、N‑乙酰半胱氨酸、烟酰胺、ALK‑5抑制因子、ROCK1抑制剂、胃泌素、R‑Spondin1、Wnt‑3a、EGF、FGF10、Noggin、毛喉素、HGF。所述培养基培养的肝胆类器官可以在体外长期扩增，提高了食蟹猴肝胆类器官培养的成功率，极大减少了食蟹猴肝胆类器官培养周期和成本。
Description
技术领域
本发明涉及生类器官培养技术领域，具体地，本发明涉及一种食蟹猴肝胆类器官模型体外构建方法，更具体地，本发明涉及一种培养基及其用途、获得肝胆类器官的方法和培养肝胆类器官的试剂盒。
背景技术
胆管是肝脏中重要的干细胞来源，胆管的培养对体外构建及诱导肝脏培养具有重要意义。目前胆管的体外培养工艺主要为多能干细胞诱导培养，但该培养方法会使来源供体的生物学特征，尤其是表观遗传特征和翻译后修饰特征发生重大改变，无法代表个体生物学特点。因此，原代来源的胆管细胞的培养无论对科研还是临床应用都具有极大潜在意义。食蟹猴肝胆类器官在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面包含了胆管上皮的所有特征，因此有需要开发一种食蟹猴肝胆类器官模型体外构建方法。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
实验用猴作为灵长类动物，与人体的某些功能是最接近的，特别是免疫系统，所以在生物制品的药物安全性实验研究中，多倾向于选择实验用猴来做实验。实验用猴在医学研究中的需求巨大，传染病学研究、药理学和毒理学研究、生殖生理研究、口腔医学研究、老年病研究、器官移植和眼科研究、内分泌病和畸胎学研究和肿瘤学研究等领域都需要用到，并且，在医学上用于人类新药的研发极其谨慎，新药必须先用于非灵长类的动物，如小白鼠、白兔等，然后开始对猴子等灵长类动物进行实验，只有在包括灵长类等以上动物的身上实验证明没有危害，才能进行对人的临床实验，而灵长类动物的实验则是最后至关重要的环节。
基于基因组序列、解剖形态和药物代谢与人类的相似性，食蟹猴被视为研究人类胃肠功能和疾病的理想动物模型，也是常用于药物毒性试验的动物之一。食蟹猕猴的基因和人类基因组相似度高达百分之九十四，一般人类可以感染上的疾病，食蟹猕猴几乎都能够感染。随着实验用猴供不应求，药物研发成本变高，研发周期变长，从而延误临床前研究，大大影响药品的注册时间。
类器官(Organoids)是一种通过3D培养技术在体外构建的能够模拟原组织结构和功能的微型器官模型。因其拥有真实器官的复杂三维结构以及与来源器官高度相似的生理功能，从而在生物学领域得到了广泛的应用，并逐步代替细胞系。使用细胞外基质(如基质凝胶)的独特系统使有机物更接近体内组织结构和功能特性。肝胆类器官培养正在成为原代细胞培养的一种流行的替代方法，用于在培养皿中重现组织和研究食蟹猴的肝胆生理学和疾病发病机制。
因此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基包括基础培养基、GlutaMax、B27、Primocin抗生素、HEPES缓冲液、青霉素-链霉素双抗、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、ALK-5抑制因子、ROCK1抑制剂、胃泌素、R-Spondin1、Wnt-3a、EGF、FGF10、Noggin、毛喉素、HGF。发明人经过大量实验得到上述较优培养基，该培养基培养的肝胆类器官可以在体外长期扩增，提高了食蟹猴肝胆类器官培养的成功率，极大减少了食蟹猴肝胆类器官培养周期和成本。
根据本发明的实施例，所述培养基进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基。
根据本发明的实施例，所述ALK-5抑制因子选自A83-01。由此，可进一步促进肝胆类器官生长。
根据本发明的实施例，所述ROCK抑制剂选自Y-27632。由此，可显著抑制肝胆类器官凋亡。
需要说明的是，本申请所述的“GlutaMax”是L-谷氨酰胺的替代品，能够显著减少有毒氨的积累，改善细胞活力和生长情况；本申请所述的“B27”是无血清细胞培养添加剂，能够促进细胞发育和再生；本申请所述的“HEPES缓冲液”是一种常用的两性离子缓冲液，在培养基中保持足够的碳酸氢盐以达到营养目的；本申请所述的“Primocin抗生素”是用于保护原代细胞免受微生物污染的抗生素，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、支原体和真菌均有杀伤作用且对原代细胞没有毒性；本申请所述的“青霉素-链霉素双抗”中青霉素对大多数革兰氏阳性菌和少数的革兰氏阴性菌有效，而链霉素对革兰氏阴性菌和少数的革兰氏阳性菌有效，两种抗生素合用能治疗大多数的细菌感染；本申请所述的“N-乙酰半胱氨酸”是一种抗氧化剂，拮抗多种蛋白酶体抑制剂的活性；本申请所述的“烟酰胺”是一种B3维生素，通过促进NAD+氧化还原稳态和提供NAD+作为催化非氧化还原反应的一类酶的底物，在细胞生理学中发挥重要作用；本申请所述的“A83-01”是一个强有力的TGF-βⅠ型受体ALK5/ALK4/ALK 7激酶的抑制剂，A83-01对ALK5的抑制作用很强，可以抑制Smad2/3的磷酸化和TGF-β诱导的生长，促进细胞生长；本申请所述的“Y-27632”是一种选择性ROCK1(p160ROCK)抑制剂，能够显著抑制类器官凋亡；本申请所述的“胃泌素(Gastrin)”，可促进胃肠道的分泌功能，促进胃窦、胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌收缩，整体综合作用是使胃排空减慢并促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖；本申请所述的“R-Spondin1”是Wnt激动剂，能够促进细胞增殖，对肠道干细胞的功能和肠上皮的再生至关重要；本申请所述的“Wnt-3a”是Wnt信号通路的重要组成之一，属于依赖β-连环蛋白(β-catenin)的经典Wnt信号通路，Wnt信号通路在胚胎发育，细胞生长、分化，以及肿瘤发生中起到关键作用；本申请所述的“表皮生长因子(EGF)”是最早发现的生长因子，对调节细胞生长、增殖和分化起着重要作用；本申请所述的“成纤维细胞生长因子10(FGF10)”为成纤维细胞生长因子家族(FGFs)成员，与多种疾病相关，主要包括肿瘤和多种器官发育不全，此外，FGF10还能促进损伤修复、毛发生长和干细胞增殖分化；本申请所述的“Noggin”是对机体多个系统的生长发育和重塑起重要调节作用的一种糖蛋白；本申请所述的“毛喉素(Forskolin)”是目前已知最强的腺苷酸环化酶(Adenylylcyclase)激活剂，可以直接刺激细胞内的腺苷酸环化酶，提高组织中环腺苷酸的浓度，加强细胞内cAMP讯号分子的作用；本申请所述的“肝细胞生长因子(HGF)”是由α链和β链组成的多功能细胞因子，在细胞增殖分化，组织纤维化，肿瘤发生、转移、耐药等方面起着重要作用。
根据本发明的实施例，所述GlutaMax在所述培养基中的体积分数为0.5～1.5％。由此，可改善肝胆类器官的活力和生长情况。
根据本发明的具体实施例，所述GlutaMax在所述培养基中的体积分数为1％。
根据本发明的实施例，所述B27在所述培养基中的体积分数为1～3％。由此，可促进肝胆类器官的发育和再生。
根据本发明的具体实施例，所述B27在所述培养基中的体积分数为2％。
根据本发明的实施例，所述Primocin抗生素在所述培养基中的体积分数为0.01～0.1％。由此，可避免肝胆类器官被污染。
根据本发明的具体实施例，所述Primocin抗生素在所述培养基中的体积分数为0.05％。
根据本发明的实施例，所述HEPES缓冲液在所述培养基中的终浓度为1～10mM。由此，可保持足够的碳酸氢盐供给肝胆类器官生长。
根据本发明的实施例，所述青霉素-链霉素双抗在所述培养基中的体积分数为0.5～1.5％。由此，可避免肝胆类器官被细菌感染。
根据本发明的具体实施例，所述青霉素-链霉素双抗在所述培养基中的体积分数为1％。
根据本发明的实施例，所述N-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的终浓度为0.2～2mM。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述烟酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5～5mM。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述ALK-5抑制因子在所述培养基中的终浓度为0.2～2μM。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述ROCK1抑制剂在所述培养基中的终浓度为0.5～5μM。由此，可促进肝胆能够显著抑制类器官凋亡。
根据本发明的实施例，所述胃泌素在所述培养基中的终浓度为1～10nM。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述R-Spondin1在所述培养基中的终浓度为50～5000ng/ml。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述Wnt-3a在所述培养基中的终浓度为50～200ng/ml。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述EGF在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述FGF10在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述Noggin在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述毛喉素在所述培养基中的终浓度为1～10μM。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
根据本发明的实施例，所述HGF在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml。由此，可促进肝胆类器官生长和发育。
在本发明的另一个方面，本发明提出了前面所述的培养基在培养肝胆类器官中的用途。发明人经过实验发现，采用前面所述的培养基能够使肝胆类器官在体外长期扩增，提高食蟹猴肝胆类器官培养的成功率，减少食蟹猴肝胆类器官培养周期和成本。
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种获得肝胆类器官的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括利用前面所述的培养基培养肝细胞或肝胆细胞，以便获得所述肝胆类器官。采用该方法能够使肝胆类器官在体外长期扩增，提高食蟹猴肝胆类器官培养的成功率，减少食蟹猴肝胆类器官培养周期和成本。
根据本发明的实施例，所述获得肝胆类器官的方法进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述肝细胞或肝胆细胞是通过将肝组织或肝外胆管组织经过消化处理得到的，所述消化处理是利用组织消化液进行的。
根据本发明的实施例，在培养所述肝细胞或肝胆细胞之前，预先将肝细胞或肝胆细胞与基质胶混合。
根据本发明的实施例，所述肝细胞或肝胆细胞与所述基质胶的体积比为(1～3)：(7～9)。由此，能够有助于后续肝胆类器官的生长。
根据本发明的实施例，所述培养时间为4～7天。
根据本发明的实施例，所述组织消化液包括基础培养基、胶原酶IV、核酸酶和ROCK1抑制剂。
根据本发明的实施例，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
根据本发明的实施例，所述ROCK1抑制剂选自Y-27632。
根据本发明的实施例，所述ROCK1抑制剂在所述组织消化液的终浓度为5～50μM。
根据本发明的实施例，所述胶原酶IV在所述组织消化液的终浓度为400～500U/ml。
根据本发明的实施例，所述核酸酶在所述组织消化液的终浓度为10～50U/ml。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养肝胆类器官的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括前面所述的培养基。所述试剂盒能够大大缩短肝胆类器官培养所需时间，提高肝胆类器官培养的成功率和存活率，并能快速建立肝胆类器官模型。
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括如下附加技术特征的至少之一：
根据本发明的实施例，所述试剂盒进一步包括组织消化液。
根据本发明的实施例，所述组织消化液包括基础培养基、胶原酶IV、核酸酶和ROCK1抑制剂。
根据本发明的实施例，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基。
根据本发明的实施例，所述ROCK1抑制剂选自Y-27632。
根据本发明的实施例，所述ROCK1抑制剂在所述组织消化液的终浓度为5～50μM。
根据本发明的实施例，所述胶原酶IV在所述组织消化液的终浓度为400～500U/ml。
根据本发明的实施例，所述核酸酶在所述组织消化液的终浓度为10～50U/ml。
有益效果：
本发明可对食蟹猴来源的微量肝组织、胆管组织进行体外培养，在培养过程中，保留胆管上皮细胞成分，自动筛选去除成肝细胞、免疫细胞等成分，形成从细胞构成及空间结构均近似于胆管的类器官；培养基含有胆管上皮细胞培养所需的最少组分，用于培养正常胆管组织，形成的胆管类器官维持了原发组织的形态结构和基因特征。
本发明所述培养基及培养方法可以实现食蟹猴的类器官培养；培养基培养的肝胆类器官可以在体外长期扩增，大于5代；仅使用少量胆管上皮细胞进行培养，提高了食蟹猴肝胆类器官培养成功率，极大减少了食蟹猴肝胆类器官培养周期和成本。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是根据本发明实施例的肝胆管类器官P1代培养2天得到的生长状态图；
图2是根据本发明实施例的肝胆管类器官P3代培养3天得到的生长状态图；
图3是根据本发明对比例的无特异性添加因子培养的肝胆类器官。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
表1
实施例1
使用表1中的试剂配置食蟹猴肝胆类器官培养基，所述培养基由Advanced DMEM/F12和特异性添加因子组成，特异性添加因子在基础培养基中的终浓度为：
GlutaMax(1％v/v)、B27(2％v/v)、Primocin抗生素(0.05％v/v)、青霉素-链霉素双抗(1％v/v)、HEPES缓冲液(1～10mM)、N-乙酰半胱氨酸(0.2～2mM)、烟酰胺(0.5～5mM)、A83-01(0.2～2μM)、Y-27632(0.5～5μM)、胃泌素(1～10nM)、R-Spondin1(50～5000ng/ml)、Wnt-3a(50～200ng/ml)、EGF(10～100ng/ml)、FGF10(10～100ng/ml)、Noggin(10～100ng/ml)、毛喉素(1～10μM)、HGF(10～100ng/ml)。
制备组织消化液：
组织消化液是含有如下各终浓度的组分的Advanced DMEM/F12培养基：400～500U/ml胶原酶IV+10～50U/ml核酸酶+5～50μM Y27632
培养方法：
1.组织样本收集：标准手术程序取食蟹猴来源的肝外胆管组织或肝组织(后续简称组织)。
2.组织处理：将组织转移到生物安全柜中，并将其放入盛有冷PBS(含1％青霉素-链霉素双抗)的6cm培养皿中，多次清洗后用组织剪将组织切成1-2mm3的碎片。
3.去除杂质细胞：将剪碎的组织转移到15mL离心管中，加入约10mL冷的PBS(含1％青霉素-链霉素双抗)并用移液管上下吹打样品，以去除红血球和脂肪，随后让组织碎片沉降，并弃去约7.5mL的上清液，包括任何漂浮的脂肪。重复此洗涤步骤两次。
4.消化液消化：将步骤3中的组织碎片用适量的上述制备的组织消化液重悬，将获得组织消化悬液转移至新的离心管内，于37℃，100-200rpm条件下的恒温振荡培养箱中，消化20-60分钟。消化至溶液中的细碎组织可以通过1mL的无菌吸头。消化期间可使用不同规格(顺序从大到小如10mL，5mL，1mL)的移液管吹打组织消化悬液，帮助充分消化。
5.终止消化：当镜检步骤4中的组织消化悬液出现大量胆管结构时，即表明消化完成。在消化完成的组织悬液中加入胎牛血清(FBS)终浓度达1％-5％以减缓消化作用，同时轻轻吹打5-10次。静置3-10min，待组织碎片自然沉降后，将上清液转移至新的15ml离心管中，加入含1％青霉素-链霉素双抗的PBS至总体积为10ml，然后用100-300×g的速度离心5分钟，弃上清以洗去残留的消化液。
6.类器官清洗：用含有1％青霉素-链霉素双抗的PBS清洗步骤5中的组织碎片沉淀中的细胞2次(混匀后250×g离心3分钟，弃去上清液)以除去FBS。若所获细胞沉淀呈红色，说明其中包含红细胞，则需在清洗前于沉淀中加入500μL红细胞裂解液裂解红细胞，室温裂解3分钟并于250×g离心力离心3分钟，吸去上清液保留沉淀，再对沉淀进行清洗。
7.基质胶3D包裹：将清洗后的细胞沉淀用含有1％青霉素-链霉素双抗的PBS进行混悬，取少量悬液进行活细胞检测和计数，并按照100,000-500,000个细胞/mL的密度加入基质胶(>70％)并在冰上混匀，混匀后置于冰上。
8.种板培养：用移液器吸取基质胶和细胞的混合液移至细胞培养孔板中，(如24孔细胞培养板每孔点20-30μL混合悬液)。将培养板放入37℃，在5％ CO2细胞培养箱中孵育15-20分钟，沿孔壁缓缓加入上述配置的食蟹猴肝胆类器官培养基。
9.持续培养：将细胞培养板放入培养箱中进行培养，每3天使用上述配置的食蟹猴肝胆类器官培养基换液并于倒置显微镜下拍照，记录多个视野中的类器官的形态和分布。
P1代培养两天后的类器官生长状态图如图1所示，结果表明肝胆类器官的生长状态较好，说明采用本申请的培养基有助于肝胆类器官的体外长期扩增，能够提高食蟹猴肝胆类器官培养成功率，极大减少了食蟹猴肝胆类器官培养周期和成本。
P3代培养三天后的类器官生长状态图如图2所示，结果表明经过连续传代后，肝胆类器官的生长状态依旧良好，说明本申请的培养基能够用于肝胆类器官的长期体外扩增培养。
对比例1
使用无特异性添加因子的培养基，即Advanced DMEM/F12基础培养基中加入1体积％的GlutaMax、2体积％的B27、0.05体积％的Primocin抗生素、1体积％的青霉素-链霉素双抗和HEPES缓冲液(1～10mM)，按照实施例1所述的方法进行培养肝胆类器官，P1代培养两天后的类器官生长状态图如图3所示，在不添加特异性添加因子的条件下培养的肝胆类器官生长较为缓慢，数量少。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种培养基，其特征在于，包括：
基础培养基、GlutaMax、B27、Primocin抗生素、HEPES缓冲液、青霉素-链霉素双抗、N-乙酰半胱氨酸、烟酰胺、ALK-5抑制因子、ROCK1抑制剂、胃泌素、R-Spondin1、Wnt-3a、EGF、FGF10、Noggin、毛喉素、HGF。
2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述基础培养基选自Advanced DMEM/F12培养基；
任选地，所述ALK-5抑制因子选自A83-01；
任选地，所述ROCK1抑制剂选自Y-27632。
3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述GlutaMax在所述培养基中的体积分数为0.5～1.5％；
任选地，所述B27在所述培养基中的体积分数为1～3％；
任选地，所述Primocin抗生素在所述培养基中的体积分数为0.01～0.1％；
任选地，所述HEPES缓冲液在所述培养基中的终浓度为1～10mM；
任选地，所述青霉素-链霉素双抗在所述培养基中的体积分数为0.5～1.5％；
任选地，所述N-乙酰半胱氨酸在所述培养基中的终浓度为0.2～2mM；
任选地，所述烟酰胺在所述培养基中的终浓度为0.5～5mM；
任选地，所述ALK-5抑制因子在所述培养基中的终浓度为0.2～2μM；
任选地，所述ROCK1抑制剂在所述培养基中的终浓度为0.5～5μM；
任选地，所述胃泌素在所述培养基中的终浓度为1～10nM；
任选地，所述R-Spondin1在所述培养基中的终浓度为50～5000ng/ml；
任选地，所述Wnt-3a在所述培养基中的终浓度为50～200ng/ml；
任选地，所述EGF在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml；
任选地，所述FGF10在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml；
任选地，所述Noggin在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml；
任选地，所述毛喉素在所述培养基中的终浓度为1～10μM；
任选地，所述HGF在所述培养基中的终浓度为10～100ng/ml。
4.权利要求1～3任一项所述的培养基在培养肝胆类器官中的用途。
5.一种获得肝胆类器官的方法，其特征在于，包括：利用权利要求1～3任一项所述的培养基培养肝细胞或肝胆细胞，以便获得所述肝胆类器官。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述肝细胞或肝胆细胞是通过将肝组织或肝外胆管组织经过消化处理得到的，所述消化处理是利用组织消化液进行的；
任选地，在培养所述肝细胞或肝胆细胞之前，预先将肝细胞或肝胆细胞与基质胶混合；
任选地，所述肝细胞或肝胆细胞与所述基质胶的体积比为(1～3)：(7～9)；
任选地，所述培养时间为4～7天；
任选地，所述组织消化液包括基础培养基、胶原酶IV、核酸酶和ROCK1抑制剂；
任选地，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基；
任选地，所述ROCK1抑制剂选自Y-27632；
任选地，所述ROCK1抑制剂在所述组织消化液的终浓度为5～50μM；
任选地，所述胶原酶IV在所述组织消化液的终浓度为400～500U/ml；
任选地，所述核酸酶在所述组织消化液的终浓度为10～50U/ml。
7.一种培养肝胆类器官的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1～3任一项所述的培养基，
任选地，所述试剂盒进一步包括组织消化液。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述组织消化液包括基础培养基、胶原酶IV、核酸酶和ROCK1抑制剂；
任选地，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12培养基；
任选地，所述ROCK1抑制剂选自Y-27632；
任选地，所述ROCK1抑制剂在所述组织消化液的终浓度为5～50μM；
任选地，所述胶原酶IV在所述组织消化液的终浓度为400～500U/ml；
任选地，所述核酸酶在所述组织消化液的终浓度为10～50U/ml。
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