JP2023551479A - 脂肪生成細胞組成物及び方法 - Google Patents

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ピー． ンゴ，ル
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Abstract

疾患又は障害の処置、予防、又は改善に有用な脂肪生成細胞を含む組成物が本明細書に開示される。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１１月２５日に出願された米国仮特許出願第６３／１１８，２２６号、２０２０年１１月２５日に出願された第６３／１１８，２３２号、２０２０年１１月２５日に出願された第６３／１１８，２３５号、及び２０２０年１１月２５日に出願された第６３／１１８，２３７号に対する優先権の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに提出されている。配列表は、２０２１年１１月２４日に作成されたファイルＶＬ７１－００１ＰＣ＿１２３８２８－５０３２＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５として提供され、サイズは２８，６７２バイトである。配列表の電子形式の情報は、その全体が参照により組み込まれる。
分野
本発明は、部分的には、脂肪生成細胞を含む同種異系、非免疫原性、長時間作用型組成物、並びに、例えばヒトなどの哺乳動物対象における、疾患又は障害の処置又は予防に有用なその作製及び使用方法に関する。
背景
いくつかの疾患又は障害は、異常なタンパク質産生又は完全なタンパク質欠損に関連している。例えば、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）は、最も一般的にはフェニルアラニンをチロシンに異化する酵素であるフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）の機能障害による、アミノ酸フェニルアラニンレベルの上昇を特徴とする。貧血は、体が十分なエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生できないことによって引き起こされる赤血球産生の減少を特徴とする。
現在、これら及び他の多くの疾患又は障害に対する有効な処置は不足しており、したがって、これらの疾患又は障害の処置に有用な治療法の必要性が依然として存在する。既存の細胞療法には、低い効力、低い発現レベル（例えば、タンパク質、脂質など）、コスト、短期間の生着、免疫原性（安全性）、低い拡張性／製造性を含む、数多くの欠点がある。
概要
一態様では、本発明は、治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性の長時間作用型組成物に関する。いくつかの実施形態では、組成物は、それを必要とする対象において疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、単回投与で投与された場合、対象における疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は培養され、拡大される。いくつかの実施形態では、組成物は、投与時に炎症反応を引き起こさない。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に投与すると、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－２、若しくはＩＦＮ－ガンマ、又はそれらの任意の組み合わせの約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％未満の増加を誘発する。いくつかの実施形態では、組成物は、対象に投与すると、ＩＤＯ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＧＦ、ＰＧＥ２、ＴＧＦベータ、及びＩＬ－６、又はそれらの任意の組み合わせの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、又は約４００％以上の増加を誘発する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞、脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）、及びＣＤ３４＋細胞から選択される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、褐色／ベージュ脂肪細胞又は白色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、ＣＩＤＥＣ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、ＬＧＡＬＳ１２、ＡＤＩＰＯＱ、ＴＵＳＣ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＰＰＡＲＧ、ＬＥＰ、ＣＥＢＰＡ、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を発現及び／又は分泌する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、以下：
ａ．有糸分裂後であること；
ｂ．約３５％（脂肪組織の新鮮重量％）を超える；任意選択により、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％を超える、脂質含量を有すること；
ｃ．約６０％～約９５％、任意選択により、６０～９４％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６０％～約７０％、約６０％～約６５％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、又は約８５％～約９０％の脂肪組織中の脂肪含量を有すること；
ｄ．約８０％、任意選択により、約７５～約８５％の平均脂肪含量を有すること；
ｅ．約５％～約４０％、任意選択により、約６～３６％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約４０％、約１５％～約４０％、約２０％～約４０％、約２５％～約４０％、約３０％～約４０％、又は約３５％～約４０％の脂肪組織中の水分含量を有すること；
ｆ．約１５％、任意選択により、約１２．５％～約１７．５％の平均水分含量を有すること；
ｇ．約１ｇ／ｍＬ、任意選択により、０．９１６ｇ／ｍＬ、約０．５ｇ／ｍＬ、約０．６ｇ／ｍＬ、約０．７ｇ／ｍＬ、約０．８ｇ／ｍＬ、約０．９ｇ／ｍＬ、約１．１ｇ／ｍＬ、又は約１．２ｇ／ｍＬの比重を有すること；
ｈ．ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、及びミリスチン酸、それらの誘導体のうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
ｉ．遊離脂肪酸、コレステロール、モノグリセリド、及びジグリセリドのうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
ｊ．細胞体積の約９０％を超える、任意選択により、９５％を超える、又は約９８％を超える、又は約９３％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９９％のサイズの脂質滴を有すること；
ｋ．細胞の体積の少なくとも約３０％～約９９％；任意選択により、少なくとも約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％を含む脂質滴を有すること；
ｌ．直径約２０～３００μｍ、任意選択により、約２０～３００μｍ、約２０～２００μｍ、約２０～１００μｍ、約２０～５００μｍ、約２０～３０μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２００μｍ、約１５０～３００μｍ、約１５０～２００μｍ、又は約２００～３００μｍの表面サイズを有すること；
ｍ．約２００～約４００μｍ３、任意選択により、約２００～約３５０μｍ３、約２００～約３００μｍ３、約２００～約２５０μｍ３、約２５０～約４００μｍ３、約２５０～約３５０μｍ３、約２５０～約３００μｍ３、約３００～約３５０μｍ３、又は約３００～約４００μｍ３の核体積を有すること；
ｎ．約４，０００～約１８，０００μｍ３、任意選択により、約４０００～約１５０００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３、約４０００～約１００００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約７５００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３の総体積を有すること；
ｏ．約１：２０～１：９０、任意選択により、約１：２０～約１：８０、約１：２０～約１：７０、約１：２０～約１：６０、約１：２０～約１：５０、約１：２０～約１：４０、約１：２０～約１：３０；約１：３０～約１：８０、約１：４０～約１：８０、約１：５０～約１：８０、約１：６０～約１：８０、又は約１：７０～約１：８０の核対細胞比を有すること；
ｐ．扁平な核を有すること；
ｑ．総細胞体積の約１０％～約６０％未満の小さい細胞質を有し、細胞質には脂質滴体積が含まれず、任意選択により、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、又は約５０％未満であること；
ｒ．液体を吸収及び放出できること；
ｓ．水又は水溶液、任意選択により、培地、又はＨＢＳＳ中で浮揚性であること；
ｔ．非中心に位置する核を有すること；
ｕ．１つ以上の脂肪滴を有すること；
ｖ．非球形の細胞質を有すること；
ｗ．アディポネクチン、レプチン、及びＴＮＦ－αのうちの１つ以上を分泌できること；
ｘ．脂質生成ができること；
ｙ．トリグリセリド（ＴＧ）を貯蔵できること；
ｚ．非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、任意選択により、オレイン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、及びステアリン酸などの長鎖脂肪酸を分泌できること；
ａａ．ホルモンに応答性であること；
ｂｂ．神経入力に応答性であること；
ｃｃ．約９年、任意選択により、約８年～約１０年の細胞代謝回転速度を有すること；
ｄｄ．約４５μｍ、任意選択により、約４７．２μｍ、約４０μｍ、約４２．５μｍ、約４７．５μｍ、又は約５０μｍの平均直径を有すること；
ｅｅ．約２５％の細胞が約５０μｍ未満の直径を有し；約４０％の細胞が約５０～６９μｍの直径を有し；約２５％の細胞が約７０～８９μｍの直径を有し；且つ約１０％の細胞が約９０μｍ以上の直径を有する、直径分布を有する細胞集団；
ｆｆ．心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）に応答性であること；
ｇｇ．脂肪分解ができること；
ｈｈ．ステロイドホルモンに結合及び応答できる受容体を発現すること；
ｉｉ．ホスファチジルコリンにより溶解されること；
ｊｊ．約１ｇ／ｍｌ、任意選択により、約０．８ｇ／ｍｌ、約０．９ｇ／ｍｌ、約１．１ｇ／ｍｌ、約１．２ｇ／ｍｌの細胞密度；
ｋｋ．約８０％を超える、任意選択により、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の生存率；
ｌｌ．約８０％を超える、任意選択により、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の純度、
ｍｍ．適切な効力、任意選択により、約２００μｇ／ｍｌを超えるオイルレッドＯの溶出量；及び
ｎｎ．微生物汚染について陰性
のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、又は３５個以上を有することを特徴とする。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約３８，０００，０００細胞／ｍＬ、約７０，０００，０００細胞／ｍＬ～約３，０００，０００細胞／ｍＬ、又は約４０，０００，０００細胞／ｍＬ～約２０，０００，０００細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、脂肪細胞及び脂肪細胞前駆細胞（脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）及びＣＤ３４＋細胞など）のうちの１つ以上から任意選択により選択される、約５０，０００～約６，０００，０００，０００個の脂肪生成細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＡＳＣである。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、約１０万～１億細胞／ｍＬ又は約５００万細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、組成物は、約１００万～約７億５０００万個のＡＳＣ又は約１億２０００万個のＡＳＣを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約２５０，０００細胞／ｋｇ～約４００万細胞／ｋｇのＡＳＣ濃度を含む。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、以下：
ａ．約９０％以上の生存率；
ｂ．約５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース取り込み；
ｃ．約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５ｍｍｏｌ／Ｌの乳酸産生
のうちの１つ以上、又は１つ、２つ、３つを有することを特徴とする。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０及びＣＤｗ２９３のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣの約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０及びＣＤ８６のうちの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣの少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％のＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、ＣＤ１０について選択的に富化されたＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣの集団を含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ１０富化ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣによって得ることができる白色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、哺乳動物の脂肪生成細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ヒト脂肪生成細胞、又はヒト対象における使用に適した脂肪生成細胞から選択される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、対象に投与されると、治療有効量の脂肪細胞を提供する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、対象に投与されると、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；アディプシン；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；アディポネクチン；ＰＥＸ５；ＡＴＰ：ｃｏｂ（１）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＭＡＢ）；１４－３－３タンパク質イプシロン；２－オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットアルファ、ミトコンドリア、ＢＣＫＤＨＡ；２－オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットベータ、ミトコンドリア、ＢＣＫＤＨＢ；３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）；３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡデアシラーゼ（ＨＩＢＣＨ）；３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ＭＣＣＣ１；３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ＭＣＣＣ２；４－アミノ酪酸－α－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＢＡＴ）；５－ヌクレオチダーゼ；６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＭＣＡＤ；短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＳＣＡＤ；超長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＶＬＣＡＤ；アセチルＣｏＡチオラーゼ（アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ）、ＡＣＡＴ１；酸性セラミダーゼ；アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＡＰＲＴ；アデノシンデアミナーゼ；脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１；アグリン；アルデヒドオキシダーゼ；アルド－ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ２；アルカリホスファターゼ、組織非特異的アイソザイム；アルキルジヒドロキシアセトンリン酸シンターゼ、ＡＧＰＳ；アルファ－２－マクログロブリン；アルファエノラーゼ；アルファフェトプロテイン；アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ；アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ８２ｋＤａ型；アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ７７ｋＤａ型；アミノアシラーゼ－１；アンジオテンシノーゲン；アンジオテンシン－１；アンジオテンシン－２；アンジオテンシン－３；アンジオテンシン－４；アンジオテンシン１－９；アンジオテンシン１－７；アンジオテンシン１－５；アンジオテンシン１－４；アネキシンＡ５；アダプター関連タンパク質複合体３サブユニットベータ１、ＡＰ３Ｂ１；アポリポタンパク質Ｅ；アルギニノコハク酸リアーゼ、ＡＳＬ；アルギニノコハク酸シンターゼ；アルギニノコハク酸シンテターゼ、ＡＳＳ；アリールスルファターゼＡ；アリールスルファターゼＡ成分Ｂ；アリールスルファターゼＡ成分Ｃ；アリールスルファターゼＢ；アスパルチルグルコサミニダーゼ；ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、ＡＢＣＤ１；ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、ＤＤＸ３Ｘ；エンドレペリン；ベータ－２－ミクログロブリン；ベータ－ガラクトシダーゼ；ベータ－ヘキソサミニダーゼサブユニットアルファ、ＨＥＸＡ；ベータヘキソサミニダーゼサブユニットベータ、ＨＥＸＢ；二官能性プリン生合成タンパク質、ＰＵＲＨ；ビグリカン；ビオチニダーゼ；ビオチニダーゼ；骨形成タンパク質１；分岐酵素、ＧＢＥ１；カルモジュリン；カルレティキュリン；ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットガンマ；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；軟骨関連タンパク質；カタラーゼ；カタラーゼ、ＣＡＴ；カテプシンＡ；カテプシンＢ；カテプシンＤ；カテプシンＦ；カテプシンＫ；シトリン、ＳＬＣ２５Ａ１３；コラーゲンアルファ－１（Ｉ）鎖；コラーゲンアルファ－１（ＩＩＩ）鎖；コラーゲンアルファ－１（ＩＶ）鎖；アレステン；コラーゲンアルファ－１（Ｖ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）鎖；エンドスタチン、コラーゲンアルファ－２（Ｉ）鎖；コラーゲンアルファ－２（ＩＶ）鎖；カンスタチン；コラーゲンアルファ－２（Ｖ）鎖；コラーゲンアルファ－２（ＶＩ）鎖；コラーゲンアルファ－３（ＶＩ）鎖；補体Ｃ１ｒサブコンポーネント；補体Ｃ１ｓサブコンポーネント；補体Ｃ３；補体Ｃ４ベータ鎖；補体因子Ｄ；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ａ、ＣＰＴ１Ａ；シスタチオニンβシンターゼ、ＣＢＳ；シスタチン－Ｃ；シスチノシン、ＣＴＮＳ；シトクロムｃ；サイトカイン受容体様因子１；細胞質アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＡＣＡＴ２；Ｄ－二官能性酵素、ＨＳＤ１７Ｂ４；デコリン；ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア；ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ、ＧＮＰＡＴ；ジペプチジルペプチダーゼ１；カテプシンＣ；ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１；ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質２；エラスチン；伸長因子２；電子伝達フラビンタンパク質サブユニットアルファ、ＥＴＦＡ；電子伝達フラビンタンパク質サブユニットベータ、ＥＴＦＢ；電子伝達フラビンタンパク質デヒドロゲナーゼ、ＥＴＦＤＨ；細胞外マトリックスタンパク質１；フィブリリン－１；フィブリリン－２；フィブロネクチン；フィブリン－１；フィブリン－５；ホルミルグリシン生成酵素、ＳＵＭＦ１；フルクトース１，６－ビホスファターゼ、ＦＢＰ１；フマリルアセトアセターゼ；フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質２Ａ、ＦＡＨＤ２Ａ；ガラクトセレブロシダーゼ；ガラクトキナーゼ１；ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ＧＡＬＴ；ガングリオシドＧＭ２アクチベーター；ガングリオシドＧＭ２アクチベーターアイソフォーム短鎖；ゲルソリン；ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ＧＮＰＴＡ；グルコース－６－リン酸１－デヒドロゲナーゼ；グルコース－６－リン酸イソメラーゼ；グルコース－６－リン酸トランスロカーゼ、Ｇ６ＰＴ１；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＧＣＤＨ；グルタチオンペルオキシダーゼ３；グルタチオンシンテターゼ；グリセロールキナーゼ；グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（＋）］、細胞質；グリシン切断酵素システム、ＡＭＴ；グリシン切断酵素システム、ＧＣＳＨ；グリコーゲン脱分枝酵素；４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼ；アミロ－アルファ－１，６－グルコシダーゼ；グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓型；グリピカン－１；グリピカン－６；ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ三官能性多酵素複合体サブユニットアルファ、ＨＡＤＨＡ；ハプトグロビン；ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＳＧＳＨ；ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ＨＧＳＮＡＴ；ホルモン感受性リパーゼ；ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＬＵＤ１の超活性；ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＨＰＲＴ；イズロン酸－２－スルファターゼ、ＩＤＳ；インスリン様成長因子結合タンパク質７；間質性コラゲナーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格１；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格６Ｂ；Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＡ鎖；Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖；ラクトイルグルタチオンリアーゼ；ラミニンサブユニットアルファ－２；ラミニンサブユニットアルファ－４；ラミニンサブユニットベータ－１；ラミニンサブユニットベータ－２；ラミニンサブユニットガンマ－１；レプチン；分枝鎖アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、ミトコンドリア、ＤＢＴのリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分；リポタンパク質リパーゼ；肝臓及び筋肉ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＢ；肝臓ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＧ２；リソソーム酸リパーゼ／コレステリルエステルヒドロラーゼ；リソソームアルファ－グルコシダーゼ；リソソームアルファ－マンノシダーゼ；リソソーム保護タンパク質；ＣＬＮ６膜貫通ＥＲタンパク質、ＣＬＮ６；ＣＬＮ８膜貫通ＥＲ及びＥＲＧＩＣタンパク質、ＣＬＮ８；リソソーム膜貫通ＣＬＮ３タンパク質、ＣＬＮ３；リソソーム膜貫通ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ５；リソソーム関連膜糖タンパク質２；リソソーム輸送調節因子、ＬＹＳＴ；マロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ、ＭＬＹＣＤ；マトリリン－３；マトリックスＧｌａタンパク質；メラノフィリン、ＭＬＰＨ；メチオニンシンターゼ還元酵素、ＭＴＲＲ；メチレンテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、ＭＴＲ；メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、ＭＴＨＦＲ；メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤＨ６Ａ１；メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ；メバロン酸キナーゼ；ミトコンドリア分岐鎖アミノトランスフェラーゼ２、ＢＣＡＴ２；ミトコンドリアオルニチントランスロカーゼ、ＳＬＣ２５Ａ１５；メチルマロン酸尿Ａ型、ＭＭＡＡ；モリブドプテリンシンターゼ、ゲフィリン、ＭＯＣＳ１Ａ；ムコリピン－１、ＭＣＯＬＮ１；筋肉ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＡ１；ミオシンＶａ、ＭＹＯ５Ａ；ミオシン軽鎖４；Ｎ－アセチルガラクトサミン－６スルファターゼ、ＧＡＬＮＳ；Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ；ニコチンアミドＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＮＰＣ細胞内コレステロールトランスポーター１、ＮＰＣ１；パルミトイルプロテインチオエステラーゼ－１、ＰＰＴ１；パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、ＰＰＴ

２；ペントラキシン関連タンパク質、ＰＴＸ３；ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼ、ＦＫＢＰ１０；ペルオキシダシンホモログ；ペロキシン－１、２、３、５、６、７、１０、１２、１３、１４、２６、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ；ホスホグルコムターゼ－１；ホスホグリセリン酸キナーゼ１；ホスホグリセリン酸ムターゼ１；色素上皮由来因子、ＰＥＤＦ；血漿アルファ－Ｌ－フコシダーゼ；細胞膜カルニチン輸送、ＯＣＴＮ２；血漿プロテアーゼＣ１阻害剤；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１；プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；プロサポシン；プロテオグリカン４；プロテオグリカン４Ｃ末端部分；ピルビン酸カルボキシラーゼ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＤＬＡＴ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＢ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＸ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＰ１；Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－２７Ａ、ＲＡＢ２７Ａ；レチノール結合タンパク質４；リボヌクレアーゼＴ２；セマフォリン－７Ａ；セピアプテリン還元酵素；セリンプロテアーゼ、ＨＴＲＡ１；セロトランスフェリン；セルピンＢ６；血清アミロイドＡ－１タンパク質；短分岐鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＡＣＡＤＳＢ；シアル酸シンターゼ；シアリダーゼ－１；シアリン（シアル酸輸送）、ＳＬＣ１７Ａ５；溶質輸送隊ファミリー２２メンバー５、ＳＬＣ２２Ａ５；ＳＰＡＲＣ関連モジュラーカルシウム結合タンパク質２；スペクトリンアルファ鎖、非赤血球１；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、ＳＭＰＤ１；スクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＯＸＣＴ１；スシリピート含有タンパク質、ＳＲＰＸ２；タファジン；テネイシン；トロンボスポンジン－２；トランスフォーミング成長因子ベータ誘導タンパク質ｉｇ－ｈ３；移行型小胞体ＡＴＰアーゼ；トリオースリン酸イソメラーゼ；トリペプチジルペプチダーゼ１；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ；血管内皮増殖因子Ｃ；バーシカンコアタンパク質；ビメンチン；ビタミンＫ依存性プロテインＳ；Ｘ連鎖ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＡ２；Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ；α－フコシダーゼ、ＦＵＣＡ１；α－ガラクトシダーゼＡ、ＧＬＡ；α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ＮＡＧＡ；β－グルコセレブロシダーゼ（別名グルコシルセラミダーゼ）；ＧＢＡ、β－グルクロニダーゼ、ＧＵＳＢ；β－マンノシダーゼ（β-mannosidasen）；ＶＥＧＦＡ；ＶＥＧＦ１６５；ＦＧＦ２；ＦＧＦ４；ＰＤＧＦ－ＢＢ（血小板由来成長因子）；Ａｎｇ１（アンジオポイテン１）、ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子）；ＬＰＡ産生酵素（ＡＸＴ）；及びフタルイミド血管新生因子（ＰＮＦ１）を含むがそれらに限定されない、治療有効量の１つ以上のタンパク質及び／又は他の分子を提供する。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸は、脂肪細胞特異的プロモーター、任意選択により、最小の近位プロモーター配列を任意選択により含む、アディポネクチンプロモーター又はａＰ２／ＦＡＢＰ４プロモーターを含み、任意選択により、１つ以上の遠位エンハンサー配列及び追加の転写因子結合部位、任意選択により、Ｃ／ＥＢＰα結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、アディポネクチンプロモーター、任意選択により、Ｃ／ＥＢＰα結合部位である。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、治療用タンパク質と作動的に関連している。
一態様では、本発明は、治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、自己由来、非免疫原性の長時間作用型組成物に関し、ここで、脂肪生成細胞は、１つ以上の異種核酸を含む。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％以上が生存可能である。いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の細菌、ウイルス、真菌、及び発熱物質を実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ、アルファ改変最小必須培地（アルファ．ＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ培地１６４０）、ＨＢＳＳ、ヒトアルブミン及びリンゲル液など、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量のヘパリン、ＦＢＳ、ヒトアルブミン、ｂＦＧＦ、ＰＰＡＲ－γアゴニスト、インスリン、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、足場を含む。いくつかの実施形態では、足場は、生分解性生体材料、任意選択により、コラーゲン、様々なプロテオグリカン、アルギン酸塩ベースの基質及びキトサンなどの天然生体材料を含む。いくつかの実施形態では、足場は、合成生体材料、任意選択により、合成ポリマーベースの材料を含む。いくつかの実施形態では、足場は、ヒドロゲル、マトリゲル、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、ＰＧＡ、ＰＬＡ、及びＰＧＡ／ＰＬＡコポリマー、シルク、死体又は非ヒト動物に任意選択により由来する無細胞／脱細胞化足場、生分解性生体材料、任意選択により、コラーゲン、プロテオグリカン、アルギン酸塩ベースの基材、キトサン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量の１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、鎮痛剤及び抗感染剤のうちの１つ以上である。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下、皮内、筋肉内、頭蓋内、眼内、静脈内、及び脂肪体から選択される経路による投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、生着後１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、２週間まで、３週間まで、１ヶ月まで、２ヶ月まで、３ヶ月まで、４ヶ月まで、５ヶ月まで、６ヶ月まで、７ヶ月まで、８ヶ月まで、９ヶ月まで、１０ヶ月まで、１１ヶ月まで、１年まで、若しくは２年まで、又はそれを超えて持続する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、１つ以上のタンパク質及び／又は他の分子を、生着後１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、２週間まで、３週間まで、１ヶ月まで、２ヶ月まで、３ヶ月まで、４ヶ月まで、５ヶ月まで、６ヶ月まで、７ヶ月まで、８ヶ月まで、９ヶ月まで、１０ヶ月まで、１１ヶ月まで、１年まで、若しくは２年まで、又はそれを超えて分泌する。
一態様では、本発明は、本開示の組成物を含むシリンジに関する。いくつかの実施形態では、シリンジは、任意選択により約３ｍＬ未満又は約２ｍＬ以下の体積で、予め充填されている。いくつかの実施形態では、組成物は、－８０℃、－２０℃、４℃、又は２１℃で保存した場合、少なくとも１２、２４、３６、又は４８時間安定であり、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、又は約５％未満の細胞生存率の喪失を示す。
一態様では、本発明は、それを必要とする対象における疾患又は障害を処置、予防、又は改善するための方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、任意選択により本開示のシリンジを介して、本開示の組成物を対象に投与することを含む。
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物であり、任意選択により、霊長類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトであり、任意選択により、成人、子供、又は乳児である。いくつかの実施形態では、組成物は、単回投与で、任意選択により単一部位又は複数部位に、投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、複数回投与で、任意選択により単一部位又は複数部位に、投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、疾患又は障害の複合寛解又は臨床的寛解は、投与から２４、１８、１２、８、又は６週間以内に達成される。いくつかの実施形態では、対象は、リソソーム蓄積障害、代謝障害、補体欠損症、脂肪細胞障害、内分泌障害、血管疾患、分枝鎖アミノ酸代謝障害、結合組織障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、血液疾患、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ベータアミノ酸及びガンマアミノ酸障害、ケトン代謝障害、ガラクトース血症、グリセロール代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、並びにペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害から選択される疾患若しくは障害を有するか、又はそれを有する疑いがあるか、又はそのリスクが高まっている疑いがある。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウォルマン病、肥満、Ｃ３欠損症、家族性リポジストロフィー、悪液質、遺伝性血管浮腫、プロピオン酸血症１型、エーラス・ダンロス症候群、長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性ＬＰＬ欠損症、プロテインＳ欠損症、チロシン血症Ｉ型、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、シトルリン血症Ｉ型、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症、サクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症、グリセロールキナーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、グルタル酸血症Ｉ型、モリブデン補酵素欠損、及びツェルウェガー症候群から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、形質転換されていない脂肪生成細胞を含む。いくつかの実施形態では、対象は、リソソーム蓄積障害、代謝障害、血液疾患、骨及び結合組織障害、内分泌障害、炎症性障害、単一遺伝子性障害、癌、心血管障害、分枝鎖アミノ酸代謝障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ケトン代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、ペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害、並びに他のタンパク質欠損障害から選択される疾患若しくは障害を有するか、又はそれを有する疑いがあるか、又はそのリスクが高まっている疑いがある。一部の実施形態では、疾患又は障害は、シスチン症、Ｔ２Ｄ、血友病Ａ又はＢ、スティックラー症候群、骨粗鬆症、関節リウマチ、Ａ１ＡＴ欠損症、乳癌、アテローム性動脈硬化症、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、カルニチン－アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症、シトステロール血症、フェニルケトン尿症、遺伝性キサンチン尿症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、非ケトン性高グリシン血症、高リジン血症、ホモシスチン尿症、レフサム病、腎臓疾患を有する小児の成長障害から選択される。いくつかの実施形態では、組成物は、任意選択により、治療用導入遺伝子を含む異種核酸を含む、形質転換された脂肪生成細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、１つ以上の遺伝子、又はシスチノシン、ＧＬＰ－１、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＯＬ２Ａ１、副甲状腺ホルモン（１～８４）、アルカリホスファターゼ、アルファ－１アンチトリプシン、トラスツズマブ、アポリポタンパク質Ａ１、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー５、ＡＢＣＧ５、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ、グリシン切断系Ｐタンパク質、リジン：α－ケトグルタル酸還元酵素、シスタチオニンβ－シンターゼ、フィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ、及びヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）に関連する遺伝子を含み、ここで、遺伝子は、脂肪細胞特異的プロモーターと作動的に関連している。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、疾患又は障害は、ウォルマン病、肥満、Ｃ３欠損症、家族性リポジストロフィー、悪液質、遺伝性血管浮腫、プロピオン酸血症１型、エーラス・ダンロス症候群、長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性ＬＰＬ欠損症、プロテインＳ欠損症、チロシン血症Ｉ型、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、シトルリン血症Ｉ型、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症、サクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症、グリセロールキナーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、グルタル酸血症Ｉ型、モリブデン補酵素欠損、及びツェルウェガー症候群から選択される。
一態様では、本発明は、疾患又は障害の処置、予防、又は改善における本開示の組成物の使用に関する。
一態様では、本発明は、疾患又は障害を処置、予防、又は改善するための薬剤の製造における本開示の組成物の使用に関する。
一態様では、本発明は、脂肪生成細胞のインビボでのエレクトロポレーションのためのプロセスの使用に関する。いくつかの実施形態では、方法は、対象の脂肪組織に脂肪生成細胞を注射すること、脂肪組織を第１のプレート電極と第２のプレート電極の間に配置すること、及び第１のプレート電極から脂肪組織を通って第２のプレート電極に電流を流すことを含む。
一態様では、本発明は、治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性の長時間作用型組成物に関し、ここで、脂肪生成細胞は、異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、野生型脂肪生成細胞及び／又は非富化脂肪生成細胞と比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞の少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％がＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ１０富化ＡＳＣから得ることができる。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現するＡＳＣから得ることができる白色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、異種核酸は、脂肪細胞特異的プロモーターを含む。
一態様では、本発明は、治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性の長時間作用型組成物に関し、ここで、脂肪生成細胞は、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現するＡＳＣから得ることができる。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸は、脂肪細胞特異的プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞の少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％がＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、白色脂肪細胞である。
図面の簡単な説明
２継代後の培養物中のヒトＡＳＣ（図１Ａ）の代表的な画像を示す。ＡＳＣは、ＡＳＣは、実施例１に記載される酵素消化法又は外植片培養法のいずれかを使用して脂肪組織から単離された。単離したＡＳＣを培養物中で拡大し、その画像をＭ５０００ ＥＶＯＳイメージングシステムで透過光及び２０Ｘを使用してキャプチャした。 ２継代後の培養物中のマウスＡＳＣ（図１Ｂ）の代表的な画像を示す。ＡＳＣは、ＡＳＣは、実施例１に記載される酵素消化法又は外植片培養法のいずれかを使用して脂肪組織から単離された。単離したＡＳＣを培養物中で拡大し、その画像をＭ５０００ ＥＶＯＳイメージングシステムで透過光及び２０Ｘを使用してキャプチャした。 ヒト脂肪組織から単離され、培養物中で拡大されたＡＳＣの表面マーカーの特徴付けを実証する実験データを示す。細胞を、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ４５、及びＣＤ３４に対するフルオロフォア結合抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。図２Ａは、染色されたＡＳＣのゲーティング戦略を表す実験データを示す。ＡＳＣの大半（＞９７％）は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ９０について陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ３１について陰性である。 ヒト脂肪組織から単離され、培養物中で拡大されたＡＳＣの表面マーカーの特徴付けを実証する実験データを示す。細胞を、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ４５、及びＣＤ３４に対するフルオロフォア結合抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。図２Ｂは、未染色ＡＳＣと染色ＡＳＣにおける異なる細胞表面マーカーの蛍光強度の分布を示す。染色されたＡＳＣは、陽性マーカー及び陰性マーカーの両方について均一な正規分布を示す。未染色細胞は破線で表し、染色細胞は実線で表す。 培養物中のＡＳＣ分化に由来する脂肪細胞の特徴付けを実証する実験データを示す。図３Ａは、ＡＳＣ及び分化したＡＳＣのオイルレッドＯ染色を示す。細胞を１０％ホルムアルデヒドで固定し、オイルレッドＯ溶液で染色した。画像は、Ｍ５０００ ＥＶＯＳイメージングシステムで２０Ｘ対物レンズによりＲＢＧ透過光を使用してキャプチャされた。オイルレッドＯは、中性脂質と結合し、脂質滴を暗赤色に染色する。分化した培養物では、細胞の８０％超が丸い形をしており、右の画像で濃色の球として示される多数の脂質滴を含有する。これらは分化した脂肪細胞である。 培養物中のＡＳＣ分化に由来する脂肪細胞の特徴付けを実証する実験データを示す。図３Ｂは、未分化ＡＳＣ及び分化ＡＳＣにおける脂肪細胞特異的遺伝子の遺伝子発現レベルを示す。アディポネクチン、ＰＰＡＲγ、レプチン、ＣＩＤＥＣ、及びＦＡＢＰ４の遺伝子発現レベルをＲＴ－ＰＣＲを使用して定量し、アクチンに対して正規化した。次いで、全ての発現レベルを対照（未分化ＡＳＣ）に対して正規化した。分化したＡＳＣでは、対照と比較して、全ての脂肪細胞特異的遺伝子が有意に上方制御されている。 ヒトアディポネクチンプロモーターマッピングを示す。ヒトアディポネクチンプロモーターの最小エレメントには、アディポネクチン遠位エンハンサー（－２６６７～－２５０７ｂｐ）及びアディポネクチン近位プロモーター領域（－５４０～＋７７ｂｐ）が含まれる。遠位エンハンサーは、転写因子Ｃ／ＥＢＰαの２つの結合部位を含有する。遠位エンハンサー及び近位プロモーター領域は一緒になって、共にヒトアディポネクチンプロモーターの転写活性化に必要十分である。 Ｐ２／ＦＡＢＰ４プロモーターマッピングを示す。ａｐ２プロモーターの最小エレメントには、ａＰ２遠位エンハンサー（－５．４ｋｂ～－４．９ｋｂ）及びａｐ２近位プロモーター領域（－６３～＋２１ｂｐ）が含まれる。遠位エンハンサー及び近位プロモーター領域は一緒になって、ａＰ２プロモーターの転写活性化に必要十分である。 マウスにおける移植されたヒトＡＳＣに由来する脂肪細胞の長期生着を示す実験データを示す（インビボ）。ヒトアディプシン（図６Ａ）は、移植後１１７日目に背側腹部で検出された。 マウスにおける移植されたヒトＡＳＣに由来する脂肪細胞の長期生着を示す実験データを示す（インビボ）。ＦＡＢＰ４（図６Ｂ）は、移植後１１７日目に背側腹部で検出された。 移植された遺伝子改変脂肪生成細胞由来の脂肪細胞によるガウシアルシフェラーゼのインビボ分泌及びマウスに移植されたヒトＡＳＣ由来の脂肪細胞の長期生着（インビボ）を実証する実験データを示す。ドナー由来の脂肪細胞は、レシピエントマウスにおいて少なくとも８４日間ＧＬｕｃを発現した。 脂肪細胞の移植及びインビボでのアディプシンの分泌を実証する実験データを示す。ヒトアディプシンレベルは、移植後１２６日まで血漿中に検出された。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビボ）を実証する実験データを示す。ｈＡＳＣ及び培養由来ｈ脂肪細胞では、移植後５時間及び５日目に自然免疫応答は検出されなかった。ＴＮＦα（図９Ａ）のレベルを測定した。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビボ）を実証する実験データを示す。ｈＡＳＣ及び培養由来ｈ脂肪細胞では、移植後５時間及び５日目に自然免疫応答は検出されなかった。ＩＦＮγ（図９Ｂ）のレベルを測定した。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビボ）を実証する実験データを示す。ｈＡＳＣ及び培養由来ｈ脂肪細胞では、移植後５時間及び５日目に自然免疫応答は検出されなかった。ＩＬ１β（図９Ｃ）のレベルを測定した。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビボ）を実証する実験データを示す。ｈＡＳＣ及び培養由来ｈ脂肪細胞では、移植後５時間及び５日目に自然免疫応答は検出されなかった。ＩＬ６（図９Ｄ）のレベルを測定した。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビボ）を実証する実験データを示す。ｈＡＳＣ及び培養由来ｈ脂肪細胞では、移植後５時間及び５日目に自然免疫応答は検出されなかった。ＩＬ１０（図９Ｅ）のレベルを測定した。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビボ）を実証する実験データを示す。ｈＡＳＣ及び培養由来ｈ脂肪細胞では、移植後５時間及び５日目に自然免疫応答は検出されなかった。ＩＬ２（図９Ｆ）のレベルを測定した。 非免疫原性脂肪生成細胞（インビトロ）を実証する実験データを示す。 埋入後９２日（図１１Ａ）における、免疫適格マウス（インビボ）における異種移植ヒト脂肪細胞の長期生着を実証する画像を示す。 埋入後１５１日（図１１Ｂ）における、免疫適格マウス（インビボ）における異種移植ヒト脂肪細胞の長期生着を実証する画像を示す。 移植された脂肪細胞の局所的な生体内分布を実証する実験データを示す。図１２Ａは、移植後３日目～９８日目に分析されたルシフェラーゼが、移植されていないマウス及び脂肪細胞を移植されたマウスで測定されたマウスの全ての時点で検出されたことを実証する実験データを示す。 移植された脂肪細胞の局所的な生体内分布を実証する実験データを示す。図１２Ｂは、１４日目及び９８日目に測定されたマウスのルシフェラーゼ活性の画像を示す。 ＣＤ１０＋細胞の脂肪生成能の増加を実証する実験データを示す。ＣＤ１０＋で選択されたＡＳＣ集団は、対照及びＣＤ１０－と比較して、有意に高いレベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を産生した。図１３Ａは、脂肪幹細胞を培養し、脂肪細胞に分化させる非限定的な方法の概略図を示す。 ＣＤ１０＋細胞の脂肪生成能の増加を実証する実験データを示す。ＣＤ１０＋で選択されたＡＳＣ集団は、対照及びＣＤ１０－と比較して、有意に高いレベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を産生した。図１３Ｂは、誘導後７日目のＡＳＣを実証する画像を示す。 ＣＤ１０＋細胞の脂肪生成能の増加を実証する実験データを示す。ＣＤ１０＋で選択されたＡＳＣ集団は、対照及びＣＤ１０－と比較して、有意に高いレベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を産生した。図１３Ｃは、対照、ＣＤ１０＋及びＣＤ１０－脂肪細胞についての、７日目の培地中のアディポネクチンタンパク質を実証する実験データを示す。 哺乳動物血清タンパク質を分泌する脂肪細胞を生成し特徴付ける能力を実証する実験データを示す。図１４Ａは、ＥＰＯを分泌する脂肪細胞を調製する非限定的な方法の概略図を示す。 哺乳動物血清タンパク質を分泌する脂肪細胞を生成し特徴付ける能力を実証する実験データを示す。図１４Ｂは、脂肪細胞特異的ＥＰＯ発現（インビトロ）を実証する実験データを示す。ｈＥＰＯ操作細胞及び操作されていない対照細胞におけるｈＥＰＯのレベルが検出された。 ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を分泌する脂肪細胞を調製する非限定的な方法の概略図を示す。 脂肪細胞特異的ｇＬＵＣ発現（インビトロ）を実証する実験データを示す。操作されたＡＳＣは、脂肪細胞にさらに分化するにつれて、より多くのＧＬｕｃを分泌した。 ＥＰＯを分泌するように遺伝子改変されたＡＳＣ及び脂肪生成細胞の移植によるマウスにおける治療効果を実証する実験データを示す。ｈＥＰＯを発現するＡＳＣ及び脂肪細胞を移植されたマウスのレベルは、対照マウスのレベルを超えて上昇し、３０日以上にわたってより高い状態が維持された。図１６Ａは、血漿中のＥＰＯレベルを実証する実験データを示す。 ＥＰＯを分泌するように遺伝子改変されたＡＳＣ及び脂肪生成細胞の移植によるマウスにおける治療効果を実証する実験データを示す。ｈＥＰＯを発現するＡＳＣ及び脂肪細胞を移植されたマウスのレベルは、対照マウスのレベルを超えて上昇し、３０日以上にわたってより高い状態が維持された。図１６Ｂは、網赤血球数を実証する実験データを示す。 ＥＰＯを分泌するように遺伝子改変されたＡＳＣ及び脂肪生成細胞の移植によるマウスにおける治療効果を実証する実験データを示す。ｈＥＰＯを発現するＡＳＣ及び脂肪細胞を移植されたマウスのレベルは、対照マウスのレベルを超えて上昇し、３０日以上にわたってより高い状態が維持された。図１６Ｃは、血漿中のＥＰＯレベルを実証する実験データを示す。 ＥＰＯを分泌するように遺伝子改変されたＡＳＣ及び脂肪生成細胞の移植によるマウスにおける治療効果を実証する実験データを示す。ｈＥＰＯを発現するＡＳＣ及び脂肪細胞を移植されたマウスのレベルは、対照マウスのレベルを超えて上昇し、３０日以上にわたってより高い状態が維持された。図１６Ｄは、網赤血球数を実証する実験データを示す。 混合リンパ球アッセイにおける細胞死の欠如によって実証されるように、本開示の同種異系ＡＳＣが非免疫原性であることを実証する実験データを示す。 混合リンパ球アッセイにおける細胞死の欠如によって実証されるように、本開示の同種異系ＡＳＣが非免疫原性であることを実証する実験データを示す。 混合リンパ球アッセイにおける細胞死の欠如によって実証されるように、本開示の同種異系ＡＳＣが非免疫原性であることを実証する実験データを示す。 混合リンパ球アッセイにおける細胞死の欠如によって実証されるように、本開示の同種異系ＡＳＣが非免疫原性であることを実証する実験データを示す。
詳細な説明
本発明は、部分的には、操作された脂肪生成細胞及び操作されていない脂肪生成細胞の両方を対象に移植することができ、これは、長期持続する細胞生着、並びにタンパク質及び／又は他の分子（タンパク質など）のインビボでの分泌をもたらし、それにより、異常なタンパク質産生又は完全なタンパク質欠損に関連する疾患又は障害を含む、疾患又は障害の処置にそれらが有効となるという驚くべき発見に関する。
脂肪生成細胞
任意の脂肪生成細胞が本発明によって企図される。脂肪生成細胞の非限定的な例としては、脂肪細胞、脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）、及びＣＤ３４＋細胞が挙げられる。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、同種異系である。同種異系細胞には、処置対象とは異なるドナーから得られた細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、自己由来である。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、実質的に純粋である。
実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の特性（例えば、治療効果、効力、分化能力、有糸分裂活性、増殖能力、形態、細胞表面マーカー、及び上記の組み合わせ）を示す脂肪生成細胞の集団を指す。実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の治療効果を示す脂肪生成細胞の集団を指す。実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の効力を示す脂肪生成細胞の集団を指す。実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の分化能力を示す脂肪生成細胞の集団を指す。実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の有糸分裂活性を示す脂肪生成細胞の集団を指す。実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の増殖能力を示す脂肪生成細胞の集団を指す。実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の形態を示す脂肪生成細胞の集団を指す。
実施形態では、実質的に純粋とは、約８０％を超える、又は約８５％を超える、約９０％を超える、又は約９５％を超える、又は約９７％を超える、又は約９８％を超える、又は約９９％を超える細胞が、同一又は類似の同一性及び／又は量の細胞表面マーカーを示す脂肪生成細胞の集団を指す。
実施形態では、実質的に純粋とは、非脂肪生成細胞（例えば、出発集団の細胞、生物学的に不活性な細胞、又は現在の治療効果を妨げる細胞）よりも脂肪生成細胞が富化された細胞の集団を指す。非脂肪生成細胞の非限定的な例には、脂肪細胞以外の細胞；出発細胞集団応じて、ＡＳＣ及び／又はＣＤ３４＋細胞；及び骨芽細胞、線維芽細胞、リンパ球、及び骨髄細胞などの、非脂肪細胞に分化するその前駆細胞が含まれる。実施形態では、実質的に純粋とは、非脂肪生成細胞よりも、約５倍、又は約１０倍、又は約１５倍、又は約２０倍、又は約３０倍、又は約５０倍、又は約１００倍、又は約３００倍、又は約５００倍、又は約１０００倍多い脂肪生成細胞を有する脂肪生成細胞の集団を指す。
実施形態において、実質的に純粋とは、非脂肪生成細胞よりも脂肪生成細胞が富化されており、現在の治療効果を増加、強化、又は維持する（例えば、非脂肪生成細胞よりも脂肪生成細胞が富化されており、１つ以上のヘルパー細胞を欠く細胞集団と比較して）１つ以上のヘルパー細胞を含有する細胞の集団を指す。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は培養され、拡大される。培養方法は本明細書に記載されており、当業者に理解されるであろう。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞を培養し、所望の量の細胞まで拡大する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞を含む組成物は、マトリックス又は支持体の存在下又は非存在下で、別個に、又は共培養物として調製される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、新たに調製及び／又は採取される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、凍結保存されたストックから解凍される。実施形態では、脂肪生成細胞は、例えば、凍結防止剤（例えば、ＤＭＳＯ、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）及び／又は生理食塩水を含む）による、凍結保護に適している。
当業者に理解されるように、脂肪生成細胞は、任意の供給源から単離され得る。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪組織から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、末梢血から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ヒト末梢血から単離される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、哺乳動物の脂肪生成細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ヒト脂肪生成細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ヒト対象における使用に適している。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、褐色／ベージュ脂肪細胞若しくは白色脂肪細胞、又は褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の組み合わせ（例えば、様々な比率で）である。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、褐色／ベージュ脂肪細胞及び白色脂肪細胞の組み合わせである。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：９９～約９９：１である。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：５０～約５０：１である。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：２５～約２５：１である。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：１０～約１０：１である。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：５～約５：１である。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：２～約２：１である。いくつかの実施形態では、褐色／ベージュ脂肪細胞と白色脂肪細胞の比は、約１：１である。
白色脂肪細胞は、白色脂肪組織に見られ、細胞の周囲に位置する扁平な核を有し、単一の大きな脂肪滴を含む脂肪細胞である。白色脂肪組織は、（断熱によって）体温を維持し、脂質の形態でエネルギーを貯蔵するのに役立つ。白色脂肪細胞は、例えば抗体染色によって測定される、Ｃ／ＥＢＰα及びＰＰＡＲγ２陽性核の存在、及びＦＡＢＰ４の高い細胞質レベルによって、前駆細胞と区別できる。白色脂肪細胞のマーカー遺伝子は周知であり、非限定的な例として、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号４０２３）、ホルモン感受性リパーゼ（ＨＳＬ；ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号３９９１）、アディポネクチン（ＡＤＩＰＯＱ ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号９３７０）、ＦＡＢＰ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号２１６７）、ＣＥＢＰＡ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１０５０）、及びＰＰＡＲＧ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号５４６８；ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０１５８６９）が挙げられ、これらは定量的ＲＴ－ＰＣＲによってアッセイできる。
褐色／ベージュ脂肪細胞は、脂質及びグルコースの化学エネルギーを利用して、非ふるえ熱産生によって熱を産生し、細胞全体に複数の脂質滴、丸い核、及び多数のミトコンドリアを含む脂肪細胞であり、これにより、細胞に独特の褐色が付与される。褐色／ベージュ脂肪細胞のマーカー遺伝子は周知であり、非限定的な例として、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ）、ＵＣＰ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号７３５０）、ＥＬＯＶＬ３（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号８３４０１）、ＰＧＣ１Ａ（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１０８９１）、ＣＹＣ１（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ番号１５３７）、ＣＥＢＰＡ、及びＰＰＡＲＧ２が挙げられ、これらは定量的ＲＴ－ＰＣＲによってアッセイできる。褐色／ベージュ脂肪細胞は、非限定的な例として、ＵＣＰ１、ＥＬＯＶＬ３、ＰＧＣ１Ａ、及びＣＹＣ１の相対発現が高く、非限定的な例として、ＡＤＩＰＯＯ、ＨＳＬ、及びＦＡＢＰ４の相対発現が低いことによって、白色脂肪細胞と区別することができ、どちらの細胞タイプも高レベルのＰＰＡＲγ２及びＬＰＬ発現を示す。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、ＣＩＤＥＣ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、ＬＧＡＬＳ１２、ＡＤＩＰＯＱ、ＴＵＳＣ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＰＰＡＲＧ、ＬＥＰ、ＣＥＢＰＡ、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を発現及び／又は分泌する。いくつかの実施形態では、ＣＩＤＥＣ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、ＬＧＡＬＳ１２、ＡＤＩＰＯＱ、ＴＵＳＣ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＰＰＡＲＧ、ＬＥＰ、ＣＥＢＰＡ、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上の発現は、ＡＳＣ及び非脂肪組織からの細胞を含む非脂肪細胞と比較して上昇する。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞及び／又は脂肪細胞前駆細胞から分化した脂肪細胞（ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞など）は、１つ以上の天然産物を分泌する。いくつかの実施形態では、天然産物は、１つ以上の脂肪酸又は他の脂肪酸由来の化学物質である。いくつかの実施形態では、脂肪酸由来の化学物質には、脂肪酸エステル、脂肪アルカン及びアルケン、脂肪アルコール、脂肪ケトン、及び脂肪ラクトンが含まれる。
いくつかの実施形態では、脂肪酸は、飽和又は不飽和脂肪酸である。いくつかの実施形態では、飽和又は不飽和脂肪酸は、例えば、少なくとも８個、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２４個、少なくとも２６個、少なくとも２８個、少なくとも３０個の炭素原子を含み、いくつかの実施形態では、飽和又は不飽和脂肪酸は、例えば、４～２４個の炭素原子、６～２４個の炭素原子、８～２４個の炭素原子、１０～２４個の炭素原子、１２～２４個の炭素原子、１４～２４個の炭素原子、又は１６～２４個の炭素原子、４～２２個の炭素原子、６～２２個の炭素原子、８～２２個の炭素原子、１０～２２個の炭素原子、１２～２２個の炭素原子、１４～２２個の炭素原子、又は１６～２２個の炭素原子、４～２０個の炭素原子、６～２０個の炭素原子、８～２０個の炭素原子、１０～２０個の炭素原子、１２～２０個の炭素原子、１４～２０個の炭素原子、又は１６～２０個の炭素原子を含む。いくつかの実施形態では、不飽和脂肪酸は、例えば、１個以上、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、又は６個以上の二重結合を有する。脂肪酸の非限定的な例としては、カプリル酸（８：０）、ペラルゴン酸（９：０）、カプリン酸（１０：０）、ウンデシル酸（１１：０）、ラウリン酸（１２：０）、トリデシル酸（１３：０）、ミリスチン酸（１４：０）、ミリストレイン酸（１４：１）、ペンタデシル酸（pentadecyclic acid）（１５：０）、パルミチン酸（１６：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、サピエン酸（１６：１）、マルガリン酸（１７：０）、ステアリン酸（１８：０）、オレイン酸（１８：１）、エライジン酸（１８：１）、バクセン酸（１８：１）、リノール酸（１８：２）、リノエライジン酸（１８：２）、ａ－リノレン酸（１８：３）、γ－リノレン酸（１８：３）、ステアリドン酸（１８：４）、ノナデシル酸（１９：０）、アラキジン酸（２０：０）、エイコセン酸（２０：１）、ジホモ－ｙ－リノレン酸（２０：３）、ミード酸（２０：３）、アラキドン酸（２０：４）、エイコサペンタエン酸（２０：５）、ヘンイコシル酸（２１：０）、ベヘン酸（２２：０）、エルカ酸（２２：１）、ドコサヘキサエン酸（２２：６）、トリコシル酸（２３：０）、リグノセリン酸（２４：０）、ネルボン酸（２４：１）、ペンタコシル酸（２５：０）、セロチン酸（２６：０）、ヘプタコシル酸（２７：０）、モンタン酸（２８：０）、ノナコシル酸（２９：０）、メリシン酸（３０：０））、ヘナトリアコンチル酸（３１：０）、ラセロイン酸（３２：０）、オオバコ酸（３３：０）、ゲジック酸（geddic acid）（３４：０）、セロプラスチック酸（３５：０）、及びヘキサトリアコンチル酸（３６：０）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、以下：
ａ．有糸分裂後であること；
ｂ．約３５％を超える（脂肪組織の新鮮重量％；例えば、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％を超える）脂質含量を有すること；
ｃ．約６０％～約９５％（例えば、６０～９４％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６０％～約７０％、約６０％～約６５％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、又は約８５％～約９０％）の脂肪組織中の脂肪含量を有すること；
ｄ．約８０％（例えば、約７５～約８５％）の平均脂肪含量を有すること；
ｅ．約５％～約４０％（例えば、約６～３６％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約４０％、約１５％～約４０％、約２０％～約４０％、約２５％～約４０％、約３０％～約４０％、又は約３５％～約４０％）の脂肪組織中の水分含量を有すること；
ｆ．約１５％（例えば、約１２．５％～約１７．５％）の平均水分含量を有すること；
ｇ．約１ｇ／ｍＬ（例えば、０．９１６ｇ／ｍＬ、約０．５ｇ／ｍＬ、約０．６ｇ／ｍＬ、約０．７ｇ／ｍＬ、約０．８ｇ／ｍＬ、約０．９ｇ／ｍＬ、約１．１ｇ／ｍＬ、又は約１．２ｇ／ｍＬ）の比重を有すること；
ｈ．ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、及びミリスチン酸、それらの誘導体のうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
ｉ．遊離脂肪酸、コレステロール、モノグリセリド、及びジグリセリドのうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
ｊ．細胞体積の約９０％を超えるサイズ（例えば、９５％を超える、又は約９８％を超える、又は約９３％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９９％）の脂質滴を有すること；
ｋ．細胞の体積の少なくとも約３０％～約９９％（例えば、少なくとも約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％）を含む脂質滴を有すること；
ｌ．直径約２０～３００μｍ（例えば、約２０～３００μｍ、約２０～２００μｍ、約２０～１００μｍ、約２０～５００μｍ、約２０～３０μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２００μｍ、約１５０～３００μｍ、約１５０～２００μｍ、又は約２００～３００μｍ）の表面サイズを有すること；
ｍ．約２００～約４００μｍ３（例えば、約２００～約３５０μｍ３、約２００～約３００μｍ３、約２００～約２５０μｍ３、約２５０～約４００μｍ３、約２５０～約３５０μｍ３、約２５０～約３００μｍ３、約３００～約３５０μｍ３、又は約３００～約４００μｍ３）の核体積を有すること；
ｎ．約４，０００～約１８，０００μｍ３（例えば、約４０００～約１５０００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３、約４０００～約１００００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約７５００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３）の総体積を有すること；
ｏ．約１：２０～１：９０（例えば、約１：２０～約１：８０、約１：２０～約１：７０、約１：２０～約１：６０、約１：２０～約１：５０、約１：２０～約１：４０、約１：２０～約１：３０；約１：３０～約１：８０、約１：４０～約１：８０、約１：５０～約１：８０、約１：６０～約１：８０、又は約１：７０～約１：８０）の核対細胞比を有すること；
ｐ．扁平な核を有すること；
ｑ．総細胞体積の約１０％～約６０％未満（（例えば、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、又は約５０％未満）の小さい細胞質を有し、細胞質には脂質滴体積が含まれないこと；
ｒ．液体を吸収及び放出できること；
ｓ．水又は水溶液（例えば、培地、又はＨＢＳＳ）中で浮揚性であること；
ｔ．非中心に位置する核を有すること；
ｕ．１つ以上の脂肪滴を有すること；
ｖ．非球形の細胞質を有すること；
ｗ．アディポネクチン、レプチン、及びＴＮＦ－αのうちの１つ以上を分泌できること；
ｘ．脂質生成ができること；
ｙ．トリグリセリド（ＴＧ）を貯蔵できること；
ｚ．非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）（例えば、オレイン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、及びステアリン酸などの長鎖脂肪酸）を分泌できること；
ａａ．ホルモンに応答性であること；
ｂｂ．神経入力に応答性であること；
ｃｃ．約９年（例えば、約８年～約１０年）の細胞代謝回転速度を有すること；
ｄｄ．約４５μｍ（例えば、約４７．２μｍ、約４０μｍ、約４２．５μｍ、約４７．５μｍ、又は約５０μｍ）の平均直径を有すること；
ｅｅ．約２５％の細胞が約５０μｍ未満の直径を有し；約４０％の細胞が約５０～６９μｍの直径を有し；約２５％の細胞が約７０～８９μｍの直径を有し；且つ約１０％の細胞が約９０μｍ以上の直径を有する、直径分布を有する細胞集団；
ｆｆ．心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）に応答性であること；
ｇｇ．脂肪分解ができること；
ｈｈ．ステロイドホルモンに結合及び応答できる受容体を発現すること；
ｉｉ．ホスファチジルコリンにより溶解されること；
ｊｊ．約１ｇ／ｍｌ（例えば、約０．８ｇ／ｍｌ、約０．９ｇ／ｍｌ、約１．１ｇ／ｍｌ、約１．２ｇ／ｍｌ）の細胞密度；
ｋｋ．約８０％を超える（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の）生存率；
ｌｌ．約８０％を超える（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の）純度、
ｍｍ．適切な効力の（例えば、約２００μｇ／ｍｌを超える）オイルレッドＯの溶出量；及び
ｎｎ．微生物汚染について陰性
のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、又は３５個以上を有することを特徴とする。
例えば、Thomas, Quarterly Journal of Experimental Physiology and Cognate Medical Sciences, 47, 2, 179-188 (1962)、ICRP Publication 23, Report of the Task Group on Reference Man (1975)、John Blarmire, BIOdotEDU:Components of cells; The macromolecules; Adipose tissue (2005)、Stenkula and Erlanson-Albertsson, Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 315, R284-R295 (2018)、Ambati et al., MBC Obes.3, 35 (2016)、Charo et al., Nucleus, 7, 3, 249-269 (2016)、Shoham et al., Biophys J., 106, 6, 1421-1431 (2014)、Verboven et al., Scientific Reports 8, 4677 (2018)を参照されたい。これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、脂質生成することができる。脂質生成を同定及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。例えば、脂質生成は、新規脂質生成（ＤＮＬ）並びに脂肪酸の伸長及び不飽和化に関与する遺伝子の発現を測定することによって決定することができる。別の例では、１３Ｃ標識基質を利用してＤＮＬの経路を研究することができる。非限定的な例において、ヒト脂肪細胞は、脂質滴中にトリアシルグリセロール（ＴＧ）を蓄積した外因性脂肪なしで分化し、正常に分化した。ＴＧ組成物は、伸長／脱飽和によって産生した不飽和脂肪酸（特に、１６：１ｎ－７及び１８：１ｎ－９）とともに、ＤＮＬ（１２：０～１８：０の飽和脂肪酸）の産物を示した。例えば、Collins et al.J. Lipid Res.52, 9, 1683-1692 (2011)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。脂質生成を同定及び／又は測定する方法の他の例については、Muller, Drug Discovery and Evaluation:Pharmacological Assays, Springer International Publishing Switzerland (2016)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、ホルモンに応答性である。ホルモンの非限定的な例としては、グルココルチコイド、エストロゲン、アンドロゲンなどのステロイドホルモン、アドレナリン、ノルアドレナリン、トリヨードチロニンなどのアミノ酸誘導体ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、甲状腺刺激ホルモン放出因子、ソマトスタチン、黄体形成ホルモン、成長ホルモン、ロイシンエンケファリンなどのペプチドホルモン、オキシトシン、バソプレシン、グルカゴン、インスリン、セクレチン、カルシトニンが挙げられる。ホルモンに対する応答性を同定及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。方法の非限定的な例については、Muller, Drug Discovery and Evaluation:Pharmacological Assays, Springer International Publishing Switzerland (2016)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、神経入力に応答性である。神経入力に対する応答性を識別及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。方法の非限定的な例については、Correll, Science 140, 26, 387-388 (1963)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）に応答性である。ＡＮＰに対する応答性を同定及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。方法の非限定的な例については、Verboven et al., Scientific Reports 8, 4677 (2018)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、脂肪分解することができる。脂肪分解を同定及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。細胞脂肪分解、無細胞脂肪分解、及び脂肪分解産物の分析のための方法の非限定的な例は、Muller, Drug Discovery and Evaluation:Pharmacological Assays, Springer International Publishing Switzerland (2016)に見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、ステロイドホルモンに結合及び応答できる受容体を発現する。ステロイドホルモンに結合し、応答することができる受容体の発現を同定及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。方法の非限定的な例については、Rebuffe-Scrive et al., J. Clin.Endocrinol.Metab.71, 5, 1215-1219 (1990)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、ホスファチジルコリンにより溶解される。ホスファチジルコリンによる溶解を同定及び／又は測定するための任意の方法が本発明によって企図される。方法の非限定的な例については、Kim et al., PLoS One 12, 5, e0176722 (2017)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＡＳＣである。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、哺乳動物ＡＳＣである。哺乳動物ＡＳＣの非限定的な例としては、霊長類ＡＳＣ（ヒトＡＳＣなど）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、以下：
（ａ）約９０％以上の生存率；
（ｂ）約５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１０ｍｍｏｌ／Ｌ（例えば、約６．１３±０．５８ｍｍｏｌ／Ｌ～約７．７３±０．３７ｍｍｏｌ／Ｌ、約５ｍｍｏｌ／Ｌ～約７．５ｍｍｏｌ／Ｌ、約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１０ｍｍｏｌ／Ｌ、約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ～約７．５ｍｍｏｌ／Ｌ、又は約２．５ｍｍｏｌ／Ｌ～約５ｍｍｏｌ／Ｌ）のグルコース取り込み；及び
（ｃ）約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５ｍｍｏｌ／Ｌ（例えば、約１０．５３±１．０９ｍｍｏｌ／Ｌ～約１２．９１±１．１２ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１４ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１３ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１２ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１１ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１４ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１３ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１２ｍｍｏｌ／Ｌ、約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５ｍｍｏｌ／Ｌ）の乳酸産生
のうちの１つ以上、又は１つ、２つ、３つを有する。
例えば、Kolodziej et al., Adipocyte 8, 1, 254-264 (2019)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、高脂肪生成である。例えば、高脂肪生成ＡＣＳは、脂肪生成分化に対する最も強いレスポンダーであり得、及び／又は対照ＡＳＣと比較して、インビトロ及びインビボの両方で有意により多くの脂肪細胞を産生し得る。いくつかの実施形態では、高脂肪生成ＡＳＣは、高脂肪生成ＡＳＣと対照ＡＳＣとの間で異なって発現される細胞表面タンパク質の選択を通じて単離される。いくつかの実施形態では、高脂肪生成ＡＣＳは、選択なしで脂肪組織から単離されたＡＳＣと比較して、上方制御された脂肪細胞特異的遺伝子の高い発現レベル又は発現レベルの上昇を示す（例えば、実施形態では、約２倍、又は約５倍、又は約１０倍、又は約３０倍、又は約１００倍）。高脂肪生成細胞において上方制御され得る遺伝子の非限定的な例としては、野生型脂肪生成細胞及び／又は非富化脂肪生成細胞と比較して、ＭＡＴ２Ｂ、ＣＣＤＣ１１５、ＣＣＤＣ６９、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＰＰＬ３、ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ２）、ＧＩＮＭ１、ＣＤｗ２１０（ＩＬ１０ＲＢ）、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３（ＴＮＦＳＦ１０）が挙げられ、及び／又は野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して高いレベルの遺伝子を発現するＡＳＣから得ることができる。いくつかの実施形態では、高脂肪生成ＡＣＳは、選択なしで脂肪組織から単離されたＡＳＣと比較して、下方制御された脂肪細胞特異的遺伝子の発現レベルの低下を示す。高脂肪生成細胞において下方制御され得る遺伝子の非限定的な例としては、野生型脂肪生成細胞及び／又は非富化脂肪生成細胞と比較して、ＭＡＰ１１、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＮＣＳ１、ＴＲＡＦ７、ＧＮＢ２、ＡＮＯ１０、ＦＫＢＰ２、ＥＭＰ３、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ（ＩＴＧＡ３）、及びＣＤ９１（ＬＲＰ１）が挙げられ、及び／又は野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して高いレベルの遺伝子を発現するＡＳＣから得ることができる。いくつかの実施形態では、高脂肪生成ＡＣＳは、インビトロ又はインビボで単離することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＭＡＴ２Ｂ、ＣＣＤＣ１１５、ＣＣＤＣ６９、ＳＬＣ２Ａ３、ＳＰＰＬ３、ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ２）、ＧＩＮＭ１、ＣＤｗ２１０（ＩＬ１０ＲＢ）、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３（ＴＮＦＳＦ１０）のうちの１つ以上の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＭＡＴ２Ｂ、ＣＣＤＣ６９、ＣＤｗ２１０（ＩＬ１０ＲＢ）、ＣＤ１０７ｂ（ＬＡＭＰ２）、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３（ＴＮＦＳＦ１０）のうちの１つ以上の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＭＡＴ２Ｂ、ＣＣＤＣ６９、ＣＤｗ２１０（ＩＬ１０ＲＢ）、及びＣＤ１６４のうちの１つ以上の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３のうちの１つ以上の上方制御を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＭＡＰ１１、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＮＣＳ１、ＴＲＡＦ７、ＧＮＢ２、ＡＮＯ１０、ＦＫＢＰ２、ＥＭＰ３、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ（ＩＴＧＡ３）、及びＣＤ９１（ＬＲＰ１）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＵＢＡＳＨ３Ｂ、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＣＤ１５１、及びＣＤ４９ｃ（ＩＴＧＡ３）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、ＵＢＡＳＨ３Ｂ及びＣＤ２６６のうちの１つ以上の下方制御を示す（野生型ＡＳＣと比較したＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、１つ以上のＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９の下方制御を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３のうちの１つ以上を高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、低いレベルのＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９のうちの１つ以上を発現及び／又は分泌する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３のうちの１つ以上を高いレベルで発現し、ＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９の１つ以上を低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５について陰性であり、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ以上について陽性である。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞に分化する。例えば、脂肪細胞は、平均的な脂肪細胞（例えば、野生型脂肪細胞及び／又は非富化脂肪細胞）よりも２．５～１０倍多くのアディポネクチンを発現する。いくつかの実施形態では、これらのＡＳＣは、それらと対照ＡＳＣとの間で異なって発現される細胞膜タンパク質の選択を通じて単離される。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、高レベルのアディポネクチンを分泌する高脂肪生成の脂肪細胞に分化する。高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞に分化するＡＳＣにおいて、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して上方制御（例えば、実施形態において、約２倍、又は約５倍、又は約１０倍、又は約３０倍、又は約１００倍）され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＧＩＮＭ１、ＣＣＤＣ６９、ＣＣＤＣ１１５、ＣＤ３６１（ＥＶＩ２Ｂ）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＤ１６４、ＣＤ２１３Ａ１（ＩＬ１３ＲＡ１）、及びＣＤ１０が挙げられる。高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞に分化するＡＳＣにおいて、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して下方制御（例えば、実施形態において、約２倍、又は約５倍、又は約１０倍、又は約３０倍、又は約１００倍）され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＦＫＢＰ２、ＴＨＢＳ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＰＺＬ１、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＣＤ１６７（ＤＤＲ１）、ＣＤ３２５（ＣＤＨ２）、及びＣＤ１１５（ＰＶＲ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＣＳは、インビトロ又はインビボで単離することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＧＩＮＭ１、ＣＣＤＣ６９、ＣＣＤＣ１１５、ＣＤ３６１（ＥＶＩ２Ｂ）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＤ１６４、ＣＤ２１３Ａ１（ＩＬ１３ＲＡ１）、及びＣＤ１０のうちの１つ以上の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤＣ６９、ＣＤ３６１（ＥＶＩ２Ｂ）、ＣＤ１２０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１（ＩＬ１３ＲＡ１）のうちの１つ以上の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤＣ６９、ＣＤ３６１（ＥＶＩ２Ｂ）、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１（ＩＬ１３ＲＡ１）の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ以上の上方制御を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＦＫＢＰ２、ＴＨＢＳ１、ＣＴＮＮＢ１、ＭＰＺＬ１、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＣＤ１６７（ＤＤＲ１）、ＣＤ３２５（ＣＤＨ２）、及びＣＤ１１５（ＰＶＲ）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）、ＣＤ１６７（ＤＤＲ１）、ＣＤ３２５（ＣＤＨ２）、及びＣＤ１１５（ＰＶＲ）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６（ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ）及びＣＤ３２５（ＣＤＨ２）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５の下方制御を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ以上を高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５のうちの１つ以上を低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ以上を高いレベルで発現し、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５のうちの１つ以上を低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２について陰性であり、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０、及びＣＤｗ２９３のうちの１つ以上について陽性である。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＣＤ１０の上方制御を示すＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのアディポネクチンを発現及び／又は分泌する。いくつかの実施形態では、ＣＤ１０の上方制御を示すＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣよりも、約１．５倍、又は約２倍、又は約５倍、又は約１０倍、又は約３０倍、又は約１００倍高いレベルのアディポネクチンを発現及び／又は分泌する。いくつかの実施形態では、約１％～約９９％、約５０％～約９９％、約７５％～約９９％、又は約８０％～約９９％のＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超のＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０を発現する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、ＣＤ１０、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、ＣＤ２５３、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ２１３Ａ１、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０及びＣＤ８６のうちの１つ以上について選択的に富化される。ＡＳＣを選択的に富化するための非限定的な方法には、アフィニティーキャプチャー及びＦＡＣＳなどの抗体ベースの方法が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＡＳＣ及び／又はＡＳＣの集団は、ＣＤ１０について選択的に富化される（例えば、ＣＤ１０富化ＡＳＣ）。いくつかの実施形態では、ＣＤ１０富化ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、約１％～約９９％、約５０％～約９９％、約７５％～約９９％、又は約８０％～約９９％のＣＤ１０富化ＡＳＣがＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超のＣＤ１０富化ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０を発現する。
いくつかの実施形態では、本開示の脂肪生成細胞は、ＣＤ１０富化ＡＳＣから得ることができる。非限定的な例では、ＣＤ１０富化ＡＳＣは、ＣＤ１０を発現する脂肪生成細胞（例えば、褐色／ベージュ脂肪細胞又は白色脂肪細胞）に分化する。脂肪生成細胞は、ＣＤ１０富化ＡＳＣから得ることができる白色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、約１％～約９９％、約５０％～約９９％、約７５％～約９９％、又は約８０％～約９９％のＣＤ１０富化ＡＳＣがＣＤ１０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は９９％超のＣＤ１０富化ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０を発現する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、高レベルの細胞内ＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を産生する。例えば、脂肪細胞は、集団の７５％より高いレベルでＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を生じる。いくつかの実施形態では、高レベルの細胞内ＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を産生するＡＳＣは、高脂肪生成である。いくつかの実施形態では、これらのＡＳＣは、それらと対照ＡＳＣとの間で異なって発現される細胞膜タンパク質の選択を通じて単離される。高レベルの細胞内ＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を産生するＡＳＣにおいて、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して上方制御（例えば、実施形態において、約２倍、又は約５倍、又は約１０倍、又は約３０倍、又は約１００倍）され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＬＲＲＦＩＰ２、ＡＶＥＮ、ＳＨＫＢＰ１、ＳＭＰＤ２、ＣＤｗ２１０ｂ（ＩＬ１０ＲＢ）、ＣＤ３４０（ＥＲＢＢ２）、及びＣＤｗ２９３（ＢＭＰＲ１Ｂ）が挙げられる。高レベルの細胞内ＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を産生するＡＳＣにおいて、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して下方制御され得る遺伝子の非限定的な例としては、ＴＧＡ７、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＹＮＣ、ＣＤ１５１、ＣＤ１０（ＭＭＥ）、ＣＤ２６（ＤＰＰ４）、及びＣＤ１４２（Ｆ３）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＡＣＳは、インビトロ又はインビボで単離することができる。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＬＲＲＦＩＰ２、ＡＶＥＮ、ＳＨＫＢＰ１、ＳＭＰＤ２、ＣＤｗ２１０ｂ（ＩＬ１０ＲＢ）、ＣＤ３４０（ＥＲＢＢ２）、及びＣＤｗ２９３（ＢＭＰＲ１Ｂ）のうちの１つ以上の上方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０ｂ（ＩＬ１０ＲＢ）、ＣＤ３４０（ＥＲＢＢ２）、及びＣＤｗ２９３（ＢＭＰＲ１Ｂ）のうちの１つ以上の上方制御を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＴＧＡ７、ＰＬＥＫＨＧ４、ＳＹＮＣ、ＣＤ１５１、ＣＤ１０（ＭＭＥ）、ＣＤ２６（ＤＰＰ４）、及びＣＤ１４２（Ｆ３）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０（ＭＭＥ）、ＣＤ２６（ＤＰＰ４）、及びＣＤ１４２（Ｆ３）のうちの１つ以上の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、ＣＤ１１５（ＰＶＲ）の下方制御を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０（ＭＭＥ）、ＣＤ２６（ＤＰＰ４）、及びＣＤ１４２（Ｆ３）の下方制御を示す。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０及びＣＤｗ２９３のうちの１つ以上を高いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、例えば野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２のうちの１つ以上を低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０、及びＣＤｗ２９３のうちの１つ以上を高いレベルで発現し、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２のうちの１つ以上を低いレベルで発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２について陰性であり、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０、及びＣＤｗ２９３のうちの１つ以上について陽性である。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣの約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０及びＣＤ８６のうちの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣの約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０及びＣＤ８６のうちの１つ以上を発現する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣの少なくとも約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣの少なくとも約９０％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上を発現する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣの少なくとも約９５％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上を発現する。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）の提供から得られる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄移植（ＢＭＴ）から得られる。いくつかの実施形態では、ドナーは、２０未満、２５未満、３０未満、３５未満、又は４０未満のボディマス指数（ＢＭＩ）を有する。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞に分化する脂肪細胞前駆細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、インビトロで脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、インビボで脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、脂肪細胞前駆細胞と比較して、より高い脂肪生成遺伝子の発現レベルを示す。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞前駆細胞を含む。当業者には理解されるように、脂肪細胞前駆細胞には、脂肪細胞に分化する細胞が含まれる。脂肪細胞前駆細胞の非限定的な例としては、脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）及びＣＤ３４＋細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、脂肪細胞前駆細胞は、ＡＳＣを含む。いくつかの実施形態では、脂肪細胞前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪細胞前駆細胞は、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞を含む。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、対象に投与されると、治療有効量の脂肪細胞を提供する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、インビトロで脂肪細胞に分化する脂肪細胞前駆細胞を含み、治療有効量の脂肪細胞が対象に投与される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、インビボで脂肪細胞に分化して治療有効量の脂肪細胞を提供する、脂肪細胞前駆細胞を含む。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞に分化する脂肪生成細胞の割合は、約１％～約９９％以上、約２０％～約９０％、又は約５０％～約８０％である。いくつかの実施形態では、約５０％～約８０％の脂肪生成細胞が脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞の約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、又は９９％以上が脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、約８０％を超える脂肪生成細胞が脂肪細胞に分化する。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、対象において自然免疫応答を誘発しない、及び／又は実質的に誘発しない。自然免疫応答を同定するための非限定的な方法には、当業者に理解されるであろう任意の方法を使用して、ＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１０、及びＩＬ２を含むがこれらに限定されない自然免疫応答を示す因子のレベルを測定することが含まれる。いくつかの実施形態では、本開示の脂肪生成細胞は、対象においてＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１０、及びＩＬ２から選択される１つ以上の因子の上方制御を生じず、及び／又は実質的に上方制御を生じない。いくつかの実施形態では、本開示の脂肪生成細胞は、自然免疫応答を示す対象と比較して、対象におけるＴＮＦα、ＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＩＬ６、ＩＬ１０、及びＩＬ２から選択される１つ以上の因子のレベルの低下をもたらす。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、それを必要とする対象に移植される。いくつかの実施形態では、移植された脂肪生成細胞は、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞などの脂肪細胞前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、移植時に脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、移植された脂肪生成細胞は、脂肪細胞を含む。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、移植後に生着する。脂肪細胞の生着を決定するための方法が本明細書に記載されており、これには、脂肪細胞によって発現されるタンパク質のベースラインを超えるレベルを測定することが含まれるが、これに限定されない。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞の生体内分布を制御及び測定することができる。いくつかの実施形態では、移植されたＡＳＣに由来する脂肪細胞の生体内分布は、移植部位に局在する。いくつかの実施形態では、移植されたＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布は、体全体に広がっている。
一態様では、脂肪細胞前駆細胞は、ある体積用量で対象に移植される。いくつかの実施形態では、約２５０，０００細胞／ｋｇ～約４００万細胞／ｋｇの濃度の脂肪細胞前駆細胞が水又は他の適切な緩衝液（例えば、ＰＢＳ、ＨＢＳＳなど）に懸濁され、脂肪細胞前駆細胞は、約０．０１μＬ～約１００ｍＬ、約０．１μＬ～約１０ｍＬ、約１μＬ～約３ｍＬ、又は約１００μＬ～約２ｍＬの用量で対象に移植される。いくつかの実施形態では、脂肪細胞前駆細胞は、約０．００００１ｃｃ～約１００ｃｃ、約０．０００１ｃｃ～約１０ｃｃ、約０．００１ｃｃ～約３ｃｃ、又は約０．１ｃｃ～約２ｃｃの用量で対象に移植される。いくつかの実施形態では、脂肪細胞前駆細胞は、ＡＳＣである。いくつかの実施形態では、脂肪細胞前駆細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞及び／又は脂肪細胞前駆細胞は、針を使用して対象に移植及び／又は埋入される。本開示の細胞を移植及び／又は埋入するのに有用な任意の針サイズ及び／又は針ゲージが本開示によって企図される。いくつかの実施形態では、針は、２５Ｇ以上、２６Ｇ以上、２７Ｇ以上、２８Ｇ以上、２９Ｇ以上、又は３０Ｇ以上のゲージを有する。いくつかの実施形態では、針ゲージは、２５Ｇ、２６Ｇ、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、又は３０Ｇである。
一態様では、本発明の脂肪生成細胞は、インビボで長期持続する細胞生着及びアディポネクチンの分泌を示す。脂肪生成細胞の生着を決定する方法は、本明細書に記載されており、アディポネクチンは脂肪細胞に特異的であるため、アディポネクチンの血清レベルによってモニタリングすること、採取した組織中の脂肪細胞の存在を評価すること、及び分化した脂肪細胞の存在についてフローサイトメトリーを使用して骨髄を分析することを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、生着率は、約１０％～約９９％の範囲である。いくつかの実施形態では、生着率は、約２０％～約８０％の範囲である。いくつかの実施形態では、生着率は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、又は９９％以上である。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、生着後１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、２週間まで、３週間まで、１ヶ月まで、２ヶ月まで、３ヶ月まで、４ヶ月まで、５ヶ月まで、６ヶ月まで、７ヶ月まで、８ヶ月まで、９ヶ月まで、１０ヶ月まで、１１ヶ月まで、１年まで、若しくは２年まで、又はそれを超えて、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０年間持続する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、生着後１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、２週間まで、３週間まで、１ヶ月まで、２ヶ月まで、３ヶ月まで、４ヶ月まで、５ヶ月まで、６ヶ月まで、７ヶ月まで、８ヶ月まで、９ヶ月まで、１０ヶ月まで、１１ヶ月まで、１年まで、若しくは２年まで、又はそれを超えて、例えば、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、又は１０年間、目的の分子（例えば、タンパク質）を分泌する。
いくつかの実施形態では、本発明の脂肪生成細胞は、改善した生存率を有する。本発明の脂肪生成細胞の生存率は、比色又は蛍光色素を用いた膜完全性の試験を含むがこれに限定されない、当技術分野で公知の任意の方法を使用して決定することができる。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％以上が生存可能である。
操作された脂肪生成細胞及び操作されていない脂肪生成細胞
一態様では、本発明は、操作された脂肪生成細胞を含む。脂肪生成細胞を遺伝子操作するための非限定的な方法が本明細書に記載される。例えば、レンチウイルスベクターを使用して、脂肪生成細胞を遺伝子改変することができる。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞には、操作された脂肪細胞及び／又は操作された脂肪細胞前駆細胞（操作されたＡＳＣ又は操作されたＣＤ３４＋細胞など）が含まれる。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣ及び／又はＣＤ３４＋細胞などの脂肪細胞前駆細胞は、脂肪細胞への分化の際に目的のタンパク質を発現及び／又は分泌するように最初に操作される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、操作されたＡＳＣを含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、操作されたＣＤ３４＋細胞を含む。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞は、インビトロで脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞は、インビボで脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞への分化の際にレポータータンパク質を発現及び／又は分泌するように操作される。レポータータンパク質の非限定的な例は、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞への分化の際に哺乳動物血清タンパク質を発現及び／又は分泌するように操作される。血清タンパク質の非限定的な例は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞への分化の際に細胞内酵素などの細胞内哺乳動物タンパク質を発現及び／又は分泌するように操作される。細胞内哺乳動物タンパク質の非限定的な例は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）である。操作された脂肪生成細胞によって発現及び／又は分泌され得るタンパク質の他の非限定的な例としては、シスチノシン、ＧＬＰ－１、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＯＬ２Ａ１、副甲状腺ホルモン（１～８４）、アルカリホスファターゼ、アルファ－１アンチトリプシン、トラスツズマブ、アポリポタンパク質Ａ１、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー５、ＡＢＣＧ５、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ、グリシン切断系Ｐタンパク質、リジン：α－ケトグルタル酸還元酵素、シスタチオニンβ－シンターゼ、フィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ、及びヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）、アディプシン、アディポネクチンが挙げられる。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞によって発現及び／又は分泌されるタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞によって発現及び／又は分泌されるタンパク質は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アディプシン、及びアディポネクチンから選択される。
一態様では、本発明は、操作されていない脂肪生成細胞を含む。いくつかの実施形態では、操作されていない脂肪生成細胞には、操作されていない脂肪細胞及び／又は操作されていない脂肪細胞前駆細胞（操作されていないＡＳＣ又は操作されていないＣＤ３４＋細胞など）が含まれる。操作されていない脂肪生成細胞を同定及び単離するための非限定的な方法が本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、操作されていない脂肪生成細胞は、インビトロで脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、操作されていない脂肪生成細胞は、インビボで脂肪細胞に分化する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、対象に投与されると、治療有効量のタンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、治療有効量のタンパク質を発現及び／又は分泌する。操作されていない脂肪生成細胞によって発現及び／又は分泌されるタンパク質の非限定的な例としては、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；アディポネクチン；ＰＥＸ５；ＡＴＰ：ｃｏｂ（１）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＭＡＢ）；１４－３－３タンパク質イプシロン；２－オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットアルファ、ミトコンドリア、ＢＣＫＤＨＡ；２－オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットベータ、ミトコンドリア、ＢＣＫＤＨＢ；３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）；３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡデアシラーゼ（ＨＩＢＣＨ）；３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ＭＣＣＣ１；３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ＭＣＣＣ２；４－アミノ酪酸－α－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＢＡＴ）；５－ヌクレオチダーゼ；６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＭＣＡＤ；短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＳＣＡＤ；超長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＶＬＣＡＤ；アセチルＣｏＡチオラーゼ（アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ）、ＡＣＡＴ１；酸性セラミダーゼ；アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＡＰＲＴ；アデノシンデアミナーゼ；脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１；アグリン；アルデヒドオキシダーゼ；アルド－ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ２；アルカリホスファターゼ、組織非特異的アイソザイム；アルキルジヒドロキシアセトンリン酸シンターゼ、ＡＧＰＳ；アルファ－２－マクログロブリン；アルファエノラーゼ；アルファフェトプロテイン；アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ；アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ８２ｋＤａ型；アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ７７ｋＤａ型；アミノアシラーゼ－１；アンジオテンシノーゲン；アンジオテンシン－１；アンジオテンシン－２；アンジオテンシン－３；アンジオテンシン－４；アンジオテンシン１－９；アンジオテンシン１－７；アンジオテンシン１－５；アンジオテンシン１－４；アネキシンＡ５；アダプター関連タンパク質複合体３サブユニットベータ１、ＡＰ３Ｂ１；アポリポタンパク質Ｅ；アルギニノコハク酸リアーゼ、ＡＳＬ；アルギニノコハク酸シンターゼ；アルギニノコハク酸シンテターゼ、ＡＳＳ；アリールスルファターゼＡ；アリールスルファターゼＡ成分Ｂ；アリールスルファターゼＡ成分Ｃ；アリールスルファターゼＢ；アスパルチルグルコサミニダーゼ；ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、ＡＢＣＤ１；ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、ＤＤＸ３Ｘ；エンドレペリン；ベータ－２－ミクログロブリン；ベータ－ガラクトシダーゼ；ベータ－ヘキソサミニダーゼサブユニットアルファ、ＨＥＸＡ；ベータヘキソサミニダーゼサブユニットベータ、ＨＥＸＢ；二官能性プリン生合成タンパク質、ＰＵＲＨ；ビグリカン；ビオチニダーゼ；ビオチニダーゼ；骨形成タンパク質１；分岐酵素、ＧＢＥ１；カルモジュリン；カルレティキュリン；ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットガンマ；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；軟骨関連タンパク質；カタラーゼ；カタラーゼ、ＣＡＴ；カテプシンＡ；カテプシンＢ；カテプシンＤ；カテプシンＦ；カテプシンＫ；シトリン、ＳＬＣ２５Ａ１３；コラーゲンアルファ－１（Ｉ）鎖；コラーゲンアルファ－１（ＩＩＩ）鎖；コラーゲンアルファ－１（ＩＶ）鎖；アレステン；コラーゲンアルファ－１（Ｖ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）鎖；エンドスタチン、コラーゲンアルファ－２（Ｉ）鎖；コラーゲンアルファ－２（ＩＶ）鎖；カンスタチン；コラーゲンアルファ－２（Ｖ）鎖；コラーゲンアルファ－２（ＶＩ）鎖；コラーゲンアルファ－３（ＶＩ）鎖；補体Ｃ１ｒサブコンポーネント；補体Ｃ１ｓサブコンポーネント；補体Ｃ３；補体Ｃ４ベータ鎖；補体因子Ｄ；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ａ、ＣＰＴ１Ａ；シスタチオニンβシンターゼ、ＣＢＳ；シスタチン－Ｃ；シスチノシン、ＣＴＮＳ；シトクロムｃ；サイトカイン受容体様因子１；細胞質アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＡＣＡＴ２；Ｄ－二官能性酵素、ＨＳＤ１７Ｂ４；デコリン；ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア；ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ、ＧＮＰＡＴ；ジペプチジルペプチダーゼ１；カテプシンＣ；ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１；ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質２；エラスチン；伸長因子２；電子伝達フラビンタンパク質サブユニットアルファ、ＥＴＦＡ；電子伝達フラビンタンパク質サブユニットベータ、ＥＴＦＢ；電子伝達フラビンタンパク質デヒドロゲナーゼ、ＥＴＦＤＨ；細胞外マトリックスタンパク質１；フィブリリン－１；フィブリリン－２；フィブロネクチン；フィブリン－１；フィブリン－５；ホルミルグリシン生成酵素、ＳＵＭＦ１；フルクトース１，６－ビホスファターゼ、ＦＢＰ１；フマリルアセトアセターゼ；フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質２Ａ、ＦＡＨＤ２Ａ；ガラクトセレブロシダーゼ；ガラクトキナーゼ１；ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ＧＡＬＴ；ガングリオシドＧＭ２アクチベーター；ガングリオシドＧＭ２アクチベーターアイソフォーム短鎖；ゲルソリン；ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ＧＮＰＴＡ；グルコース－６－リン酸１－デヒドロゲナーゼ；グルコース－６－リン酸イソメラーゼ；グルコース－６－リン酸トランスロカーゼ、Ｇ６ＰＴ１；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＧＣＤＨ；グルタチオンペルオキシダーゼ３；グルタチオンシンテターゼ；グリセロールキナーゼ；グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（＋）］、細胞質；グリシン切断酵素システム、ＡＭＴ；グリシン切断酵素システム、ＧＣＳＨ；グリコーゲン脱分枝酵素；４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼ；アミロ－アルファ－１，６－グルコシダーゼ；グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓型；グリピカン－１；グリピカン－６；ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ三官能性多酵素複合体サブユニットアルファ、ＨＡＤＨＡ；ハプトグロビン；ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＳＧＳＨ；ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ＨＧＳＮＡＴ；ホルモン感受性リパーゼ；ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＬＵＤ１の超活性；ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＨＰＲＴ；イズロン酸－２－スルファターゼ、ＩＤＳ；インスリン様成長因子結合タンパク質７；間質性コラゲナーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格１；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格６Ｂ；Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＡ鎖；Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖；ラクトイルグルタチオンリアーゼ；ラミニンサブユニットアルファ－２；ラミニンサブユニットアルファ－４；ラミニンサブユニットベータ－１；ラミニンサブユニットベータ－２；ラミニンサブユニットガンマ－１；レプチン；分枝鎖アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、ミトコンドリア、ＤＢＴのリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分；リポタンパク質リパーゼ；肝臓及び筋肉ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＢ；肝臓ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＧ２；リソソーム酸リパーゼ／コレステリルエステルヒドロラーゼ；リソソームアルファ－グルコシダーゼ；リソソームアルファ－マンノシダーゼ；リソソーム保護タンパク質；ＣＬＮ６膜貫通ＥＲタンパク質、ＣＬＮ６；ＣＬＮ８膜貫通ＥＲ及びＥＲＧＩＣタンパク質、ＣＬＮ８；リソソーム膜貫通ＣＬＮ３タンパク質、ＣＬＮ３；リソソーム膜貫通ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ５；リソソーム関連膜糖タンパク質２；リソソーム輸送調節因子、ＬＹＳＴ；マロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ、ＭＬＹＣＤ；マトリリン－３；マトリックスＧｌａタンパク質；メラノフィリン、ＭＬＰＨ；メチオニンシンターゼ還元酵素、ＭＴＲＲ；メチレンテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、ＭＴＲ；メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、ＭＴＨＦＲ；メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤＨ６Ａ１；メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ；メバロン酸キナーゼ；ミトコンドリア分岐鎖アミノトランスフェラーゼ２、ＢＣＡＴ２；ミトコンドリアオルニチントランスロカーゼ、ＳＬＣ２５Ａ１５；メチルマロン酸尿Ａ型、ＭＭＡＡ；モリブドプテリンシンターゼ、ゲフィリン、ＭＯＣＳ１Ａ；ムコリピン－１、ＭＣＯＬＮ１；筋肉ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＡ１；ミオシンＶａ、ＭＹＯ５Ａ；ミオシン軽鎖４；Ｎ－アセチルガラクトサミン－６スルファターゼ、ＧＡＬＮＳ；Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ；ニコチンアミドＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＮＰＣ細胞内コレステロールトランスポーター１、ＮＰＣ１；パルミトイルプロテインチオエステラーゼ－１、ＰＰＴ１；パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、ＰＰＴ２；ペントラキシン関連タンパク質、ＰＴＸ３；ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼ、ＦＫＢＰ１０；ペルオキシダシンホモログ；ペロキシン－１、２、３、５、６、７、１０、１２、１３、１４、２６、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ；ホスホグルコムターゼ－１；ホスホグリセリン酸キナーゼ１；ホスホグリセリン酸ムターゼ１；色素上皮由来因子、ＰＥＤＦ；血漿アルファ－Ｌ－フコシダーゼ；細胞膜カルニチン輸送、ＯＣＴＮ２；血漿プロテアーゼＣ１阻害剤；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１；プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；プロサポシン；プロテオグリカン４；プロテオグリカン４Ｃ末端部分；ピルビン酸カルボキシラーゼ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＤＬＡＴ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＢ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＸ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＰ１；Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－２７Ａ、ＲＡＢ２７Ａ；レチノール結合タンパク質４；リボヌクレアーゼＴ２；セマフォリン－７Ａ；セピアプテリン還元酵素；セリンプロテアーゼ、ＨＴＲＡ１；セロトランスフェリン；セルピンＢ６；血清アミロイドＡ－１タンパク質；短分岐鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＡＣＡＤＳＢ；シアル酸シンターゼ；シアリダーゼ－１；シアリン（シアル酸輸送）、ＳＬＣ１７Ａ５；溶質輸送隊ファミリー２２メンバー５、ＳＬＣ２２Ａ５；ＳＰＡＲＣ関連モジュラーカルシウム結合タンパク質２；スペクトリンアルファ鎖、非赤血球１；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、ＳＭＰＤ１；スクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＯＸＣＴ１；スシリピート含有タンパク質、ＳＲＰＸ２；タファジン；テネイシン；トロンボスポンジン－２；トランスフォーミング成長因子ベータ誘導タンパク質ｉｇ－ｈ３；移行型小胞体ＡＴＰアーゼ；トリオースリン酸イソメラーゼ；トリ

ペプチジルペプチダーゼ１；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ；血管内皮増殖因子Ｃ；バーシカンコアタンパク質；ビメンチン；ビタミンＫ依存性プロテインＳ；Ｘ連鎖ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＡ２；Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ；α－フコシダーゼ、ＦＵＣＡ１；α－ガラクトシダーゼＡ、ＧＬＡ；α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ＮＡＧＡ；β－グルコセレブロシダーゼ（別名グルコシルセラミダーゼ）；ＧＢＡ、β－グルクロニダーゼ、ＧＵＳＢ；β－マンノシダーゼ（β-mannosidasen）；ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦ１６５；ＦＧＦ２；ＦＧＦ４；ＰＤＧＦ－ＢＢ（血小板由来成長因子）；Ａｎｇ１（アンジオポイテン１）、ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子）；ＬＰＡ産生酵素（ＡＸＴ）；及びフタルイミド血管新生因子（ＰＮＦ１）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、操作されていない脂肪生成細胞は、リソソーム酸リパーゼ、アディポネクチン、補体Ｃ３、脂肪細胞（adiponcyte）（全細胞）、脂肪細胞（adiponcyte）（全細胞）、血漿プロテアーゼＣ１阻害剤、プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ、コラーゲンアルファ－１（Ｖ）鎖、ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ三官能性多酵素複合体サブユニットアルファ、リソソーム酸リパーゼ、ビタミンＫ依存性プロテインＳ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼドメイン含有プロテイン２Ａ、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、シトリン、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、スクシニル－ＣｏＡ ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、グリセロールキナーゼ、グリシン切断酵素系プロテインＨ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、モリブドプテリンシンターゼ、及びペロキシンのうちの１つ以上を発現及び／又は分泌する。
本明細書に記載の任意のタンパク質及び／又は分子を発現及び／又は分泌する脂肪生成細胞を生成するための非限定的な方法には、タンパク質及び／又は分子を発現するレンチウイルスレポーターベクターを用いて脂肪細胞前駆細胞（例えば、ＡＳＣ）をトランスフェクトすること、細胞を分化させること、及び操作された脂肪生成細胞を回収することが含まれる。例えば、図１４Ａ及び１５Ａを参照されたい。
いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞及び／又は操作されていない脂肪生成細胞は、ヘムを調節する治療有効量のタンパク質のうちの１つ以上を発現及び／又は分泌する。ヘムを調節するタンパク質の非限定的な例としては、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯＲ、及びＧＡＴＡ－１、エポエチンアルファ（例えば、Procrit及びEpogen）、エポエチンベータ（例えば、NeoRecormon）、エポエチンゼータ（例えば、Silapo及びRetacrit）、ダルベポエチンアルファ（例えば、Aranesp）、及びメトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ（例えば、Mircera）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ヘムを調節するタンパク質は、ヘム含有細胞を調節するＥＰＯを調節する低酸素誘導因子（ＨＩＦ）を含むがこれに限定されないＥＰＯも調節する。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞との組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：９９～約９９：１である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：５０～約５０：１である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：２５～約２５：１である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：１０～約１０：１である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：５～約５：１である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：２～約２：１である。いくつかの実施形態では、操作された脂肪生成細胞と操作されていない脂肪生成細胞の比は、約１：１である。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、異種核酸を含む。異種核酸の例としては、例えば、コードされたタンパク質の産生の目的で導入される、目的の遺伝子産物をコードするＤＮＡ又はＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、異種核酸は、脂肪細胞特異的プロモーターを含む。脂肪細胞特異的プロモーターの非限定的な例としては、アディポネクチンプロモーター及びａＰ２／ＦＡＢＰ４プロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、最小の近位プロモーター配列を含む。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、任意選択により、１つ以上の遠位エンハンサー配列及び追加の転写因子結合部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、転写因子結合部位は、Ｃ／ＥＢＰα結合部位である。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、アディポネクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、アディポネクチンプロモーターは、ヒトアディポネクチンプロモーターである。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、１つ以上の治療用タンパク質と作動的に関連している。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、アディポネクチン又はａｐ２／ＦＡＢＰ４から選択される。いくつかの実施形態では、脂肪細胞特異的プロモーターは、ＣＦＤ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ２、ＰＬＩＮ４、ＬＥＰ、ＬＩＰＥ、ＰＰＡＲγ、レジスチン、ＩｓＧ１２ｂ、及びＡＣＶＲ１Ｃから選択される。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、非脂肪細胞特異的プロモーター、及び／又は部分的脂肪細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態では、非脂肪細胞特異的プロモーター及び／又は部分的脂肪細胞特異的プロモーターは、ＤＣＮ、ＡＤＨ１Ｂ、及びＨＡＳ１から選択される。
いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、導入遺伝子の発現に有用である。いくつかの実施形態では、構成的プロモーターは、ＥＦ１ａ、ＣＭＶ、及びＣＡＧから選択される。
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は、抗酸化活性、結合、カーゴ受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節因子、分子トランスデューサー活性、栄養リザーバー活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性、又はトランスポーター活性のうちの１つ以上を有する。治療用タンパク質の例には、酵素置換タンパク質、補充用タンパク質、タンパク質ワクチン、抗原（例えば、腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、癌）、細胞再プログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節されたデスエフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又はネクローシスの誘導物質）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、腫瘍タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック改変剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質改変酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核受容体活性化剤又は阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター又は阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質断片又はドメイン、リガンド又は受容体、及びＣＲＩＳＰＲシステム又はその成分が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、異種核酸は、１つ以上のＲＮＡ発現配列を含み、そのそれぞれがポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、相当量で産生される。したがって、ポリペプチドは、産生することができる任意のタンパク質性分子であり得る。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、細胞から分泌され得る、又は細胞の細胞質、核若しくは膜区画に局在し得るポリペプチドであり得る。ポリペプチドの例としては、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、寛容原（toleragen）、サイトカイン、毒素、その不存在が疾患に関連する酵素、及び動物内で（例えば、動物の腸内で）切断されるまで活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、異種核酸から発現させることができるタンパク質には、ヒトタンパク質、例えば、受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレーター、及び再生タンパク質（例えば、創傷治癒のための、増殖及び分化に関与するタンパク質、例えば、治療用タンパク質）が含まれる。いくつかの実施形態では、異種核酸から発現させることができる例示的なタンパク質には、ＥＧＦ（上皮成長因子）が含まれる。いくつかの実施形態では、異種核酸から発現され得る例示的なタンパク質には、酵素、例えば、酸化還元酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素、及びデサチュラーゼが含まれる。いくつかの実施形態では、異種核酸から発現させることができる例示的なタンパク質には、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、タンパク質は、NanoLuc（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）である。いくつかの実施形態では、異種核酸から発現させることができる例示的なタンパク質には、分泌タンパク質、例えば、分泌酵素が含まれる。いくつかの場合には、異種核酸は、血中で短い治療剤の半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか、又は細胞内局在シグナルを有するタンパク質、若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、異種核酸は、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。いくつかの場合には、異種核酸は、非ヒトタンパク質、例えば、蛍光タンパク質、エネルギー伝達アクセプター、又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ、若しくはＨｉｓなどのタンパク質タグを発現する。いくつかの実施形態では、異種発現物から発現させることができる例示的なタンパク質には、ＧＦＰが含まれる。いくつかの実施形態では、異種核酸は、タグ付きタンパク質、例えば、タンパク質タグ、例えば、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ；配列番号１４）、カルモジュリンタグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ；配列番号１５）；ポリグルタミン酸タグ（ＥＥＥＥＥＥ；配列番号１６）；Ｅタグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ；配列番号１７）；ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号１８）、ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１９）；Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号２０）；Ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号２１）；ＮＥタグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ；配列番号２２）；Ｓタグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ；配列番号２３）；ＳＢＰタグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ；配列番号２４）；Ｓｏｆｔａｇ１（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ；配列番号２５）；Ｓｏｆｔａｇ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ；配列番号２６）；スポットタグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ；配列番号：２７）；Ｓｔｒｅｐタグ（ＳｔｒｅｐタグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号２８）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ；配列番号２９）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ；配列番号３０）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ；配列番号３１）；ＶＳＶタグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号３２）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ；配列番号３３）を含有する、融合タンパク質又は操作されたタンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、異種核酸は、抗体、例えば、抗体断片、又はｓｃＦｖ及びその結合体若しくは多量体を含む抗体の抗原結合断片などのその一部を発現する。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞によって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。いくつかの実施形態では、異種核酸は、軽鎖、重鎖、Ｆｃ断片、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖ断片、又はＦａｂ断片、そのさらなる一部などの、抗体の一部を発現する。いくつかの実施形態では、異種核酸は、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、異種核酸は、複数の発現配列を含むことができ、そのそれぞれが抗体の一部を発現し、その合計が抗体を構成することができる。いくつかの場合には、異種核酸は、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列、及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。いくつかの場合には、異種核酸が軽鎖及び重鎖を発現する場合、適切な改変、フォールディング、又は他の翻訳後改変を受けて、機能的抗体を形成することができる。
実施形態では、本開示の脂肪生成細胞は、細胞死を調節する改変を含む。実施形態では、改変は、自殺スイッチであるか、又はそれを含む。自殺スイッチの非限定的な例としては、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ｔｋ）、カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）、ＣＤ２０／ｅＧＦＲｔ発現、及びＨＬＡターゲティング抗体が挙げられる。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、例として、ＨＳＶ－ｔｋ、ｉＣａｓｐ９、及びＣＤ２０／ｅＧＦＲｔ発現などの薬物誘発性自殺スイッチである。いくつかの実施形態では、自殺スイッチはＨＳＶ－ｔｋである。いくつかの実施形態では、ＨＳＶ－ｔｋは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）と組み合わせて使用される。例えば、Moolten and Wells, J Natl Cancer Inst.82:297-300 (1990)及びSangro et al., Cancer Gene Ther.17:837-843 (2010)（これらはいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＨＳＶ－ｔｋは、ＧＣＶなどの特定のヌクレオシド類似体をリン酸化し、ＤＮＡポリメラーゼの作用によってＤＮＡに組み込まれる基質としての三リン酸と競合する有毒なＧＣＶ三リン酸化合物を形成し、ＤＮＡ合成の阻害とそれに続く細胞死を引き起こす。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、カプサーゼ、又はその改変型、例えば、ｉＣａｓｐ９であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、ｉＣａｓｐ９は、二量体化の化学誘導物質（ＣＩＤ）と組み合わせて使用される。ＣＩＤの非限定的な例には、リミデュシド（ＡＰ１９０３）及びラパマイシン及び／又はラパログが含まれる。実施形態では、ｉＣａｓｐ９は、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）、例えば、ＦＫＢＰ１２に融合した改変ヒトカスパーゼ９を含有し、ＣＩＤの条件付き投与は二量体化を形成し、下流のカスパーゼ分子を活性化して、融合タンパク質を発現する細胞のアポトーシスを引き起こす。例えば、Gargett and Brown, Front.Pharmacol.5:235 (2014)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、ＦＫＢＰ、例えば、ＦＫＢＰ１２であるか、又はそれを含み、ＣＩＤと結合又は相互作用することができる。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、ＣＤ２０／ｅＧＦＲｔである。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞はＣＤ２０／ｅＧＦＲｔを発現し、この自殺スイッチは、改変脂肪生成細胞を標的とする抗体と組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、ＨＬＡターゲティング抗体である。非限定的な例では、ＨＬＡターゲティング抗体は、ドナーに依存する。別の非限定的な例では、自殺スイッチは、ＲＱＲ８であるか、又はＲＱＲ８を含む。いくつかの実施形態では、自殺スイッチは、短縮型ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲｔ）であるか、又はそれを含む。いくつかの実施形態では、細胞死を調節する改変には、本開示の脂肪生成細胞の１つ以上の生着の除去が含まれる。
組成物
一態様では、本発明は、本明細書に記載の脂肪生成細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量の脂肪生成細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、同種異系であるか、又は同種異系細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、非免疫原性である。例えば、組成物は、投与時に炎症反応を引き起こさない。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、非免疫原性である。いくつかの実施形態では、対象に投与すると、組成物、任意選択により、その中の脂肪生成細胞は、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－２、若しくはＩＦＮ－ガンマなどの炎症性サイトカイン、又はそれらの任意の組み合わせの約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％未満の増加を誘発する。いくつかの実施形態では、組成物及び／又は脂肪生成細胞は、免疫応答に関連するタンパク質を発現及び／又は分泌しないか、又は、組成物及び／又は脂肪生成細胞を投与したときに対象が免疫応答を示さないように、低下したレベルで免疫応答に関連するタンパク質を発現及び／又は分泌する。
いくつかの実施形態では、組成物は、対象に投与すると、ＩＤＯ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＧＦ、ＰＧＥ２、ＴＧＦベータ、及びＩＬ－６、又はそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上サイトカインの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、又は約４００％以上の増加を誘発する。
いくつかの実施形態では、組成物は、長時間作用型である。実施形態では、本明細書に記載の脂肪生成細胞の長時間作用型組成物などの長時間作用型組成物は、治療上有効なレベルで、タンパク質、脂質、又はホルモン分泌などの治療効果を長期間、いくつかの実施形態では、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１５、約１８、約２１、又は約２４ヶ月から約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、又は約１０年にわたって提供することができる。実施形態では、本明細書に記載の脂肪生成細胞の長時間作用型組成物などの長時間作用型組成物は、治療上有効なレベルで、タンパク質、脂質、又はホルモン分泌などの治療効果を長期間、いくつかの実施形態では、少なくとも約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１５、約１８、約２１、約２４ヶ月、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、又は約１０年にわたって提供することができる。
一態様では、本発明は、本明細書に記載の脂肪生成細胞を含む組成物を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性、長時間作用型組成物である。いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、自己由来、非免疫原性、長時間作用型組成物であり、ここで、脂肪生成細胞は、１つ以上の異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、それを必要とする対象において疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、脂肪細胞及び脂肪細胞前駆細胞（脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）及びＣＤ３４＋細胞など）のうちの１つ以上から任意選択により選択される、約５０，０００～約６，０００，０００，０００個の脂肪生成細胞（例えば、任意選択により、１つ以上の脂肪細胞及び脂肪細胞前駆細胞（脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）、及びＣＤ３４＋細胞など）から選択される、約５０，０００～約５，０００，０００，０００個、約５０，０００～約４，０００，０００，０００個、約５０，０００～約３，０００，０００，０００個、約５０，０００～約２，０００，０００，０００個、約５０，０００～約１，０００，０００，０００個、約５０，０００～約５００，０００，０００個、約５０，０００～約１００，０００，０００個、約５０，０００～約１０，０００，０００個、約５０，０００～約１，０００，０００個の細胞）を含む。
いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約７０，０００，０００細胞／ｍＬ～約３，０００，０００細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約５０，０００，０００細胞／ｍＬ～約１０，０００，０００細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約４０，０００，０００細胞／ｍＬ～約２０，０００，０００細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約３８，０００，０００ 細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約３０，０００，０００ 細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、約５，０００，０００ 細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、約１０万細胞／ｍＬ～約１億細胞／ｍＬ（例えば、約１０万細胞／ｍＬ～約１０００万細胞／ｍＬ、約１０万細胞／ｍＬ～約１００万細胞／ｍＬ、又は約１０万細胞／ｍＬ～約５０万細胞／ｍＬ）の濃度で組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、約５００万細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する。
いくつかの実施形態では、組成物は、約１００万～約７億５０００万個のＡＳＣを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約１億２０００万個のＡＳＣを含む。いくつかの実施形態では、組成物は、約４×１０６個のＡＳＣを含む。
いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、約２５０，０００細胞／ｋｇ～約４００万細胞／ｋｇの濃度で組成物中に存在する。
いくつかの実施形態では、組成物は、約０．２×１０６～約０．８×１０６個のＣＤ３４＋細胞を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上の細菌、ウイルス、真菌、及び発熱物質を実質的に含まず、より特定の実施形態では、上記の全てを実質的に含まない。
医薬組成物及び製剤
一態様では、組成物は、医薬組成物である。いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載されるように、有効成分として治療有効量の脂肪生成細胞を提供するように製剤化される。典型的には、医薬組成物はまた、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、不活性固体希釈剤及び充填剤を含む担体、滅菌水溶液及び様々な有機溶媒を含む希釈剤、透過促進剤、可溶化剤及びアジュバントを含む。
医薬賦形剤は、水及び油などの液体であってもよく、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む。医薬賦形剤は、例えば、生理食塩水、アカシアガム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素などであり得る。さらに、補助剤、安定剤、増粘剤、潤滑剤、及び着色剤を使用することができる。実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与されるとき、無菌である。水は、本明細書に開示されるいずれかの薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。生理食塩水並びにブドウ糖及びグリセロール水溶液も、特に注射用溶液の液体賦形剤として利用できる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども挙げられる。本明細書に開示される任意の組成物は、所望の場合、湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝剤とともに製剤化することもできる。適切な医薬賦形剤の他の例は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 1447-1676 (Alfonso R. Gennaro eds., 19th ed. 1995)に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、組成物は、賦形剤又は担体を含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は、薬学的に許容される賦形剤又は担体である。
いくつかの実施形態では、組成物は、希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、希釈剤は、薬学的に許容される希釈剤である。希釈剤の非限定的な例には、水、エタノール、プロピレングリコール、グリセリン及びそれらの様々な組み合わせなどの液体希釈剤、及び炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンなどの不活性固体希釈剤が含まれる。いくつかの実施形態では、希釈剤は、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ、アルファ改変最小必須培地（アルファＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ培地１６４０）、ＨＢＳＳ、ヒトアルブミン及びリンゲル液など、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量のヘパリン、ＦＢＳ、ヒトアルブミン、ｂＦＧＦ、ＰＰＡＲ－γアゴニスト、インスリン、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む。ＰＰＡＲ－γアゴニストの非限定的な例には、ロシグリタゾン、ＧＷ－９６６２、テサグリタザール、ＧＷ１９２９塩酸塩、シグリタゾン、ｎＴＺＤｐａ、トログリタゾン、ゲニステイン、テルミサルタン、エダグリタゾン、１５－デオキシ－Δ－１２，１４－プロスタグランジンＪ２、及び塩酸ピオグリタゾンが含まれる。Ｒｈｏキナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、ファスジル、Ｙ２７６３２、ロプレッサ、及びネタルスジルが挙げられる。
いくつかの実施形態では、希釈剤は、ヘパリン、ＦＢＳ、ヒトアルブミン、ｂＦＧＦ、ＰＰＡＲ－γアゴニスト、インスリン、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えば医薬組成物は、生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、ＰＢＳなどを含むがこれらに限定されない）中に懸濁される。
本技術は、医薬組成物の様々な製剤中に、開示される脂肪生成細胞を含む。本明細書に開示される任意の脂肪生成細胞は、溶液、懸濁液、エマルジョン、点滴剤、錠剤、丸剤、ペレット、カプセル、液体を含有するカプセル、粉末、持続放出製剤、エマルジョン、エアロゾル、スプレー、懸濁液の形態、又は使用に適した任意の他の形態をとることができる。
必要な場合、脂肪生成細胞を含む医薬組成物は、可溶化剤を含むこともできる。また、薬剤は、当技術分野で公知の適切なビヒクル又は送達装置を用いて送達することができる。
いくつかの実施形態では、組成物は、足場を含む。いくつかの実施形態では、足場は、生体材料を含む。非限定的な例では、三次元生体材料には、足場に付着した、足場内に分散した、又は足場内に捕捉された細胞外マトリックスに埋め込まれた脂肪細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、生体材料は、生分解性及び／又は合成である。
いくつかの実施形態では、足場は、生分解性生体材料を含む。生分解性生体材料の非限定的な例としては、フィブリン、コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、再構成基底膜マトリックス、デンプン、デキストラン、アルギン酸塩、ヒアルロン、キチン、キトサン、アガロース、糖、ヒアルロン酸、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリエチレングリコール、脱細胞化組織、自己組織化ペプチド、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、それらの誘導体及び混合物が挙げられる。他の有用な生分解性ポリマー又はポリマー種としては、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリオキサレート、ポリ（α－エステル）、ポリ無水物、ポリアセテート、ポリカプロラクトン、ポリ（オルトエステル）、ポリアミノ酸、ポリアミド、及びそれらの混合物及びコポリマー、Ｌ－乳酸及びＤ－乳酸ステレオポリマー、ビス（パラカルボキシフェノキシ）プロパン酸とセバシン酸のコポリマー、セバシン酸コポリマー、カプロラクトンコポリマー、ポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）／ポリエチレングリコールコポリマー、ポリウレタンとポリ（乳酸）のコポリマー、ポリウレタンとポリ（乳酸）のコポリマー、α－アミノ酸コポリマー、α－アミノ酸とカプロン酸のコポリマー、Ａ－ベンジルグルタメートとポリエチレングリコールのコポリマー、コハク酸とポリ（グリコール）のコポリマー、ポリホスファゼン、ポリヒドロキシアルカノエート及びそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。二成分及び三成分系も企図される。いくつかの実施形態では、足場は、コラーゲン、様々なプロテオグリカン、アルギン酸塩ベースの基質、及びキトサンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、足場は、ヒドロゲル、シルク、マトリゲル、無細胞及び／又は脱細胞（decellarized）足場、ポリ－ε－カプロラクトン足場、吸収性足場、及びナノファイバー－ヒドロゲル複合材のうちの１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、足場は、合成生体材料を含む。合成生体材料の非限定的な例としては、ポリラクチド、ポリカプロラクトングリコリド、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリアミノ酸、多糖、ポリホスファゼン、ポリ（エーテル－エステル）コポリマー（例えば、ＰＥＯ－ＰＬＬＡ）などのラクトン系ポリエステル又はコポリエステル；ポリジメチルシロキサン、ポリ（エチレン－酢酸ビニル）、アクリレート系ポリマー又はコポリマー（例えば、ポリヒドロキシエチルメチルメタクリレート、ポリビニルピロリジノン）、ポリテトラフルオロエチレン及びセルロースエステルなどのフッ素化ポリマーが挙げられる。
いくつかの実施形態では、足場は、ヒドロゲル、マトリゲル、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、ＰＧＡ、ＰＬＡ、及びＰＧＡ／ＰＬＡコポリマー、生分解性生体材料（例えば、コラーゲン、プロテオグリカン、アルギン酸塩ベースの基材、キトサン）又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む。
製剤のさらなる例については、米国特許出願公開第２０１６０３２４９８２号、米国特許出願公開第２０１８００７７９２２号、及び韓国特許出願公開第２０１６０１４７９２９号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
いくつかの実施形態では、組成物は、治療有効量の１つ以上の追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、鎮痛剤及び抗感染剤のうちの１つ以上である。例えば、組成物は、瘻孔部位の炎症又は痛みの処置を補助する鎮痛剤、又は組成物で処置される部位の感染を予防する抗感染剤を含み得る。追加の治療剤の非限定的な例としては、非ステロイド性抗炎症薬、オピエートアゴニスト及びサリチル酸塩などの鎮痛剤；駆虫剤、抗嫌気性菌剤、抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、抗真菌系抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、各種のＢ－ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、抗マイコバクテリア剤、抗結核抗マイコバクテリア剤、抗原虫剤、抗マラリア抗原虫剤、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、疥癬剤、抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、鎮痒剤／局所麻酔剤、局所抗感染剤、抗真菌局所抗感染剤、抗ウイルス局所抗感染剤などの抗感染剤；酸性化剤、アルカリ化剤、利尿剤、炭酸脱水酵素阻害利尿剤、ループ利尿剤、浸透圧利尿剤、カリウム保持性利尿剤、チアジド系利尿剤、電解質置換剤、及び尿酸排泄促進剤などの電解質剤及び腎臓作用剤；膵酵素及び血栓溶解酵素などの酵素；抗下痢剤、制吐剤、胃腸抗炎症剤、サリチル酸胃腸抗炎症剤、制酸性抗潰瘍剤、胃酸ポンプ阻害抗潰瘍剤、胃粘膜抗潰瘍剤、Ｈ２ブロッカー抗潰瘍剤、潰瘍剤、胆石溶解剤、消化剤、催吐剤、下剤及び便軟化剤、並びに腸管運動促進剤などの胃腸薬；吸入麻酔剤、ハロゲン化吸入麻酔剤、静脈麻酔剤、バルビツレート静脈麻酔剤、ベンゾジアゼピン静脈麻酔剤、及びオピエートアゴニスト静脈麻酔剤などの全身麻酔剤；堕胎剤、副腎剤、コルチコステロイド副腎剤、アンドロゲン、抗アンドロゲンなどのホルモン及びホルモン改変剤、免疫グロブリン、免疫抑制剤、トキソイド、及びワクチンなどの免疫生物学的薬剤；アミド局所麻酔剤及びエステル局所麻酔剤などの局所麻酔剤；抗痛風抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸系抗炎症剤、ミネラルなどの筋骨格系薬剤；ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、及びビタミンＫなどのビタミンが挙げられる。
上記のカテゴリーからの有用な治療剤のさらなる非限定的な例としては、（１）リドカイン又はその誘導体などの鎮痛剤全般、及びジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、及びナプロキセンを含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）鎮痛剤；（２）コデイン、フェンタニル、ヒドロモルホン、及びモルヒネなどのオピエートアゴニスト鎮痛剤；（３）アスピリン（ＡＳＡ）（腸溶性コーティングＡＳＡ）などのサリチル酸系鎮痛剤；（４）クレマスチン及びテルフェナジンなどのハイブロッカー抗ヒスタミン剤；（５）ムピロシンなどの抗感染剤；（６）クロラムフェニコール及びクリンダマイシンなどの抗嫌気性抗感染剤；（７）アムホテリシンｂ、クロトリマゾール、フルコナゾール、及びケトコナゾールなどの抗真菌抗生物質抗感染剤；（８）アジスロマイシン及びエリスロマイシンなどのマクロライド系抗生物質抗感染剤；（９）アズトレオナム及びイミペネムなどの各種のＢ－ラクタム系抗生物質抗感染剤；（１０）ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンＧ、及びペニシリンＶなどのペニシリン系抗生物質抗感染剤；（１１）シプロフロキサシン及びノルフロキサシンなどのキノロン系抗生物質抗感染剤；（１２）ドキシサイクリン、ミノサイクリン、テトラサイクリンなどのテトラサイクリン系抗生物質抗感染剤；（１３）イソニアジド（ＩＮＨ）及びリファンピンなどの抗結核抗マイコバクテリア抗感染剤；（１４）アトバコン及びダプソンなどの抗原虫抗感染剤；（１５）クロロキン及びピリメタミンなどの抗マラリア抗原虫抗感染剤；（１６）リトナビル及びジドブジンなどの抗レトロウイルス抗感染剤；（１７）アシクロビル、ガンシクロビル、インターフェロンアルファ、及びリマンタジンなどの抗ウイルス抗感染剤；（１８）アムホテリシンＢ、クロトリマゾール、ミコナゾール、及びナイスタチンなどの抗真菌局所抗感染剤；（１９）アシクロビルなどの抗ウイルス局所抗感染剤；（２０）ラクツロースなどの電解質剤及び腎臓作用剤；（２１）フロセミドなどのループ利尿剤；（２２）トリアムテレンなどのカリウム保持性利尿剤；（２３）ヒドロクロロチアジド（ＨＣＴＺ）などのチアジド系利尿剤；（２４）プロベネシドなどの尿酸排泄促進剤；（２５）ＲＮａｓｅ及びＤＮａｓｅなどの酵素；（２６）プロクロルペラジンなどの制吐剤；（２７）スルファサラジンなどのサリチル酸胃腸抗炎症剤；（２８）オメプラゾールなどの胃酸ポンプ阻害抗潰瘍剤；（２９）シメチジン、ファモチジン、ニザチジン、及びラニチジンなどのＨ２ブロッカー抗潰瘍剤；（３０）パンクレリパーゼなどの消化剤；（３１）エリスロマイシンなどの胃腸運動促進剤；（３２）ベンゾカイン及びプロカインなどのエステル局所麻酔剤；（３３）ベクロメタゾン、ベタメタゾン、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、及びプレドニゾンなどの筋骨格系コルチコステロイド抗炎症剤；（３４）アザチオプリン、シクロホスファミド、及びメトトレキサートなどの筋骨格系抗炎症性免疫抑制剤；（３５）ジクロフェナク、イブプロフェン、ケトプロフェン、ケトロラク（ketorlac）、及びナプロキセンなどの筋骨格系非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；（３６）鉄、カルシウム、及びマグネシウムなどのミネラル；（３７）シアノコバラミン（ビタミンＢ１２）及びナイアシン（ビタミンＢ３）などのビタミンＢ化合物；（３８）アスコルビン酸などのビタミンＣ化合物；並びに（３９）カルシトリオールなどのビタミンＤ化合物が挙げられる。
いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞の分化及び／又は増殖に影響を与える成長因子又は他の分子であってもよい。最終分化状態を誘導する成長因子は当技術分野で周知であり、最終分化状態を誘導することが示されている任意のそのような因子から選択され得る。本明細書に記載される方法で使用する成長因子は、特定の実施形態では、天然に存在する成長因子のバリアント又は断片であってもよい。例えば、バリアントは、保存的アミノ酸変更を行い、得られたバリアントを上記の機能アッセイのうちの１つ又は当技術分野で公知の別の機能アッセイで試験することによって生成され得る。保存的アミノ酸置換とは、類似した側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。保存的アミノ酸置換基の非限定的な例としては、バリン－ロイシン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、及びアスパラギン－グルタミンが挙げられる。
当業者に理解されるように、ポリペプチド成長因子のバリアント又は断片は、離散点突然変異の作製を含む、突然変異誘発などの従来の技術を使用して、又は短縮によって生成することができる。例えば、突然変異は、それが由来するポリペプチド成長因子の生物学的活性と実質的に同じであるか、又は単にそのサブセットを保持するバリアントを生じ得る。
本明細書に記載の脂肪生成細胞を含む医薬組成物は、単位剤形で簡便に提供してもよく、薬学の分野で周知の方法のいずれかによって調製してもよい。このような方法は一般に、治療剤を担体と結合させるステップを含み、担体は１つ以上の副成分を構成する。典型的には、医薬組成物は、治療剤を液体担体、微細化された固体担体、又はその両方と均一且つ緊密に会合させ、次いで、必要に応じて、産物を所望の製剤の剤形に成形することによって調製される（例えば、湿式又は乾式造粒、粉末ブレンドなど、及びその後の当技術分野で公知の従来の方法を使用した錠剤化）。
実施形態では、本明細書に開示される任意の脂肪生成細胞は、本明細書に開示される投与様式に適合した医薬組成物として日常的な手順に従って製剤化される。
処置方法
一態様では、本発明は、有効量の本発明の脂肪生成細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患又は障害を処置、予防、又は改善するための方法を含む。一部の実施形態では、対象は、疾患又は障害を有する。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害を有する疑いがある。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害のリスクが高まっている。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は障害のリスクが高まっている疑いがある。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、実質的に純粋である。
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、異常なタンパク質産生に関連している。いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、タンパク質の完全欠損に関連している。
いくつかの実施形態では、方法は、操作されていない又は形質転換されていない脂肪生成細胞を含む組成物を投与することを含む。操作又は形質転換されていない脂肪生成細胞を投与することによって処置、予防、又は改善できる疾患又は障害の非限定的な例としては、リソソーム蓄積障害、代謝障害、補体欠損症、脂肪細胞障害、内分泌障害、血管疾患、分枝鎖アミノ酸代謝障害、結合組織障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、血液疾患、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ベータアミノ酸及びガンマアミノ酸障害、ケトン代謝障害、ガラクトース血症、グリセロール代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、並びにペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害が挙げられる。以下の表１は、本発明の操作されていない脂肪生成細胞を使用して処置、予防、又は改善できる疾患及び障害のクラスの非限定的な例、及び適応症の例を示す。
Figure 2023551479000002
Figure 2023551479000003
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、ウォルマン病、肥満、Ｃ３欠損症、家族性リポジストロフィー、悪液質、遺伝性血管浮腫、プロピオン酸血症１型、エーラス・ダンロス症候群、長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性ＬＰＬ欠損症、プロテインＳ欠損症、チロシン血症Ｉ型、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、シトルリン血症Ｉ型、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症、サクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症、グリセロールキナーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、グルタル酸血症Ｉ型、モリブデン補酵素欠損、及びツェルウェガー症候群から選択される。
いくつかの実施形態では、方法は、操作又は形質転換された脂肪生成細胞を含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸は、治療用導入遺伝子を含む。操作又は形質転換された脂肪生成細胞を投与することによって処置、予防、又は改善できる疾患又は障害の非限定的な例としては、リソソーム蓄積障害、代謝障害、血液疾患、骨及び結合組織障害、内分泌障害、炎症性障害、単一遺伝子性障害、癌、心血管障害、分枝鎖アミノ酸代謝障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ケトン代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、ペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害、並びに他のタンパク質欠損障害が挙げられる。以下の表２は、本発明の操作された脂肪生成細胞を使用して処置、予防、又は改善できる疾患及び障害のクラスの非限定的な例、及び適応症の例を示す。
Figure 2023551479000004
一部の実施形態では、疾患又は障害は、シスチン症、Ｔ２Ｄ、血友病Ａ又はＢ、スティックラー症候群、骨粗鬆症、関節リウマチ、Ａ１ＡＴ欠損症、乳癌、アテローム性動脈硬化症、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、カルニチン－アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症、シトステロール血症、フェニルケトン尿症、遺伝性キサンチン尿症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、非ケトン性高グリシン血症、高リジン血症、ホモシスチン尿症、レフサム病、腎臓疾患を有する小児の成長障害から選択される。
いくつかの実施形態では、疾患又は障害は、高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）である。一部の実施形態では、疾患又は障害は、貧血である。
一態様では、本発明は、有効量の本発明の脂肪生成細胞を含む組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における赤血球産生を増加させるための方法を含む。いくつかの実施形態では、方法は、ヘム因子を発現及び／又は分泌する脂肪生成細胞を投与することを含む。
一態様では、本発明の組成物は、疾患又は障害の処置、予防、又は改善のためにそれを必要とする対象に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、直腸、頬側、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、経口、局所、又は吸入薬を含む、同様の有用性を有する薬剤の許容される投与様式のいずれかによって単回又は複数回投与で投与することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、単回投与で対象に投与される。非限定的な例において、単回投与には、単一部位又は複数部位での投与が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、複数回投与で対象に投与される。非限定的な例において、複数回投与には、単一部位又は複数部位での反復投与が含まれる。いくつかの実施形態では、組成物は、単回投与で投与された場合、対象における疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、複数回投与で投与された場合、対象における疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下、皮内、筋肉内、頭蓋内、眼内、静脈内、及び脂肪体から選択される経路による投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下、皮内、筋肉内、頭蓋内、眼内、静脈内、及び脂肪体内に投与される。いくつかの実施形態では、組成物は、皮下注射によって投与される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、対象に移植される。
本明細書に開示される任意の脂肪生成細胞の投与量及び投与スケジュールは、特定の脂肪生成細胞、処置される疾患、状態の重症度、状態が処置又は予防されるかどうか、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、及び投与する医師の裁量を含むがこれらに限定されない、様々なパラメーター及び要因に依存し得る。さらに、特定の対象に関する薬理ゲノミクス（治療薬の薬物動態、薬力学、又は有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響）情報が、使用される投与量に影響を与え得る。さらに、正確な個々の投与量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与時間、投与経路、製剤の性質、排出速度、処置される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む、様々な要因に応じて若干調整することができる。投与量にはいくらかの変動が予想され得る。
別の実施形態では、送達は、小胞、特にリポソーム内であり得る（Langer, 1990, Science 249:1527-1533；Treat et al., in Liposomes in Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)を参照）。
本明細書に開示される脂肪生成細胞は、制御放出手段又は持続放出手段によって、又は当業者に周知のデバイスの送達によって投与することができる。例としては、限定されないが、米国特許第３，８４５，７７０号、第３，９１６，８９９号；第３，５３６，８０９号；第３，５９８，１２３号；第４，００８，７１９号；第５，６７４，５３３号；第５，０５９，５９５号；第５，５９１，７６７号；第５，１２０，５４８号；第５，０７３，５４３号；第５，６３９，４７６号；第５，３５４，５５６号；及び第５，７３３，５５６号に記載されているものが挙げられ、これらはそれぞれその全体が参照により本明細書に組み込まれる。このような剤形は、異なる割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過膜、浸透圧システム、多層コーティング、微粒子、リポソーム、ミクロスフェア、又はそれらの組み合わせを使用して、１つ以上の活性成分の制御放出又は持続放出を提供するのに有用であり得る。有効成分の制御放出又は持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、光の適切な波長による刺激、酵素の濃度若しくは利用可能性、水の濃度若しくは利用可能性、又は他の生理学的条件若しくは化合物を含むがこれらに限定されない様々な条件によって刺激される。
別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984)；Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol.Sci.Rev. Macromol.Chem.23:61；Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann.Neurol.25:351；Howard et al., 1989, J. Neurosurg.71:105を参照）。
別の実施形態では、制御放出システムを処置される標的領域の近くに配置することができ、したがって全身用量の一部のみを必要とする（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release,上掲, vol. 2, pp. 115-138 (1984)を参照）。Langer, 1990, Science 249:1527-1533によるレビューで論じられている他の放出制御システムを使用してもよい。
本明細書に開示される任意の脂肪生成細胞を利用する投与計画は、対象のタイプ、種、年齢、体重、性別及び病状、処置される症状の重症度；投与経路；対象の腎臓又は肝臓の機能；個体の薬理ゲノム構造；並びに利用される本発明の特定の組成物を含む、様々な要因に従って選択することができる。本明細書に開示される任意の脂肪生成細胞は、１日１回の用量で投与することができ、又は１日総用量を１日２、３又は４回の分割用量で投与することができる。さらに、本明細書に開示される任意の脂肪生成細胞は、投与計画全体を通じて断続的ではなく連続的に投与することができる。
いくつかの実施形態では、疾患又は障害の複合寛解又は臨床的寛解は、組成物の投与から２４週間、１８週間、１２週間、８週間、又は６週間以内に達成される。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、疾患又は障害は、ウォルマン病、肥満、Ｃ３欠損症、家族性リポジストロフィー、悪液質、遺伝性血管浮腫、プロピオン酸血症１型、エーラス・ダンロス症候群、長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性ＬＰＬ欠損症、プロテインＳ欠損症、チロシン血症Ｉ型、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、シトルリン血症Ｉ型、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症、サクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症、グリセロールキナーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、グルタル酸血症Ｉ型、モリブデン補酵素欠損、ツェルウェガー症候群、シスチン症、Ｔ２Ｄ、血友病Ａ又はＢ、スティックラー症候群、骨粗鬆症、関節リウマチ、Ａ１ＡＴ欠損症、乳癌、アテローム性動脈硬化症、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、カルニチン－アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症、シトステロール血症、フェニルケトン尿症、遺伝性キサンチン尿症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、非ケトン性高グリシン血症、高リジン血症、ホモシスチン尿症、レフサム病、腎臓疾患を有する小児の成長障害から選択される。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ３４＋細胞であり、疾患又は障害は、リソソーム蓄積障害、代謝障害、血液疾患、骨及び結合組織障害、内分泌障害、炎症性障害、単一遺伝子性障害、癌、心血管障害、分枝鎖アミノ酸代謝障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ケトン代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、ペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害、他のタンパク質欠損障害、補体欠損症、脂肪細胞障害、血管疾患、結合組織障害、ベータアミノ酸及びガンマアミノ酸障害、ガラクトース血症、グリセロール代謝障害から選択される疾患又は障害から選択される。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞及び／又はそれを含む組成物は、１つ以上の追加の化合物と組み合わせて投与される。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、例えば対象への投与前に、１つ以上の追加の化合物で前処理される。いくつかの実施形態では、１つ以上の化合物は、追加の治療剤である。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物には、小分子、大分子、及び／又は抽出物が含まれる。小分子の非限定的な実施形態には、ＴＧＰ－３７７などのＶＥＧＦ活性化剤；３，４ＤＨＢ、Ｌ－ミモシン、ＤＢＭ、シクロピロックスオラミン、ＤＦＯ、ＮＯＧ、及びＤＭＯＧなどの、ＨＩＦ－１アルファ活性化剤／安定化剤；２（Ｓ）－ＯＭＰＴなどのＬＰＡアゴニスト、アデノシン受容体アゴニスト、ペニシリン及びセファロスポリンＣなどのβ－ラクタム；エリスロマイシンなどのマクロライド系薬剤；ストレプトマイシンなどのアミノグリコシド；レスベラトロール；Ｒｂ１、Ｒｂ２、Ｒｇ３、Ｒｈ２、Ｒｈ３、Ｒｇ１、Ｒｇ２、Ｒｈ１、Ｆ１などのジンセノサイド；クルクミン；アデノシン；硫酸ソコトラステロール；及びコレスタン三硫酸塩が含まれる。高分子の非限定的な例としては、ＶＥＧＦＡ；ＶＥＧＦ１６５；ＦＧＦ２；ＦＧＦ４；ＰＤＧＦ－ＢＢ（血小板由来成長因子）；Ａｎｇ１（アンジオポイテン１）、ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子）；ＬＰＡ産生酵素（ＡＸＴ）；フタルイミド血管新生因子（ＰＮＦ１）が挙げられる。抽出物の非限定的な実施形態には、ホザキノイカリソウ（Epimedium sagittatum）の抽出物、キカラスウリ（Trichosanthes kirilowii）の抽出物、及びニオイシタン（Dalbergia odorifera）の抽出物が含まれる。
一態様では、本発明は、脂肪生成細胞のインビボでのエレクトロポレーション（ＥＰ）のためのプロセスを含む。エレクトロポレーションは、電気刺激による一時的な膜孔の生成により、細胞膜を透過化する方法である。いくつかの実施形態では、方法は、対象の脂肪組織に脂肪生成細胞を注射すること、脂肪組織を第１のプレート電極と第２のプレート電極の間に配置すること、及び第１のプレート電極から脂肪組織を通って第２のプレート電極に電流を流すことを含む。いくつかの実施形態では、組織は、第１の平板電極と第２の平板電極の間で折り畳まれる。
いくつかの実施形態では、電流は、一連の電気パルスである。いくつかの実施形態では、プレート電極はそれぞれ、約１５０ｃｍ－１～約３５０ｃｍ－１の電圧を有する。いくつかの実施形態では、プレート電極はそれぞれ、約１７５ｃｍ－１～約３００ｃｍ－１の電圧を有する。いくつかの実施形態では、プレート電極はそれぞれ、約１９０ｃｍ－１～約２５０ｃｍ－１の電圧を有する。いくつかの実施形態では、プレート電極はそれぞれ、約１９５ｃｍ－１～約２１０ｃｍ－１の電圧を有する。いくつかの実施形態では、プレート電極はそれぞれ、約１５５Ｖ、約１６０Ｖ、約１６５Ｖ、約１７０Ｖ、約１７５Ｖ、約１８０Ｖ、約１８５Ｖ、約１９０Ｖ、約１９５Ｖ、約２００Ｖ、約２０５Ｖ、約２１０Ｖ、約２１５Ｖ、約２２０Ｖ、約２２５Ｖ、約２３０Ｖ、約２３５Ｖ、約２４０Ｖ、約２４５Ｖ、約２５０Ｖ、約２５５Ｖ、約２６０Ｖ、約２６５Ｖ、約２７０Ｖ、約２７５Ｖ、約２８０Ｖ、約２９５Ｖ、又は約３００Ｖまでの電圧を有する。
いくつかの実施形態では、第１のプレート電極と第２のプレート電極との間の距離は、約５ｍｍ～約５０ｍｍ、約５ｍｍ～約２０ｍｍ、又は約１０ｍｍ～約１５ｍｍの範囲である。いくつかの実施形態では、第１のプレート電極と第２のプレート電極との間の距離は、約５ｍｍ、約６ｍｍ、約７ｍｍ、約８ｍｍ、約９ｍｍ、約１０ｍｍ、約１１ｍｍ、約１２ｍｍ、約１３ｍｍ、約１４ｍｍ、約１５ｍｍ、約１６ｍｍ、約１７ｍｍ、約１８ｍｍ、約１９ｍｍ、又は約２０ｍｍである。例えば、Fisher et al.Gene Therapy 24:757-767 (2017)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
対象及び／又は動物
いくつかの実施形態では、対象及び／又は動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、又はサル、チンパンジー、若しくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。他の実施形態では、対象及び／又は動物は、例えばゼブラフィッシュなどの非哺乳動物である。いくつかの実施形態では、対象及び／又は動物は、（例えば、ＧＦＰを有する）蛍光タグ付き細胞を含んでもよい。いくつかの実施形態では、対象及び／又は動物は、例えばＲＰＥ細胞及び／又は免疫細胞などの、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。いくつかの実施形態では、対象及び／又は動物は、ヒトである。いくつかの実施形態では、ヒトは、小児である。いくつかの実施形態では、ヒトは、乳児又は子供である。いくつかの実施形態では、ヒトは、成人である。いくつかの実施形態では、ヒトは、老人である。他の実施形態では、ヒトは、患者と呼ばれ得る。
特定の実施形態では、ヒトは、生後約０ヶ月～約６ヶ月、生後約６ヶ月～約１２ヶ月、生後約６ヶ月～約１８ヶ月、生後約１８ヶ月～約３６ヶ月、約１歳～約５歳、約５歳～約１０歳、約１０歳～約１５歳、約１５歳～約２０歳、約２０歳～約２５歳、約２５歳～約３０歳、約３０歳～約３５歳、約３５歳～約４０歳、約４０歳～約４５歳、約４５歳～約５０歳、約５０歳～約５５歳、約５５歳～約６０歳、約６０歳～約６５歳、約６５歳～約７０歳、約７０歳～約７５歳、約７５歳～約８０歳、約８０歳～約８５歳、約８５歳～約９０歳、約９０歳～約９５歳、又は約９５歳～約１００歳の範囲の年齢を有する。
他の実施形態では、対象は非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学的使用に関する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、家庭用ペットである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は、家畜動物である。
様々な実施形態では、対象及び／又は動物の眼は、（ｉ）対象及び／又は動物における眼の疾患又は障害の存在を示すのに有効な量の蛍光化合物、及び（ｉｉ）眼組織の萎縮を誘発するのに有効な量の毒素を含む。いくつかの実施形態では、そのような対象及び／又は動物は、本発明の薬剤を投与されるか、又は本発明の薬剤を投与されない。
様々な実施形態では、ＲＰＥ及び免疫細胞が評価され、及び／又は影響を受ける。いくつかの実施形態では、免疫細胞には、対象及び／又は動物の自然免疫系の細胞が含まれる。いくつかの実施形態では、そのような細胞には、マクロファージ、単球、及びミクログリア細胞が含まれるが、これらに限定されない。様々な実施形態では、本発明は、対象及び／又は動物の眼における、免疫細胞の存在の検出、不存在の検出、又は量の測定を提供する。
キット
本発明は、本明細書に記載の任意の薬剤の投与を簡素化できるキットを提供する。本発明の例示的なキットは、本明細書に記載の任意の薬剤を単位剤形で含む。一実施形態では、単位剤形は、本明細書に記載の任意の薬剤及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含有する、無菌であってもよい予め充填されたシリンジなどの容器である。キットは、本明細書に記載される任意の薬剤の使用を指示するラベル又は印刷された説明書をさらに含むことができる。キットは、眼瞼鏡、局所麻酔剤、眼表面の洗浄剤も含んでもよい。キットはまた、本明細書に記載される１つ以上の追加の薬剤をさらに含むこともできる。
一態様では、本発明は、本発明の１つ以上の組成物を含むシリンジを含む。いくつかの実施形態では、シリンジには、ある体積の組成物が予め充填されている。いくつかの実施形態では、シリンジは、約１ｍＬ～約１０ｍＬの体積で予め充填されている。いくつかの実施形態では、シリンジは、約６．０ｍＬ、約５．９ｍＬ、約５．８ｍＬ、約５．７ｍＬ、約５．６ｍＬ、約５．５ｍＬ、約５．４ｍＬ、約５．３ｍＬ、約５．２ｍＬ、約５．１ｍＬ、約５．０ｍＬ、約４．９ｍＬ、約４．８ｍＬ、約４．７ｍＬ、約４．６ｍＬ、約４．５ｍＬ、約４．４ｍＬ、約４．３ｍＬ、約４．２ｍＬ、約４．１ｍＬ、約４．０ｍＬ、約３．９ｍＬ、約３．８ｍＬ、約３．７ｍＬ、約３．６ｍＬ、約３．５ｍＬ、約３．４ｍＬ、約３．３ｍＬ、約３．２ｍＬ、約３．１ｍＬ、約３．０ｍＬ、約２．９ｍＬ、約２．８ｍＬ、約２．７ｍＬ、約２．６ｍＬ、約２．５ｍＬ、約２．４ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．１ｍＬ、約２ｍＬ、約１．９ｍＬ、約１．８ｍＬ、約１．７ｍＬ、約１．６ｍＬ、約１．５ｍＬ、約１．４ｍＬ、約１．３ｍＬ、約１．２ｍＬ、約１．１ｍＬ、又は約１．０ｍＬ以下の組成物の体積で予め充填されている。いくつかの実施形態では、シリンジには、約１０ｍＬ未満の量の組成物が予め充填されている。いくつかの実施形態では、シリンジには、約６ｍＬ未満の量の組成物が予め充填されている。いくつかの実施形態では、シリンジには、約３ｍＬ未満の量の組成物が予め充填されている。いくつかの実施形態では、シリンジには、約２ｍＬ以下の量の組成物が予め充填されている。
いくつかの実施形態では、シリンジは、約２時間～約１週間の範囲の保存安定性を有する組成物を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、約－８５℃～約２５℃の範囲の温度で保存した場合、少なくとも約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、又は約７２時間の保存安定性を有する組成物を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、約２時間～約１週間の範囲の保存安定性を有する組成物を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、約１５℃～約２５℃の範囲の温度で保存した場合、少なくとも約１２時間、約２４時間、約３６時間、約４８時間、又は約７２時間の保存安定性を有する組成物を含む。
いくつかの実施形態では、シリンジは、約－８５℃～約２５℃の温度範囲で保存した場合、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、又は約５％未満の細胞生存率の喪失を示す組成物を含む。いくつかの実施形態では、シリンジは、約１５℃～約２５℃の温度範囲で保存した場合、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、又は約５％未満の細胞生存率の喪失を示す組成物を含む。
いくつかの実施形態では、保管温度は、約－８０℃である。いくつかの実施形態では、保管温度は、約－２０℃である。いくつかの実施形態では、保管温度は、約４℃である。いくつかの実施形態では、保管温度は、約２１℃である。
一実施形態では、キットは、本発明の脂肪生成細胞を含む組成物と、本明細書に記載されるような追加の治療薬の治療有効量とを含有する容器を含む。
定義
以下の定義は、本明細書に開示される本発明に関連して使用される。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
「有効量」は、本明細書に記載されるような疾患又は障害を処置、予防、又は改善するのに有効な量である。
薬剤が、疾患若しくは障害の測定可能な処置、予防、又は発症率の低下を提供する場合、その薬剤は「疾患又は障害の処置に有用である」。
本明細書で使用される場合、「a」、「an」、又は「the」は、１つ又は複数を意味することができる。
本明細書で言及される場合、特に指定しない限り、全ての組成割合は、全組成物の重量によるものである。本明細書で使用される場合、「含む」という語及びその変形は、非限定的であることが意図され、列挙された項目の記載は、この技術の材料、組成物、装置、及び方法においてまた有用であり得る他の同様の項目を排除するものではない。同様に、「できる（can）」及び「してもよい（may）」という用語及びそれらの変形は、非限定的であることが意図され、ある実施形態が特定の要素又は特徴を含むことができる、又は含んでもよいという記載は、それらの要素又は特徴を含まない本技術の他の実施形態を排除するものではない。
「含む（comprising）」というオープンエンドの用語は、含む（including）、含有する（containing）、又は有する（having）などの用語の同義語として、本発明を説明及び請求するために本明細書で使用されるが、本発明又はその実施形態は、「からなる」又は「から本質的になる」などの代替用語を使用して説明されてもよい。
実施形態では、脂肪組織は、任意の脂肪組織を含む。脂肪組織は、皮下、大網／内臓、乳房、生殖腺、又は他の脂肪組織部位に由来する褐色又は白色脂肪組織であり得る。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物からのものであってもよい。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、哺乳動物のものである。いくつかの実施形態では、脂肪組織は、ヒトのものである。脂肪組織の簡便な供給源は脂肪吸引手術によるものであるが、脂肪組織の供給源又は脂肪組織の単離方法は限定されない。
実施形態では、脂肪生成細胞は、対象に投与すると、優先的に脂肪細胞を提供する細胞である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、白色又は褐色／ベージュ脂肪細胞である。ある特定の実施形態では、脂肪細胞は、白色脂肪細胞である。他の実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪由来幹細胞（ＡＳＣ）である。さらに他の実施形態では、脂肪生成細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。したがって、脂肪生成細胞には、前駆脂肪細胞、前駆ＡＳＣ、及びＭＳＣなどの、前述のいずれかに対する前駆（precursor）細胞又は前駆（progenitor）細胞が含まれ得る。脂肪細胞（adipocyte）、又は一般に脂肪細胞（fat cell）は、様々な特性によって特徴付けることができる。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、発現（例えば、発現の上昇）又はＣＩＤＥＣ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、ＬＧＡＬＳ１２、ＡＤＩＰＯＱ、ＴＵＳＣ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＰＰＡＲＧ、ＬＥＰ、ＣＥＢＰＡ、及びそれらの組み合わせを含む１つ以上の遺伝子を特徴とする。いくつかの実施形態では、脂肪細胞は、以下：
ａ．有糸分裂後であること；
ｂ．約３５％を超える（脂肪組織の新鮮重量％；例えば、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％を超える）脂質含量を有し；任意選択により、約６０％～約９５％（例えば、６０～９４％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６０％～約７０％、約６０％～約６５％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、又は約８５％～約９０％）の脂肪組織中の脂肪含量を有し、任意選択により、約８０％（例えば、約７５～約８５％）の平均脂肪含量を有し、任意選択により、約５％～約４０％（例えば、約６～３６％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約４０％、約１５％～約４０％、約２０％～約４０％、約２５％～約４０％、約３０％～約４０％、又は約３５％～約４０％）の脂肪組織中の水分含量を有し、任意選択により、約１５％（例えば、約１２．５％～約１７．５％）の平均水分含量を有し、任意選択により、約１ｇ／ｍＬ（例えば、０．９１６ｇ／ｍＬ、約０．５ｇ／ｍＬ、約０．６ｇ／ｍＬ、約０．７ｇ／ｍＬ、約０．８ｇ／ｍＬ、約０．９ｇ／ｍＬ、約１．１ｇ／ｍＬ、又は約１．２ｇ／ｍＬ）の比重を有すること；
ｃ．遊離脂肪酸、コレステロール、モノグリセリド、及びジグリセリドのうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
ｄ．ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、及びミリスチン酸、それらの誘導体のうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
ｅ．細胞体積の約９０％を超えるサイズ（例えば、９５％を超える、又は約９８％を超える、又は約９３％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９９％）の脂質滴を有すること；
ｆ．細胞の体積の少なくとも約３０％～約９９％（例えば、少なくとも約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％）を含む脂質滴を有すること；
ｇ．直径約２０～３００μｍ（例えば、約２０～３００μｍ、約２０～２００μｍ、約２０～１００μｍ、約２０～５００μｍ、約２０～３０μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２００μｍ、約１５０～３００μｍ、約１５０～２００μｍ、又は約２００～３００μｍ）の表面サイズを有すること；
ｈ．約２００～約４００μｍ３（例えば、約２００～約３５０μｍ３、約２００～約３００μｍ３、約２００～約２５０μｍ３、約２５０～約４００μｍ３、約２５０～約３５０μｍ３、約２５０～約３００μｍ３、約３００～約３５０μｍ３、又は約３００～約４００μｍ３）の核体積を有すること；
ｉ．約４，０００～約１８，０００μｍ３（例えば、約４０００～約１５０００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３、約４０００～約１００００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約７５００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３）の総体積を有すること；
ｊ．約１：２０～１：９０（例えば、約１：２０～約１：８０、約１：２０～約１：７０、約１：２０～約１：６０、約１：２０～約１：５０、約１：２０～約１：４０、約１：２０～約１：３０；約１：３０～約１：８０、約１：４０～約１：８０、約１：５０～約１：８０、約１：６０～約１：８０、又は約１：７０～約１：８０）の核対細胞比を有すること；
ｋ．扁平な核を有すること；
ｌ．総細胞体積の約１０％～約６０％未満（（例えば、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、又は約５０％未満）の小さい細胞質を有し、細胞質には脂質滴体積が含まれないこと；
ｍ．液体を吸収及び放出できること；
ｎ．水又は水溶液（例えば、培地、又はＨＢＳＳ）中で浮揚性であること；
ｏ．非中心に位置する核を有すること；
ｐ．１つ以上の脂肪滴を有すること；
ｑ．非球形の細胞質を有すること；
ｒ．アディポネクチン、レプチン、及びＴＮＦ－αのうちの１つ以上を分泌できること；
ｓ．脂質生成ができること；
ｔ．トリグリセリド（ＴＧ）を貯蔵できること；
ｕ．非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）（例えば、オレイン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、及びステアリン酸などの長鎖脂肪酸）を分泌できること；
ｖ．ホルモンに応答性であること；
ｗ．神経入力に応答性であること；
ｘ．約９年（例えば、約８年～約１０年）の細胞代謝回転速度を有すること；
ｙ．約４５μｍ（例えば、約４７．２μｍ、約４０μｍ、約４２．５μｍ、約４７．５μｍ、又は約５０μｍ）の平均直径を有すること；
ｚ．約２５％の細胞が約５０μｍ未満の直径を有し；約４０％の細胞が約５０～６９μｍの直径を有し；約２５％の細胞が約７０～８９μｍの直径を有し；且つ約１０％の細胞が約９０μｍ以上の直径を有する、直径分布を有する細胞集団；
ａａ．心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）に応答性であること；
ｂｂ．脂肪分解ができること；
ｃｃ．ステロイドホルモンに結合及び応答できる受容体を発現すること；
ｄｄ．ホスファチジルコリンにより溶解されること；
ｅｅ．約１ｇ／ｍｌ（例えば、約０．８ｇ／ｍｌ、約０．９ｇ／ｍｌ、約１．１ｇ／ｍｌ、約１．２ｇ／ｍｌ）の細胞密度；
ｆｆ．約８０％を超える（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の）生存率；
ｇｇ．約８０％を超える（例えば、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の）純度、
ｈｈ．適切な効力の（例えば、約２００μｇ／ｍｌを超える）オイルレッドＯの溶出量；及び
ｉｉ．微生物汚染について陰性
のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、又は３５個以上を有することを特徴とする。
実施形態では、脂肪由来幹細胞又はＡＳＣとも呼ばれる脂肪幹細胞は、脂肪組織の間質画分、一般的にヒトなどの哺乳動物、すなわちヒト脂肪組織（ｈＡＳＣ）に由来する幹細胞である。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上について陽性（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てについて陽性）であり；特定の実施形態では、ＡＳＣは、表面マーカーＣＤ３１及びＣＤ４５のうちの１つ以上について陰性（例えば、一方又は両方について陰性）であり；一方、さらなる実施形態では、ＡＳＣは、表面マーカーＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上について陽性（例えば、１つ、２つ、３つ、又は４つ全てについて陽性）であり、表面マーカーＣＤ３１、ＣＤ３４、及びＣＤ４５のうちの１つ以上について陰性（例えば、１つ、２つ、又は３つ全てについて陰性）である。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、標準的な培養条件下でプラスチックに接着する。特定の実施形態では、拡大したＡＳＣは、培養物中で線維芽細胞様の形態を示す。いくつかの実施形態では、ＡＳＣは、骨形成系統、脂肪生成系統、筋原系統、又は軟骨形成系統のうちの１つ以上に分化する能力を特徴とする。
いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ７３、及びＭＨＣ－１のうちの１つ以上について陽性（例えば、１つ、２つ、又は３つ全てについて陽性）であり；特定の実施形態では、脂肪生成細胞は、表面マーカーＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４５、及びＣＤ４０のうちの１つ以上について陰性（例えば、１つ、２つ、又は３つ全てについて陰性）であり；一方、さらなる実施形態では、脂肪生成細胞は、表面マーカーＣＤ９０、ＣＤ７３、及びＭＨＣ－Ｉのうちの１つ以上について陽性（例えば、１、２、又は３つ全てについて陽性）であり、表面マーカーＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４５及びＣＤ４０のうちの１つ以上について陰性（例えば、１つ、２つ、又は３つ全てについて陰性）である。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、ＡＳＣである。いくつかの実施形態では、脂肪生成細胞は、脂肪細胞である。本開示全体を通じて、「ＭＨＣ」及び「ＨＬＡ」という用語は互換的に使用され得る。
実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、表面マーカーＣＤ３４について陽性の細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＣＤ３４細胞は、ＣＤ９０及びＣＤ４９Ｆのうちの１つ以上（例えば、１つ又は両方）についても陽性である。特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、及びＣＤ４５ＲＡのうちの１つ以上について陰性である（例えば、１つ、２つ又は３つ全てについて陰性）。さらに他の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ９０及びＣＤ４９Ｆの１つ又は両方について陽性であり、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、及びＣＤ４５ＲＡの１つ以上について陰性である。特定の実施形態では、これらの細胞は、造血幹細胞、並びに造血前駆細胞及び内皮前駆細胞などの前駆細胞である。ヒトＣＤ３４＋細胞は、比較的まれな細胞であり、通常は成人の骨髄に見られる。これらの細胞は、全ての主要な造血系を生じる。ＣＤ３４に加えて、それらは通常、表面マーカーＣＤ９０及びＣＤ４９Ｆについて陽性であり、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、及びＣＤ４５ＲＡに対して陰性である。
本発明を以下の非限定的な例によりさらに説明する。
実施例
実施例１：ＡＳＣの単離及び培養物中の細胞拡大。
この例は、とりわけ、脂肪組織からＡＳＣを単離し、培養物中でＡＳＣを拡大するプロセスを実証する。
この例では、ＡＳＣは、酵素消化法又は外植片培養法のいずれかを使用して脂肪組織から単離された。脂肪組織は、標準的な脂肪吸引手順によってヒトドナーから単離されるか、又はマウスから外科的に除去された、皮下白色脂肪組織であった。Wu et al., Clevel.Clin.J. Med.87, 6, 367-476 (2020)及びKilroy et al., Isolation of murine adipose-derived stromal/stem cells for adipogenic differentiation or flow cytometry-based analysis, Adipose-derived stem cells:Methods and protocols.2nd ed. New York (NY):Springer Nature, 137-146 (2018)（これらはいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。酵素消化法は以下の通りである。脂肪組織をＰＢＳで３～４回洗浄し、等体積の０．１％コラゲナーゼＩ型（Sigma-Aldrich、ＳＣＲ１０３）に懸濁した。消化は、３７℃、５％加湿ＣＯ２、連続撹拌で６０分間実施し、その後、酵素をＦＢＳで中和した。次いで、消化物を４００ｘｇで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを完全培地（低グルコースのＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ及びペニシリン－ストレプトマイシンを補充）で２回洗浄し、１００μｍセルストレーナー（Falcon、３５２３６０）を通して濾過した。細胞を完全培地に１×１０４～２×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、５％加湿ＣＯ２とともに３７℃に維持した。非接着細胞は２４時間後に培地を交換して除去し、プラスチック接着細胞は３～４日ごとに培地を交換して拡大させた。細胞を複製１５まで拡大し、凍結した。
ＡＳＣを単離するための外植片培養法は以下の通りであった。脂肪組織を洗浄して、等体積のＰＢＳと混合することによって過剰の血液を除去し、脂肪画分から水相を分離するために５分間放置した。次いで、脂肪をペトリ皿に移し、そこで約５ｍｍ３の断片に刻んだ。組織断片は、組織培養処理した皿の表面に均一に分配した。１００ｍｍ皿あたりおよそ１ｇの組織をプレーティングした。外植片が培養皿の表面と接触したままであるように、２．５ｍｌの予め温めた完全培地を皿に穏やかに加えた。３～４日ごとに培地を交換しながら、５％加湿ＣＯ２とともに皿を３７℃に維持した。プレーティング後５～１０日目に細胞の成長が観察され、さらに５～７日後に外植片組織が除去された。成長した細胞を複製１５まで拡大し、凍結した。
ＡＳＣは、培養物中で単離及び拡大することに成功した。図１Ａ～Ｂは、EVOS M5000イメージングシステム（ThermoFisher）で、透過光及び２０Ｘ対物レンズを使用して撮影された、培養物中のＡＳＣの代表的な画像（図１Ａ：ヒトＡＳＣ、図１Ｂ：マウスＡＳＣ）を示す。細胞は、組織培養皿の表面に接着しており、紡錘形及び大きく扁平な外観の典型的なＡＳＣ形態を示す。
単離及び拡大した細胞は、フローサイトメトリー分析を使用してＡＳＣの表面マーカーについて特徴付けられた。具体的には、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ３１、ＣＤ４５、及びＣＤ３４に対する直接結合抗体で細胞を染色した。単離された細胞は、ＣＤ２９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の高発現、ＣＤ３１及びＣＤ４５の低発現、並びにＣＤ３４の可変発現を示すことが予想された。図２Ａ～Ｂは、ＡＳＣが比較的均質な集団を構成し、ＡＳＣの９７％超がＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ９０について陽性であり、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ３１について陰性であることを示す。
全体として、この例は、とりわけ、ＡＳＣが脂肪組織から首尾よく単離され、培養物中の細胞を拡大させることができ、細胞表面マーカーの発現に基づいて特徴付けられたことを実証する。
実施例２：ヒトＣＤ３４＋細胞の単離及び培養物中の細胞拡大
この例は、とりわけ、末梢血からヒトＣＤ３４＋細胞を単離し、細胞培養物を拡大するプロセスを実証する。
この例では、ＣＤ３４＋細胞は、以下のようにヒトドナーから単離される。骨髄からのＣＤ３４＋細胞の動員は、フィルグラスチム（顆粒球コロニー刺激因子；Ｇ－ＣＳＦ）及びプレリキサフォルを使用して実施される。末梢血単核細胞は、アフェレーシスによって回収される。製造元の指示に従って、CliniMACSデバイス（Miltenyi Biotec）を使用して、採取した細胞をＣＤ３４＋細胞につき富化する。細胞は、以下のサイトカインを補充した幹細胞増殖培地（ＳＣＧＭ、Cell Genix）で培養する：１００ｎｇ／ｍＬ トロンボポエチン（ＴＰＯ）、１００ｎｇ／ｍＬ Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦｌｔＬ）、及び１００ｎｇ／ｍＬ 幹細胞因子（ＳＣＦ）（全てCell Genix製）。細胞を５％加湿ＣＯ２とともに３７℃に維持し、１×１０５～５×１０５細胞／ｍＬの範囲の適切な細胞密度を維持するために、必要に応じて毎日新鮮培地で希釈する。細胞は、１週間まで培養物中に維持し、凍結する。
新たに単離された細胞及び培養細胞は、フローサイトメトリー分析を使用して表面マーカーについて特徴付けられた。具体的には、ＣＤ３４、ＣＤ９０、ＣＤ４９Ｆ、Ｌｉｎ、ＣＤ３８、又はＣＤ４５ＲＡ（Biolegend）に対する直接結合抗体で細胞を染色する。細胞は、ＣＤ３４、ＣＤ９０、及びＣＤ４９Ｆの高発現、並びにＬｉｎ、ＣＤ３８、及びＣＤ４５ＲＡの低発現を示すことが予想される。
全体として、この例は、とりわけ、ヒト動員末梢血からＣＤ３４＋細胞を単離し、培養物中で拡大させ、特徴付けることができることを示す。
実施例３：ＡＳＣの分化による脂肪細胞のインビトロ産生
この例は、とりわけ、ＡＳＣから脂肪細胞を取得するための脂肪生成分化のプロセスを実証する。
実施例１に記載されるように、ＡＳＣを単離し、培養物中で拡大した。脂肪細胞は、Li et al., Isolation of human adipose-derived stem cells from lipoaspirates, Adipose-derived stem cells:Methods and protocols.2nd ed. New York (NY):Springer Nature. p. 155-165 (2018)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）から改変された手順を使用してＡＳＣから得られた。１００％コンフルエンスで拡大したＡＳＣを次の分化培地で処理した：１０％ＦＢＳ、３３μＭビオチン（Fisher、ＢＰ２３２－１）、１７μＭパントテン酸（Fisher、ＡＡＡ１６６０９２２）、１μＭウシインスリン（Sigma、Ｉ０５１６）、１μＭデキサメタゾン（Fisher、Ｄ１９６１１Ｇ）、０．１８７５ｍＭイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Fisher、ＡＣ２２８４２００１０）、及び０．２ｍＭインドメタシン（Fisher、ＡＡＡ１９９１００６）を補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２（Gibco、１０５６５０４２）。ヒトＡＳＣは、分化培地上で７～８日間維持された。他方で、脂肪生成誘導の３日後、マウスＡＳＣには、ＩＢＭＸ及びインドメタシンを含まない同じ培地をさらに４～５日間フィードした。分化したＡＳＣは、３７℃で５～１０分間、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡとインキュベートすることによって採取した。トリプシン－ＥＤＴＡは、ＤＭＥＭ（＋１０％ＦＢＳ）の添加により不活化される。凍結保存の場合、採取した細胞を凍結保存培地（９０％ＦＢＳ、１０％ＤＭＳＯ）に２．５×１０７細胞／ｍＬで再懸濁し、直ちに－８０℃の冷凍容器に一晩入れ、次いで、保存のために液体窒素タンク（－１４０℃）に移した。
脂肪生成分化は、オイルレッドＯ染色によって細胞形態を観察することにより、細胞内脂質滴の存在について評価した。具体的には、細胞を１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルムアルデヒド（Sigma、ＨＴ５０１１２８）で１時間固定し、６０％（ｖ／ｖ）オイルレッドＯ溶液（Fisher、ＡＡＡ１２９８９１４）で１０分間染色した。分化率は、総細胞数に対するオイルレッドＯ陽性細胞数の比率として表した。
分化した細胞における脂肪細胞特異的遺伝子発現のレベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって定量した。フェノールベースの抽出試薬（Invitrogen）を使用して細胞から全ＲＮＡを単離し、逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（BioRad）を使用して実施した。以下の脂肪生成遺伝子を、列挙されたプライマー対を使用してアッセイした：アディポネクチン（ヒト：プライマー１及び２；マウス：プライマー３及び４）、ＰＰＡＲγ（ヒト：プライマー５及び６；マウス：プライマー７及び８）、レプチン（ヒト：プライマー９及び１０；マウス：プライマー１１及び１２）、ＣＩＤＥＣ（ヒト：プライマー１３及び１４；マウス：プライマー１５及び１６）、ＦＡＢＰ４（ヒト：プライマー１７及び１８；マウス：プライマー１９及び２０）。ＧＡＰＤＨ（ヒト：プライマー２１及び２２；マウス：プライマー２３及び２４）及びアクチン（ヒト：プライマー２５及び２６；マウス：プライマー２７及び２８）を対照として使用した。
図３Ａに示すように、ＡＳＣの８０％超が脂肪細胞に分化し、これは、オイルレッドＯについて陽性に染色された脂質滴を含有する。さらに、図３Ｂは、試験した全ての脂肪細胞特異的遺伝子が、分化した細胞で高度に上方制御されていることを示しており、これは、脂肪生成分化をさらに裏付ける。
脂肪生成分化の効率もフローサイトメトリー分析によって定量される。具体的には、LipidTOX Deep Red（Fisher、Ｈ３４４７７）を細胞懸濁液に１：２００希釈で加え、穏やかに混合する。細胞を室温で３０分間インキュベートする。次いで、細胞をフローサイトメーターで分析する。分化した脂肪細胞は、ＡＳＣと比較してより高いレベルで、LipidTOXについて染色されることが予想される。LipidTOX陽性細胞は、落射蛍光顕微鏡を使用した細胞イメージングを介して定量化することもできる。
全体として、この例は、とりわけ、培養物中でＡＳＣを脂肪細胞に分化させるステップを詳しく説明する。この例は、脂肪生成分化を評価し、分化した細胞を特徴付ける方法も実証する。
実施例４：ＣＤ３４＋細胞の分化による脂肪細胞のインビトロ産生
この例は、とりわけ、ＣＤ３４＋細胞から脂肪細胞を取得するための脂肪生成分化のプロセスを実証する。
実施例２に記載されるように、ＣＤ３４＋細胞を単離し、培養物中で拡大する。脂肪細胞は、以下のように、ＣＤ３４＋細胞に由来する。ＣＤ３４＋細胞は、２０％ＦＢＳ、１５ｎｇ／ｍＬインターロイキン－３（ＩＬ－３）（Gibco、ＰＨＣ００３４）、及び０．６ｎｇ／ｍＬ組換えヒトマクロファージコロニー刺激因子（ヒトＭ－ＣＳＦ）（R&D Systems、２１６－ＭＣ）を含有する最小必須培地α（αＭＥＭ）（Gibco、１２５７１０６３）で３日間培養する。非接着細胞を０．０２％プロナーゼ（MilliporeSigma）で処理し、次いで、２０％ＦＢＳ及び１０ｎｇ／ｍＬのＭ－ＣＳＦを含有するαＭＥＭ中で２日間培養する。接着細胞を脂肪細胞に分化させるために、完全増殖培地を、αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬヒトＭ－ＣＳＦ、０．５ｍＭ ＩＢＭＸ（Fisher、ＡＣ２２８４２００１０）、及び１μＭデキサメタゾン（Fisher、Ｄ１９６１１Ｇ）、及び１０μｇ／ｍＬインスリン（Sigma、Ｉ０５１６）からなる脂肪生成開始培地に置換した。誘導の２日後、培地を、αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１００ｎｇ／ｍＬヒトＭ－ＣＳＦ、及び１０μｇ／ｍＬインスリンからなる脂肪生成進行培地と交換する。２日後、脂肪生成進行培地を、αＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１００ｎｇ／ｍＬヒトＭ－ＣＳＦからなる維持培地と交換し、インキュベーションを少なくともさらに５日間継続する。
ＣＤ３４＋細胞の脂肪生成分化は、実施例３に記載されるように、オイルレッドＯ染色によって細胞形態を観察することにより、細胞内脂質滴の存在について評価される。予想される脂肪生成分化率は５０～８０％である。
ＣＤ３４＋細胞の脂肪生成分化の効率は、実施例３に記載されるように、フローサイトメトリー分析によって定量することもできる。分化した脂肪細胞は、ＡＳＣと比較してより高いレベルで、LipidTOXについて染色されることが予想される。LipidTOX陽性細胞は、落射蛍光顕微鏡を使用した細胞イメージングを介して定量化することもできる。
分化した細胞における脂肪細胞特異的遺伝子発現のレベルは、実施例３に記載されるように、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって定量する。脂肪細胞は、ＡＳＣと比較して脂肪生成遺伝子のより高い発現レベルを示すことが予想される。
全体として、この例は、とりわけ、培養物中でＣＤ３４＋細胞を脂肪細胞に分化させるステップを詳しく説明する。この例は、とりわけ、脂肪生成分化を評価し、分化した細胞を特徴付ける方法も実証する。
実施例５Ａ：マウスにおける移植されたＡＳＣ由来の脂肪細胞の長期生着及びインビボでのアディポネクチン分泌
この例は、とりわけ、移植されたＡＳＣが、インビボで長期持続する脂肪細胞生着及びアディポネクチンの分泌を生じる能力を実証する。
この例では、実施例１に記載されるように、ＡＳＣが単離され、培養物中で拡大される。凍結保存されたＡＳＣを解凍し、１×１０５～３×１０５細胞／ｃｍ２で播種して、細胞を培養物中で凍結保存から回復させ、拡大させない。６～７日で細胞を採取し、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ又はマトリゲル（Corning、３５４２３４）に４×１０６細胞／１００μＬの濃度で懸濁する。細胞注射の前に、イソフルランを使用してマウスを麻酔する。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、フェノールレッド不含ＤＭＥＭ又はマトリゲルに懸濁したＡＳＣ（４×１０６細胞／面）を、２９Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の各面に注射する。模擬移植コホートでは、等体積のフェノールレッド不含ＤＭＥＭ又はマトリゲル単独を注射する。回復後、マウスに通常の固形飼料（LabDiet、５０５８）又は高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１）を与える。
１つのコホートでは、８週齢のＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（重度複合免疫不全自然突然変異Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄについてホモ接合性、The Jackson Laboratory、００１３０３）又はＢＡＬＢ／ｃＪマウス（The Jackson Laboratory、０００６５１）にヒト脂肪組織由来のＡＳＣを注射する（ｈＡＳＣ）。アディポネクチンは脂肪細胞に特異的であり、循環中に分泌されるため、インビボでのｈＡＳＣの脂肪細胞への分化は、ヒトアディポネクチンの血清レベルによってモニタリングされる。これらのマウスでは、回復後６ヶ月間まで、７日ごとに血清を採取する。回収した血清をＰＢＳで１～１０倍に希釈し、酵素結合免疫吸着測定法（Zen-Bio,Inc.、ADIP-1）によってヒトアディポネクチンについて分析する。移植されたマウスのヒトアディポネクチンの血清レベルは、回復後２週間目の時点で模擬移植マウスのレベルを上回り、６ヶ月まで高く維持されることが予想される。
同じコホートでは、インビボでのｈＡＳＣの脂肪細胞への分化も、採取した組織中のヒト脂肪細胞の存在によって評価される。具体的には、ｈＡＳＣを移植した背部組織、マウス脂肪デポ（生殖腺、腎周囲、後腹膜、腸間膜、及び鼠径部）及び非脂肪デポ（下肢骨格筋、肝臓、及び肺）を回復から７日後、及びその後６ヶ月まで毎月採取する。採取した組織は、選別と同じ日にホールマウントイメージングに供される。具体的には、組織を約４ｍｍ３の小片に刻み、１％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定する。固定組織をＰＢＳで各３×１０分間再水和し、BODIPY-493/503（ThermoFisher、Ｄ３９２２）（成熟脂肪細胞を可視化するために２μｇ／ｍｌ）、ＤＡＰＩ（ThermoFisher、Ｄ１３０６）（１μｇ／ｍｌ、核を可視化するため）、及び抗ヒトＣＤ２９抗体（１：２５、ヒト細胞の位置を特定するため）（Biolegend）で、暗所の氷上で３０分間染色する。染色された組織をＰＢＳで３×１０分間洗浄して、未結合の色素及び抗体を除去する。次いで、組織を顕微鏡スライド上に置き、Fluoromount-G（商標）（ThermoFisher、００－４９５８－０２）でマウントする。スライドは、EVOS M5000イメージングシステム（Thermo Fisher）で２０Ｘ対物レンズを使用してイメージングされる。取得した画像は、Adobe Photoshopソフトウェアで処理する。ヒト脂肪細胞は、BODIPY及びヒトＣＤ２９の両方について陽性に染色された細胞である。これらの細胞は、回復後７日目の時点でｈＡＳＣを移植した背部組織に出現すると予想される。１２週間までに、移植部位に脂肪体が明らかになることが予想される。ヒト脂肪細胞は、移植部位の外へのｈＡＳＣの移動により、マウス脂肪及び非脂肪デポでも観察され得る。
別のコホートでは、８週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（The Jackson Laboratory、０００６６４）に、ＵＢＣ－ＧＦＰトランスジェニックマウス（The Jackson Laboratory、００４３５３）から脂肪組織由来のＡＳＣ（ＧＦＰ＋ｍＡＳＣ）を注射する。ＧＦＰ＋ｍＡＳＣのＧＦＰ＋脂肪細胞への分化は、移植組織、レシピエントマウス脂肪デポ（生殖腺、腎周囲、後腹膜、腸間膜、及び鼠径部）及び非脂肪デポ（下肢骨格筋、肝臓、及び肺）を回復から７日後、及びその後６ヶ月まで毎月採取することによって評価される。上記のように、採取した組織を約４ｍｍ３の小片に刻み、１％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定する。固定組織をＰＢＳで各３×１０分間再水和し、BODIPY-493/503（ThermoFisher、Ｄ３９２２）（成熟脂肪細胞を可視化するために２μｇ／ｍｌ）、ＤＡＰＩ（ThermoFisher、Ｄ１３０６）（１μｇ／ｍｌ、核を可視化するため）、及び抗ＧＦＰ抗体（移植された細胞の位置を特定するため）（Biolegend）で染色する。次いで、染色された組織を洗浄し、上記のようにイメージングする。ＧＦＰ＋ｍＡＳＣに由来する脂肪細胞は、ＧＦＰ及びBODIPY-493/503の両方について陽性に染色される細胞である。ｈＡＳＣ移植コホートと同様に、ＧＦＰ＋ｍＡＳＣ由来の脂肪細胞は、回復後７日目の時点で、移植した背部組織に出現すると予想される。１２週間までに、移植部位に脂肪体が明らかになることが予想される。ＧＦＰ＋ｍＡＳＣ由来の脂肪細胞は、移植部位の外へのＧＦＰ＋ｍＡＳＣの移動により、レシピエントマウスの脂肪及び非脂肪デポでも観察され得る。
全体として、この例は、とりわけ、ヒト及びマウスＡＳＣの両方が移植時に脂肪細胞を生成し、ドナー由来の脂肪細胞がレシピエントマウスにおいて６ヶ月まで持続することを実証する。この例はまた、とりわけ、移植されたｈＡＳＣに由来するヒト脂肪細胞によるヒトアディポネクチンの長期インビボ分泌を達成する能力を示す。
実施例５Ｂ：マウスに移植されたＡＳＣ由来の脂肪細胞及びインビボでの長期生着
この例は、とりわけ、移植後１１７日目における脂肪生成遺伝子アディプシン及びＦＡＢＰ４の検出によって実証されるように、移植されたヒトＡＳＣがインビボで長期持続する脂肪細胞生着を生じる能力を実証する。
細胞を解凍する前に、１０％ＦＢＳ（Gemini、１００－１０６）及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher、１５１４０－１２２）を補充したＤＭＥＭ低グルコース＋Glutamax（Thermo Fisher、１０５６７－０１４）で増殖培地を調製し、０．２２ｕｍフィルターボトルで滅菌濾過した。所望の数の冷凍ＡＳＣクライオバイアルを液体窒素保管庫から回収し、３７度で、ビーズバス上で解凍した。ＡＳＣのバイアルが解凍されると、細胞溶液を解凍細胞１ｍＬ対増殖培地９ｍＬの比率で増殖培地と混合し、その後、スイングバケット遠心分離機で、２００ｘｇで５分間ペレット化した。遠心分離後、ペレットを取り除くことなく培地を慎重に吸引除去した。次いで、ペレットを５ｍＬの増殖培地に再懸濁し、上下にピペッティングすることによって穏やかに混合し、ペレットを単一細胞中に取り出した。ペレットを単一細胞中で完全に砕いた後、細胞溶液を適切なサイズの滅菌容器に移し、培養に使用するサイズの容器に合わせた所定の体積の増殖培地で満たした。次いで、細胞を３×１０４～６×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、細胞を培養物中で凍結保存から回復させ、拡大でさせた。細胞を解凍した翌日に増殖培地を交換し、続いて細胞が７０％コンフルエンスに達するまで２～３日ごとに交換した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらを上記のように継代し、６ウェル培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養させた。翌日、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するｇＬＵＣレポーター遺伝子を発現するレンチウイルスレポーターベクターを用いて、細胞を所定のＭＯＩでトランスフェクトした（操作された細胞）。ｇＬＵＣ発現は、ｈＡＳＣ中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）によって駆動された。操作された細胞は、ピューロマイシンを使用して選択した。次いで、操作された細胞及び操作されていない細胞の両方をさらに拡大した。
細胞が７０％コンフルエンスに達すると、移植のために採取した。増殖培地を培養容器から吸引除去し、所望の体積の０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher、２５２００－０７２）を各容器に加えた。次に、細胞をプラスチックから分離させるために、容器を３７度で５分間インキュベートした。５分後、細胞を４Ｘの顕微鏡で観察し、プラスチックから十分に分離されていることを確認した。次いで、血清用ピペットを使用して細胞をプラスチックから完全に分離し、細胞及びトリプシン溶液を上下に静かにピペッティングし、培養容器の全長にわたって洗浄した。次いで、細胞溶液を、等体積の増殖培地に十分な空間を残した適切なサイズの容器に移した。次いで、血清用ピペットを使用して等体積の増殖培地で培養容器を１回洗浄し、培養容器上の残留細胞を確実に完全に除去した。次いで、増殖培地を細胞及びトリプシン溶液に移して、トリプシンをクエンチした。次いで、スイングバケット遠心分離機で、８０×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。ペレット化後、培地を除去し、予め冷却したフェノールレッド不含ＨＢＳＳ（ThermoFisher、１４１７５－０９５）に細胞を再懸濁し、血清用ピペットを使用して上下にピペッティングして、ペレットを崩し、単一細胞とした。完全に混合した後、１０ｕＬの細胞溶液を１０ｕＬの０．４％トリパンブルー（Thermo Fisher、１５２５０－０６１）と微量遠心管中で混合し、次いで、血球計数器（Hausser Scientific、３１１０）を使用して計数して、総生細胞数を決定した。総細胞数を決定した後、スイングバケット遠心分離機で、８０×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。ペレット化後、上清を吸引除去し、細胞を予め冷却したＨＢＳＳに最終濃度４×１０６細胞／１００ｕＬとなるように再懸濁した。
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（重度複合免疫不全自然突然変異Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄについてホモ接合性、The Jackson Laboratory、００１３０３）にＡＳＣを注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁したＡＳＣ（４×１０６細胞／面）を、２５Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の各面に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみを注射した。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を１４日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。インビボでのｈＡＳＣの脂肪細胞への分化は、背側腹部における移植後１１７日目に、ヒトＦＡＢＰ４及びアディプシンのＲＴ－ＰＣＲによってモニタリングした。分化した細胞におけるヒト脂肪細胞特異的遺伝子発現のレベルは、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）によって定量した。フェノールベースの抽出試薬（Invitrogen）を使用して細胞から全ＲＮＡを単離し、逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ－ＰＣＲ分析は、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（Applied Biosystems）を使用して実施した。以下の脂肪生成遺伝子を、列挙されたプライマー対を使用してアッセイした：ＦＡＢＰ４（ヒト：プライマー１７及び１８）及びアディプシン（ヒトプライマー：ヒトアディプシンプライマー１０８：ＧＡＣＡＣＣＡＴＣＧＡＣＣＡＣＧＡＣＣ（配列番号３４）及び１０９：ＧＣＣＡＣＧＴＣＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＣ（配列番号３５））。生のＣＴ値がプロットされ、非検出値は４０ＣＴでプロットされた。図６Ａ～６Ｂに示すように、ヒトＦＡＢＰ４及びアディプシンは、移植後１１７日目に背側腹部で検出された。これらのマーカーはヒト特異的であり、したがって、マウス組織に由来するものではあり得ない。操作されたｈＡＳＣ及び操作されていないｈＡＳＣはいずれも、インビボで脂肪細胞に分化した。
全体として、この例は、とりわけ、ヒトＡＳＣが移植時に脂肪細胞を生成し、ドナー由来の脂肪細胞がレシピエントマウスにおいて１１７日間を超えて持続することを実証する。
実施例５Ｃ：移植された遺伝子改変脂肪生成細胞由来の脂肪細胞によるガウシアルシフェラーゼのインビボ分泌及びマウスに移植されたヒトＡＳＣ由来の脂肪細胞の長期生着（インビボ）
この例は、とりわけ、操作された脂肪生成細胞を移植することによって、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）の持続的なインビボ分泌を達成する能力を実証する。さらに、脂肪細胞特異的アディポネクチンプロモーター下でのガウシアルシフェラーゼの発現の検出によって実証されるように、移植された操作されたヒトＡＳＣがインビボで長期持続する脂肪細胞生着を生じることを実証する。
この例では、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるｈＡＳＣと同様にヒトＡＳＣ、ｈＡＳＣを培養した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらを実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように継代し、６ウェル培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養させた。翌日、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するＧＬｕｃレポーター遺伝子を発現するレンチウイルスレポーターベクターを用いて、細胞を所定のＭＯＩでトランスフェクトした。ＧＬｕｃ発現は、ヒトアディポネクチンプロモーター配列番号４によって駆動された。ｈＡＳＣは、増殖培地と計算された使用量の特定のＬＶとを組み合わせることにより、所定のＭＯＩを使用してトランスフェクトされた。トランスフェクションの２４時間後、増殖培地及びＬＶを除去し、新鮮な増殖培地と交換した。７２時間後、ＬＶ１ Ｇｌｕｃ細胞を２ｕｇ／ｍＬ ピューロマイシン（Sigma、Ｐ９６２０）を含有する新しい増殖培地に交換し、９６時間培養して、ＬＶ１トランスフェクト細胞を選択した。９６時間後、実質的な細胞死が観察され、全ての残存細胞がＬＶ１構築物と積極的に統合された。細胞を新しい増殖培地に交換し、７０％コンフルエンスになるまで６～７日間成長させ、２～３日ごとに培地交換を実施した。７０％コンフルエンスに達した後、トランスフェクトされたｈＡＳＣを実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように継代し、２～３日ごとに培地を交換しながら６～７日間成長させた。次いで、細胞を実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように再度継代し、２～３日ごとに培地を交換しながら６～７日間成長させた。７０％コンフルエンスに達した後、細胞を実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるように分化のために継代し、続いて実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるように分化させた。
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory、００１３０３）にＡＳＣを注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁したＡＳＣ（８×１０６細胞／面）を、２５Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の各面に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみを注射した。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を２８日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。血漿中の脂肪細胞特異的ｇｌｕｃの発現を毎週測定した。ＧＬｕｃ分泌は、Pierce（商標）Gaussia Luciferase Glow Assay kit（Thermo Fisher、１６１６１）を製造元の指示に従って使用して定量した。簡潔には、血漿を尾部の切れ目から回収し、セレンテラジンを含有する緩衝液と混合した。ＧＬｕｃによって生成される生物発光は、セレンテラジンの酸化によって生じ、そのシグナルはルミノメーターを使用して測定した。図７に示すように、ドナー由来の脂肪細胞は、レシピエントマウスにおいて少なくとも８４日間ｇｌｕｃを発現する。
全体として、この例は、とりわけ、ヒトＡＳＣが移植時に脂肪細胞を生成し、ドナー由来の脂肪細胞がレシピエントマウスにおいて少なくとも８４日間持続することを実証する。この例はまた、とりわけ、移植されたｈＡＳＣに由来する脂肪細胞によるガウシアルシフェラーゼの長期インビボを達成する能力を示す。
実施例６：移植されたＣＤ３４＋細胞由来の脂肪細胞の長期生着及びインビボでのアディポネクチン分泌
この例は、とりわけ、移植されたＣＤ３４＋細胞が、インビボで長期持続する脂肪細胞生着及びアディポネクチンの分泌を生じる能力を実証する。
この例では、実施例２に記載されるように、ヒトＣＤ３４＋細胞が単離され、培養物中で拡大される。凍結保存したＣＤ３４＋を解凍し、サイトカイン補充培地中、およそ１×１０６細胞／ｍＬで２４～４８時間予備刺激する（実施例２に記載）。ＮＯＤ．Ｃｇ－ＫｉｔＷ－４１ＪＴｙｒ＋ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ（ＮＢＳＧＷ）マウスは、Jackson Laboratory（Stock 026622）から入手する。非照射ＮＢＳＧＷ雌マウス（６～８週齢）に、０．２～０．８×１０６ＣＤ３４＋細胞（２００μｌ ＤＰＢＳに再懸濁）を眼窩後注射により注入する。アディポネクチンは脂肪細胞に特異的であり、循環中に分泌されるため、移植されたヒトＣＤ３４＋細胞のインビボでの脂肪細胞への分化は、ヒトアディポネクチンの血清レベルによってモニタリングされる。これらのマウスでは、回復後６ヶ月間まで、７日ごとに血清を採取する。収集した血清をＰＢＳで１～１０倍に希釈し、酵素結合免疫吸着測定法（Zen-Bio,Inc.、ADIP-1）によってヒトアディポネクチンについて分析する。移植されたマウスのヒトアディポネクチンの血清レベルは、回復後２週間目の時点で模擬移植マウスのレベルを上回り、６ヶ月まで高く維持されることが予想される。
インビボでのヒトＣＤ３４＋細胞の脂肪細胞への分化も、採取した組織中のヒト脂肪細胞の存在によって評価される。具体的には、マウス脂肪デポ（生殖腺、腎周囲、後腹膜、腸間膜、及び鼠径部）及び非脂肪デポ（下肢骨格筋、肝臓、及び肺）を回復から７日後、及びその後６ヶ月まで毎月採取する。採取した組織は、選別と同じ日にホールマウントイメージングに供される。具体的には、組織を約４ｍｍ３の小片に刻み、１％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定する。固定組織をＰＢＳで各３×１０分間再水和し、BODIPY-493/503（ThermoFisher、Ｄ３９２２）（成熟脂肪細胞を可視化するために２μｇ／ｍｌ）、ＤＡＰＩ（ThermoFisher、Ｄ１３０６）（１μｇ／ｍｌ、核を可視化するため）、及び抗ヒトＣＤ２９抗体（１：２５、ヒト細胞の位置を特定するため）（Biolegend）で、暗所の氷上で３０分間染色する。染色された組織をＰＢＳで３×１０分間洗浄して、未結合の色素及び抗体を除去する。次いで、組織を顕微鏡スライド上に置き、Fluoromount-G（商標）（ThermoFisher、００－４９５８－０２）でマウントする。スライドは、EVOS M5000イメージングシステム（Thermo Fisher）で２０Ｘ対物レンズを使用してイメージングされる。取得した画像は、Adobe Photoshopソフトウェアで処理する。ヒト脂肪細胞は、BODIPY及びヒトＣＤ２９の両方について陽性に染色された細胞である。これらの細胞は、回復後２週間の時点でマウスの脂肪デポに出現すると予想される。ヒト脂肪細胞は、マウスの非脂肪デポでも観察され得る。
さらに、ヒトＣＤ３４＋細胞の生着は、生着後１２～１６週間でレシピエントマウスから骨髄を採取することによって評価される。骨髄細胞は、ヒトＣＤ３４＋由来細胞の存在についてフローサイトメトリーを使用して分析される。具体的には、骨髄細胞をまずHuman TruStain FcX（４２２３０２、Biolegend）及びTruStain fcX（抗マウスＣＤ１６／３２、１０１３２０、Biolegend）ブロッキング抗体とともに１０分間インキュベートし、続いてＶ４５０マウス抗ヒトＣＤ４５クローンＨＩ３０（５６０３６７、BDBiosciences）、ＰＥ－ｅＦｌｕｏｒ６１０ｍＣＤ４５モノクローナル抗体（３０－Ｆ１１）（６１－０４５１－８２、Thermo Fisher）、ＦＩＴＣ抗ヒトＣＤ２３５ａ抗体（３４９１０４、Biolegend）、ＰＥ抗ヒトＣＤ３３抗体（３６６６０８、Biolegend）、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ１９抗体（３０２２１２、Biolegend）、及びlive/dead染色用Fixable Viability Dye eFluor 780（６５－０８６５－１４、Thermo Fisher）とともにインキュベートする。ヒト生着の割合は、ｈＣＤ４５＋細胞／（ｈＣＤ４５＋細胞＋ｍＣＤ４５＋細胞）×１００として計算される。この数値は、２０％～９０％の間で変動すると予想される。
全体として、この例は、とりわけ、ヒトＣＤ３４＋細胞が移植時に脂肪細胞を生成し、ドナー由来の脂肪細胞がレシピエントマウスにおいて６ヶ月まで持続することを実証する。この例はまた、とりわけ、移植されたＣＤ３４＋に由来するヒト脂肪細胞によるヒトアディポネクチンの長期インビボ分泌を達成する能力を示す。
実施例７Ａ：脂肪細胞の移植及びアディポネクチンのインビボ分泌
この例は、とりわけ、インビボでの長期持続する細胞生着及びアディポネクチンの分泌をもたらす脂肪細胞の移植プロセスを実証する。
この例では、脂肪細胞は、実施例３に記載されるＡＳＣ又は実施例４に記載されるＣＤ３４＋細胞のいずれかに由来する。脂肪細胞は、新たに採取されるか、又は凍結保存されたストックから解凍される。細胞をフェノールレッド不含ＤＭＥＭに１０６細胞／４０μＬで懸濁する。細胞注射の前に、イソフルランを使用してマウスを麻酔する。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、フェノールレッド不含ＤＭＥＭに懸濁した脂肪細胞（４×１０６細胞／面）を、２６Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の各面に注射する。模擬移植コホートでは、等体積のフェノールレッド不含ＤＭＥＭを注射する。
１つのコホートでは、８週齢のＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory、００１３０３）又はＢＡＬＢ／ｃＪマウス（The Jackson Laboratory、０００６５１）に、ｈＡＳＣ由来の脂肪細胞又は培養物中のヒトＣＤ３４＋細胞（ｈ脂肪細胞）を注射する。ｈ脂肪細胞生着のエビデンスは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載の手順後の移植組織における血清ヒトアディポネクチンレベルの上昇、並びにBODIPY-493/503及びヒトＣＤ２９の両方の陽性染色である。血清ヒトアディポネクチンレベルは、回復後３日間測定され、その後は６ヶ月まで毎週測定される。組織は回復から７日後に採取され、染色され、その後は６ヶ月まで毎月行われる。血清ヒトアディポネクチンレベルは、生着後３日目の時点でベースラインを超えて上昇し、６ヶ月まで高く維持されることが予想される。対照的に、模擬移植マウスでは血清ヒトアディポネクチンは検出されない。さらに、移植されたマウスでは、BODIPY-493/503及びヒトＣＤ２９の両方について陽性に染色された細胞は、生着後６ヶ月まで移植部位に持続すると予想される。
別のコホートでは、８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（The Jackson Laboratory、０００６６４）に、培養物中のＧＦＰ＋ｍＡＳＣに由来する脂肪細胞（ＧＦＰ＋ｍ脂肪細胞）を注射する。ＧＦＰ＋ｍ脂肪細胞生着のエビデンスは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載の手順後の移植組織におけるBODIPY-493/503及びＧＦＰの両方に対する陽性染色である。組織は回復から７日後に採取され、染色され、その後は６ヶ月まで毎月行われる。BODIPY-493/503及びＧＦＰの両方について陽性に染色された細胞は、生着後最大６ヶ月まで移植部位に持続すると予想される。
要約すると、この例の結果は、とりわけ、培養物中のヒトＡＳＣ、マウスＡＳＣ、又はヒトＣＤ３４＋細胞由来の脂肪細胞を移植して、インビボで長期持続する脂肪細胞生着を達成できることを示す。この例はまた、とりわけ、移植されたヒト脂肪細胞からのヒトアディポネクチンの長期インビボ分泌を達成する能力を実証する。
実施例７Ｂ：脂肪細胞の移植及びアディプシンのインビボ分泌
この例は、とりわけ、インビボで長期持続する細胞生着及び用量依存性のアディプシン分泌をもたらす、皮膚の皮下層及び鼠径部脂肪体に脂肪細胞を移植するプロセスを実証する。
ＡＳＣは、最初にObatalaから購入した。細胞を解凍する前に、１０％ＦＢＳ（Gemini、１００－１０６）及び１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher、１５１４０－１２２）を補充したＤＭＥＭ低グルコース＋Glutamx（Thermo Fisher、１０５６７－０１４）で増殖培地を調製し、０．２２ｕｍフィルターボトルで滅菌濾過した。所望の数の冷凍ＡＳＣクライオバイアルを液体窒素保管庫から回収し、３７度で、ビーズバス上で解凍した。ＡＳＣのバイアルが解凍されると、細胞溶液を解凍細胞１ｍＬ対増殖培地９ｍＬの比率で増殖培地と混合し、その後、スイングバケット遠心分離機で、２００ｘｇで５分間ペレット化した。遠心分離後、ペレットを取り除くことなく培地を慎重に吸引除去した。次いで、ペレットを５ｍＬの増殖培地に再懸濁し、上下にピペッティングすることによって穏やかに混合し、ペレットを単一細胞中に取り出した。ペレットを単一細胞中で完全に砕いた後、細胞溶液を適切なサイズの滅菌容器に移し、培養に使用するサイズの容器に合わせた所定の体積の増殖培地で満たした。次いで、細胞を３×１０４～６×１０４細胞／ｃｍ２で播種し、細胞を培養物中で凍結保存から回復させ、拡大でさせた。細胞を解凍した翌日に増殖培地を交換し、続いて細胞が７０％コンフルエンスに達するまで２～３日ごとに交換した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、分化用のシードに継代した。増殖培地を培養容器から吸引除去し、所望の体積の０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher、２５２００－０７２）を各容器に加えた。次に、細胞をプラスチックから分離させるために、容器を３７度で５分間インキュベートした。５分後、細胞を４Ｘの顕微鏡で観察し、プラスチックから十分に分離されていることを確認した。次いで、血清用ピペットを使用して細胞をプラスチックから完全に分離し、細胞及びトリプシン溶液を上下に静かにピペッティングし、培養容器の全長にわたって洗浄した。次いで、細胞溶液を、等体積の増殖培地に十分な空間を残した適切なサイズの容器に移した。次いで、血清用ピペットを使用して等体積の増殖培地で培養容器を１回洗浄し、培養容器上の残留細胞を確実に完全に除去した。次いで、増殖培地を細胞及びトリプシン溶液に移して、トリプシンをクエンチした。次いで、スイングバケット遠心分離機で、８０×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。ペレット化後、上清を除去し、細胞を所定体積の増殖培地に再懸濁した。次いで、１０μＬの細胞を回収し、１０ｕＬの０．４％トリパンブルー（Thermo Fisher、１５２５０－０６１）と混合し、血球計数器（Hausser Scientific、３１１０）を使用して計数した。総生数を測定した後、細胞を所望の数の培養容器に４１，６６６細胞／ｃｍ２で再播種し、３日間培養した。３日間の培養後、ＡＳＣから脂肪細胞への分化が開始する。３％ＦＢＳ（Gemini、１００－１０６）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher、１５１４０－１２２）、３３μＭビオチン（Fisher Scientific、ＢＰ２３２－１）、１７μＭパントテン酸（Fisher Scientific、ＡＡＡ１６６０９２２）、１μＭインスリン（Sigma、Ｉ９２７８）、１８７．５ｕＭ ＩＢＭＸ（Fisher Scientific、ＡＡＪ６４５９８ＭＣ）、２００ｕＭインドメタシン（Fisher Scientific、ＡＡＡ１９９１００６）、及び１μＭデキサメタゾン（Fisher Scientific、Ｄ１６９１１Ｇ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Thermo Fisher、１０５６５－０１８）で十分なヒト脂肪細胞誘導培地を調製し、次いで、０．２２ｕＭＰＥＳフィルターボトルを通して滅菌濾過した。次いで、増殖培地を培養容器から吸引除去し、新たに調製したヒト脂肪細胞誘導培地と交換し、その後３日間培養した。３日後、３％ＦＢＳ（Gemini、１００－１０６）、１Ｘペニシリン－ストレプトマイシン（Thermo Fisher、１５１４０－１２２）、３３μＭビオチン（Fisher Scientific、ＢＰ２３２－１）、１７ｕＭパントテン酸（Fisher Scientific、ＡＡＡ１６６０９２２）、１μＭインスリン（Sigma、Ｉ９２７８）（Fisher Scientific、ＡＡＡ１９９１００６）、及び１μＭデキサメタゾン（Fisher Scientific、Ｄ１６９１１Ｇ）を含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２（Thermo Fisher、１０５６５－０１８）で十分なヒト脂肪細胞維持培地を調製し、次いで、０．２２μＭＰＥＳフィルターボトルを通して滅菌濾過した。ヒト脂肪細胞誘導培地を培養容器から吸引除去し、新たに調製したヒト脂肪細胞維持培地と交換し、４日間培養した。７日間の分化後、ヒト脂肪細胞維持培地を培養容器から吸引除去し、所望の体積の０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Thermo Fisher、２５２００－０７２）を各容器に加えた。次に、細胞をプラスチックから分離させるために、容器を３７度で５分間インキュベートした。５分後、細胞を４Ｘの顕微鏡で観察し、プラスチックから十分に分離されていることを確認した。次いで、血清用ピペットを使用して細胞をプラスチックから完全に分離し、細胞及びトリプシン溶液を上下に静かにピペッティングし、培養容器の全長にわたって洗浄した。次いで、細胞溶液を、等体積のＤＭＥＭ／Ｆ１２培地に十分な空間を残した適切なサイズの容器に移した。次いで、血清用ピペットを使用して等体積のＤＭＥＭ／Ｆ１２で培養容器を１回洗浄し、培養容器上の残留細胞を確実に完全に除去した。次いで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２を細胞及びトリプシン溶液に移して、トリプシンをクエンチした。次いで、スイングバケット遠心分離機で、８０×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。ペレット化後、培地を除去し、予め冷却したフェノールレッド不含ＨＢＳＳ（ThermoFisher、１４１７５－０９５）に細胞を再懸濁し、血清用ピペットを使用して上下にピペッティングして、ペレットを崩し、単一細胞とした。完全に混合した後、１０ｕＬの細胞溶液を１０ｕＬの０．４％トリパンブルー（Thermo Fisher、１５２５０－０６１）と微量遠心管中で混合し、次いで、血球計数器（Hausser Scientific、３１１０）を使用して計数して、総生細胞数を決定した。総細胞数を決定した後、スイングバケット遠心分離機で、８０×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。ペレット化後、上清を吸引除去し、細胞を予め冷却したＨＢＳＳに最終濃度１６及び３２×１０６細胞／１００μＬとなるように再懸濁した。
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory、００１３０３）にＡＳＣ由来の脂肪細胞（ｈ脂肪細胞）を注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁した脂肪細胞（８、１６又は３２×１０６細胞／面）を、皮下投与のために２７Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の面又は鼠径部の脂肪体に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみを注射した。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を１４日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。
ｈ脂肪細胞の生着は、血漿中のヒトアディプシンレベルの検出によって実証された。投与後１２６日まで、ヒトアディプシンの細胞ＥＬＩＳＡキット（LEGENDplex（商標）Human Adipokine、Biolegend）を使用して、血清中のヒトアディプシン分泌レベルを分析した。図８に示すように、ヒトアディプシンレベルは、移植後１２６日まで血漿中に検出された。ヒトアディプシンは、１６Ｍヒト細胞を投与した場合の約５０ｐｇ／ｍｌと比較して、３２Ｍヒト細胞を投与した場合は約８０ｐｇ／ｍｌというより高いレベルで検出され、さらに、ＨＢＳＳを投与した対照マウスでは約５ｐｇ／ｍｌという非常に低いバックグラウンドレベルが検出された。
要約すると、この例の結果は、とりわけ、培養物中のヒトＡＳＣ由来の脂肪細胞を移植して、インビボで長期持続する脂肪細胞生着を達成できることを示す。この例はまた、とりわけ、移植されたヒト脂肪細胞からのヒトアディポネクチンの長期インビボ分泌を達成する能力を実証する。
実施例８Ａ：培養物中のＡＳＣ及び分化した脂肪細胞の非免疫原性
この例は、とりわけ、培養物中のＡＳＣ、及びＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞が低い免疫原性を有することを実証する。
この例では、ｈＡＳＣは、実施例１に記載されるように単離及び拡大する。ｈ脂肪細胞は、実施例３に記載されるようにｈＡＳＣに由来するか、又は実施例４に記載されるようにヒトＣＤ３４＋細胞に由来する。これらの細胞型の両方の免疫原性特性は、免疫表現型解析又は一元混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを使用して評価される。
免疫型判定では、フローサイトメトリー分析を使用して免疫原性マーカーについて細胞を特徴付ける。ヒト末梢血単核細胞（ｈＰＢＭＣ）（AllCells）を対照として使用する。細胞を、１％ＦＢＳを含有するＰＢＳで洗浄し、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ－ＡＢＣ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ８０、又はＣＤ８６（全てBiolegend製）に対する直接結合抗体と４℃で３０分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、フローサイトメーターで分析する。アイソタイプ一致陰性対照は、バックグラウンド染色を定義するために使用される。ｈＡＳＣ及びｈ脂肪細胞は、ｈＰＢＭＣと比較して、より低いレベルのＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６を発現すると予想される。
ｈＡＳＣ及びｈ脂肪細胞の免疫原性も、一元ＭＬＲアッセイを使用して特徴付けられる。ＭＬＲアッセイにおけるレスポンダー細胞は、以下のように調製される。ｈＰＢＭＣは、白血球除去した末梢血細胞（AllCells）をＬＳＭ密度勾配で遠心分離することによって調製される。磁気ビーズを使用した負の選択により、ＰＢＭＣの一部からＴ細胞が精製される。簡潔には、ｈＰＢＭＣは、単球（抗ＣＤ１４；クローンＵＣＨＭ１）、Ｂ細胞（抗ＣＤ１９；クローンＬＴ１９）、ナチュラルキラー細胞（抗ＣＤ５６；クローンＥＲＩＣ－１）、及びＭＨＣクラスＩＩ抗原を発現する細胞（抗ＭＨＣクラスＩＩ ＤＲ；クローンＨＬ－３９）に結合するように選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（全てSerotec製）のカクテルで処理される。ｈＰＢＭＣは、抗マウスＩｇＧ抗体（Dynal Corp）でコーティングされた磁気ビーズと混合する。ビーズに結合した細胞は磁石を使用して除去され、精製されたＴ細胞の集団が残る（抗ＣＤ３ ｍＡｂを使用したフローサイトメトリーにより９０％超のＴ細胞）。
精製されたレスポンダーＴ細胞は、細胞増殖を追跡するために、５，６－カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（CellTrace（商標）ＣＦＳＥ、Thermo Fisher、Ｃ３４５５４）で標識されている。具体的には、細胞をペレット化し、CellTrace（商標）ＣＦＳＥ染色液（１：１０００希釈）に穏やかに再懸濁し、遮光して３７℃で２０分間インキュベートする。次いで、元の染色体積の５倍の培地を細胞に加え、５分間インキュベートする。次いで、細胞をペレット化し、新鮮な温かい培地に再懸濁する。培地は、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、抗生物質／抗真菌剤、２－メルカプトエタノール（試薬は全てGibco製）、及び５％ヒトＡＢ血清（Pel-Freez）を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地である。
ＭＬＲは、９６ウェルのマイクロタイタープレートで実施する。２人の異なるドナーに由来するＣＦＳＥ標識精製Ｔ細胞を、ウェルあたりドナーあたり２×１０５細胞でプレーティングする。Ｔ細胞集団の少なくとも１つがｈＡＳＣ及びｈ脂肪細胞に対して主要なミスマッチである可能性を最大化するために、異なるドナーが使用される。アッセイで使用される刺激細胞には、自己ｈＰＢＭＣ（ベースライン応答）、同種異系ｈＰＢＭＣ（陽性対照応答）、ｈＡＳＣ、及びｈ脂肪細胞が含まれる。ｈＡＳＣ及びｈ脂肪細胞は、３７℃で３時間、５０μｇ／ｍＬマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）で前処理され、ｈＰＢＭＣは、同じ用量で３０分間前処理される。追加の対照培養物は、培地のみにプレーティングされたＴ細胞で構成される（刺激細胞なし）。各処理につき三重の培養を実施する。次いで、刺激細胞を、ウェルあたり５，０００～２０，０００個の範囲の様々な数で培養ウェルに加える。３日間のインキュベーション後、上清を回収し、酵素結合免疫吸着測定法（R&D Systems）によって炎症誘発性サイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ－α）のレベルを測定する。残りのＴ細胞の増殖は、CellTrace（商標）ＣＦＳＥ染色用の４８８ｎｍ励起及び５３０／３０ｎｍバンドパス発光フィルターを備えたフローサイトメーターを使用して分析される。ヒストグラムの個別のピークは、増殖している細胞の連続世代を表す。各分裂ピーク下でこれらの娘細胞を生成するために必要なＴ細胞前駆体の相対数は、娘細胞イベントの数を、２の所与の分裂ラウンドの累乗（２ｎ）で割ることによって計算される。各分割ピークから計算された前駆体の数の全ての合計を使用して、応答性Ｔ細胞前駆体の数を表す。
免疫応答は、精製されたレスポンダーＴ細胞の増殖並びにＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－αの分泌に基づいて評価される。レスポンダー細胞を同種異系ｈＰＢＭＣと共培養すると、その増殖が有意に増加することが予測される。対照的に、ｈＡＳＣ又はｈ脂肪細胞との共培養では、レスポンダー細胞の有意な増殖は予想されない。さらに、同種異系ｈＰＢＭＣとの共培養では、ＩＦＮ－γ及びＴＮＦ－α分泌の有意な増加が観察されるはずであるが、ｈＡＳＣ又はｈ脂肪細胞との共培養では有意な分泌は予想されない。
結論として、この例の結果は、免疫原性マーカーの低い発現レベル、及び同種異系Ｔ細胞と共培養した場合の免疫応答の欠如で実証されるように、とりわけ、ｈＡＳＣ及び培養物由来のｈ脂肪細胞が非免疫原性であることを示す。
実施例８Ｂ：培養物中のＡＳＣ及び分化した脂肪細胞の非免疫原性
この例は、とりわけ、培養物中のＡＳＣ、及びＡＳＣ細胞に由来する脂肪細胞が、細胞移植後に自然免疫応答を誘導しないことを実証する。
この例では、ｈＡＳＣは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大し、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるように脂肪細胞を生成する。総細胞数を決定した後、スイングバケット遠心分離機で、８０×ｇで５分間遠心分離することによって細胞をペレット化した。ペレット化後、上清を吸引除去し、ＡＳＣ及び脂肪細胞をそれぞれ４×１０６／１００μＬの濃度で予め冷却したＨＢＳＳに別々に再懸濁した。
これらの細胞型の両方の免疫原性特性は、免疫適性動物に移植し、移植前、移植後５時間及び移植後５日の血漿中のサイトカインレベルを評価することによって評価された。Ｃ５７ＢＬ／６ｊには、ｈＡＳＣ又はｈＡＳＣ由来の脂肪細胞（ｈ脂肪細胞）のいずれかを注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁したＡＳＣ及び脂肪細胞（４×１０６細胞／面）を、皮下投与のために２５Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の面に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみを注射した。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を２８日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。ＴＮＦアルファ、ＩＦＮγ、ＩＬ１Ｂ、ＩＬ６、ＩＬ１０及びＩＬ－２の発現によって示されるように、ｈＡＳＣ及びｈ脂肪細胞は、投与後５時間及び投与後５日の両方で、免疫適格マウス動物において免疫応答を誘導しなかった（図９Ａ～９Ｆ）。
ｈＡＳＣ、及びｈＡＳＣ由来のｈ脂肪細胞の免疫表現型検査では、フローサイトメトリーを使用して免疫原性及び細胞型特異的表面マーカーを評価した。トリプシンを使用して細胞を細胞培養容器から採取し、３％ＦＢＳ、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有するＨＢＳＳで洗浄した。０．１×１０６～１×１０６個の細胞を、ＭＨＣクラスＩ（ＨＬＡ－ＡＢＣ）、ＭＨＣクラスＩＩ（ＨＬＡ－ＤＲ）、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ４５、及びＣＤ９０（全てBiolegend製）に対する直接結合抗体と４℃で３０分間インキュベートする。次に細胞を洗浄し、Attune NXTフローサイトメーターで分析した。
マウスの血漿又は血清に対してサイトカイン評価が実施された。血漿について、マウス血液をＥＤＴＡでコーティングしたチューブに回収し、４℃で１０分間、３，０００ｘｇで遠心分離して処理した。血漿を分取し、ｐＨ約７．５のＰＢＳで２倍に希釈した後、－８０℃で凍結した。血漿中のサイトカインは、Eve Technologies Corporation（カナダ、アルバータ州カルガリー）のMouse Cytokine Array Proinflammatory Focused 10-plex（ＭＤＦ１０）で、二重測定で評価された。ＡＳＣ及び脂肪細胞はいずれも、ＣＤ９０、ＣＤ７３及びＭＨＣ－Ｉについては陽性であったが、ＭＨＣ－ＩＩ、ＣＤ４５及びＣＤ４０については陰性であった（図１０）。
結論として、この例の結果は、細胞上の免疫原性マーカーの発現レベルが低いこと、及び免疫適格動物における移植後に免疫応答が誘導されないことから実証されるように、とりわけ、ｈＡＳＣ及び培養物由来のｈ脂肪細胞が非免疫原性であることを示す。
実施例８Ｃ：免疫適格マウスにおける異種移植されたヒト脂肪細胞の長期生着（インビボ）
この例は、とりわけ、免疫適格動物において実質的な免疫応答を誘導することなく、移植されたヒト脂肪細胞を投与できることを実証する。ヒト脂肪細胞は、とりわけ、投与後９２日の埋入部位における脂肪生成移植片の検出によって実証されるように、免疫適格マウスにおいてインビボで生存する。
この例では、実施例８Ａに記載されるように、ヒトＡＳＣ及び脂肪細胞を投与されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスを経時的に追跡した。移植から９２日後に動物を安楽死させ、埋入部位を分析した。図１１Ａに示すように、脂肪移植片は、ＡＳＣ（３匹中２匹）及び脂肪細胞（３匹中２匹）を投与した動物では検出されたが、対照動物（２匹中０匹）では検出されなかった。
インビボでのヒト細胞の埋入は、背側腹部で移植後９２日目の可視的な移植片によってモニタリングした。全体として、この例は、ヒトＡＳＣ及びヒト脂肪細胞が実質的な免疫応答を誘導せず、レシピエントマウスにおいて９２日間を超えて持続することを実証する。
別のコホートでは、ＥＦ１ａプロモーター下でＥＰＯを発現するように遺伝子改変されたｈＡＳＣも、免疫適格動物における異種移植片の生存について分析した。この例では、ｈＡＳＣは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらを実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように継代し、６ウェル培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養させた。翌日、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）レポーター遺伝子を発現するレンチウイルスレポーターベクターを用いて、細胞を所定のＭＯＩでトランスフェクトした。続いて、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるようにｈＡＳＣを拡大した。操作されていないｈＡＳＣ（８×１０６細胞／面）及び操作されたｈＡＳＣ（１６×１０６細胞／面）を、前述のようにマウスに移植した。端的には、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスにＡＳＣを注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁したＡＳＣを、皮下投与のために２５Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の面に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみ。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を２８日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。
移植後１５１日目に動物を安楽死させ、脂肪血管移植片の存在について埋入部位を分析した。図１１Ｂに示すように、脂肪移植片は、ＡＳＣ（２匹中２匹）及びＡＳＣ－ｈＥＰＯ（５匹中３匹）を投与した動物では検出されたが、対照動物（３匹中０匹）では検出されなかった。
全体として、この例は、とりわけ、ヒトＡＳＣ及びヒト脂肪細胞が実質的な免疫応答を誘導せず、レシピエントマウスにおいて９２日間を超えて持続することを実証する。
実施例９：脂肪細胞への分化時にホタルルシフェラーゼを発現するＧＦＰ発現ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の操作
この例は、とりわけ、ＧＦＰを構成的に発現し、脂肪細胞への分化の際にホタルルシフェラーゼを発現するように、ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を遺伝子操作できることを実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、ヒト由来（ｈＡＳＣ及びｈＣＤ３４＋細胞）又はマウス由来（ｍＡＳＣ）のいずれかである。細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子（配列番号１）及びホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）レポーター遺伝子（配列番号２）を発現する２つのレンチウイルスレポーターベクターで遺伝子標識されている。ＧＦＰ発現は、構成的プロモーターＣＭＶ（ｐＣＭＶ）（配列番号３）によって駆動され、移植された細胞を識別するために使用される。Ｌｕｃ発現は、ｈＡＳＣ及びｈＣＤ３４＋細胞中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）（配列番号４）、又はｍＡＳＣ中のマウスアディポネクチンプロモーター（ｐｍＡｄｉｐｏＱ）（配列番号５）によって駆動される。Segawa et al., J. Endocrinol.200, 1, 107-116及びKoshiishi et al., Gene 424, 1-2, 146（これらはいずれも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。アディポネクチンプロモーターは、ホタルルシフェラーゼレポーターの脂肪細胞特異的発現を駆動し、これは、移植された細胞に由来する脂肪細胞をインサイチュで同定するために使用される。
ヒトアディポネクチンプロモーターは、最小の遠位エンハンサー領域（ヒトアディポネクチンの転写開始部位から－２６６７～－２５０７ｂｐ上流）及び近位プロモーター領域（ヒトアディポネクチンの転写開始部位から－５４０～＋７７ｂｐ）を含有する（Segawa et al, 2009）（図４）。遠位エンハンサーは高度に保存されており、２つの完全に保存されたＣＣＡＡＴボックスを含有する。転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（Ｃ／ＥＢＰα）は、このエンハンサーに結合し、アディポネクチン遺伝子の転写活性を調節する。近位プロモーター領域は、その遠位エンハンサーによる完全な転写活性化に必要であることがわかっている。
マウスアディポネクチンプロモーターは、完全な転写活性化に必要な遠位エンハンサー領域（マウスアディポネクチンの転写開始部位から－２２２８～－２０６６ｂｐ上流）も含有する（Koshiishi et al, 2008）。遠位エンハンサーは、転写因子Ｃ／ＥＢＰα、Ｃ／ＥＢＰβ、及びＣ／ＥＢＰδによって結合される２つの保存されたモチーフＣＡＣＡＡＴＧＣを含有する。
代替プロモーターを使用して、脂肪細胞特異的な導入遺伝子発現を駆動することもできる。一例は、ａＰ２／ＦＡＢＰ４プロモーター（配列番号１３）である。ａＰ２／ＦＡＢＰ４最小プロモーターは、ｋｂ－４．９とｋｂ－５．４（ａＰ２の転写開始部位から上流）の間にマッピングされる５１８ｂｐのエンハンサー断片と、近位プロモーター領域（マウスａＰ２の転写開始部位から－６３～＋２１ｂｐ）を含有する（図５）。Graves et al, J. Cell.Biochem.49, 219-244 (1992)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ＨＩＶ－１ベースのレンチウイルスは、第３世代パッケージングシステムを使用して構築及び産生される。Dull et al., J. Virol.72, 11, 8463-8471 (1998)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。このシステムは、目的のプラスミド、２つのヘルパープラスミド（パッケージ）、及びエンベロープ（ＶＳＶ－Ｇ糖タンパク質）をコードするプラスミドの４つのプラスミドで構成される。１つのレンチウイルス（ＬＶ－７１．１）では、目的のプラスミドがＣＭＶプロモーター（ｐＣＭＶ－ＧＦＰ）の制御下でＧＦＰタンパク質をコードし、選択マーカーとしてハイグロマイシンＢ耐性遺伝子（配列番号６）を発現する。別のレンチウイルスでは、目的のプラスミドは、ｈＡｄｉｐｏＱ（ＬＶ－７１．３のｐｈＡｄｉｐｏＱ－Ｌｕｃ）又はｍＡｄｉｐｏＱプロモーター（ＬＶ－７１．６のｐｍＡｄｉｐｏＱ－Ｌｕｃ）の制御下でホタルルシフェラーゼタンパク質をコードし、ピューロマイシン耐性遺伝子（配列番号７）を選択マーカーとして発現する。
レンチウイルスは、２９３Ｔ細胞及びｐＰＡＣＫＨ１パッケージングキット（System Biosciences、ＬＶ５００Ａ）を使用して生成される。簡潔には、トランスフェクションの１８～２４時間前に、２９３Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、GlutaMAX（商標）（Gibco、３５０５００６１）、及びペニシリン－ストレプトマイシンを補充した高グルコースの２０ｍＬ ＤＭＥＭ（Gibco、１１９６５０８４）中で、７～８×１０６細胞の密度で１５０ｃｍ２プレートに播種する。トランスフェクション混合物を調製するために、４５μＬのｐＰＡＣＫＨ１、５～８μｇの目的のプラスミド、及び５５μＬのPureFection（商標）トランスフェクション試薬（System Biosciences、ＬＶ７５０Ａ）を各１ｍＬの無血清ＤＭＥＭに加える。混合物を室温で１５分間インキュベートし、次いで、２９３Ｔ細胞培養プレートに滴下する。５％加湿ＣＯ２を有する３７℃の細胞培養インキュベーターにプレートを戻す。レンチウイルスを含有する培地は、トランスフェクションの４８時間後及び７２時間後に回収される。培地を室温で１５分間、３，０００×ｇで遠心分離し、細胞破片をペレット化する。ウイルス粒子を含有する上清を回収する。ウイルスを濃縮するために、上清の４体積部ごとに１体積部の冷ＰＥＤ－ｉｔウイルス沈降溶液（System Biosciences、ＬＶ８１０Ａ）を加える。次いで、混合物を４℃で少なくとも１２時間インキュベートし、４℃で３０分間、１，５００ｘｇで遠心分離する。上清を除去し、冷ＰＢＳを使用してレンチウイルス粒子を含有するペレットを元の体積の１／１０～１／１００に再懸濁する。ウイルス懸濁液を凍結し、使用するまで－８０℃で保存する。
ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞は、以下のようにレンチウイルスベクターで形質導入される。形質導入は、２４ウェルマイクロタイタープレートで実施する。細胞を５×１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングする。形質導入は、細胞が５０～７０％コンフルエントであるときに実施する。形質導入培地は、１：２００希釈のTransDux（商標）（System Biosciences、ＬＶ８６０Ａ）又は４μｇ／ｍＬ硫酸プロタミン（Fisher、ＩＣＮ１０２７５２０５）を補充した完全培地である。ＬＶ－７１．１とＬＶ－７１．３（ｈＡＳＣ及びヒトＣＤ３４＋細胞の場合）、又はＬＶ－７１．１とＬＶ－７１．６（ｍＡＳＣの場合）の混合物を形質導入培地と合わせ、異なるＭＯＩ（２０～１４０）で各ウェルに加える。形質導入の７２時間後、培地を吸引除去し、新鮮な培地を各ウェルに加える。落射蛍光顕微鏡を使用して、細胞のＧＦＰ発現を検査する。安定した細胞株を樹立するために、ハイグロマイシンＢ（５０～２００μｇ／ｍＬ）（Fisher、４０００５２２０ＭＬ）及びピューロマイシン（１～５μｇ／ｍＬ）（Fisher、５０－１６５－７０５０）を含有する培地で細胞を選択する。新鮮な抗生物質を含む培地は、耐性コロニーが特定されるまで（典型的には選択の１０～１４日後）３～４日ごとに交換される。
遺伝子改変細胞におけるレポータータンパク質の発現は次のように特徴付けられる。ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞は、それぞれ実施例３及び４に記載されるように、脂肪細胞に分化する。ＧＦＰ発現は、フローサイトメトリー分析又は蛍光顕微鏡で評価される。ＧＦＰは、ＡＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、及び脂肪細胞で高度に発現されることが予想される。ホタルルシフェラーゼ活性は、標準ルシフェラーゼアッセイ（Promega、Ｅ１５００）を使用して定量される。簡潔には、細胞は、Cell Culture Lysis Reagent（Promega、Ｅ１５３１）で溶解される。次いで、細胞溶解物を、甲虫ルシフェリンを含有するルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega、Ｅ１４８３）と混合し、反応からの発光を、ルミノメーターを使用して測定する。脂肪細胞は、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、より高いルシフェラーゼ活性を示すと予想される。
全体として、この例は、とりわけ、構成的にＧＦＰを発現し、ＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼの両方を発現する脂肪細胞を産生するように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞を操作できることを実証する。
実施例１０：移植されたＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布
この例は、とりわけ、移植されたＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布を制御及び測定する能力を実証する。
この例では、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞を実施例９に記載されるように遺伝子改変し、それぞれ実施例５及び６に記載されるようにマウスに移植する。移植された細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布は、ルシフェラーゼ活性の全身イメージングを使用して、毎週、回復後６ヶ月まで評価される。具体的には、ルシフェラーゼ活性は、IVIS Imaging System 50（Caliper Life Sciences、米国マサチューセッツ州ホプキントン）で、移植を受けていないマウス及びＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を移植されたマウスで測定される。動物にペントバルビタール（６５ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で軽く麻酔し、Ｄ－ルシフェリン（１２０ｍｇ／ｋｇ、１００μＬ 後眼窩）を注射する。測定はルシフェリン注射の３分後に開始し、発光が５分間にわたって積分される。
さらに、回復後２、４、及び６ヶ月目、マウスを全身イメージングの直後に安楽死させる。マウス脂肪デポ（生殖腺、腎周囲、後腹膜、腸間膜、及び鼠径部）及び非脂肪デポ（下肢骨格筋、肝臓、及び肺）を採取する。追加の採取部位は、それぞれＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を移植したマウスの移植組織又は骨髄である。採取した組織は、単離された組織の発光を分析するために、すぐにイメージャに戻す。次いで、組織を約４ｍｍ３の小片に刻み、１％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定する。固定組織をＰＢＳで各３×１０分間再水和し、ＤＡＰＩ（ThermoFisher、Ｄ１３０６）（１μｇ／ｍＬ、核を可視化するため）、及び抗ＧＦＰ抗体（移植された細胞の位置を特定するため）（Biolegend）で染色する。次いで、染色された組織を洗浄し、EVOS M5000イメージングシステム（Thermo Fisher）で２０Ｘ対物レンズを使用してイメージングする。
ＡＳＣを移植されたマウスでは、生着後２～４週間の時点で、両方の全身イメージングによって移植部位で発光が検出され、分化した脂肪細胞の出現が示されることが予想される。ＡＳＣの移動により、移植部位の外側でも微量の発光が観察され得る。分化した脂肪細胞の数が増加するにつれて、発光は経時的に増加する。採取した組織からのルシフェラーゼ活性は、インビボイメージングの結果と一致すると予想される。具体的には、移植組織ではルシフェラーゼ活性が高レベルとなり、移植組織の外側のマウス脂肪デポでは少量の発光が予想される。移植されたＧＦＰ＋細胞の少なくとも５０％が研究期間全体を通じて移植部位に存在すると予想され、これは、移植されたＡＳＣが長期持続する生着を達成することを実証する。ＧＦＰ＋細胞は、ＡＳＣ遊走のさらなる証拠として、移植部位の外側の組織でも検出され得る。
ＣＤ３４＋細胞を移植したマウスでは、有意な全身発光が移植後４～８週間で現れ、経時的に増加すると予想され、これは、移植由来の脂肪細胞が体全体に分布していることを実証する。採取した組織では、ルシフェラーゼ活性は全ての脂肪組織で高レベルであるが、非脂肪組織ではベースラインを有意に超えないことが予想される。移植されたＣＤ３４＋細胞の存在は、研究期間全体を通じて、骨髄、脂肪組織、及び非脂肪組織を含む大半の採取組織で異なる数のＧＦＰ＋細胞として検出される。
この例の結果は、とりわけ、移植されたＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布を制御及び測定できることを実証すると予想される。具体的には、局所ＡＳＣ注入による脂肪細胞の局所的な分布が予想される。さらに、ＣＤ３４＋細胞の全身注射により、体全体に広範な脂肪細胞の分布が予想される。
実施例１１Ａ：移植された脂肪細胞の生体内分布
この例は、とりわけ、移植された脂肪細胞の分布を制御及び測定する能力を実証する。
この例では、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞は、実施例９に記載されるように遺伝子改変され、それぞれ実施例３及び４に記載されるようにインビトロで脂肪細胞に分化する。遺伝子標識された脂肪細胞を、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるようにマウスに移植する。移植された細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布は、ルシフェラーゼ活性の全身イメージングを使用して、毎週、回復後６ヶ月まで評価される。具体的には、ルシフェラーゼ活性は、実施例１０に記載されるように、IVIS Imaging System 50（Caliper Life Sciences、米国マサチューセッツ州ホプキントン）で、移植を受けていないマウス及び脂肪細胞を移植されたマウスで測定される。さらに、回復後２、４、及び６ヶ月目、マウスを全身イメージングの直後に安楽死させる。移植組織、レシピエントマウス脂肪デポ（生殖腺、腎周囲、後腹膜、腸間膜、及び鼠径部）及び非脂肪デポ（下肢骨格筋、肝臓、及び肺）を採取する。採取した組織は、実施例１０に記載されるように、発光及びＧＦＰ＋細胞について分析する。
全身イメージングにおける発光は、注射後１週間の時点で主に移植部位で検出され、６ヶ月まで持続すると予想される。移植部位で採取された組織も高レベルのルシフェラーゼ活性を示す。対照的に、移植部位の外側で採取された組織では有意な発光はない。移植部位のＧＦＰ＋細胞の５０％超が研究期間を通じて持続すると予想される。
全体として、この例の結果は、とりわけ、長期持続する脂肪細胞を局所的に生着させることが可能であることを実証する。
実施例１１Ｂ：移植された脂肪細胞の生体内分布
この例は、とりわけ、移植された脂肪細胞の分布を追跡できることを実証し、移植後の脂肪細胞の寿命を実証する。
この例では、ＡＳＣ、及びＡＳＣ由来のｈ脂肪細胞は、実施例９に記載されるように遺伝子改変され、それぞれ実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるようにインビトロで脂肪細胞に分化した。遺伝子標識された脂肪細胞を、２００万個及び８００万個の２回の用量でマウスの皮下に移植した。
ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory、００１３０３）にＡＳＣ由来の脂肪細胞を注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁した脂肪細胞（２又は８×１０６細胞／面）を、皮下投与のために２５Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の面に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみを注射した。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を２８日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。
移植された細胞に由来する脂肪細胞の生体内分布は、投与後３日目から９８日目までのルシフェラーゼ活性の全身イメージングを使用して評価した。具体的には、ホタルルシフェラーゼ活性は、IVIS Lumina LT Series 3（Caliper Life Sciences、米国マサチューセッツ州ホプキントン）で、移植を受けていないマウス及び脂肪細胞を移植されたマウスで測定された。ルシフェラーゼは、移植後３日目～９８日目に分析され、全ての時点で検出された（図１２Ａ）。さらに、埋入物は、９８日間、注射部位の周囲に局在したままであった（図１２Ｂ）。
全体として、この例の結果は、とりわけ、長期持続する脂肪細胞を局所的に生着させることが可能であったことを実証する。
実施例１２：改変されていない脂肪生成細胞の移植によるツェルウェガーマウスモデルにおける治療効果
この例は、とりわけ、未修飾の脂肪生成細胞を移植すると、Ｐｅｘ５－／－ツェルウェガーマウスモデルの病原性表現型が軽減されることを実証する。
この例では、Ｐｅｘ５－ｌｏｘＰマウス（The Jackson Laboratory、０３１６６５）をＮｅｓｔｉｎ－Ｃｒｅマウス（The Jackson Laboratory、００３７７１）と交配させることによって、Ｃ５７ＢＬ６／Ｊ遺伝的背景のＰｅｘ５－／－マウスが生成される。野生型Ｃ５７ＢＬ６／ＪマウスからのｍＡＳＣを、実施例１に記載されるように単離及び拡大する。マウス脂肪細胞は、実施例３に記載されるように、培養物中のｍＡＳＣに由来する。ｍＡＳＣ又はマウス脂肪細胞を５～１０×１０６細胞／ｍＬでＰＢＳ溶液に懸濁し、２６Ｇゲージシリンジを使用して１０μＬの細胞懸濁液を新生Ｐｅｘ５－／－又は野生型仔マウスの背側腹部の各面に注入する。対照コホートでは、Ｐｅｘ５－／－又は野生型の仔マウスに１０μＬのＰＢＳを同様に注射する。総体重は、生後２週間まで毎日モニタリングされる。２、３、７、及び１４日目に、肝臓、腎臓、脳、脂肪組織を採取し、重量を測定する。
野生型ｍＡＳＣ又は野生型マウス脂肪細胞を移植されたＰｅｘ５－／－仔マウスの少なくとも２０％は、生後３日を超えて、２週間まで生存するが、対照Ｐｅｘ５－／－仔マウスは全て、生後３日よりも前の様々な時点で死亡すると予想される。さらに、移植後、Ｐｅｘ５－／－仔マウスは、年齢が一致する対照Ｐｅｘ５－／－仔マウスと比較して、総体重が増加し始める。移植されたＰｅｘ５－／－仔マウスの採取された組織も、年齢が一致する対照Ｐｅｘ５－／－仔マウスの組織と比較して有意に重くなる。最後に、Ｐｅｘ５－／－仔マウスで典型的に観察される重度の生理的苦痛行動（例えば、脚で体重を支えることができない、息切れ、代償性腹式呼吸、及び無呼吸期間）は、年齢が一致して移植されたＰｅｘ５－／－仔マウスではそれほど顕著でないと予想される。
全体として、この例は、未修飾の野生型脂肪生成細胞（ＡＳＣ及び派生脂肪細胞）が、新生仔マウスへの移植時にツェルウェガー病マウスモデルの生存を促進し、症状を軽減できることを示す。
実施例１３：高脂肪生成ＡＳＣの同定及び単離
この例は、とりわけ、高脂肪生成であるＡＳＣのサブタイプを同定し、単離できることを実証する。
この例では、Min et al., PNAS 116, 36, 17970-17979 (2019)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのＲＮＡ配列データを使用して、脂肪生成分化に対する最も強いレスポンダーであるＡＳＣサブタイプが同定された。具体的には、脂肪生成分化を起こした５２個のクローンＡＳＣ集団に対するｋ平均法クラスタリングを使用して、１０個の脂肪細胞特異的遺伝子（ＣＩＤＥＣ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、ＬＧＡＬＳ１２、ＡＤＩＰＯＱ、ＴＵＳＣ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＰＰＡＲＧ、ＬＥＰ、ＣＥＢＰＡ）にわたって高い発現レベルを示す１３個のクラスターの集団が同定された。Ahn et al., Sci.Rep. 9, 1, 3087 (2019)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。これらの集団を生じさせる１３個のＡＳＣクローンは、脂肪生成分化の最も強力なレスポンダーである。これらのＡＳＣを実験的に単離するために、これらのＡＳＣクローンと残りのＡＳＣクローンとの間で異なって発現される細胞表面タンパク質のセットが同定された。最も強いレスポンダーについて最も上方制御される４つの遺伝子は、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３であり、最も下方制御される４つの遺伝子は、ＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９１である。
ｈＡＳＣは、実施例１に記載されるように単離及び拡大する。単細胞懸濁液をＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ペニシリン－ストレプトアビジンを有するＰＢＳ）で０．７５又は１×１０７細胞／ｍｌに希釈し、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、ＣＤ２５３、ＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９１に対する直接結合抗体で染色する。細胞を光から保護して氷上で抗体のカクテルとともに２０分間インキュベートし、その後細胞を洗浄し、生存率を評価するためにＤＡＰＩ（Sigma＃Ｄ９５４２）又はヨウ化プロピジウム（Molecular Probes＃Ｐ３５６６）で染色し、Becton Dickinson FACSAria IIソーターを使用して、ＦＡＣＳに供する。補償測定は、コンペンセーションビーズ（eBiosciences＃０１－２２２２－４２）を使用して単一染色について実施する。細胞を選別する際には、次のゲーティング戦略が適用される：まず、サイズ及び粒度又は複雑さ（側方散乱及び前方散乱）に基づいて細胞が選択され、次いで複数の細胞を表し得るイベントが全て排除される。次いで、ＣＤ２６６－ＣＤ１５１－ＣＤ４９－ＣＤ９１－集団が選択され、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３マーカーのうちの１つ又はそれらの組み合わせについて陽性である集団を選択するために使用される。
選択された各集団は、インビトロでの脂肪生成について試験する。予め選択されたＡＳＣ集団が対照として使用される。細胞は、実施例３に記載されるように、インビトロ脂肪生成分化手順に供される。脂肪生成分化は、実施例３に記載されるように、オイルレッドＯ染色、LipidTox染色、及び脂肪生成マーカーのｑＰＣＲによって、脂肪生成誘導培地中で３、７、及び１４日後に測定される。オイルレッドＯ及びLipidTox染色によって測定されるように、選択されたＡＳＣ集団のうちの１つ以上は、１つ以上の時点で対照よりも有意に多くの脂肪細胞を生成すると予想される。さらに、これらの集団の１つ以上は、脂肪生成誘導培地中、早くも３日で８０％超に到達する。最後に、選択された集団のうちの１つ以上が、分化の際に対照と比較して有意に高いレベルで１つ以上の脂肪生成マーカーを発現すると予想される。
選択されたＡＳＣ集団は、インビボで脂肪細胞を生成する能力についても試験される。予め選択されたＡＳＣ集団も対照として使用される。ＡＳＣ集団をマウスに移植し、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように、誘導された脂肪細胞の存在をヒトアディポネクチンの血清レベルとして測定する。選択されたＡＳＣ集団のうちの１つ以上は、移植後１４日の時点で、対照ＡＳＣ集団と比較して有意に高いヒトアディポネクチンの血清レベルをもたらすことが予想される。
全体として、この例は、とりわけ、高脂肪生成であり、インビトロ及びインビボで脂肪細胞を効率的に産生するために使用できる、ＡＳＣサブタイプを同定できることを実証する。
実施例１４Ａ：アディポネクチンを高度に分泌する脂肪細胞に対するＡＳＣのインビトロでの単離、特徴付け、及び／又は調節
この例は、とりわけ、高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を産生するＡＳＣのサブタイプを同定及び単離できることを実証する。
この例では、本発明者らは、Min et al., PNAS 116, 36, 17970-17979 (2019)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのＲＮＡ配列データを使用して、アディポネクチンを最も多く産生するＡＳＣサブタイプを同定した。具体的には、本発明者らは、実施例１３で同定された最も強力な脂肪生成レスポンダーの中で、平均よりも２．５～１０倍多くのアディポネクチンを発現する脂肪細胞を生じる８つのＡＳＣクローンのクラスターを同定した。これらのＡＳＣを実験的に単離するために、本発明者らは、これらのＡＳＣクローンと残りのＡＳＣクローンとの間で異なって発現される細胞膜タンパク質を同定した。最も上方制御される４つの遺伝子は、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１であり、最も下方制御される４つの遺伝子は、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５である。
ｈＡＳＣは、実施例１に記載されるように単離及び拡大する。実施例１３に記載されるＦＡＣＳを使用して、マーカーＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５について陰性であり、マーカーＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ又は組み合わせについて陽性である細胞集団が選択される。
選択されたＡＳＣ集団は、実施例３に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。誘導された脂肪細胞は、インビトロでのアディポネクチン分泌について試験する。予め選択されたＡＳＣ集団に由来する脂肪細胞を対照として使用する。分化した脂肪細胞の数は、実施例３に記載されるように、オイルレッドＯ又はLipidTOX染色を使用して測定される。脂肪細胞あたりのアディポネクチン分泌レベルは、細胞培養物上清を回収し、ヒトアディポネクチン用のＥＬＩＳＡキット（Zen-Bio, Inc.、ＡＤＩＰ－１）を使用して分析することによって計算され、各サンプルの分化した脂肪細胞の数によって正規化される。選択されたＡＳＣ集団の１つ以上は、対照と比較して有意に高いレベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を産生することが予想される。
選択されたＡＳＣ集団に由来する脂肪細胞は、そのインビボでのアディポネクチン分泌能力を試験するためにマウスに移植される。対照ＡＳＣ集団に由来する同数の脂肪細胞も移植される。移植手順は、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されている。ヒトアディポネクチンの血清レベルも、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるように、異なる時点で測定される。対照と比較して、選択されたＡＳＣ集団に由来する脂肪細胞によって、有意に高いレベルのヒトアディポネクチンが産生されることが予想される。
要約すると、この例は、とりわけ、高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を誘導するために使用できるＡＳＣサブタイプを同定及び単離できることを示す。
実施例１４Ｂ：アディポネクチンを高度に分泌する脂肪細胞に対するＡＳＣのインビトロでの単離、特徴付け、及び／又は調節
この例は、とりわけ、高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞に分化できるＡＳＣのサブタイプを同定及び単離できることを実証する。
ｈＡＳＣの免疫表現型が解析され、不均一な発現を示す細胞表面タンパク質が同定された。ｈＡＳＣを単離し、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大した。実施例８Ａに記載されるようにＦＡＣＳを使用して、ＣＤ１０マーカーについて陽性及び陰性の細胞集団を別のウェルに分けた。未染色の対照細胞を別のウェルに分けた。
選択されたＡＳＣ集団は、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化した。誘導された脂肪細胞は、ＥＬＩＳＡキットを使用して、インビトロでのアディポネクチン分泌について試験した。ＣＤ１０＋で選択されたＡＳＣ集団は、対照及びＣＤ１０－と比較して、有意に高いレベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を産生した（図１３Ａ～１３Ｃ）。
要約すると、この例は、とりわけ、高レベルのアディポネクチンを分泌する脂肪細胞を誘導するためにＣＤ１０＋ＡＳＣサブタイプを使用でき、同定及び単離できることを示す。
実施例１５：ＰＥＸ５を高度に発現する脂肪細胞に対するＡＳＣのインビトロでの単離、特徴付け、及び／又は調節
この例は、とりわけ、高レベルの細胞内ＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を産生するＡＳＣのサブタイプを同定及び単離できることを実証する。
この例では、Min et al., PNAS 116, 36, 17970-17979 (2019)（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）からのＲＮＡ配列データを使用して、ＰＥＸ５を最も多く産生するＡＳＣサブタイプが同定された。具体的には、実施例１３で同定された最も強い脂肪生成レスポンダーの中で、集団の７５％よりも高いレベルでＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を生じさせる３つのＡＳＣクローンのクラスターが同定された。これらのＡＳＣを実験的に単離するために、本発明者らは、これらのＡＳＣクローンと残りのＡＳＣクローンとの間で異なって発現される細胞膜タンパク質を同定した。最も上方制御される３つの遺伝子は、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０、及びＣＤｗ２９３であり、最も下方制御される４つの遺伝子は、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２である。
ｈＡＳＣは、実施例１に記載されるように単離及び拡大する。実施例１３に記載されるＦＡＣＳを使用して、マーカーＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２について陰性であり、マーカーＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０及びＣＤｗ２９３のうちの１つ又は組み合わせについて陽性である細胞集団が選択される。
選択されたＡＳＣ集団は、実施例３に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。誘導された脂肪細胞は、ｑＰＣＲによってＰＥＸ５遺伝子発現について試験する。予め選択されたＡＳＣ集団に由来する脂肪細胞を対照として使用する。ｑＰＣＲは、実施例３に記載されるように実施する。ヒトＰＥＸ５のｑＰＣＲプライマーは、２９及び３０である。ＧＡＰＤＨ（プライマー２１及び２２）及びアクチン（プライマー２５及び２６）を対照として使用する。選択されたＡＳＣ集団の１つ以上に由来する脂肪細胞は、対照と比較して有意に高いＰＥＸ５遺伝子発現レベルを示すことが予想される。
ＰＥＸ５タンパク質の発現は、ウェスタンブロット分析を使用して測定される。１２ウェルプレート内の分化した脂肪細胞からの総タンパク質は、各ウェルに２００μＬのＲＩＰＡバッファーを加えることによって採取される。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで分析する。ドライ転写法を使用してニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＰＥＸ５抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼとともにインキュベートする。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体が使用される。ブロットは増強化学発光（ＥＣＬ）キットを使用して視覚化される。ウェスタンブロットのバンド強度はImageJによって測定される。選択されたＡＳＣ集団の１つ以上に由来する脂肪細胞は、対照と比較して有意に高いレベルのＰＥＸ５タンパク質を示すことが予想される。
ＰＥＸ５タンパク質の発現は、免疫組織化学法を使用して測定することもできる。分化した脂肪細胞は、ＤＡＰＩ及び蛍光結合抗ＰＥＸ５抗体で染色し、落射蛍光顕微鏡を使用してイメージングする。画像はImageJを使用して解析される。ＰＥＸ５発現のレベルは、細胞あたりの平均総蛍光強度として計算される。選択されたＡＳＣ集団の１つ以上に由来する脂肪細胞は、平均して、対照と比較して有意に高いレベルでＰＥＸ５を発現することが予想される。
要約すると、この例は、とりわけ、大量のＰＥＸ５を発現する脂肪細胞を産生するＡＳＣサブタイプが同定及び単離され得ることを示す。
実施例１６：脂肪細胞への分化時にガウシアルシフェラーゼを分泌するためのＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の操作
この例は、とりわけ、脂肪細胞への分化の際に、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を分泌するようにＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を遺伝子操作できることを実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子（配列番号１）及びＧＬｕｃレポーター遺伝子（配列番号８）を発現する２つのレンチウイルスレポーターベクターで遺伝子標識されている。ＧＦＰ発現は、構成的プロモーターＣＭＶ（ｐＣＭＶ）（配列番号３）によって駆動される。ＧＬｕｃ発現は、ｈＡＳＣ及びｈＣＤ３４＋細胞中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）（配列番号４）、又はｍＡＳＣ中のマウスアディポネクチンプロモーター（ｐｍＡｄｉｐｏＱ）（配列番号５）によって駆動される。アディポネクチンプロモーターは、ＧＬｕｃレポーターの脂肪細胞特異的発現を駆動する。レンチウイルスベクターを使用して、実施例９に記載の方法に従ってＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞を遺伝子改変する。次いで、細胞は、実施例３及び４に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。
遺伝子改変細胞におけるレポータータンパク質の発現は次のように特徴付けられる。ＧＦＰ発現は、フローサイトメトリー分析又は蛍光顕微鏡で評価される。形質導入効率は、総細胞中のＧＦＰ発現ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の割合として計算される。形質導入されたＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞もＧＦＰを発現すると予想される。ＧＬｕｃ分泌は、Pierce（商標）Gaussia Luciferase Glow Assay kit（Thermo Fisher、１６１６１）を製造元の指示に従って使用して定量する。簡潔には、細胞培養物上清を回収し、セレンテラジンを含有する緩衝液と混合した。ＧＬｕｃによって生成される生物発光は、セレンテラジンの酸化によって生じ、そのシグナルはルミノメーターを使用して測定される。脂肪細胞は、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、より高いレベルのＧＬｕｃを分泌すると予想される。
全体として、この例は、とりわけ、ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を操作することによって、レポータータンパク質（ＧＬｕｃ）を分泌する脂肪細胞を生成し、特徴付けられることを実証する。
実施例１７Ａ：脂肪細胞への分化時にエリスロポエチンを分泌するためのＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の操作
この例は、とりわけ、脂肪細胞への分化の際にエリスロポエチン（ＥＰＯ）を分泌するために、ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を遺伝子操作できることを実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、ヒトＥＰＯ（配列番号９）又はマウスＥＰＯ（配列番号１０）を発現するレンチウイルスベクターで遺伝子改変される。ヒトＥＰＯ発現は、ｈＡＳＣ及びｈＣＤ３４＋細胞中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）（配列番号４）によって駆動され、マウスＥＰＯ発現は、ｍＡＳＣ中のマウスアディポネクチンプロモーター（ｐｍＡｄｉｐｏＱ）（配列番号５）によって駆動される。アディポネクチンプロモーターは、ＥＰＯの脂肪細胞特異的発現を駆動する。レンチウイルスベクターを使用して、実施例９に記載の方法に従ってＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞を遺伝子改変する。次いで、細胞は、実施例３及び４に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。
ＥＰＯ遺伝子発現は、実施例３に記載の手順に従って、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して定量する。ヒトＥＰＯのプライマー対は、３１及び３２、マウスＥＰＯのプライマー対は、３３及び３４である。ＧＡＰＤＨ（ヒト：プライマー２１及び２２；マウス：プライマー２３及び２４）及びアクチン（ヒト：プライマー２５及び２６；マウス：プライマー２７及び２８）を対照として使用する。ＥＰＯ遺伝子発現のレベルは、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、脂肪細胞でより高いことが予想される。
ＥＰＯ分泌は、ヒトＥＰＯ（Abcam、ａｂ１１９５２２）又はマウスＥＰＯ（Abcam、ａｂ１１９５９３）に対する標準的な酵素結合免疫吸着測定法を使用して測定する。具体的には、ＥＰＯ特異的抗体が９６ウェルプレート上にプレコートされている。細胞培養上清を回収し、ビオチン化ＥＰＯ検出抗体とともにウェルに加える。次いで、マイクロプレートを室温で１時間インキュベートする。洗浄緩衝液で洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ結合体を各ウェルに加える。マイクロプレートを室温で１５分間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液を使用して未結合の結合体を洗い流す。次いで、ＴＭＢを加え、マイクロプレートを室温で１０分間インキュベートする。停止溶液を加えると反応が停止し、これにより溶液が青色から黄色に変化する。黄色着色の濃度は、プレートに捕捉されたＥＰＯの量に正比例し、主波長として４５０ｎｍを使用して分光光度計で吸光度として測定される。遺伝子改変脂肪細胞は、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、より高いレベルのＥＰＯを分泌すると予想される。
全体として、この例は、とりわけ、ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を操作することによって、哺乳動物の血清タンパク質、ＥＰＯを分泌する脂肪細胞を生成し、特徴付けられることを実証することが予想される。
実施例１７Ｂ：脂肪細胞への分化時にエリスロポエチンを分泌するためのＡＳＣ細胞の操作（インビトロ）
この例は、とりわけ、ＡＳＣ内で、及び脂肪細胞への分化の際に、エリスロポエチン（ＥＰＯ）を分泌するために、ＡＳＣ細胞を遺伝子操作できることを実証する。
この例では、ｈＡＳＣは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらを実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように継代し、６ウェル培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養させた。翌日、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）レポーター遺伝子を発現するレンチウイルスレポーターベクター（ＬＶ７）を用いて、細胞を所定のＭＯＩでトランスフェクトした。ｈＥＰＯ発現は、ｈＡＳＣ中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）によって駆動された。実施例１６に記載のようにｈＡＳＣをトランスフェクトし、続いて、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大し、次いで、分化のために播種し、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに詳述するように分化させた。次いで、６日目に培地を回収し、ｈＥＰＯ ＥＬＩＳＡキットを使用してｈＥＰＯの存在について分析した。ＥＰＯ分泌は、ヒトＥＰＯに対する標準的な酵素結合免疫吸着測定法（Biolegend、４４２９０７）を使用して測定した。具体的には、ＥＰＯ特異的抗体が９６ウェルプレート上にプレコートされている。細胞培養物上清を回収し、アッセイ緩衝液で所定の値に希釈し、次いで、ウェルに加えた。次いで、プレートをオービタルシェーカー上で、室温で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液で洗浄した後、ビオチン化ＥＰＯ検出抗体を各ウェルに添加した。次いで、マイクロプレートをオービタルシェーカー上で、室温で２時間インキュベートした。洗浄緩衝液で洗浄した後、ストレプトアビジン－ＨＲＰ結合体を各ウェルに加えた。マイクロプレートをオービタルシェーカー上、室温で３０分間インキュベートし、次いで、洗浄緩衝液を使用して未結合の結合体を洗い流した。次いで、基質溶液Ｆを加え、マイクロプレートを室温で１５分間インキュベートした。停止溶液を加えると反応が停止し、これにより溶液が青色から黄色に変化した。黄色着色の濃度は、プレートに捕捉されたＥＰＯの量に正比例し、主波長として４５０ｎｍ、バックグラウンド波長として５６０ｎｍを使用して分光光度計で吸光度として測定した。
図１４Ａ及び１４Ｂに示すように、ｈＥＰＯは、ｈＥＰＯ操作細胞が成長している培地では約２５０ｍｉＵ／ｍｌで検出されたが、操作されていない対照細胞からの培地では約０．４ｍＩＵ／ｍｌの非常に低いバックグラウンドレベルで検出された。
全体として、この例は、とりわけ、ＡＳＣ細胞を操作し、次いでそれらを分化させることによって、特に脂肪細胞特異的プロモーターＡｄｉｐｏＱ下で哺乳動物の血清タンパク質、ＥＰＯを分泌する脂肪細胞を生成し、特徴付けられることを実証した。
実施例１７Ｃ：脂肪細胞への分化時にガウシアルシフェラーゼを分泌するためのＡＳＣ細胞の操作（インビトロ）
この例は、とりわけ、ＡＳＣにおいて、及び脂肪細胞への分化の際に、ガウシアルシフェラーゼを分泌するようにＡＳＣ細胞を遺伝子操作できること実証する。
この例では、ｈＡＳＣは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大し、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに記載されるように脂肪細胞を生成した。実施例１６に記載されるように、細胞を、アディポネクチンプロモーター下でＧＬｕｃレポーター遺伝子（ＬＶ１）を発現するレンチウイルスレポーターで遺伝子標識した。
この例では、ｈＡＳＣは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらを実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように継代し、６ウェル培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養させた。翌日、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するガウシアルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するレンチウイルスレポーターベクターを用いて、細胞を所定のＭＯＩでトランスフェクトした。ｇＬｕｃ発現は、ｈＡＳＣ中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）によって駆動された。次いで、分化のために細胞を播種し、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに詳述するように分化させた。３日目～７日目の分化培地を回収し、Pierce（商標）Gaussia Luciferase Glow Assay kit（Thermo Fisher、１６１６１）を製造元の指示に従って使用してガウシアルシフェラーゼについて分析した。簡潔には、培地を回収し、セレンテラジンを含有する緩衝液と混合した。ＧＬｕｃによって生成される生物発光は、セレンテラジンの酸化によって生じ、そのシグナルはルミノメーターを使用して測定した。図１５Ａ及び１５Ｂに示すように、ＡＳＣは、脂肪細胞にさらに分化するにつれて、より多くのＧＬｕｃを分泌した。
全体として、この例は、とりわけ、ＡＳＣ細胞を操作することによって、ガウシアルシフェラーゼを分泌する脂肪細胞を生成し、特徴付けられることを実証する。
実施例１８：脂肪細胞への分化時にフェニルアラニンヒドロキシラーゼを細胞内で発現するためのＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞の操作
この例は、とりわけ、脂肪細胞への分化時に細胞内酵素フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）を発現するようにＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を遺伝子操作できることを実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、ヒトＰＡＨ（配列番号１１）又はマウスＰＡＨ（配列番号１２）を発現するレンチウイルスベクターで遺伝子標識される。ヒトＰＡＨ発現は、ｈＡＳＣ及びｈＣＤ３４＋細胞中のヒトアディポネクチンプロモーター（ｐｈＡｄｉｐｏＱ）（配列番号４）によって駆動され、マウスＰＡＨ発現は、ｍＡＳＣ中のマウスアディポネクチンプロモーター（ｐｍＡｄｉｐｏＱ）（配列番号５）によって駆動される。アディポネクチンプロモーターは、ＰＡＨの脂肪細胞特異的発現を駆動する。レンチウイルスベクターを使用して、実施例９に記載の方法に従ってＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞を遺伝子改変する。次いで、細胞は、実施例３及び４に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。
遺伝子改変細胞におけるＰＡＨ遺伝子発現は、実施例３に記載の手順に従って、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）を使用して定量する。ヒトＰＡＨのプライマー対は、３５及び３６、マウスＰＡＨのプライマー対は、３７及び３８である。ＧＡＰＤＨ（ヒト：プライマー２１及び２２；マウス：プライマー２３及び２４）及びアクチン（ヒト：プライマー２５及び２６；マウス：プライマー２７及び２８）を対照として使用する。ＰＡＨ遺伝子発現のレベルは、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、脂肪細胞でより高いことが予想される。
操作された細胞内のＰＡＨタンパク質レベルは、ウェスタンブロット分析を使用して測定される。１２ウェルプレート内の分化した脂肪細胞からの総タンパク質は、各ウェルに２００μＬのＲＩＰＡバッファーを加えることによって採取される。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０～２０％勾配ポリアクリルアミド／ＳＤＳゲルで分析する。ドライ転写法を使用してニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＰＡＨ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼとともにインキュベートする。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体が使用される。ブロットは増強化学発光（ＥＣＬ）キットを使用して視覚化される。ウェスタンブロットのバンド強度はImageJによって測定される。操作された脂肪細胞は、操作されたＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、有意に高いレベルのＰＡＨタンパク質を発現すると予想される。
ＰＡＨタンパク質の発現は、免疫組織化学法を使用して測定することもできる。分化した脂肪細胞は、ＤＡＰＩ及び蛍光結合抗ＰＡＨ抗体で染色し、落射蛍光顕微鏡を使用してイメージングする。画像はImageJを使用して解析される。ＰＡＨ発現のレベルは、細胞あたりの平均総蛍光強度として計算される。操作された脂肪細胞は、操作されたＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞と比較して、より高いレベルのＰＡＨ蛍光を示すことが予想される。
全体として、この例は、とりわけ、ＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞を操作することによって、哺乳動物の細胞内タンパク質、ＰＡＨを発現する脂肪細胞を生成し、特徴付けられることを実証することが予想される。
実施例１９：移植された遺伝子改変脂肪生成細胞由来の脂肪細胞によるガウシアルシフェラーゼのインビボ分泌
この例は、とりわけ、操作された脂肪生成細胞を移植することによって、ガウシアルシフェラーゼの持続的なインビボ分泌を達成する能力を実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、実施例１６に記載されるように、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーター遺伝子（配列番号１）を構成的に発現し、アディポネクチンプロモーター下でＧＬｕｃレポーター遺伝子（配列番号８）を発現する２つのレンチウイルスレポーターベクターで遺伝子標識される。次いで、細胞は、実施例３及び４に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。
遺伝子改変されたＡＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、及び分化した脂肪細胞を、それぞれ実施例５、６、及び７に記載されるようにマウスに移植する。ＧＬｕｃの分泌は、ＧＬｕｃの血清レベルを介してモニタリングされる。このレベルは、Pierce（商標）Gaussia Luciferase Glow Assay kit（Thermo Fisher、１６１６１）を製造元の指示に従って使用して定量する。移植されたマウスでは、回復後６ヶ月まで、７日ごとに血液を採取する。血液５μＬを１μＬの２０ｍＭ ＥＤＴＡに加え、１００μＬの１００μＭセレンテラジンを含有する緩衝液と混合する。ＧＬｕｃによって生成される生物発光は、セレンテラジンの酸化によって生じ、そのシグナルはルミノメーターを使用して測定される。移植されたマウスのＧＬｕｃの血清レベルは、回復後２週間目の時点で対照マウスのレベルを上回り、６ヶ月まで高く維持されることが予想される。
遺伝子改変ＡＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、及び分化脂肪細胞の移植による脂肪細胞の生着は、移植組織（ＡＳＣ及び脂肪細胞のみの場合）、レシピエントマウス脂肪デポ（生殖腺、腎周囲、後腹膜、腸間膜、及び鼠径部）及び非脂肪デポ（下肢骨格筋、肝臓、及び肺）を回復から７日後、及びその後６ヶ月まで毎月採取することによって評価される。採取した組織を約４ｍｍ３の小片に刻み、１％パラホルムアルデヒド中、室温で１５分間固定する。固定組織をＰＢＳで各３×１０分間再水和し、BODIPY-493/503（ThermoFisher、Ｄ３９２２）（成熟脂肪細胞を可視化するために２μｇ／ｍｌ）、ＤＡＰＩ（ThermoFisher、Ｄ１３０６）（１μｇ／ｍｌ、核を可視化するため）、及び抗ＧＦＰ抗体（移植された細胞の位置を特定するため）（Biolegend）で染色する。次いで、染色された組織を洗浄し、落射蛍光顕微鏡を使用してイメージングする。移植された脂肪細胞、及び移植されたＡＳＣ又はＣＤ３４＋細胞に由来する脂肪細胞は、ＧＦＰ及びBODIPY-493/503の両方について陽性に染色される。脂肪細胞の生着は、実施例５、６、及び７で観察された結果と同様であると予想される。
全体として、この例は、とりわけ、遺伝子改変された脂肪生成細胞の移植がインビボでのＧＬｕｃタンパク質の持続的な分泌につながり得ることを示すことが予想される。
実施例２０Ａ：ＥＰＯを分泌する脂肪細胞を産生するように遺伝子改変された脂肪生成細胞の移植によるマウスにおける治療効果
この例は、とりわけ、アディポネクチンプロモーター下でＥＰＯを発現するように遺伝子改変された脂肪生成細胞を移植することによって、インビボで赤血球産生を増加させられることを実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、実施例１７に記載されるように、ヒトアディポネクチンプロモーターの下でヒトＥＰＯ（配列番号９）を発現するか、又はマウスアディポネクチンプロモーターの下でマウスＥＰＯ（配列番号１０）を発現するレンチウイルスベクターを用いて遺伝子改変される。次いで、細胞は、実施例３及び４に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。
遺伝子改変されたＡＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、及び分化した脂肪細胞を、それぞれ実施例５、６、及び７に記載されるようにマウスに移植する。ＥＰＯの分泌は、ＥＰＯの血清レベル、網赤血球レベル、及び全血からのヘマトクリットによってモニタリングされる。以下に手順を説明する。
移植されたマウスでは、回復後６ヶ月まで、７日ごとに血液を採取する。１８μＬの血液を２μＬ ＥＤＴＡ（０．２ｍｏｌ／Ｌ）と混合し、２０μＬのDrummondガラスマイクロキャピラリー管（Sigma-Aldrich）に入れる。管の一端をCha-seal（Chase Scientific Glass、テネシー州ロックウッド）で密封した後、毛細管をＩＥＣ ＭＢマイクロヘマトクリット遠心分離機（DAMON/IEC Division、マサチューセッツ州ニーダム）で、１２，７００ｘｇで３分間遠心分離する。毛細管がスキャンされ（ScanMaker；Microtek、カリフォルニア州サンタフェ）、毛細管のデジタル画像がCanvas X（ADB System、ワシントン州シアトル）にインポートされる。充填された細胞の体積比が決定される。
ヘマトクリットの測定後、毛細管を折り、血漿ＥＰＯレベルを測定するために血漿を回収する。血漿ＥＰＯレベルは、実施例１７に記載されるように、ヒトＥＰＯ（Abcam、ａｂ１１９５２２）又はマウスＥＰＯ（Abcam、ａｂ１１９５９３）に対する標準的な酵素結合免疫吸着測定法を使用して定量する。
網赤血球レベルを測定するために、製造元の推奨に従って、５μＬの血液を０．５μＬ ＥＤＴＡ（０．２ｍｏｌ／Ｌ）と混合し、Retic-COUNT（商標）、チアゾールオレンジ試薬（BD Biosciences、３４９２０４）を使用して分析する。染色された細胞はフローサイトメーターで分析し、その値を総赤血球に対する網赤血球の割合として表す。
移植されたマウスのヘマトクリット、血漿ＥＰＯレベル、及び網赤血球レベルは、生着後７日目の時点で対照マウスのレベルを上回り、６ヶ月まで高く維持されることが予想される。
全体として、この例は、とりわけ、アディポネクチンプロモーター下でＥＰＯを発現するように操作された脂肪生成細胞の移植が、マウスにおける赤血球産生の増加につながり得ることを示すことが予想される。
実施例２０Ｂ：ＥＰＯを分泌するように遺伝子改変されたＡＳＣ及び脂肪生成細胞の移植によるマウスにおける治療効果
この例は、とりわけ、ＥＦ１ａプロモーター下でＥＰＯを発現するように遺伝子改変されたＡＳＣ及びＡＳＣに由来する脂肪生成細胞を移植することによって、インビボで赤血球産生を増加させられることを実証する。
この例では、ｈＡＳＣは、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように拡大した。細胞が７０％コンフルエンスに達すると、それらを実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるように継代し、６ウェル培養プレートに１×１０５細胞／ウェルで播種し、一晩培養させた。翌日、ピューロマイシン耐性遺伝子を有するヒトＥＰＯ（ｈＥＰＯ）レポーター遺伝子を発現するレンチウイルスレポーターベクターを用いて、細胞を所定のＭＯＩでトランスフェクトした。続いて、実施例５Ａ及び／又は５Ｂに記載されるようにｈＡＳＣを拡大し、次いで、分化のために播種し、実施例７Ａ及び／又は７Ｂに詳述するように分化させた。未分化ｈＡＳＣ及び分化ｈ脂肪細胞を、先に記載されるようにマウスに移植した。簡潔には、ＮＯＤ ＳＣＩＤマウス（The Jackson Laboratory、００１３０３）にＡＳＣ又はＡＳＣ由来の脂肪細胞（ｈ脂肪細胞）を注射した。各マウスの背側を７０％エタノールで拭き取り、ＨＢＳＳに懸濁したＡＳＣ（１６×１０６細胞／面）及び脂肪細胞（８×１０６細胞／面）を、皮下投与のために２５Ｇゲージシリンジを使用して背側腹部の面に注射した。模擬移植コホートでは、等体積のＨＢＳＳのみ又は操作されていない細胞を注射した。回復後、マウスに高脂肪食（Research Diets、Ｄ１２４５１４５％高脂肪食製品＃ＮＣ９２４８６０９）を２８日間与え、続いて研究の残りの期間は通常の固形飼料（LabDiet、５００１）を与えた。
マウスからほぼ毎週採血し、ｈＥＰＯタンパク質の存在及び網赤血球レベルについて血液を分析した。
ＥＰＯ分泌は、ヒトＥＰＯのｑＰＣＲベースのイムノアッセイを使用して測定した（Thermo Fisher、Ａ４０４１９）。具体的には、５倍に希釈した細胞培養物上清又はマウス血清サンプルをＥＰＯ特異的オリゴ結合抗体と組み合わせ、室温で１時間インキュベートした。リガーゼ及び追加のスプリントオリゴをプレートに加えた。ｑＰＣＲプロトコルを実行して塩基ＤＮＡテンプレートを生成し、次いで、各サイクルで産生される蛍光を測定しながら、４０サイクルにわたって変性及びアニーリングを行った。図１６Ａ～１６Ｄに示すように、ｈＥＰＯを発現するように操作された脂肪細胞及びＡＳＣは、研究の全期間（１００日）にわたってｈＥＰＯを分泌した。
網赤血球レベルを測定するために、５μＬの血液を、製造元の推奨に従って、１ｍＬのRetic-COUNT（商標）、チアゾールオレンジ試薬BD Biosciences、３４９２０４）、及び１ｍＬのＰＢＳ（対照）と混合した。染色された細胞は、Attune（商標）NxT No-Wash No-Lyse Filter Kitを使用してフローサイトメーターで分析し、値を総赤血球に対する網赤血球の割合として表した。
図１６Ａ～１６Ｄに示すように、ｈＥＰＯを発現するＡＳＣ及び脂肪細胞を移植されたマウスにおける網赤血球レベルは、対照マウスのレベルを超えて上昇し、３０日以上にわたってより高い状態が維持された。
全体として、この例は、とりわけ、ＥＰＯを発現するように操作されたＡＳＣ及び脂肪生成細胞の移植がマウスにおける赤血球産生の増加につながり得ることを示す。
実施例２１：脂肪生成分化の際にＰＡＨを発現するように遺伝子改変された脂肪生成細胞を移植することによるＰＫＵマウスモデルにおける治療効果
この例は、とりわけ、脂肪生成分化の際にＰＡＨを発現するように操作された脂肪生成細胞の移植が、ＰＫＵマウスモデルにおける高フェニルアラニン血症（ＨＰＡ）の長期持続する減少をもたらす実証する。
この例では、実施例１及び２に記載されるように、ＡＳＣ及びＣＤ３４＋細胞が単離及び拡大される。細胞は、実施例１８に記載されるように、ヒトアディポネクチンプロモーターの下でヒトＰＡＨ（配列番号１１）を発現するか、又はマウスアディポネクチンプロモーターの下でマウスＰＡＨ（配列番号１２）を発現するレンチウイルスベクターを用いて遺伝子標識される。次いで、細胞は、実施例３及び４に記載されるように、インビトロで脂肪細胞に分化する。
ホモ接合性Ｐａｈｅｎｕ２－／－であるＰＫＵマウスは、ヘテロ接合性Ｐａｈｅｎｕ２＋／マウス（Ｂ６．ＢＴＢＲ－Ｐａｈｅｎｕ２、The Jackson Laboratory、０２９２１８）を交配させることによって生成される。遺伝子改変されたＡＳＣ、ＣＤ３４＋細胞、及び分化した脂肪細胞を、それぞれ実施例５、６、及び７に記載される手順に従って、生後４週間のＰＫＵマウスに移植する。マウスは、通常の固形飼料で飼育される。メラニンの生合成の減弱のため、色素沈着低下はＨＰＡの可視的な表現型の１つである。この表現型は、移植されたマウスにおいて有意に逆転することが予想される。具体的には、生着後早くも２週間で、移植されたマウスは対照マウスよりも顕著に暗い色を示すことが予想される。移植されたマウスの毛色は、経時的に濃くなり続け、２～４か月後には野生型マウスと区別できなくなり得る。
ＨＰＡに対する移植の効果は、標準フェニルアラニンアッセイキット（Millipore Sigma、ＭＡＫ００５）を使用して血清フェニルアラニン（Ｐｈｅ）濃度を定量することによっても測定される。移植されたマウスでは、回復後６ヶ月まで、７日ごとに血清を採取する。アッセイに使用する前に、血清を１０ｋＤａ ＭＷＣＯスピンフィルターでタンパク質除去する。１０～５０μＬのタンパク質除去した血清を、フェニルアラニンアッセイ緩衝液で最終体積５０μＬまで直接希釈する。反応物を光から保護し、３７℃で２０分間インキュベートする。存在するフェニルアラニンに比例する蛍光強度（λｅｘ＝５３５ｎｍ／λｅｍ＝５８７ｎｍ）は、蛍光マルチウェルプレートリーダーを使用して測定される。移植されたマウスの血清Ｐｈｅ濃度は、生着後２週間の時点で対照マウスのレベルと比較して有意に低下し、研究期間中低く維持されることが予想される。
実施例２２：培養物中のＡＳＣの非免疫原性
この例は、とりわけ、培養物中の同種異系ＡＳＣが低い免疫原性を有することを実証する。
この例では、ｍＡＳＣは、実施例５Ｂ及び／又は１９に記載されるように拡大した。細胞を９６ウェルプレートにウェルあたり２×１０４細胞でプレーティングした。マウスリンパ球は、徒手解剖、その後の１０ｍＬシリンジプランジャーによる機械的破砕、及びピペッティングの反復による均質化によって初代マウス脾臓から回収された。溶液を７０μｍセルストレーナーで濾過し、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで洗浄した。遠心分離により細胞を回収し、塩化アンモニウムを使用して赤血球を溶解した。脾臓は次の株から回収した：Ｃ５７、Ｂａｌｂ／ｃ、及びＦＶＢ。
ｍＡＳＣの免疫原性は、細胞毒性アッセイを使用して特徴付けた。細胞毒性アッセイにおけるレスポンダー細胞は、Ｃ５７マウス由来のｍＡＳＣであった。細胞毒性アッセイにおけるエフェクター細胞は、同系（Ｃ５７）及び同種異系（Ｂａｌｂ／ｃ及びＦＶＢ）マウスから単離された脾細胞であった。ＹＡＣ－１は、ＮＫ媒介細胞毒性の陽性対照として使用されるマウスリンパ腫細胞株であった。
細胞毒性アッセイは、９６ウェルマイクロタイタープレートで実施した。標的ｍＡＳＣ及びＹＡＣ－１細胞をウェルあたり２×１０４細胞でプレーティングした。エフェクター細胞（脾細胞）を、ウェルあたり２×１０５～２×１０６細胞の範囲の様々な数で加えた。Ｃ５７脾細胞は同系対照として働き、Ｂａｌｂ／ｃ及びＦＶＢ脾細胞は同種異系エフェクターとして働く。追加の対照には、ｍＡＳＣ単独、及びＹＡＣ－１細胞単独が含まれる。４時間のインキュベーション後、CytoTox-Glo Assay Reagent（Promega）を各ウェルに加え、２０分間インキュベートし、発光を測定した。次いで、ジギトニン溶液をウェルに加えて全ての細胞を完全に溶解し、２０分後に発光を測定した。発光は、各ウェル内の死細胞の数と直接的に相関していた。
図１７Ａに示すように、ＹＡＣ－１細胞を単独で分析した場合、５，０００細胞のＲＬＵは約５００，０００であり、溶解前のＲＬＵは約６４０，０００であり、一方、溶解後のＲＬＵは、溶解細胞では約４．６Ｍ及び約８．４Ｍまで上昇し、したがって、細胞が溶解したことにより、アッセイの陽性技術的対照が有効であることが実証された。さらに、ＹＡＣ－１細胞を脾細胞と共培養した場合、図１７Ａ～１７Ｂに示すように脾細胞をＹＡＣ１培養物に加えると、より高いＲＬＵによって示されるように細胞死の増加を検出することができ、脾細胞が機能していることが実証される。図１７Ｃ～１７Ｄでは、Ｃ５７ ＡＳＣは、溶解前に約９００，０００、１．２Ｍ、２．７ＭのＲＬＵを示す一方、溶解後は、播種した細胞の数に応じて１０～１２ＭのＲＬＵを示し、機能したアッセイの陽性技術的対照を再び示した。脾細胞をｍＡＳＣと共培養した場合、図１７Ｂに示すように、細胞毒性はごくわずかしか観察されなかった。さらに、同系及び同種異系のｍＡＳＣ脾細胞共培養物間の細胞毒性レベルは同様であった。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、これらの結果は、同種異系ＡＳＣが非免疫原性であることを実証する。
免疫原性は、同系脾細胞に対し、同種異系脾細胞とｍＡＳＣを共培養したときの細胞毒性の変化に基づいて評価した。全ての脾細胞がＹＡＣ－１に対して活性である一方で、同種異系及び同系ｍＡＳＣに対しては細胞毒性を非常にわずかしか示さないことが示された。図１７Ａ～１７Ｄに示すように、同種異系脾細胞は、ＹＡＣ－１細胞に対して細胞毒性を示したが、ｍＡＳＣに対しては示さなかった。
結論として、この例の結果は、混合リンパ球アッセイにおける細胞死の欠如によって実証されるように、とりわけ、ｍＡＳＣが非免疫原性であることを示す。要約すると、この例は、とりわけ、ＰＫＵマウスモデルにおけるＨＰＡの長期持続する減少が、ＰＡＨ発現脂肪細胞を産生するように操作された脂肪生成細胞を移植することによって達成できることを示すことが予想される。
配列
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Figure 2023551479000006
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Figure 2023551479000011
均等物
当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、又は確認することができよう。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
本明細書で使用される全ての見出しは、単に整理するためのものであり、いかなる形でも開示を制限することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、全てのセクションに同様に適用され得る。
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (87)

  1. 治療有効量の実質的に純粋な脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性、長時間作用型組成物。
  2. 前記組成物が、それを必要とする対象において疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記組成物が、単回投与で投与された場合、前記対象における疾患又は障害を処置、予防、又は改善することができる、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記脂肪生成細胞が培養され、拡大される、請求項１～３のいずれか一項に記載の組成物。
  5. 前記組成物が、投与時に炎症反応を引き起こさない、請求項１～４のいずれか一項に記載の組成物。
  6. 前記組成物は、対象に投与すると、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－２、若しくはＩＦＮ－ガンマ、又はそれらの任意の組み合わせの約４０％、約３５％、約３０％、約２５％、約２４％、約２３％、約２２％、約２１％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％未満の増加を誘発する、請求項１～５のいずれか一項に記載の組成物。
  7. 前記組成物は、対象に投与すると、ＩＤＯ、ＨＬＡ－Ｇ、ＨＧＦ、ＰＧＥ２、ＴＧＦベータ、及びＩＬ－６、又はそれらの任意の組み合わせの約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％、約２５０％、約３００％、約３５０％、又は約４００％以上の増加を誘発する、請求項１～６のいずれか一項に記載の組成物。
  8. 前記脂肪生成細胞が、脂肪細胞、脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）、及びＣＤ３４＋細胞から選択される、請求項１～７のいずれか一項に記載の組成物。
  9. 前記脂肪生成細胞が、脂肪細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  10. 前記脂肪細胞が、褐色／ベージュ脂肪細胞又は白色脂肪細胞である、請求項９に記載の組成物。
  11. 前記脂肪細胞が、ＣＩＤＥＣ、ＦＡＢＰ４、ＰＬＩＮ１、ＬＧＡＬＳ１２、ＡＤＩＰＯＱ、ＴＵＳＣ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＰＰＡＲＧ、ＬＥＰ、ＣＥＢＰＡ、又はそれらの組み合わせのうちの１つ以上を発現及び／又は分泌する、請求項９～１０のいずれか一項に記載の組成物。
  12. 前記脂肪細胞が、以下：
    ａ．有糸分裂後であること；
    ｂ．約３５％（脂肪組織の新鮮重量％）を超える；任意選択により、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、又は約８０％を超える、脂質含量を有すること；
    ｃ．約６０％～約９５％、任意選択により、６０～９４％、約６０％～約９０％、約６０％～約８５％、約６０％～約８０％、約６０％～約７５％、約６０％～約７０％、約６０％～約６５％、約６５％～約９０％、約７０％～約９０％、約７５％～約９０％、約８０％～約９０％、又は約８５％～約９０％の脂肪組織中の脂肪含量を有すること；
    ｄ．約８０％、任意選択により、約７５～約８５％の平均脂肪含量を有すること；
    ｅ．約５％～約４０％、任意選択により、約６～３６％、約５％～約３５％、約５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、約５％～約１０％、約１０％～約４０％、約１５％～約４０％、約２０％～約４０％、約２５％～約４０％、約３０％～約４０％、又は約３５％～約４０％の脂肪組織中の水分含量を有すること；
    ｆ．約１５％、任意選択により、約１２．５％～約１７．５％の平均水分含量を有すること；
    ｇ．約１ｇ／ｍＬ、任意選択により、０．９１６ｇ／ｍＬ、約０．５ｇ／ｍＬ、約０．６ｇ／ｍＬ、約０．７ｇ／ｍＬ、約０．８ｇ／ｍＬ、約０．９ｇ／ｍＬ、約１．１ｇ／ｍＬ、又は約１．２ｇ／ｍＬの比重を有すること；
    ｈ．ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、パルミチン酸、パルミトレイン酸、及びミリスチン酸、それらの誘導体のうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
    ｉ．遊離脂肪酸、コレステロール、モノグリセリド、及びジグリセリドのうちの１つ以上を含む脂質含量を有すること；
    ｊ．細胞体積の約９０％を超える、任意選択により、９５％を超える、又は約９８％を超える、又は約９３％、又は約９５％、又は約９７％、又は約９９％のサイズの脂質滴を有すること；
    ｋ．細胞の体積の少なくとも約３０％～約９９％；任意選択により、少なくとも約４０％～約９０％、約５０％～約９０％、約６０％～約９０％、約７０％～約９０％、約８０％～約９０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、又は約９０％を含む脂質滴を有すること；
    ｌ．直径約２０～３００μｍ、任意選択により、約２０～３００μｍ、約２０～２００μｍ、約２０～１００μｍ、約２０～５００μｍ、約２０～３０μｍ、約５０～３００μｍ、約５０～２００μｍ、約５０～１００μｍ、約１００～３００μｍ、約１００～２００μｍ、約１５０～３００μｍ、約１５０～２００μｍ、又は約２００～３００μｍの表面サイズを有すること；
    ｍ．約２００～約４００μｍ３、任意選択により、約２００～約３５０μｍ３、約２００～約３００μｍ３、約２００～約２５０μｍ３、約２５０～約４００μｍ３、約２５０～約３５０μｍ３、約２５０～約３００μｍ３、約３００～約３５０μｍ３、又は約３００～約４００μｍ３の核体積を有すること；
    ｎ．約４，０００～約１８，０００μｍ３、任意選択により、約４０００～約１５０００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３、約４０００～約１００００μｍ３、約５０００～約１５０００μｍ３、約７５００～約１５０００μｍ３、約１００００～約１５０００μｍ３、約１２５００～約１５０００μｍ３の総体積を有すること；
    ｏ．約１：２０～１：９０、任意選択により、約１：２０～約１：８０、約１：２０～約１：７０、約１：２０～約１：６０、約１：２０～約１：５０、約１：２０～約１：４０、約１：２０～約１：３０；約１：３０～約１：８０、約１：４０～約１：８０、約１：５０～約１：８０、約１：６０～約１：８０、又は約１：７０～約１：８０の核対細胞比を有すること；
    ｐ．扁平な核を有すること；
    ｑ．総細胞体積の約１０％～約６０％未満の小さい細胞質を有し、前記細胞質には脂質滴体積が含まれず、任意選択により、約２０％未満、約３０％未満、約４０％未満、又は約５０％未満であること；
    ｒ．液体を吸収及び放出できること；
    ｓ．水又は水溶液、任意選択により、培地、又はＨＢＳＳ中で浮揚性であること；
    ｔ．非中心に位置する核を有すること；
    ｕ．１つ以上の脂肪滴を有すること；
    ｖ．非球形の細胞質を有すること；
    ｗ．アディポネクチン、レプチン、及びＴＮＦ－αのうちの１つ以上を分泌できること；
    ｘ．脂質生成ができること；
    ｙ．トリグリセリド（ＴＧ）を貯蔵できること；
    ｚ．非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）、任意選択により、オレイン酸、パルミトレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、ラウリン酸、及びステアリン酸などの長鎖脂肪酸を分泌できること；
    ａａ．ホルモンに応答性であること；
    ｂｂ．神経入力に応答性であること；
    ｃｃ．約９年、任意選択により、約８年～約１０年の細胞代謝回転速度を有すること；
    ｄｄ．約４５μｍ、任意選択により、約４７．２μｍ、約４０μｍ、約４２．５μｍ、約４７．５μｍ、又は約５０μｍの平均直径を有すること；
    ｅｅ．約２５％の細胞が約５０μｍ未満の直径を有し；約４０％の細胞が約５０～６９μｍの直径を有し；約２５％の細胞が約７０～８９μｍの直径を有し；且つ約１０％の細胞が約９０μｍ以上の直径を有する、直径分布を有する細胞集団；
    ｆｆ．心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）に応答性であること；
    ｇｇ．脂肪分解ができること；
    ｈｈ．ステロイドホルモンに結合及び応答できる受容体を発現すること；
    ｉｉ．ホスファチジルコリンにより溶解されること；
    ｊｊ．約１ｇ／ｍｌ、任意選択により、約０．８ｇ／ｍｌ、約０．９ｇ／ｍｌ、約１．１ｇ／ｍｌ、約１．２ｇ／ｍｌの細胞密度；
    ｋｋ．約８０％を超える、任意選択により、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の生存率；
    ｌｌ．約８０％を超える、任意選択により、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９８％、又は約９９％の純度、
    ｍｍ．適切な効力、任意選択により、約２００μｇ／ｍｌを超えるオイルレッドＯの溶出量；及び
    ｎｎ．微生物汚染について陰性
    のうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、又は３５個以上を有することを特徴とする、請求項９～１１のいずれか一項に記載の組成物。
  13. 前記脂肪細胞が、約３８，０００，０００細胞／ｍＬ、約７０，０００，０００細胞／ｍＬ～約３，０００，０００細胞／ｍＬ、又は約４０，０００，０００細胞／ｍＬ～約２０，０００，０００細胞／ｍＬの濃度で存在する、請求項８～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  14. 前記組成物が、脂肪細胞及び脂肪細胞前駆細胞（脂肪生成幹細胞（ＡＳＣ）及びＣＤ３４＋細胞など）のうちの１つ以上から任意選択により選択される、約５０，０００～約６，０００，０００，０００個の脂肪生成細胞を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組成物。
  15. 前記脂肪生成細胞が、ＡＳＣである、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  16. 前記ＡＳＣが、約１０万～１億細胞／ｍＬ又は約５００万細胞／ｍＬの濃度で組成物中に存在する、請求項１５に記載の組成物。
  17. 前記組成物が、約１００万～約７億５０００万個のＡＳＣ又は約１億２０００万個のＡＳＣを含む、請求項１５又は１６に記載の組成物。
  18. 前記組成物が、約２５０，０００細胞／ｋｇ～約４００万細胞／ｋｇのＡＳＣ濃度を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の組成物。
  19. 前記ＡＳＣが、以下：
    ａ．約９０％以上の生存率；
    ｂ．約５ｍｍｏｌ／Ｌ～約１０ｍｍｏｌ／Ｌのグルコース取り込み；
    ｃ．約１０ｍｍｏｌ／Ｌ～約１５ｍｍｏｌ／Ｌの乳酸産生
    のうちの１つ以上、又は１つ、２つ、３つを有することを特徴とする、請求項１５～１８のいずれか一項に記載の組成物。
  20. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２５３のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを高いレベルで発現する、請求項１５～１９のいずれか一項に記載の組成物。
  21. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１５１、ＣＤ４９ｃ、及びＣＤ９のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを低いレベルで発現する、請求項１５～２０のいずれか一項に記載の組成物。
  22. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ３６１、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１６４、及びＣＤ２１３Ａ１のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを高いレベルで発現する、請求項１５～２１のいずれか一項に記載の組成物。
  23. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ２６６、ＣＤ１６７、ＣＤ３２５、及びＣＤ１１５のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを低いレベルで発現する、請求項１５～２２のいずれか一項に記載の組成物。
  24. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤｗ２１０ｂ、ＣＤ３４０及びＣＤｗ２９３のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを高いレベルで発現する、請求項１５～２３のいずれか一項に記載の組成物。
  25. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１５１、ＣＤ１０、ＣＤ２６、及びＣＤ１４２のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを低いレベルで発現する、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  26. ＡＳＣの約５％未満が、表面マーカーＨＬＡＩＩ、ＣＤｌ ｌｂ、ＣＤｌ ｌｃ、ＣＤ１４、ＣＤ４５、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ８０及びＣＤ８６のうちの１つ以上を発現する、請求項１５～２５のいずれか一項に記載の組成物。
  27. 前記ＡＳＣの少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％が、表面マーカーＨＬＡＩ、ＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ５９、ＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５のうちの１つ以上を発現する、請求項１５～２６のいずれか一項に記載の組成物。
  28. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現する、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  29. 前記ＡＳＣの少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％が、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０を発現する、請求項２８に記載の組成物。
  30. 前記ＡＳＣが、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、ＣＤ１０について選択的に富化されたＡＳＣの集団を含む、請求項１５～２４のいずれか一項に記載の組成物。
  31. 前記脂肪生成細胞が、ＣＤ１０富化ＡＳＣによって得ることができる白色脂肪細胞である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の組成物。
  32. 前記脂肪生成細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項１～８のいずれか一項に記載の組成物。
  33. 前記脂肪生成細胞が、哺乳動物脂肪生成細胞である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の組成物。
  34. 前記脂肪生成細胞が、ヒト脂肪生成細胞、又はヒト対象における使用に適した脂肪生成細胞から選択される、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記脂肪生成細胞は、対象に投与されると、治療有効量の脂肪細胞を提供する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
  36. 前記脂肪生成細胞は、対象に投与されると、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；アディプシン；フェニルアラニンヒドロキシラーゼ（ＰＡＨ）；アディポネクチン；ＰＥＸ５；ＡＴＰ：ｃｏｂ（１）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＭＭＡＢ）；１４－３－３タンパク質イプシロン；２－オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットアルファ、ミトコンドリア、ＢＣＫＤＨＡ；２－オキソイソ吉草酸デヒドロゲナーゼサブユニットベータ、ミトコンドリア、ＢＣＫＤＨＢ；３－ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼ（ＨＩＢＡＤＨ）；３－ヒドロキシイソブチリル－ＣｏＡデアシラーゼ（ＨＩＢＣＨ）；３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ＭＣＣＣ１；３－メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ、ＭＣＣＣ２；４－アミノ酪酸－α－ケトグルタル酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＢＡＴ）；５－ヌクレオチダーゼ；６－ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ、脱炭酸；中鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＭＣＡＤ；短鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＳＣＡＤ；超長鎖アシルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＶＬＣＡＤ；アセチルＣｏＡチオラーゼ（アセチル補酵素Ａアセチルトランスフェラーゼ）、ＡＣＡＴ１；酸性セラミダーゼ；アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＡＰＲＴ；アデノシンデアミナーゼ；脂肪細胞エンハンサー結合タンパク質１；アグリン；アルデヒドオキシダーゼ；アルド－ケト還元酵素ファミリー１メンバーＣ２；アルカリホスファターゼ、組織非特異的アイソザイム；アルキルジヒドロキシアセトンリン酸シンターゼ、ＡＧＰＳ；アルファ－２－マクログロブリン；アルファエノラーゼ；アルファフェトプロテイン；アルファ－Ｌ－イズロニダーゼ、アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ；アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ８２ｋＤａ型；アルファ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ７７ｋＤａ型；アミノアシラーゼ－１；アンジオテンシノーゲン；アンジオテンシン－１；アンジオテンシン－２；アンジオテンシン－３；アンジオテンシン－４；アンジオテンシン１－９；アンジオテンシン１－７；アンジオテンシン１－５；アンジオテンシン１－４；アネキシンＡ５；アダプター関連タンパク質複合体３サブユニットベータ１、ＡＰ３Ｂ１；アポリポタンパク質Ｅ；アルギニノコハク酸リアーゼ、ＡＳＬ；アルギニノコハク酸シンターゼ；アルギニノコハク酸シンテターゼ、ＡＳＳ；アリールスルファターゼＡ；アリールスルファターゼＡ成分Ｂ；アリールスルファターゼＡ成分Ｃ；アリールスルファターゼＢ；アスパルチルグルコサミニダーゼ；ＡＴＰ結合カセットトランスポーター、ＡＢＣＤ１；ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼ、ＤＤＸ３Ｘ；エンドレペリン；ベータ－２－ミクログロブリン；ベータ－ガラクトシダーゼ；ベータ－ヘキソサミニダーゼサブユニットアルファ、ＨＥＸＡ；ベータヘキソサミニダーゼサブユニットベータ、ＨＥＸＢ；二官能性プリン生合成タンパク質、ＰＵＲＨ；ビグリカン；ビオチニダーゼ；ビオチニダーゼ；骨形成タンパク質１；分岐酵素、ＧＢＥ１；カルモジュリン；カルレティキュリン；ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ触媒サブユニットガンマ；軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質；軟骨関連タンパク質；カタラーゼ；カタラーゼ、ＣＡＴ；カテプシンＡ；カテプシンＢ；カテプシンＤ；カテプシンＦ；カテプシンＫ；シトリン、ＳＬＣ２５Ａ１３；コラーゲンアルファ－１（Ｉ）鎖；コラーゲンアルファ－１（ＩＩＩ）鎖；コラーゲンアルファ－１（ＩＶ）鎖；アレステン；コラーゲンアルファ－１（Ｖ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＩ）鎖、コラーゲンアルファ－１（ＸＶＩＩＩ）鎖；エンドスタチン、コラーゲンアルファ－２（Ｉ）鎖；コラーゲンアルファ－２（ＩＶ）鎖；カンスタチン；コラーゲンアルファ－２（Ｖ）鎖；コラーゲンアルファ－２（ＶＩ）鎖；コラーゲンアルファ－３（ＶＩ）鎖；補体Ｃ１ｒサブコンポーネント；補体Ｃ１ｓサブコンポーネント；補体Ｃ３；補体Ｃ４ベータ鎖；補体因子Ｄ；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼ１Ａ、ＣＰＴ１Ａ；シスタチオニンβシンターゼ、ＣＢＳ；シスタチン－Ｃ；シスチノシン、ＣＴＮＳ；シトクロムｃ；サイトカイン受容体様因子１；細胞質アセトアセチルＣｏＡチオラーゼ、ＡＣＡＴ２；Ｄ－二官能性酵素、ＨＳＤ１７Ｂ４；デコリン；ジヒドロリポイルデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア；ジヒドロキシアセトンリン酸アシルトランスフェラーゼ、ＧＮＰＡＴ；ジペプチジルペプチダーゼ１；カテプシンＣ；ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質１；ＥＧＦ含有フィブリン様細胞外マトリックスタンパク質２；エラスチン；伸長因子２；電子伝達フラビンタンパク質サブユニットアルファ、ＥＴＦＡ；電子伝達フラビンタンパク質サブユニットベータ、ＥＴＦＢ；電子伝達フラビンタンパク質デヒドロゲナーゼ、ＥＴＦＤＨ；細胞外マトリックスタンパク質１；フィブリリン－１；フィブリリン－２；フィブロネクチン；フィブリン－１；フィブリン－５；ホルミルグリシン生成酵素、ＳＵＭＦ１；フルクトース１，６－ビホスファターゼ、ＦＢＰ１；フマリルアセトアセターゼ；フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼドメイン含有タンパク質２Ａ、ＦＡＨＤ２Ａ；ガラクトセレブロシダーゼ；ガラクトキナーゼ１；ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、ＧＡＬＴ；ガングリオシドＧＭ２アクチベーター；ガングリオシドＧＭ２アクチベーターアイソフォーム短鎖；ゲルソリン；ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼ、ＧＮＰＴＡ；グルコース－６－リン酸１－デヒドロゲナーゼ；グルコース－６－リン酸イソメラーゼ；グルコース－６－リン酸トランスロカーゼ、Ｇ６ＰＴ１；グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＧＣＤＨ；グルタチオンペルオキシダーゼ３；グルタチオンシンテターゼ；グリセロールキナーゼ；グリセロール－３－リン酸デヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（＋）］、細胞質；グリシン切断酵素システム、ＡＭＴ；グリシン切断酵素システム、ＧＣＳＨ；グリコーゲン脱分枝酵素；４－アルファ－グルカノトランスフェラーゼ；アミロ－アルファ－１，６－グルコシダーゼ；グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓型；グリピカン－１；グリピカン－６；ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ三官能性多酵素複合体サブユニットアルファ、ＨＡＤＨＡ；ハプトグロビン；ヘパランＮ－スルファターゼ、Ｎ－スルホグルコサミンスルホヒドロラーゼ、ＳＧＳＨ；ヘパラン－アルファ－グルコサミニドＮ－アセチルトランスフェラーゼ、ＨＧＳＮＡＴ；ホルモン感受性リパーゼ；ヒドロキシアシル補酵素Ａデヒドロゲナーゼ、ミトコンドリア；グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、ＧＬＵＤ１の超活性；ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ＨＰＲＴ；イズロン酸－２－スルファターゼ、ＩＤＳ；インスリン様成長因子結合タンパク質７；間質性コラゲナーゼ；イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格１；ケラチン、ＩＩ型細胞骨格６Ｂ；Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＡ鎖；Ｌ－乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖；ラクトイルグルタチオンリアーゼ；ラミニンサブユニットアルファ－２；ラミニンサブユニットアルファ－４；ラミニンサブユニットベータ－１；ラミニンサブユニットベータ－２；ラミニンサブユニットガンマ－１；レプチン；分枝鎖アルファ－ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体、ミトコンドリア、ＤＢＴのリポアミドアシルトランスフェラーゼ成分；リポタンパク質リパーゼ；肝臓及び筋肉ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＢ；肝臓ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＧ２；リソソーム酸リパーゼ／コレステリルエステルヒドロラーゼ；リソソームアルファ－グルコシダーゼ；リソソームアルファ－マンノシダーゼ；リソソーム保護タンパク質；ＣＬＮ６膜貫通ＥＲタンパク質、ＣＬＮ６；ＣＬＮ８膜貫通ＥＲ及びＥＲＧＩＣタンパク質、ＣＬＮ８；リソソーム膜貫通ＣＬＮ３タンパク質、ＣＬＮ３；リソソーム膜貫通ＣＬＮ５タンパク質、ＣＬＮ５；リソソーム関連膜糖タンパク質２；リソソーム輸送調節因子、ＬＹＳＴ；マロニル－ＣｏＡデカルボキシラーゼ、ＭＬＹＣＤ；マトリリン－３；マトリックスＧｌａタンパク質；メラノフィリン、ＭＬＰＨ；メチオニンシンターゼ還元酵素、ＭＴＲＲ；メチレンテトラヒドロ葉酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、ＭＴＲ；メチレンテトラヒドロ葉酸還元酵素、ＭＴＨＦＲ；メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ＡＬＤＨ６Ａ１；メチルマロニル－ＣｏＡムターゼ；メバロン酸キナーゼ；ミトコンドリア分岐鎖アミノトランスフェラーゼ２、ＢＣＡＴ２；ミトコンドリアオルニチントランスロカーゼ、ＳＬＣ２５Ａ１５；メチルマロン酸尿Ａ型、ＭＭＡＡ；モリブドプテリンシンターゼ、ゲフィリン、ＭＯＣＳ１Ａ；ムコリピン－１、ＭＣＯＬＮ１；筋肉ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＡ１；ミオシンＶａ、ＭＹＯ５Ａ；ミオシン軽鎖４；Ｎ－アセチルガラクトサミン－６スルファターゼ、ＧＡＬＮＳ；Ｎ－アセチルグルコサミン－６－スルファターゼ；ニコチンアミドＮ－メチルトランスフェラーゼ；ＮＰＣ細胞内コレステロールトランスポーター１、ＮＰＣ１；パルミトイルプロテインチオエステラーゼ－１、ＰＰＴ１；パルミトイルプロテインチオエステラーゼ、ＰＰＴ２；ペントラキシン関連タンパク質、ＰＴＸ３；ペプチジル－プロリルシス－トランスイソメラーゼ、ＦＫＢＰ１０；ペルオキシダシンホモログ；ペロキシン－１、２、３、５、６、７、１０、１２、１３、１４、２６、ホスホアセチルグルコサミンムターゼ；ホスホグルコムターゼ－１；ホスホグリセリン酸キナーゼ１；ホスホグリセリン酸ムターゼ１；色素上皮由来因子、ＰＥＤＦ；血漿アルファ－Ｌ－フコシダーゼ；細胞膜カルニチン輸送、ＯＣＴＮ２；血漿プロテアーゼＣ１阻害剤；プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤１；プロコラーゲン－リジン、２－オキソグルタル酸５－ジオキシゲナーゼ１；プロピオニル－ＣｏＡカルボキシラーゼ；プロサポシン；プロテオグリカン４；プロテオグリカン４Ｃ末端部分；ピルビン酸カルボキシラーゼ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＤＬＡＴ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＢ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＨＸ；ピルビン酸デヒドロゲナーゼ複合体、ＰＤＰ１；Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－２７Ａ、ＲＡＢ２７Ａ；レチノール結合タンパク質４；リボヌクレアーゼＴ２；セマフォリン－７Ａ；セピアプテリン還元酵素；セリンプロテアーゼ、ＨＴＲＡ１；セロトランスフェリン；セルピンＢ６；血清アミロイドＡ－１タンパク質；短分岐鎖アシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＡＣＡＤＳＢ；シアル酸シンターゼ；シアリダーゼ－１；シアリン（シアル酸輸送）、ＳＬＣ１７Ａ５；溶質輸送隊ファミリー２２メンバー５、ＳＬＣ２２Ａ５；ＳＰＡＲＣ関連モジュラーカルシウム結合タンパク質２；スペクトリンアルファ鎖、非赤血球１；スフィンゴミエリンホスホジエステラーゼ、ＳＭＰＤ１；スクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ、ＯＸＣＴ１；スシリピート含有タンパク質、ＳＲＰＸ２；タファジン；テネイシン；トロンボスポンジン－２；トランスフォーミング成長因子ベータ誘導タンパク質ｉｇ－ｈ３；移行型小胞体ＡＴＰアーゼ；トリオースリン酸イソメラーゼ；トリペプチジルペプチダーゼ１；腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１１Ｂ；血管内皮増殖因子Ｃ；バーシカンコアタンパク質；ビメンチン；ビタミンＫ依存性プロテインＳ；Ｘ連鎖ホスホリラーゼキナーゼ、ＰＨＫＡ２；Ｘａａ－Ｐｒｏジペプチダーゼ；α－フコシダーゼ、ＦＵＣＡ１；α－ガラクトシダーゼＡ、ＧＬＡ；α－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼ、ＮＡＧＡ；β－グルコセレブロシダーゼ（別名グルコシルセラミダーゼ）；ＧＢＡ、β－グルクロニダーゼ、ＧＵＳＢ；β－マンノシダーゼ（β-mannosidasen）；ＶＥＧＦＡ；ＶＥＧＦ１６５；ＦＧＦ２；ＦＧＦ４；ＰＤＧＦ－ＢＢ（血小板由来成長因子）；Ａｎｇ１（アンジオポイテン１）、ＴＧＦβ（トランスフォーミング成長因子）；ＬＰＡ産生酵素（ＡＸＴ）；及びフタルイミド血管新生因子（ＰＮＦ１）のうちの１つ以上の

    治療有効量を提供する、請求項１～３５のいずれか一項に記載の組成物。
  37. 前記脂肪生成細胞が、異種核酸を含む、請求項１～３６のいずれか一項に記載の組成物。
  38. 前記異種核酸が、脂肪細胞特異的プロモーター、任意選択により、最小の近位プロモーター配列を任意選択により含む、アディポネクチンプロモーター又はａＰ２／ＦＡＢＰ４プロモーターを含み、任意選択により、１つ以上の遠位エンハンサー配列及び追加の転写因子結合部位、任意選択により、Ｃ／ＥＢＰα結合部位をさらに含む、請求項３７に記載の組成物。
  39. 前記脂肪細胞特異的プロモーターが、アディポネクチンプロモーター、任意選択により、ヒトアディポネクチンプロモーターである、請求項３８に記載の組成物。
  40. 前記脂肪細胞特異的プロモーターが、治療用タンパク質と作動的に関連している、請求項３８又は３９に記載の組成物。
  41. 脂肪生成細胞が、１つ以上の異種核酸を含む、治療有効量の実質的に純粋な前記脂肪生成細胞を含む、自己由来、非免疫原性、長時間作用型組成物。
  42. 前記脂肪生成細胞は、少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、又は約９９％以上が生存可能である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物。
  43. 前記組成物が、１つ以上の細菌、ウイルス、真菌、及び発熱物質を実質的に含まない、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組成物。
  44. 前記組成物が、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記希釈剤が、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ダルベッコ改変イーグル培地ＤＭＥＭ、アルファ改変最小必須培地（アルファ．ＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地１６４０（ＲＰＭＩ培地１６４０）、ＨＢＳＳ、ヒトアルブミン及びリンゲル液など、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項４４に記載の組成物。
  46. 前記組成物が、治療有効量のヘパリン、ＦＢＳ、ヒトアルブミン、ｂＦＧＦ、ＰＰＡＲ－γアゴニスト、インスリン、及びＲｈｏキナーゼ阻害剤のうちの１つ以上、又はそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記組成物が、足場を含む、請求項１～４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記足場が、生分解性生体材料、任意選択により、コラーゲン、様々なプロテオグリカン、アルギン酸塩ベースの基質及びキトサンなどの天然生体材料を含む、請求項４７に記載の組成物。
  49. 前記足場が、合成生体材料、任意選択により、合成ポリマーベースの材料を含む、請求項４７に記載の組成物。
  50. 前記足場が、ヒドロゲル、マトリゲル、アルギン酸塩、コラーゲン、キトサン、ＰＧＡ、ＰＬＡ、及びＰＧＡ／ＰＬＡコポリマー、シルク、死体又は非ヒト動物に任意選択により由来する無細胞／脱細胞化足場、生分解性生体材料、任意選択により、コラーゲン、プロテオグリカン、アルギン酸塩ベースの基材、若しくはキトサン、又はそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含む、請求項４７に記載の組成物。
  51. 前記組成物が、治療有効量の１つ以上の追加の治療剤をさらに含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記追加の治療剤が、鎮痛剤及び抗感染剤のうちの１つ以上である、請求項５１に記載の組成物。
  53. 前記組成物が、皮下、皮内、筋肉内、頭蓋内、眼内、静脈内、及び脂肪体から選択される経路による投与のために製剤化される、請求項１～５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 前記脂肪生成細胞が、生着後１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、２週間まで、３週間まで、１ヶ月まで、２ヶ月まで、３ヶ月まで、４ヶ月まで、５ヶ月まで、６ヶ月まで、７ヶ月まで、８ヶ月まで、９ヶ月まで、１０ヶ月まで、１１ヶ月まで、１年まで、若しくは２年まで、又はそれを超えて持続する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
  55. 脂肪生成細胞が、１つ以上のタンパク質及び／又は他の分子を、生着後１日まで、２日まで、３日まで、４日まで、５日まで、６日まで、７日まで、２週間まで、３週間まで、１ヶ月まで、２ヶ月まで、３ヶ月まで、４ヶ月まで、５ヶ月まで、６ヶ月まで、７ヶ月まで、８ヶ月まで、９ヶ月まで、１０ヶ月まで、１１ヶ月まで、１年まで、若しくは２年まで、又はそれを超えて分泌する、請求項１～５３のいずれか一項に記載の組成物。
  56. 請求項１～５５のいずれか一項に記載の組成物を含む、シリンジ。
  57. 前記シリンジが、任意選択により約３ｍＬ未満又は約２ｍＬ以下の体積で、予め充填されている、請求項５４に記載のシリンジ。
  58. 前記組成物は、－８０℃、－２０℃、４℃、又は２１℃で保存した場合、少なくとも１２、２４、３６、又は４８時間安定であり、約３５％、約３０％、約２５％、約２０％、約１９％、約１８％、約１７％、約１６％、約１５％、約１４％、約１３％、約１２％、約１１％、約１０％、約９％、約８％、約７％、約６％、又は約５％未満の細胞生存率の喪失を示す、請求項５６～５７のいずれか一項に記載のシリンジ。
  59. 任意選択により請求項５６～５８のいずれか一項に記載のシリンジを介して、請求項１～５３のいずれか一項に記載の組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において疾患又は障害を処置、予防、又は改善するための方法。
  60. 前記対象が、哺乳動物であり、任意選択により、霊長類である、請求項５９に記載の方法。
  61. 前記対象がヒトであり、任意選択により、成人、子供、又は乳児である、請求項６０に記載の方法。
  62. 前記組成物が、単回投与で、任意選択により単一部位又は複数部位に投与される、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
  63. 前記組成物が、複数回投与で、任意選択により単一部位又は複数部位に投与される、請求項５９～６１のいずれか一項に記載の方法。
  64. 前記組成物が、皮下注射によって投与される、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
  65. 前記疾患又は障害の複合寛解又は臨床的寛解が、投与から２４、１８、１２、８、又は６週間以内に達成される、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。
  66. 前記対象が、リソソーム蓄積障害、代謝障害、補体欠損症、脂肪細胞障害、内分泌障害、血管疾患、分枝鎖アミノ酸代謝障害、結合組織障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、血液疾患、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ベータアミノ酸及びガンマアミノ酸障害、ケトン代謝障害、ガラクトース血症、グリセロール代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、並びにペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害から選択される疾患若しくは障害を有するか、又はそれを有する疑いがあるか、又はそのリスクが高まっている疑いがある、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
  67. 前記疾患又は障害が、ウォルマン病、肥満、Ｃ３欠損症、家族性リポジストロフィー、悪液質、遺伝性血管浮腫、プロピオン酸血症１型、エーラス・ダンロス症候群、長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性ＬＰＬ欠損症、プロテインＳ欠損症、チロシン血症Ｉ型、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、シトルリン血症Ｉ型、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症、サクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症、グリセロールキナーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、グルタル酸血症Ｉ型、モリブデン補酵素欠損、及びツェルウェガー症候群から選択される、請求項６６に記載の方法。
  68. 前記組成物が、形質転換されていない脂肪生成細胞を含む、請求項６６又は６７に記載の方法。
  69. 前記対象が、リソソーム蓄積障害、代謝障害、血液疾患、骨及び結合組織障害、内分泌障害、炎症性障害、単一遺伝子性障害、癌、心血管障害、分枝鎖アミノ酸代謝障害、脂肪酸輸送及びミトコンドリア酸化障害、遺伝性脂質異常症、フェニルアラニン及びチロシン代謝障害、プリン代謝障害、尿素サイクル障害、ケトン代謝障害、グリシン代謝障害、リジン代謝障害、メチオニン及び硫黄代謝障害、ペルオキシソーム生合成及び超長鎖脂肪酸代謝障害、並びに他のタンパク質欠損障害から選択される疾患若しくは障害を有するか、又はそれを有する疑いがあるか、又はそのリスクが高まっている疑いがある、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
  70. 前記疾患又は障害が、シスチン症、Ｔ２Ｄ、血友病Ａ又はＢ、スティックラー症候群、骨粗鬆症、関節リウマチ、Ａ１ＡＴ欠損症、乳癌、アテローム性動脈硬化症、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、カルニチン－アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症、シトステロール血症、フェニルケトン尿症、遺伝性キサンチン尿症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、非ケトン性高グリシン血症、高リジン血症、ホモシスチン尿症、レフサム病、腎臓疾患を有する小児の成長障害から選択される、請求項６５に記載の方法。
  71. 前記組成物が、任意選択により、治療用導入遺伝子を含む異種核酸を含む、形質転換された脂肪生成細胞を含む、請求項６９又は７０に記載の方法。
  72. 脂肪生成細胞が、１つ以上の遺伝子、又はシスチノシン、ＧＬＰ－１、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、ＣＯＬ２Ａ１、副甲状腺ホルモン（１～８４）、アルカリホスファターゼ、アルファ－１アンチトリプシン、トラスツズマブ、アポリポタンパク質Ａ１、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ、ＳＬＣ２５Ａ２０、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー５、ＡＢＣＧ５、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、キサンチンデヒドロゲナーゼ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ、グリシン切断系Ｐタンパク質、リジン：α－ケトグルタル酸還元酵素、シスタチオニンβ－シンターゼ、フィタノイル－ＣｏＡヒドロキシラーゼ、及びヒト成長ホルモン（ソマトトロピン）に関連する遺伝子を含み、前記遺伝子が、脂肪細胞特異的プロモーターと作動的に関連している、請求項７１に記載の方法。
  73. 前記脂肪生成細胞が、ＣＤ３４＋細胞であり、前記疾患又は障害が、ウォルマン病、肥満、Ｃ３欠損症、家族性リポジストロフィー、悪液質、遺伝性血管浮腫、プロピオン酸血症１型、エーラス・ダンロス症候群、長鎖３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、家族性ＬＰＬ欠損症、プロテインＳ欠損症、チロシン血症Ｉ型、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症、シトルリン血症Ｉ型、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ欠損症、サクシニル－ＣｏＡ３－オキソ酸－ＣｏＡトランスフェラーゼ欠損症、ガラクトース－１－リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症、グリセロールキナーゼ欠損症、非ケトーシス型高グリシン血症、グルタル酸血症Ｉ型、モリブデン補酵素欠損、ツェルウェガー症候群、シスチン症、Ｔ２Ｄ、血友病Ａ又はＢ、スティックラー症候群、骨粗鬆症、関節リウマチ、Ａ１ＡＴ欠損症、乳癌、アテローム性動脈硬化症、イソブチリル－ＣｏＡデヒドロゲナーゼ欠損症、カルニチン－アシルカルニチントランスロカーゼ欠損症、シトステロール血症、フェニルケトン尿症、遺伝性キサンチン尿症、オルニチントランスカルバモイラーゼ欠損症、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡシンターゼ欠損症、非ケトン性高グリシン血症、高リジン血症、ホモシスチン尿症、レフサム病、腎臓疾患を有する小児の成長障害から選択される、請求項５９～７２のいずれか一項に記載の方法。
  74. 疾患又は障害の処置、予防、又は改善における、請求項１～５５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  75. 疾患又は障害の処置、予防、又は改善のための医薬の製造における、請求項１～５５のいずれか一項に記載の組成物の使用。
  76. 対象の脂肪組織に脂肪生成細胞を注射すること；
    前記脂肪組織を第１のプレート電極と第２のプレート電極の間に配置すること：及び
    前記第１のプレート電極から前記脂肪組織を通って前記第２のプレート電極に電流を流すことを含む、前記脂肪生成細胞のインビボでのエレクトロポレーションのためのプロセス。
  77. 脂肪生成細胞が、異種核酸を含む、治療有効量の実質的に純粋な前記脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性、長時間作用型組成物。
  78. 前記脂肪生成細胞が、野生型脂肪生成細胞及び／又は非富化脂肪生成細胞と比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現する、請求項７７に記載の組成物。
  79. 前記脂肪生成細胞の少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％がＣＤ１０を発現する、請求項７７に記載の組成物。
  80. 前記脂肪生成細胞は、ＣＤ１０富化ＡＳＣから得ることができる、請求項７７に記載の組成物。
  81. 前記脂肪生成細胞が、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現するＡＳＣから得ることができる白色脂肪細胞である、請求項８０に記載の組成物。
  82. 前記異種核酸が、脂肪細胞特異的プロモーターを含む、請求項７７に記載の組成物。
  83. 脂肪生成細胞は、野生型ＡＳＣ及び／又は非富化ＡＳＣと比較して、高いレベルのＣＤ１０を発現するＡＳＣから得ることができる、治療有効量の実質的に純粋な前記脂肪生成細胞を含む、同種異系、非免疫原性、長時間作用型組成物。
  84. 前記脂肪生成細胞が、異種核酸を含む、請求項８３に記載の組成物。
  85. 前記異種核酸が、脂肪細胞特異的プロモーターを含む、請求項８４に記載の組成物。
  86. 前記脂肪生成細胞の少なくとも約９０％又は少なくとも約９５％がＣＤ１０を発現する、請求項８３に記載の組成物。
  87. 前記脂肪生成細胞が、白色脂肪細胞である、請求項８３に記載の組成物。
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