CN117701500A - 一种间充质干细胞的培养方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及其应用。所述培养方法包括以下步骤：(1)脐带的分离；(2)组织块的冻存；(3)组织块的复苏；(4)原代培养；(5)传代培养；将冻存的组织块复苏后原代、传代培养出间充质干细胞，原代、传代培养过程中使用的完全培养基不添加动物血清和生长因子。本发明培养方法简单快捷，节约成本，制得的间充质干细胞增值能力强，纯度高，具有免疫调节和促进细胞增殖的作用。
Description
技术领域
本发明涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种间充质干细胞的培养方法及其应用。
背景技术
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，可以从多种组织中分离和培养得到。MSCs具有广泛的临床应用前景，包括再生医学、组织工程、免疫治疗和药物筛选等领域。培养MSCs具有重要的意义，MSCs具有自我更新和多向分化的潜能，可以分化为多种细胞类型，如成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等。这使得MSCs在组织修复和再生方面具有巨大潜力。通过培养和扩增MSCs，可以获得足够数量的细胞用于细胞治疗，例如骨折愈合、软骨修复、心肌再生和神经退行性疾病等。MSCs可以作为药物筛选的有效工具。通过培养MSCs并将其暴露于不同药物或化合物中，可以评估其对细胞增殖、分化和功能的影响。这有助于发现新的药物靶点、评估药物的效力和安全性，并加速药物研发过程。MSCs具有免疫调节和免疫抑制的能力，可以调节免疫反应、减轻炎症反应，并促进免疫平衡。通过培养MSCs并将其应用于免疫治疗，可以治疗一些自身免疫性疾病、器官移植排斥反应和免疫相关疾病。MSCs作为一种重要的细胞类型，对于了解细胞生物学、发育过程和疾病机制具有重要意义。通过培养MSCs，可以进行基础研究，深入探究其分化潜能、信号通路调控、基因表达和细胞功能等方面的机制。总之，间充质干细胞的培养具有广泛的临床应用前景和科学研究价值。然而，目前MSCs的培养方法在一些方面存在一些不足之处，其中包括以下几个方面：MSCs可以从多种组织中分离得到，但不同组织来源的MSCs可能具有不同的特性和功能，这种异质性可能会对MSCs的扩增和分化能力产生影响；在MSCs的培养过程中，可能存在其他细胞类型的污染，例如血管内皮细胞、成纤维细胞等，这些污染的细胞类型可能会影响MSCs的功能和应用效果；目前使用的MSCs培养基通常包含多种成分，如血清和生长因子，血清的批次变异性和生长因子的成本限制了MSCs培养的可重复性和可扩展性；MSCs在体外培养过程中存在一定的有限扩增能力，长期的培养可能导致细胞老化、功能丧失和遗传稳定性的下降。总体而言，目前的间充质干细胞培养方法仍然面临一些挑战和不足之处。因此，如何开发一种MSCs的纯度高，动物血清依赖性小，且MSCs的扩增能力和长期稳定性强的间充质干细胞的培养方法，是亟需解决的技术问题。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提出了一种间充质干细胞的培养方法及其应用。本发明将冻存的组织块复苏后原代、传代培养出间充质干细胞，简便快捷，细胞活力好。通过本发明培养方法获得的间充质干细胞，增殖能力强，细胞均一，不易产生增殖能力下降和细胞变大等老化现象，长期稳定性强。本发明配置的完全培养基排除了血清、异源蛋白带来的病毒风险，安全性更高，排除了因血清的批次变异性和生长因子的成本限制了间充质干细胞培养的可重复性和可扩展性，细胞纯度高，动物血清依赖性小。本发明所制备的细胞生长调节剂可以促进细胞增殖，提高间充质干细胞的激活Treg细胞活性的能力，细胞稳定剂可以使细胞长期稳定，提高细胞存活率，维持较强的增殖能力，不易老化。添加的黄芪甲苷、当归内酯、丹参多酚酸、银杏黄酮具有抗氧化作用，各组分协同增效，可以促进细胞增殖和提高细胞活性，提高细胞免疫调节活性。通过本发明培养方法获得的间充质干细胞可以促进PBMC分泌IL-6和IL-10，抑制TNF-α的分泌，促进Treg细胞分化，抑制Th1和Th17细胞增殖，具有免疫调节作用，此外还可以促进PBMC的增殖。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1) 脐带的分离；
(2) 组织块的冻存；
(3) 组织块的复苏；
(4) 原代培养；
(5) 传代培养。
进一步地，所述步骤(1)的脐带的分离方法，包括以下步骤：
(11) 胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，用含有1wt%双抗和250 μg/mL两性霉素的D-Hank’s液浸泡2 min并充分冲洗脐带，用20 mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血；
(12) 使用高温灭菌并冷却的眼科剪沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2-3 cm的小段，小心去除两条动脉和一条静脉，然后剪碎至1 mm3大小的组织块。
进一步地，所述步骤(2)的组织块的冻存方法，包括以下步骤：
(21) 将步骤(12)所得组织块浸入2-8℃的冻存保护液中5-10 min后分装到2 mL的冻存管中；
(22) 将步骤(21)所述冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，8-20 h后将冻存管转移至液氮罐内保存。
进一步地，步骤(21)所述冻存保护液包括基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂。
进一步地，所述基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂的用量比为3mL:7 mL:1 g。
进一步地，所述基础液为磷酸盐缓冲液PBS和生理盐水按照1:1的体积比混合均匀而成。
进一步地，所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种组合。
进一步地，所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合。
进一步地，所述步骤(3)的组织块的复苏方法，包括以下步骤：
(31) 将步骤(22)所述装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2-5min，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1-5次后获得复苏的组织块。
进一步地，步骤(31)所述的复苏缓冲液包括磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种或几种的组合。
进一步地，所述步骤(4)的原代培养方法，包括以下步骤：
(41) 将步骤(31)所得复苏的组织块接种到10 cm的培养皿中，每个皿0.5-1 g组织，放置于5% CO2、37℃培养箱内，静置1-2 h后每皿添加12 mL完全培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5% CO2培养箱进行培养；
(42) 72 h后，每皿补加3 mL完全培养基，之后每72 h进行换液，去除旧培养基，保留组织块，添加10 mL新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，第12-14天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10 mL新鲜培养基，得到P0代脐带间充质干细胞。
进一步地，所述步骤(5)的传代培养方法，包括以下步骤：
(51) 待P0代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%-90%后，去除旧培养基，使用室温的PBS洗去皿内残留的培养基，PBS的量为0.04 mL/cm2，弃去PBS，加入0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA，加入量为0.02 mL/cm2，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，置于培养箱内消化90-100 s，得到细胞消化液；
(52) 用8倍于步骤(51)所述0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA体积的完全培养基终止消化，转移到离心管内，配平后室温300 g离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，5mL吸管混匀，得到细胞混悬液；
(53) 采用细胞计数仪对步骤(52)所得细胞混悬液进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，传代密度为6000-8000 cells/cm2，得到P1代脐带间充质干细胞，待P1代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%-90%后可继续传代，P1代细胞传代可得P2代细胞，依次扩增；
(54) 传代后标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复4-6次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5% CO2的培养箱内培养。
进一步地，所述完全培养基的制备方法为：向lonza Ultra CULTURE MEDIUM无血清培养基中加入以下组分：PALL血清替代物5v/v%、L-谷氨酰胺2 mM、重组人白蛋白0.8 g/L、1×NEAA、细胞生长调节剂25 mg/L、稳定剂20 mg/L、黄芪甲苷10 mg/L、当归内酯12 mg/L、丹参多酚酸2 mg/L、银杏黄酮8 mg/L。
进一步地，所述细胞生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
(411) 将猪肝除去非肝组织，洗净、粉碎制成初始肝浆，加入初始肝浆重量50-60%的去离子水混匀，再加入1 mol/L的盐酸溶液调节pH值为4.2-4.8，得到调酸肝浆，将调酸肝浆搅拌加热至90-95℃，保温40 min后，停止加热，得到固液混合物；
(412) 将步骤(411)所制得的固液混合物1000 r/min离心3 min，得到上清液和沉淀，将上清液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，静置4-5 h分层，取上层物质，得到油状物；
(413) 将步骤(412)所得沉淀与无水乙醇按照1:3的质量比混合均匀，150 W超声1h，过滤后将滤液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，得到膏状物，将步骤B所得油状物与膏状物按照1:1的质量比混合均匀，得到反应混合物A；
(414) 将反应混合物A与无水乙醇按照1 g:20 mL的比例混合均匀，加入N,N-二甲基甲酰胺，反应混合物A与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为4:1，室温下120 rpm搅拌15-18 h，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，得到反应混合物B；
(415) 将反应混合物B按照1 g:10 mL的比例溶解在氯仿中，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH至3.6-4.2，60℃下120 rpm搅拌12 h，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为6-7，离心去上清，丙酮洗涤，在四氢呋喃中重结晶，抽滤，依次用乙醇、去离子水洗涤3次，紫外灭菌3 h，冷冻干燥，制得细胞生长调节剂。
进一步地，所述稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(416) 取鼠尾草的根茎洗净干燥后研磨，过60目筛，与80-96vol%的乙醇溶液按照1 g:20 mL的比例混合均匀，150 W超声2 h后过滤，将滤液与聚酰胺凝胶按照1:5的体积比混合，搅拌2 h后过滤，加入到无水乙醇中，120 W超声40-50 min，得到反应混合液①；
(417)将步骤(416)所得反应混合液①离心后取上清液，与丙二醇甲醚醋酸酯按照1:1.2的质量比混合，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，喷雾干燥，紫外灭菌3 h，制得稳定剂。
进一步地，本发明还提供了所述间充质干细胞在调节免疫和促进细胞增殖方面的应用，包括以下步骤：将间充质干细胞与PBMC共培养。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的间充质干细胞的培养方法无需扩增出大量的干细胞，只需将冻存的组织块复苏后原代、传代培养出间充质干细胞，简便快捷，细胞活力好。通过本发明培养方法所获得的细胞形态完整、分泌能力强且纯度较高，符合国际对间充质干细胞的质控标准。且该培养体系下培养的细胞安全、理想，具有良好的临床及商业应用前景。本发明的培养方法可在占用较小空间、消耗很少培养基、操作更简便、工作量大大减少的条件下，通过很少的间充质干细胞扩增获得大量的间充质干细胞。通过本发明培养方法获得的间充质干细胞，增殖能力强，细胞均一，不易产生增殖能力下降和细胞变大等老化现象，长期稳定性强。本发明配置的完全培养基未添加血清，排除了血清、异源蛋白带来的病毒风险，安全性更高，更合适应用于临床疾病治疗。同时未添加生长因子，排除了因血清的批次变异性和生长因子的成本限制了MSCs培养的可重复性和可扩展性，细胞纯度高，动物血清依赖性小。本发明所提供的完全培养基各组分之间合理配伍，可促进细胞的增殖，提高间充质干细胞的表达率和细胞纯度，并在较短的时间内获得足够的干细胞数量。细胞生长调节剂可以促进细胞增殖，提高间充质干细胞的激活Treg细胞活性的能力，细胞稳定剂可以使细胞长期稳定，提高细胞存活率，维持较强的增殖能力，不易老化。添加的黄芪甲苷、当归内酯、丹参多酚酸、银杏黄酮具有抗氧化作用，各组分协同增效，可以促进细胞增殖和提高细胞活性，提高细胞免疫调节活性。通过本发明培养方法获得的间充质干细胞可以促进PBMC分泌IL-6和IL-10，抑制TNF-α的分泌，促进Treg细胞分化，抑制Th1和Th17细胞增殖，具有免疫调节作用，此外还可以促进PBMC的增殖。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1 为本发明实施例1所述间充质干细胞的显微镜照片；
图2 为本发明实施例2所述间充质干细胞表面标志物的流式细胞检测图；
图3 为本发明实施例3和对比例1-3所述间充质干细胞的生长曲线图；
图4 为本发明实施例3所述间充质干细胞对PBMC分泌IL-6、IL-10和TNF-α的分泌影响图；
图5 为本发明实施例3所述间充质干细胞抑制Th1和Th17效果图，其中a、b和c分别为PBMC+PHA、MSC+PBMC+PHA(1:5)和MSC+PBMC+PHA(1:10)培养3天后的Th1细胞占比，d、e和f为PBMC+PHA、MSC+PBMC+PHA(1:5)和MSC+PBMC+PHA(1:10)培养3天后的Th17细胞占比；
图6 为本发明实施例1所述间充质干细胞激活Treg效果图，其中，a为PBMC组中的Treg细胞占比，b为PBMC+MSC组中的Treg细胞占比；
图7 为本发明实施例2所述间充质干细胞对PBMC增殖的促进效果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明，但本发明并不仅限于以下的实施例。
需要说明的是，无特殊说明外，本发明中涉及到的化学试剂均通过商业渠道购买。
实施例1：本实施例提供了一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1) 脐带的分离；
(2) 组织块的冻存；
(3) 组织块的复苏；
(4) 原代培养；
(5) 传代培养。
所述步骤(1)的脐带的分离方法，包括以下步骤：
(11) 胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，用含有1wt%双抗和250 μg/mL两性霉素的D-Hank’s液浸泡2 min并充分冲洗脐带，用20 mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血；
(12) 使用高温灭菌并冷却的眼科剪沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成3 cm的小段，小心去除两条动脉和一条静脉，然后剪碎至1mm3大小的组织块。
所述步骤(2)的组织块的冻存方法，包括以下步骤：
(21) 将步骤(12)所得组织块浸入8℃的冻存保护液中10 min后分装到2 mL的冻存管中；所述冻存保护液为基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂按3 mL:7 mL:1 g的比例混合而成；所述基础液为磷酸盐缓冲液PBS和生理盐水按照1:1的体积比混合均匀而成；所述渗透性冷冻保护剂为乙二醇；所述非渗透性冷冻保护剂为甘露醇；
(22) 将步骤(21)所述冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，20 h后将冻存管转移至液氮罐内保存。
所述步骤(3)的组织块的复苏方法，包括以下步骤：
(31) 将步骤(22)所述装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻5min，将脐带组织块经生理盐水洗涤5次后获得复苏的组织块。
所述步骤(4)的原代培养方法，包括以下步骤：
(41) 将步骤(31)所得复苏的组织块接种到10 cm的培养皿中，每个皿1 g组织，放置于5% CO2、37℃培养箱内，静置2 h后每皿添加12 mL完全培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5% CO2培养箱进行培养；
(42) 72 h后，每皿补加3 mL完全培养基，之后每72 h进行换液，去除旧培养基，保留组织块，添加10 mL新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，第14天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10mL新鲜培养基，得到P0代脐带间充质干细胞。
所述步骤(5)的传代培养方法，包括以下步骤：
(51) 待P0代脐带间充质干细胞长至细胞融合90%后，去除旧培养基，使用室温的PBS洗去皿内残留的培养基，PBS的量为0.04 mL/cm2，弃去PBS，加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA，加入量为0.02 mL/cm2，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，置于培养箱内消化100 s，得到细胞消化液；
(52) 用8倍于步骤(51)所述0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA体积的完全培养基终止消化，转移到离心管内，配平后室温300 g离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，5mL吸管混匀，得到细胞混悬液；
(53) 采用细胞计数仪对步骤(52)所得细胞混悬液进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，传代密度为8000 cells/cm2，得到P1代脐带间充质干细胞，待P1代脐带间充质干细胞长至细胞融合90%后可继续传代，P1代细胞传代可得P2代细胞，依次扩增；
(54) 传代后标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复6次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5% CO2的培养箱内培养。
所述完全培养基的制备方法为：向lonza Ultra CULTURE MEDIUM无血清培养基中加入以下组分：PALL血清替代物5v/v%、L-谷氨酰胺2 mM、重组人白蛋白0.8 g/L、1×NEAA、细胞生长调节剂25 mg/L、稳定剂20 mg/L、黄芪甲苷10 mg/L、当归内酯12 mg/L、丹参多酚酸2 mg/L、银杏黄酮8 mg/L。
所述细胞生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
(411) 将猪肝除去非肝组织，洗净、粉碎制成初始肝浆，加入初始肝浆重量60%的去离子水混匀，再加入1 mol/L的盐酸溶液调节pH值为4.8，得到调酸肝浆，将调酸肝浆搅拌加热至95℃，保温40 min后，停止加热，得到固液混合物；
(412) 将步骤(411)所制得的固液混合物1000 r/min离心3 min，得到上清液和沉淀，将上清液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，静置5 h分层，取上层物质，得到油状物；
(413) 将步骤(412)所得沉淀与无水乙醇按照1:3的质量比混合均匀，150 W超声1h，过滤后将滤液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，得到膏状物，将步骤B所得油状物与膏状物按照1:1的质量比混合均匀，得到反应混合物A；
(414) 将反应混合物A与无水乙醇按照1 g:20 mL的比例混合均匀，加入N,N-二甲基甲酰胺，反应混合物A与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为4:1，室温下120 rpm搅拌18 h，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，得到反应混合物B；
(415) 将反应混合物B按照1 g:10 mL的比例溶解在氯仿中，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH至4.2，60℃下120 rpm搅拌12 h，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为7，离心去上清，丙酮洗涤，在四氢呋喃中重结晶，抽滤，依次用乙醇、去离子水洗涤3次，紫外灭菌3 h，冷冻干燥，制得细胞生长调节剂。
所述稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(416) 取鼠尾草的根茎洗净干燥后研磨，过60目筛，与96vol%的乙醇溶液按照1g:20 mL的比例混合均匀，150 W超声2 h后过滤，将滤液与聚酰胺凝胶按照1:5的体积比混合，搅拌2 h后过滤，加入到无水乙醇中，120 W超声50 min，得到反应混合液①；
(417) 将步骤(416)所得反应混合液①离心后取上清液，与丙二醇甲醚醋酸酯按照1:1.2的质量比混合，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，喷雾干燥，紫外灭菌3 h，制得稳定剂。
实施例2：本实施例提供了一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1) 脐带的分离；
(2) 组织块的冻存；
(3) 组织块的复苏；
(4) 原代培养；
(5) 传代培养。
所述步骤(1)的脐带的分离方法，包括以下步骤：
(11) 胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，用含有1wt%双抗和250 μg/mL两性霉素的D-Hank’s液浸泡2 min并充分冲洗脐带，用20 mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血；
(12) 使用高温灭菌并冷却的眼科剪沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2 cm的小段，小心去除两条动脉和一条静脉，然后剪碎至1mm3大小的组织块。
所述步骤(2)的组织块的冻存方法，包括以下步骤：
(21) 将步骤(12)所得组织块浸入2℃的冻存保护液中5 min后分装到2 mL的冻存管中；所述冻存保护液为基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂按3 mL:7 mL:1g的比例混合而成；所述基础液为磷酸盐缓冲液PBS和生理盐水按照1:1的体积比混合均匀而成；所述渗透性冷冻保护剂为二甲基亚砜；所述非渗透性冷冻保护剂为蔗糖；
(22) 将步骤(21)所述冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，8 h后将冻存管转移至液氮罐内保存。
所述步骤(3)的组织块的复苏方法，包括以下步骤：
(31) 将步骤(22)所述装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2min，将脐带组织块经磷酸盐缓冲液PBS洗涤1次后获得复苏的组织块。
所述步骤(4)的原代培养方法，包括以下步骤：
(41) 将步骤(31)所得复苏的组织块接种到10 cm的培养皿中，每个皿0.5 g组织，放置于5% CO2、37℃培养箱内，静置1 h后每皿添加12 mL完全培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5% CO2培养箱进行培养；
(42) 72 h后，每皿补加3 mL完全培养基，之后每72 h进行换液，去除旧培养基，保留组织块，添加10 mL新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，第12天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10mL新鲜培养基，得到P0代脐带间充质干细胞。
所述步骤(5)的传代培养方法，包括以下步骤：
(51) 待P0代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%后，去除旧培养基，使用室温的PBS洗去皿内残留的培养基，PBS的量为0.04 mL/cm2，弃去PBS，加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA，加入量为0.02 mL/cm2，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，置于培养箱内消化90 s，得到细胞消化液；
(52) 用8倍于步骤(51)所述0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA体积的完全培养基终止消化，转移到离心管内，配平后室温300 g离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，5mL吸管混匀，得到细胞混悬液；
(53) 采用细胞计数仪对步骤(52)所得细胞混悬液进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，传代密度为6000 cells/cm2，得到P1代脐带间充质干细胞，待P1代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%后可继续传代，P1代细胞传代可得P2代细胞，依次扩增；
(54)传代后标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复4次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5% CO2的培养箱内培养。
所述完全培养基的制备方法为：向lonza Ultra CULTURE MEDIUM无血清培养基中加入以下组分：PALL血清替代物5v/v%、L-谷氨酰胺2 mM、重组人白蛋白0.8 g/L、1×NEAA、细胞生长调节剂25 mg/L、稳定剂20 mg/L、黄芪甲苷10 mg/L、当归内酯12 mg/L、丹参多酚酸2 mg/L、银杏黄酮8 mg/L。
所述细胞生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
(411) 将猪肝除去非肝组织，洗净、粉碎制成初始肝浆，加入初始肝浆重量50%的去离子水混匀，再加入1 mol/L的盐酸溶液调节pH值为4.2，得到调酸肝浆，将调酸肝浆搅拌加热至90℃，保温40 min后，停止加热，得到固液混合物；
(412) 将步骤(411)所制得的固液混合物1000 r/min离心3 min，得到上清液和沉淀，将上清液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，静置4 h分层，取上层物质，得到油状物；
(413) 将步骤(412)所得沉淀与无水乙醇按照1:3的质量比混合均匀，150 W超声1h，过滤后将滤液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，得到膏状物，将步骤B所得油状物与膏状物按照1:1的质量比混合均匀，得到反应混合物A；
(414) 将反应混合物A与无水乙醇按照1 g:20 mL的比例混合均匀，加入N,N-二甲基甲酰胺，反应混合物A与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为4:1，室温下120 rpm搅拌15 h，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，得到反应混合物B；
(415) 将反应混合物B按照1 g:10 mL的比例溶解在氯仿中，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH至3.6，60℃下120 rpm搅拌12 h，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为6，离心去上清，丙酮洗涤，在四氢呋喃中重结晶，抽滤，依次用乙醇、去离子水洗涤3次，紫外灭菌3 h，冷冻干燥，制得细胞生长调节剂。
所述稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(416) 取鼠尾草的根茎洗净干燥后研磨，过60目筛，与80vol%的乙醇溶液按照1g:20 mL的比例混合均匀，150 W超声2 h后过滤，将滤液与聚酰胺凝胶按照1:5的体积比混合，搅拌2 h后过滤，加入到无水乙醇中，120 W超声40 min，得到反应混合液①；
(417) 将步骤(416)所得反应混合液①离心后取上清液，与丙二醇甲醚醋酸酯按照1:1.2的质量比混合，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，喷雾干燥，紫外灭菌3 h，制得稳定剂。
实施例3：本实施例提供了一种间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
(1) 脐带的分离；
(2) 组织块的冻存；
(3) 组织块的复苏；
(4) 原代培养；
(5) 传代培养。
所述步骤(1)的脐带的分离方法，包括以下步骤：
(11) 胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，用含有1wt%双抗和250 μg/mL两性霉素的D-Hank’s液浸泡2 min并充分冲洗脐带，用20 mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血；
(12) 使用高温灭菌并冷却的眼科剪沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2.5 cm的小段，小心去除两条动脉和一条静脉，然后剪碎至1 mm3大小的组织块。
所述步骤(2)的组织块的冻存方法，包括以下步骤：
(21) 将步骤(12)所得组织块浸入6℃的冻存保护液中8 min后分装到2 mL的冻存管中；所述冻存保护液为基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂按3 mL:7 mL:1g的比例混合而成；所述基础液为磷酸盐缓冲液PBS和生理盐水按照1:1的体积比混合均匀而成；所述渗透性冷冻保护剂为甘油；所述非渗透性冷冻保护剂为海藻糖；
(22) 将步骤(21)所述冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，14 h后将冻存管转移至液氮罐内保存。
所述步骤(3)的组织块的复苏方法，包括以下步骤：
(31) 将步骤(22)所述装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻3min，将脐带组织块经生理盐水洗涤3次后获得复苏的组织块。
所述步骤(4)的原代培养方法，包括以下步骤：
(41) 将步骤(31)所得复苏的组织块接种到10 cm的培养皿中，每个皿0.8 g组织，放置于5% CO2、37℃培养箱内，静置1.5 h后每皿添加12 mL完全培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5% CO2培养箱进行培养；
(42) 72 h后，每皿补加3 mL完全培养基，之后每72 h进行换液，去除旧培养基，保留组织块，添加10 mL新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，第13天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10mL新鲜培养基，得到P0代脐带间充质干细胞。
所述步骤(5)的传代培养方法，包括以下步骤：
(51) 待P0代脐带间充质干细胞长至细胞融合85%后，去除旧培养基，使用室温的PBS洗去皿内残留的培养基，PBS的量为0.04 mL/cm2，弃去PBS，加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA，加入量为0.02 mL/cm2，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，置于培养箱内消化95 s，得到细胞消化液；
(52) 用8倍于步骤(51)所述0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA体积的完全培养基终止消化，转移到离心管内，配平后室温300 g离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，5mL吸管混匀，得到细胞混悬液；
(53) 采用细胞计数仪对步骤(52)所得细胞混悬液进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，传代密度为7000 cells/cm2，得到P1代脐带间充质干细胞，待P1代脐带间充质干细胞长至细胞融合85%后可继续传代，P1代细胞传代可得P2代细胞，依次扩增；
(54) 传代后标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复5次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5% CO2的培养箱内培养。
所述完全培养基的制备方法为：向lonza Ultra CULTURE MEDIUM无血清培养基中加入以下组分：PALL血清替代物5v/v%、L-谷氨酰胺2 mM、重组人白蛋白0.8 g/L、1×NEAA、细胞生长调节剂25 mg/L、稳定剂20 mg/L、黄芪甲苷10 mg/L、当归内酯12 mg/L、丹参多酚酸2 mg/L、银杏黄酮8 mg/L。
所述细胞生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
(411) 将猪肝除去非肝组织，洗净、粉碎制成初始肝浆，加入初始肝浆重量55%的去离子水混匀，再加入1 mol/L的盐酸溶液调节pH值为4.5，得到调酸肝浆，将调酸肝浆搅拌加热至92℃，保温40 min后，停止加热，得到固液混合物；
(412) 将步骤(411)所制得的固液混合物1000 r/min离心3 min，得到上清液和沉淀，将上清液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，静置4.5 h分层，取上层物质，得到油状物；
(413) 将步骤(412)所得沉淀与无水乙醇按照1:3的质量比混合均匀，150 W超声1h，过滤后将滤液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，得到膏状物，将步骤B所得油状物与膏状物按照1:1的质量比混合均匀，得到反应混合物A；
(414) 将反应混合物A与无水乙醇按照1 g:20 mL的比例混合均匀，加入N,N-二甲基甲酰胺，反应混合物A与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为4:1，室温下120 rpm搅拌16 h，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，得到反应混合物B；
(415) 将反应混合物B按照1 g:10 mL的比例溶解在氯仿中，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH至4，60℃下120 rpm搅拌12 h，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为6.5，离心去上清，丙酮洗涤，在四氢呋喃中重结晶，抽滤，依次用乙醇、去离子水洗涤3次，紫外灭菌3 h，冷冻干燥，制得细胞生长调节剂。
所述稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(416) 取鼠尾草的根茎洗净干燥后研磨，过60目筛，与90vol%的乙醇溶液按照1g:20 mL的比例混合均匀，150 W超声2 h后过滤，将滤液与聚酰胺凝胶按照1:5的体积比混合，搅拌2 h后过滤，加入到无水乙醇中，120 W超声45 min，得到反应混合液①；
(417) 将步骤(416)所得反应混合液①离心后取上清液，与丙二醇甲醚醋酸酯按照1:1.2的质量比混合，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，喷雾干燥，紫外灭菌3 h，制得稳定剂。
对比例1与实施例1的区别仅在于，不添加细胞生长调节剂。
对比例2与实施例1的区别仅在于，不添加稳定剂。
对比例3与实施例1的区别仅在于，黄芪甲苷、当归内酯、丹参多酚酸、银杏黄酮的用量分别为1 mg/L、2 mg/L、0.1 mg/L和0.5 mg/L。
实验例1： 将实施例1培养出的P2代间充质干细胞置于倒置显微镜下拍照，细胞形状为短梭形，大小均一，排列整齐，如图1所示。
实验例2：待实施例2的P3代脐带间充质干细胞生长至80%融合时，用0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化后，加入等量完全培养基终止消化，使用PBS缓冲溶液洗涤1次，250 g离心5 min，用含4% FBS的DPBS重悬细胞，调整细胞密度为1.5×106个细胞/mL，按照每管100μL的量分装14支，各管依次添加荧光素标记的CD90、CD73、CD45、CD34、HLA-DR、CD19和CD105抗体及其同型对照各10 μL，振荡混匀，避光4℃孵育30 min，1500 rpm离心5 min去除上清，添加PBS 2 mL洗涤2次，每管加入1wt%多聚甲醛200 μL，震荡混匀，4℃避光放置，24 h内上机，FACS Calibur流式细胞仪检测，Cell Quest软件进行表型分析。检测细胞表面标志物的阳性比率，结果如图2和表1所示。
表1 脐带间充质干细胞表面标志物流式细胞检测结果
图2和表1结果显示，采用本发明培养方法培养得到的P3代脐带间充质干细胞的CD105和CD90表达量高于99%，CD73、CD45、CD34、CD19和HLA-DR的表达量低于1.5%，显示脐带间充质干细胞的属性，具有MSCs的特征，且纯度较高。
实验例3：将实施例3和对比例1-3的P6代脐带间充质干细胞按照实验例2的方法进行细胞表面标志物的流式细胞仪检测，结果如表2所示。
表2 脐带间充质干细胞表面标志物流式细胞检测结果
表2结果显示，采用本发明的培养方法传代培养得到的P6代羊膜间充质干细胞的CD105和CD90的表达量高于90%，CD73、CD45、CD34、CD19和HLA-DR低于1%，说明采用本发明培养方法培养得到的P6代羊膜间充质干细胞继续保持间充质干细胞的特性。与对比例1-3的结果相比，实施例3的流式结果更优。
实验例4：取实施例1和对比例1-3制备好的P2代间充质干细胞，消化至单细胞悬液，以相应的完全培养基调整浓度至1×104个细胞/mL，加入96孔板中，每孔200 μL，置于37℃、含5%的CO2、饱和湿度的培养箱中培养，每2天换液，分别在培养1 d、3 d、5 d、7 d后，每孔加20 μL浓度为5 mg/mL的噻唑蓝(MTT)，继续培养，4 h后小心移去培养上清，每孔加入100 μL的二甲基亚砜，微量振荡器震荡5 min，置酶标仪上测450 nm处的吸光值，每个样本做6个重复，统计学分析后绘制出生长曲线，结果如图3所示。
由图3结果可以看出，实施例1细胞保持旺盛的增殖能力，增殖曲线变化不明显，细胞增殖速度更快，未见增殖减缓等衰老现象，并且能够稳定地增殖传代。而对比例1-3表现出明显的增殖减缓现象。说明本发明培养方法可以促进细胞增殖。
实验例5：取实施例2和对比例1-3制备好的P1代细胞，消化至单细胞悬液，以8000cells/cm2的密度接种，传代至P5代时收获细胞，使用贝克曼库尔特Vi-CELLXR计数仪检测P5代细胞直径分布情况，根据统计结果得到不同实施例和对比例中人脐带间充质干细胞的直径数据，结果如表3所示。
表3 P5代细胞直径分布情况
表3结果显示，实施例2的培养条件下人脐带间充质干细胞直径均一性更好，而对比例1-3培养的间充质干细胞培养过程中容易出现较多直径较大的细胞，细胞均一性较差，长期培养过程中更容易发生老化和分化。
实验例6：消化收集实施例3的P0代间充质干细胞，采用PBS重悬制成2.5 mL密度为1×107cell/mL的细胞悬液。利用来自健康捐赠者的细胞，采用淋巴分离液分离人外周血中的淋巴细胞，制备了PBMC，计数，用实施例3的完全培养基以1×106cell/mL密度悬浮，接种于6孔板，每孔2 mL，每组3个复孔，依次加入200 μL PBS、20 μL细胞悬液，作为PBMC+MSC组，PBMC与MSC的比例为10:1；同时设置不添加细胞悬液的PBMC组作为对照组；另将实施例3的P0代间充质干细胞用实施例3的完全培养基以1×106cell/mL密度悬浮，接种于6孔板，每孔2 mL，每组3个复孔，依次加入200 μL PBS，作为MSC组。置于37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养3天后收集细胞，取培养基上清，采用TNF-α、IL-6和IL-10的ELISA试剂盒检测其中的含量，结果如图4所示。
图4结果显示，MSC自身会分泌较高浓度的IL-6，PBMC不会分泌IL-6，共培养后，IL-6的分泌量增多，PBMC和MSC共培养后，IL-10的分泌量也显著增多，从而促进免疫调节；PBMC和MSC共培养后，上清液中TNF-α含量下降，MSC能够明显抑制PBMC 分泌TNF-α 能力。表明本发明培养的间充质干细胞具有免疫调节作用。
将PBMC用完全培养基以1×106cell/mL的密度悬浮，接种于6孔板，每孔2 mL，再加入200 μL PBS和10 μg PHA，作为PBMC+PHA组，即对照组；另设置两组实验组：将MSC和PBMC以1:5的比例共培养，加入10 μg PHA，作为MSC+PBMC+PHA(1:5)组；将MSC和PBMC以1:10的比例共培养，加入10 μg PHA，作为MSC+PBMC+PHA(1:10)组。置于37℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱中培养3天后收集细胞，采用流式细胞术检测Th1和Th17的比例，根据抑制率计算公式计算出Th1和Th17的抑制率，其公式为：抑制率(%)＝(1-实验组比例/对照组比例)×100%，结果如图5和表4所示。
表4 Th1和Th17细胞抑制率
图5和表4结果显示，经过3 天的共培养，Th1和Th17细胞占比均显著下降，表明本发明培养的间充质干细胞可以抑制Th1和Th17细胞的增殖，具有免疫调节活性。
实验例7：设置PBMC单独培养组，和PBMC和MSC按照10:1的比例共培养组，培养方法同实验例6，3天后收集细胞用流式细胞仪检测Treg细胞占比，结果如图6和表5所示。
表5 Treg细胞占比
图6和表5结果显示，共培养后Treg细胞占比明显上升，表明本发明培养的间充质干细胞可以促进Treg细胞的分化，激活Treg细胞，具有免疫调节活性。
实验例8：将PBMC与间充质干细胞进行共培养，并使用基于羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)染料的流式细胞术分析PBMC增殖。首先将CFSE标记的PBMC与MSC细胞在圆底24孔板中分别以2.5×105:1×105、5×105:1×105和1×106:1×105细胞/mL的密度(即2.5:1、5:1和10:1的比例)共培养3天，同时设置PBMC以2.5×105、5×105和1×106细胞/mL的密度培养的对照组，即PBMC 2.5、PBMC 5和PBMC 10组。使用BD FacsCanto II Plus仪器（BDBiosciences)通过CD3阳性细胞的CFSE染料稀释测定PBMC增殖。使用FlowJov.10软件（Treestar,Inc.Ashland,OR）分析流式细胞仪数据。结果如图7所示，MSC促进了PBMC的增殖。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于包括以下步骤：
(1) 脐带的分离；
(2) 组织块的冻存；
(3) 组织块的复苏；
(4) 原代培养；
(5) 传代培养；
所述步骤(1)的脐带的分离方法，包括以下步骤：
(11) 胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐截取脐带，用生理盐水冲洗脐带，再用医用酒精消毒，用含有1wt%双抗和250 μg/mL两性霉素的D-Hank’s液浸泡2 min并充分冲洗脐带，用20 mL注射器冲洗脐静脉和脐动脉内的残存积血；
(12) 使用高温灭菌并冷却的眼科剪沿脐带结扎内侧剪断，加入适量的生理盐水清洗至表面无血渍后将脐带剪成2-3 cm的小段，小心去除两条动脉和一条静脉，然后剪碎至1mm3大小的组织块；
所述步骤(2)的组织块的冻存方法，包括以下步骤：
(21) 将步骤(12)所得组织块浸入2-8℃的冻存保护液中5-10 min后分装到2 mL的冻存管中；
(22) 将步骤(21)所述冻存管置于程序降温盒中，放入-80℃冰箱，8-20 h后将冻存管转移至液氮罐内保存；
步骤(21)所述冻存保护液包括基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂；所述基础液、渗透性冷冻保护剂、非渗透性冷冻保护剂的用量比为3 mL:7 mL:1 g；所述基础液为磷酸盐缓冲液PBS和生理盐水按照1:1的体积比混合均匀而成；所述渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜、乙二醇、丙二醇、甘油中的一种或几种组合；所述非渗透性冷冻保护剂包括蔗糖、甘露醇、海藻糖中的一种或几种的组合；
所述步骤(3)的组织块的复苏方法，包括以下步骤：
(31) 将步骤(22)所述装有冻存的脐带组织块的冻存管于37℃水浴锅中解冻2-5 min，将脐带组织块经复苏缓冲液洗涤1-5次后获得复苏的组织块；所述复苏缓冲液包括磷酸盐缓冲液PBS、生理盐水、蔗糖、海藻糖、甘露醇中的一种或几种的组合；
所述步骤(4)的原代培养方法，包括以下步骤：
(41) 将步骤(31)所得复苏的组织块接种到10 cm的培养皿中，每个皿0.5-1 g组织，放置于5% CO2、37℃培养箱内，静置1-2 h后每皿添加12 mL完全培养基，轻晃培养皿使细胞及组织块分布均匀，37℃、5% CO2培养箱进行培养；
(42) 72 h后，每皿补加3 mL完全培养基，之后每72 h进行换液，去除旧培养基，保留组织块，添加10 mL新鲜培养基，晃动使组织块均匀分布于皿内，此后每天晃动一次培养基和组织块，使爬出的细胞均匀分布皿内，第12-14天，弃去旧培养基和组织块，旧皿中添加10mL新鲜培养基，得到P0代脐带间充质干细胞；
所述步骤(5)的传代培养方法，包括以下步骤：
(51) 待P0代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%-90%后，去除旧培养基，使用室温的PBS洗去皿内残留的培养基，PBS的量为0.04 mL/cm2，弃去PBS，加入0.25%胰蛋白酶-0.01%EDTA，加入量为0.02 mL/cm2，轻轻晃动培养皿使消化酶均匀覆盖皿底，置于培养箱内消化90-100 s，得到细胞消化液；
(52) 用8倍于步骤(51)所述0.25%胰蛋白酶-0.01% EDTA体积的完全培养基终止消化，转移到离心管内，配平后室温300 g离心5min，弃上清，加入完全培养基重悬细胞，5 mL吸管混匀，得到细胞混悬液；
(53) 采用细胞计数仪对步骤(52)所得细胞混悬液进行细胞计数，根据细胞计数进行接种，传代密度为6000-8000 cells/cm2，得到P1代脐带间充质干细胞，待P1代脐带间充质干细胞长至细胞融合80%-90%后可继续传代，P1代细胞传代可得P2代细胞，依次扩增；
(54) 传代后标记细胞类型、代数、传代日期，以十字方向轻柔滑动培养皿，重复4-6次，以使细胞分布均匀，将培养皿小心转移到37℃，5% CO2的培养箱内培养。
2. 根据权利要求1所述的一种间充质干细胞的培养方法，其特征在于，所述完全培养基为向lonza Ultra CULTURE MEDIUM无血清培养基中加入以下组分：PALL血清替代物5v/v%、L-谷氨酰胺2 mM、重组人白蛋白0.8 g/L、1×NEAA、细胞生长调节剂25 mg/L、稳定剂20mg/L、黄芪甲苷10 mg/L、当归内酯12 mg/L、丹参多酚酸2 mg/L、银杏黄酮8 mg/L；
所述细胞生长调节剂的制备方法，包括以下步骤：
(411) 将猪肝除去非肝组织，洗净、粉碎制成初始肝浆，加入初始肝浆重量50-60%的去离子水混匀，再加入1 mol/L的盐酸溶液调节pH值为4.2-4.8，得到调酸肝浆，将调酸肝浆搅拌加热至90-95℃，保温40 min后，停止加热，得到固液混合物；
(412) 将步骤(411)所制得的固液混合物1000 r/min离心3 min，得到上清液和沉淀，将上清液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，静置4-5 h分层，取上层物质，得到油状物；
(413) 将步骤(412)所得沉淀与无水乙醇按照1:3的质量比混合均匀，150 W超声1 h，过滤后将滤液0.001 MPa、60℃下浓缩至原体积的10%，得到膏状物，将步骤B所得油状物与膏状物按照1:1的质量比混合均匀，得到反应混合物A；
(414) 将反应混合物A与无水乙醇按照1 g:20 mL的比例混合均匀，加入N,N-二甲基甲酰胺，反应混合物A与N,N-二甲基甲酰胺的质量比为4:1，室温下120 rpm搅拌15-18 h，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，得到反应混合物B；
(415) 将反应混合物B按照1 g:10 mL的比例溶解在氯仿中，用1 mol/L的盐酸溶液调节pH至3.6-4.2，60℃下120 rpm搅拌12 h，用1 mol/L的氢氧化钠溶液调节pH为6-7，离心去上清，丙酮洗涤，在四氢呋喃中重结晶，抽滤，依次用乙醇、去离子水洗涤3次，紫外灭菌3 h，冷冻干燥，制得细胞生长调节剂；
所述稳定剂的制备方法，包括以下步骤：
(416) 取鼠尾草的根茎洗净干燥后研磨，过60目筛，与80-96vol%的乙醇溶液按照1 g:20 mL的比例混合均匀，150 W超声2 h后过滤，将滤液与聚酰胺凝胶按照1:5的体积比混合，搅拌2 h后过滤，加入到无水乙醇中，120 W超声40-50 min，得到反应混合液①；
(417) 将步骤(416)所得反应混合液①离心后取上清液，与丙二醇甲醚醋酸酯按照1:1.2的质量比混合，0.001 MPa、60℃下减压浓缩3 h，喷雾干燥，紫外灭菌3 h，制得稳定剂。
3.根据权利要求1-2任一项所述的一种间充质干细胞的培养方法制备的间充质干细胞在调节免疫和促进细胞增殖方面的应用，其特征在于，包括以下步骤：将间充质干细胞与PBMC共培养。
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Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006311814A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Olympus Corp | 間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法 |
| US20100323027A1 (en) * | 2005-09-02 | 2010-12-23 | Agency For Science, Technology And Research | Mesenchymal stem cell conditioned medium |
| CN105238750A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种复苏脐带间充质干细胞的方法 |
| WO2017096618A1 (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 郭镭 | 一种从脐带外层羊膜组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法 |
| CN111172106A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-19 | 广州益养生物科技有限公司 | 一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法 |
| CN111690601A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-22 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法 |
| CN113005078A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-06-22 | 南京鼓楼医院 | 一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用 |
| EP4083186A1 (en) * | 2019-12-27 | 2022-11-02 | Bourbon Corporation | Cell growth regulator |
| CN116555178A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-08-08 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 冻存脐带血单个核细胞的分离方法及应用 |
| CN117210399A (zh) * | 2023-09-21 | 2023-12-12 | 无锡优纳尔特生物科技有限公司 | 一种脐带血间充质干细胞的培养方法 |
-
2024
- 2024-02-01 CN CN202410141776.9A patent/CN117701500B/zh active Active
Patent Citations (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2006311814A (ja) * | 2005-05-09 | 2006-11-16 | Olympus Corp | 間葉系幹細胞の培養方法および生体組織補填体の製造方法 |
| US20100323027A1 (en) * | 2005-09-02 | 2010-12-23 | Agency For Science, Technology And Research | Mesenchymal stem cell conditioned medium |
| CN105238750A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-13 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种复苏脐带间充质干细胞的方法 |
| WO2017096618A1 (zh) * | 2015-12-11 | 2017-06-15 | 郭镭 | 一种从脐带外层羊膜组织中分离培养脐带间充质干细胞的方法 |
| EP4083186A1 (en) * | 2019-12-27 | 2022-11-02 | Bourbon Corporation | Cell growth regulator |
| CN111172106A (zh) * | 2020-01-16 | 2020-05-19 | 广州益养生物科技有限公司 | 一种从人胎盘或脐带中提取间充质干细胞及提取其分泌物的方法 |
| CN111690601A (zh) * | 2020-06-08 | 2020-09-22 | 海南优尼科尔生物科技有限公司 | 一种脐带间充质干细胞制剂的制备方法 |
| CN113005078A (zh) * | 2021-03-17 | 2021-06-22 | 南京鼓楼医院 | 一种筛选优质人脐带间充质干细胞免疫调节能力干细胞量化标准的构建方法及应用 |
| CN116555178A (zh) * | 2023-06-20 | 2023-08-08 | 协和干细胞基因工程有限公司 | 冻存脐带血单个核细胞的分离方法及应用 |
| CN117210399A (zh) * | 2023-09-21 | 2023-12-12 | 无锡优纳尔特生物科技有限公司 | 一种脐带血间充质干细胞的培养方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 李江涛等: "间充质干细胞治疗慢性重症乙型肝炎临床分析", 《中外医疗》, vol. 31, no. 3, 31 January 2012 (2012-01-31), pages 107 * |
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