CN115478077A - 一种manf基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，涉及滚塑技术领域，包括以下步骤：S1、原始胚胎干细胞的获取；S2、细胞转染；S3、细胞观察；S4、细胞鉴定；S5、细胞储存。该MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，利用MANF基因载体使得脐带间充质干细胞转染表达为脐带间充质干细胞，该脐带间充质干细胞制备过程中经过传代培养并经由细胞鉴定将无损的细胞留置保存，使得脐带间充质干细胞活性高效用强，由于脐带间充质干细胞源自脐带兼具胚胎干细胞和成体于细胞的遗传和行为特征细胞采集不对采集者造成伤害，同时迁移到新环境下，对环境刺激更敏感适应性，因为脐带间充质干细胞具有较低的免疫，移植后不会引起宿主的免疫防御。
Description
技术领域
本发明涉及干细胞制备技术领域，具体为一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用。
背景技术
干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。多年来对干细胞的定义不断进行修正，并从不同的层面上来进行定义，间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSC)是一类具有自我更新和多向分化潜能的种子细胞，在不同的诱导条件下不仅能够分化形成骨、软骨、脂肪、肌肉等中胚层的细胞，还能跨胚层分化形成外胚层的神经元、神经胶质细胞、皮肤细胞以及内胚层的血管内皮细胞等多种组织细胞。除具有多向分化潜能外，MSC还可分泌多种细胞因子，MSC通过旁分泌的形式分泌EGF、KGF、VEGF、促血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)、bFGF、IGF-1、Wnt1/3A/5A、HGF、PDGF-BB和EPO等众所周知能促进血管生成、促进组织细胞生物合成及能量代谢的细胞活性物质，其还可加强创面愈合。另外，这些因子可对调节表皮及上皮细胞生长、分化增殖、促进毛细血管生长、改善生长微环境、保持细胞活性等方面起着重要作用。文献报道，极微量的EGF、FGF即能强烈促进皮肤细胞的分裂和生长，从而达到促进人皮肤的新陈代谢、促进再生修复、减缓皮肤衰老，使皮肤重新恢复弹性和光泽。
目前，打干细胞针已经受到越来越多人的青睐，因为是通过输注特定的多种细胞的形式来激活人体自身的“自愈”功能。干细胞技术近年来发展迅速，因其在疾病治疗、组织修复、抗衰美容等多方面极具发展潜力和临床应用价值，而成为生命科学领域的重要方向之一，吸引了全球范围的广泛关注。
现有的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备常常因为干细胞在体外培养容易自然失去干细胞的基本特性，同时还需要维持细胞干性，为此，我们提出一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，解决了上述背景技术中提出的现有的MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备常常因为干细胞在体外培养容易自然失去干细胞的基本特性，同时还需要维持细胞干性的问题。
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现、一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，包括以下步骤：
S1、原始胚胎干细胞的获取
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；
S2、细胞转染
构建MANF基因载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；
S3、细胞观察
接着将培养皿中取1ml细胞液，加入1ml混合液体，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续传代培养，经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；
S4、细胞鉴定
利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中；
S5、细胞储存
将S4步骤中得到的细胞置于培养液中，并对细胞进行降温，最后细胞置于-196℃的液氮中保存。
进一步的，所述在步骤S1原始胚胎干细胞的获取过程中用胰酶提取足月产胎儿脐带组织中充质干细胞悬液离心10min，弃上清液。
进一步的，所述在步骤S2细胞转染过程中MANF基因载体为慢病毒载体。
进一步的，所述在步骤细S3细胞观察过程中为了防止细菌污染按细胞培养体系要求在培养皿中添加双抗；
进一步的，所述在步骤细S3细胞观察过程中1ml混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能。
本发明提供了一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，具备以下有益效果：该MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，利用MANF基因载体使得脐带间充质干细胞转染表达为脐带间充质干细胞，该脐带间充质干细胞制备过程中经过传代培养并经由细胞鉴定将无损的细胞留置保存，使得脐带间充质干细胞活性高效用强，由于脐带间充质干细胞源自脐带兼具胚胎干细胞和成体于细胞的遗传和行为特征细胞采集不对采集者造成伤害，同时迁移到新环境下，对环境刺激更敏感适应性，因为脐带间充质干细胞具有较低的免疫，移植后不会引起宿主的免疫防御，以脐带间充质干细胞为基准将其应用于美容行业，可以明显改善肤质、淡斑祛皱、恢复皮肤弹，增强免疫调节代谢。
具体实施方式
一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，包括以下步骤：
S1、原始胚胎干细胞的获取
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；
S2、细胞转染
构建MANF基因载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；
在步骤S2细胞转染过程中MANF基因载体为慢病毒载体；
S3、细胞观察
接着将培养皿中取1ml细胞液，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续传代培养，经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；
S4、细胞鉴定
利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中；
S5、细胞储存
将S4步骤中得到的细胞置于培养液中，并对细胞进行降温，最后细胞置于-196℃的液氮中保存。
具体实施例一
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，接着将取出1ml的干细胞液放入新的培养皿中并加入慢病毒载体的质粒溶液并轻轻摇匀，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装，最后对的得到的脐带间充质干细胞进行传代培养，利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中，观察次实施例中脐带间充质干细胞生长有无异常，利用显微镜能够看出有细胞分化较低。
具体实施例二
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，接着将取出1ml的干细胞液放入新的培养皿中并加入以MANF基因慢病毒载体的质粒溶液并轻轻摇匀，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，最后对的得到的经过MANF基因修饰的脐带间充质干细胞进行传代培养，利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中，观察次实施例中脐带间充质干细胞生长有无异常。
具体实施例三
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，接着将取出1ml的干细胞液放入新的培养皿中并加入以MANF基因慢病毒载体的质粒溶液并轻轻摇匀，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，最后对的得到的经过MANF基因修饰的脐带间充质干细胞进行传代培养，利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中，观察次实施例中脐带间充质干细胞生长有无异常，采用随机分组方法，将30只大鼠随机分成脐带间充质干细胞与MANF基因修饰的脐带间充质干细胞两组，同时将两组大鼠在实验前均禁食12h，然后将麻醉后的大鼠切开进腹，随后仔细分离出大鼠的门静脉，用注射器将脐带间充质干细胞与MANF基因修饰的脐带间充质干细胞分别经大鼠门静脉注射，在止血后逐层缝合切口，然后常规饲养并在饲养的过程中观察大鼠随后用流动式细胞仪检测大鼠细胞中转染率与死亡率，经记录在分别在注射后的第八天与第十三天各有大鼠死亡，接着将大鼠内脏取出，肝脏，做成冰冻切片,在荧光显微镜下观察，切片捣肝脏，做成冰冻切片，在荧光显微镜下观察.切片捣碎、离心成悬液，用20g/L多聚甲醛固定10min，流式细胞仪检测标记细胞百分比；再加人AnnexinV凋亡试剂检测坏死细胞百分比，比较两种方法在活体内转染效率和凋亡率，由此能够得出MANF基因修饰的脐带间充质干细胞的转染效率明显大于脐带间充质干细胞的转染效率，对比实施例一与实施例二即可得知经过MANF基因修饰的脐带间充质干细胞能够分化呈成熟的细胞，由此能够得到经过MANF基因修饰的脐带间充质干细胞能够增强细胞的分化。
具体实施例四
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，接着将取出1ml的干细胞液放入新的培养皿中并加入以MANF基因慢病毒载体的质粒溶液并轻轻摇匀，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，最后对的得到的经过MANF基因修饰的脐带间充质干细胞进行传代培养，利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中，观察次实施例中脐带间充质干细胞生长有无异常，然后取MANF基因修饰的脐带间充质干细胞作为技术及支持，将其利用医学加入甘草黄酮、谷胱甘肽、左旋VCVitaminC和传明酸等混合；将再次采用随机分组方法，将30只大鼠随机分成空白组与MANF基因修饰的脐带间充质干细胞两组，接着将两组大鼠分别放置于培养仓中正常饲养，随后利用注射器采用静脉注射的方式将还含有MANF基因修饰的脐带间充质干细胞的美容针溶液注射进大鼠体内，随后利用医学观测观察大鼠的生命特征以及体貌状态，待30天后观察两组大鼠有无明显体态上的变化，能够得出注射MANF基因修饰的脐带间充质干细胞的大鼠毛发具有光泽度，随后随机去两组大鼠组织，接着将大鼠组织剪碎成1mm3左右的组织块，然后在取组织块加入生理盐水混合利用显微镜观察细胞装状态，经过对比注射MANF基因修饰的脐带间充质干细胞的大鼠的细胞老化程度小于正常大鼠细胞，由此能够得出脐带间充质干细胞具有较低的免疫，移植后不会引起宿主的免疫防御，疫原性,移植后并不会引起宿主的免疫防御，MANF基因修饰的脐带间充质干细胞，经过持续的观察可得知干细胞激活基底细胞，持续分泌胶原蛋白，填充组织缺失部分或者皱纹凹陷处，强力除皱功能，同时通过促进皮肤细胞代谢、分泌大量细胞因子、清除自由基、沉积脂褐素等物质，淡化和去除局部污渍，经MANF基因修饰的脐带间充质干细胞分化能力更强，由此能够得出脐带间充质干细胞具有较低的免疫，移植后不会引起宿主的免疫防御，疫原性,移植后并不会引起宿主的免疫防御，同时在活体大鼠体内进行，并且是异种异体移植,研究是在活体大鼠体内进行，并且是异种异体移植，干细胞所处的环境差异大，区别于一般条件下的体外实验.但仍不引起大鼠明显异常，无撕咬、饮食及、生活习性正常。
综上，该MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，使用时MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用包括以下具体步骤：
S1、原始胚胎干细胞的获取：首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；
S2、细胞转染：接着构建MANF基因慢病毒载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；
S3、细胞观察：随后将S2步骤中培养皿中取1ml细胞液，加入1ml混合液体，该混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续传代培养，经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；
S4、细胞鉴定：利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中；
S5、细胞储存：将S4步骤中得到的细胞置于培养液中，并对细胞进行降温，最后置于将细胞-196℃的液氮中保存。
Claims (5)
1.一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，其特征在于，包括以下步骤：
S1、原始胚胎干细胞的获取
首先取得足月产胎儿脐带组织，接着将脐带组织剪碎成1mm3左右的组织块，并将组织块接种于培养皿中加入培养液，待组织块贴壁后再补充培养液继续培养，其中的干细胞可沿组织块周围长出，然后去除组织块并进行传代扩增获得大量干细胞，使得同一组织块可进行反复培育，用酶原梯度法分离并收集细胞将细胞接种在培养皿中；
S2、细胞转染
构建MANF基因载体，将MANF基因载体用PBS缓冲液10％铺在S1步骤中取得的细胞中，使得细胞在培养皿中进行细胞转染；
S3、细胞观察
接着将培养皿中取1ml细胞液，加入1ml含有脂质体和质粒的混合物，10h后去除复合物的培养基，加入培养液，待48h后，经过滤膜过滤即可等得到含有病毒的上清液，完成慢病毒的包装利用病毒感染干细胞，并利用荧光显微镜观察干细胞的转染效果继续传代培养，经过转染的脐带间充质干细胞即可得到MANF基因修饰的脐带间充质干细胞；
S4、细胞鉴定
利用显微镜用荧光对细胞的生长、表型、核型、细胞周期以及分化潜能进行分析鉴定，将细胞中活性强的细胞单独放置在培养皿中；
S5、细胞储存
将S4步骤中得到的细胞置于培养液中，并对细胞进行降温，最后细胞置于-196℃的液氮中保存。
2.根据权利要求1所述的一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，其特征在于：所述在步骤S1原始胚胎干细胞的获取过程中用胰酶提取足月产胎儿脐带组织中充质干细胞悬液离心10min，弃上清液。
3.根据权利要求1所述的一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，其特征在于：所述在步骤S2细胞转染过程中MANF基因载体为慢病毒载体。
4.根据权利要求1所述的一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，其特征在于：所述在步骤细S3细胞观察过程中为了防止细菌污染按细胞培养体系要求在培养皿中添加双抗。
5.根据权利要求1所述的一种MANF基因修饰的脐带间充质干细胞制备与应用，其特征在于：所述在步骤细S3细胞观察过程中1ml混合液体由胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸、β-巯基乙醇、白血病抑制因子(LIF)、干细胞因子(SCF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)构成，其中白血病抑制因子(LIF)具有抑制干细胞分化的功能。
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| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |