CN103243119A

CN103243119A - 可溶性cd83的表达和制备方法

Info

Publication number: CN103243119A
Application number: CN2013101879153A
Authority: CN
Inventors: 肖卫华; 郭雨刚; 李锐; 钟永军; 贾皓; 孙浩; 田志刚
Original assignee: University of Science and Technology of China USTC
Current assignee: Hefei Ruida Immune Drug Research Institute Co Ltd
Priority date: 2013-05-20
Filing date: 2013-05-20
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2033-05-20
Also published as: CN103243119B

Abstract

本发明提供了一种可溶性CD83(soluble CD83，sCD83)表达和制备的方法。利用本发明提供的方法，sCD83的表达量高达200mg/L，通过两步纯化，纯度可达95％以上。实验表明sCD83具有与天然CD83相似的生物学结构，具有与其天然受体结合的能力和很强的免疫抑制活性。此外，本发明还为sCD83的生产提供了一种简单而稳定的发酵工艺，并提供了针对所制备的sCD83的多克隆抗体。

Description

可溶性CD83的表达和制备方法

技术领域

本发明涉及重组蛋白的表达和制备领域，特别是涉及与抗原呈递和淋巴细胞活化有关的分子受体的表达。

背景技术

CD83是一种分子量为45kDa的表面糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族。由炎症因子诱导，在包括淋巴细胞、朗格汉斯细胞、网状细胞等不同细胞表达。在人和小鼠树突状细胞成熟过程中，与协同刺激分子CD80与CD86一样，CD83选择性上调表达，因此曾经被用作成熟树突状细胞的特异性表面标记。在活化的B细胞和T细胞中，CD83似乎能调节B细胞的功能和成熟。大量的CD83同样表达在活化的调节性T细胞表面。进一步的报道表明，在体内或体外未接触抗原的T细胞中，CD83的强迫表达会诱导免疫抑制表型。

存在膜结合的和可溶性的两种形式的CD83蛋白。膜结合CD83蛋白(mCD83)包含胞内区、跨膜区、胞外区三个结构域。胞外区包括一个V型免疫球蛋白结构域，而且其氨基酸组成在人和鼠之间显示出59％的一致性。总体上看，鼠科动物的CD83分子与人的CD83分子在氨基酸组成上有63％的一致性，因此，暗示其在人和小鼠中具有类似的功能。

显示CD83功能的第一个证据来自人树突状细胞感染不同病毒的实验，包括麻疹病毒、牛痘病毒和I型单纯疱疹病毒(HSV-1)。在HSV-1感染的成熟树突状细胞中，发生了通过细胞蛋白酶体的CD83的特异性降解，而这些树突状细胞对T细胞的刺激能力降低。此外，通过阻碍CD83的mRNA从细胞核转运到细胞质来降低CD83的表达也导致了对T细胞刺激能力的降低。而且，在单核细胞来源的树突状细胞中，通过siRNA敲低CD83的表达显示，CD83作为一个共刺激分子在树突状细胞中表达进而促进T细胞增殖。

CD83的表达情况高度影响CD4⁺T细胞在胸腺中发育，这一点可以由CD83敲除或者突变鼠中外周CD4⁺T细胞的严重降低显示。而且，B细胞和CD4⁺T细胞的寿命也依赖CD83的表达。

正如上面提到的，存在两种形式的CD83分子，膜结合的(mCD83)和可溶性的(soluble CD83，sCD83)，两者具有不同的生物学功能。sCD83仅包含mCD83的胞外区段而且具有免疫抑制功能。例如，感染了人巨细胞病毒后，树突状细胞会释放一种sCD83的同种型，表现出一种新的病毒逃逸机制。另外，在血液系统恶性肿瘤和风湿性关节炎患者中，发现了高水平的sCD83。然而，sCD83释放背后的机制仍然未被阐明。

为了更加详尽的研究sCD83的功能，CD83的胞外段进行了重组表达。在这些研究中，sCD83在大肠杆菌里表达，利用高压液相色谱纯化。突变分析显示，sCD83通过二硫键形成二聚体。有趣的是，在体外使用该重组蛋白可以将树突状细胞介导的T细胞刺激途径阻塞而且树突状细胞的细胞骨架会被改变。sCD83的功能进一步的通过实验性自身免疫性脑脊髓炎模型来研究。在此模型中，无论是对于治疗还是预防，sCD83都具有很好的作用。

尽管在上述描述中，原核表达的sCD83有很成功的应用，但是，其仍具有不少缺陷。首先，该重组蛋白是非糖基化的，而糖基化对于其在体外的稳定性和半衰期是很重要的。此外，在从原核细胞纯化该重组蛋白的过程中，不可避免的引入了一些富含LPS的碎片，进一步的纯化必须分离这些LPS碎片，这将给重组蛋白的产量带来不可忽略的降低。

因此，一种可以生产大量的，无LPS污染的具有糖基化修饰的sCD83的表达和纯化方法将是很有意义的。

发明内容

本发明涉及一种从酵母，如巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母、多形汉逊酵大量表达和纯化具有功能活性的sCD83的方法。

本发明中，我们首次利用酵母，如巴斯德毕赤酵母在基础盐培养基中高密度发酵表达sCD83。表达量高于200mg/L，显著高于之前文献报道的其他方法的产量(约8-10倍)。通过两步纯化，纯度可以达到95％以上。进行了N-糖基的鉴定，从几个角度验证了酵母表达的sCD83具有应用价值和生物活性。此外，我们还为sCD83的生产提供了一种简单但是稳健的发酵工艺。综上所述，甲醇利用型毕赤酵母一个是理想的sCD83表达系统，为sCD83进一步研究提供了充分的保障。

具体内容如下：

1.一种表达可溶性CD83的方法，所述方法包括使用酵母构建重组可溶性CD83表达菌株的步骤。

2.一种制备可溶性CD83的方法，所述方法包括以下步骤：

使用酵母构建重组可溶性CD83表达菌株；和

对重组可溶性CD83表达菌株进行发酵表达，优选地，在所述发酵中采用甲醇流加三步法进行重组可溶性CD83表达菌株的分批补料培养。

3.以上1或2的方法，其中所述酵母包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或多形汉逊酵。

4.以上1或2的方法，其中所述酵母是甲醇利用型毕赤酵母，优选地，所述甲醇利用型毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母，更优选是巴斯德毕赤酵母GS115。

5.以上1或2的方法，其中所述使用酵母构建重组可溶性CD83表达菌株的步骤包括：构建可溶性CD83表达载体；和转化和筛选重组可溶性CD83表达菌株。

6.以上5的方法，其中所述构建可溶性CD83表达载体包括使用质粒pCMV6-XL4-CD83为模板扩增可溶性CD83基因；使用质粒pPIC9K构建重组可溶性CD83表达载体；和将重组可溶性CD83表达载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。

7.以上2的方法，所述方法还包括纯化重组可溶性CD83的步骤，优选地，所述纯化包括以下步骤：固液分离；样品澄清；蛋白捕获；浓缩；和精细纯化。

8.一种重组可溶性CD83表达菌株，所述菌株通过以上1、3或4的方法获得。

9.通过以上1-7中任一项的方法所制备或由以上8的重组可溶性CD83表达菌株所表达的可溶性CD83重组蛋白。

10.以上9的可溶性CD83重组蛋白用于对细胞膜表面潜在表达CD83受体的细胞进行筛选分析的应用。

11.以上9的可溶性CD83重组蛋白用于免疫抑制活性的应用。

12.一种多克隆抗体，其针对通过以上1-7中任一项的方法获得的可溶性CD83。

附图说明

图1.在P.pastoris中构建pPIC9K-sCD83-His表达载体；

图2.筛选来自YPDG板的sCD83高表达克隆及pH、温度等表达条件优化；

图3.P.pastoris中sCD83发酵；

图4.sCD83纯化；

图5.sCD83表征；

图6.sCD83pAb纯度及活性检测

图7.sCD83竞争细胞膜CD83；

图8.sCD83pAb/PE-CD83的抗体竞争；

图9.sCD83与单核细胞上的假定CD83受体结合，但不与T细胞结合，其中，线性曲线是sCD83和PE-CD83染色，且阴影曲线是对照；和

图10.sCD83抑制ConA刺激的PBMC的增殖。

具体实施方式

以下以巴斯德毕赤酵母为例进一步详述本发明。

1.实验材料

1.1菌株与质粒

巴斯德毕赤酵母菌株(P.pastoris)菌株GS115、pPIC9K载体购自Invitrogen公司。

实验中所用细胞由健康人外周血中分离得到，血液样品由安徽省血液中心合肥市中心血站提供。

1.2试剂

Yeast nitrogen base(YNB)购自BD公司；RPMI-1640培养基购自Hyclone公司；胎牛血清购自Gibco公司；Yeast extract和Trypton购自OXOID公司；BCA蛋白检测试剂盒购自Pierce公司；d-Sorbitol、d-biotin、质粒抽提试剂盒、PCR产物回收试剂盒、胶回收试剂盒、DNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶、蛋白marker和PAGE配置相关试剂购自上海生工；G418、ConA、LPS购自Sigma-Aldrich公司；细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4购自PeproTech公司；EZ-ECL化学发光检测试剂盒购自BiologicalIndustries公司；抗his-tag mouse mAb购自Abmart公司；二抗anti-mouse lgG-HRPconjugate购自Bio Legend公司；含硅泡敌购自江苏赛欧信越消泡剂有限公司；流式检测相关抗体购自BD Bioscience公司；细胞增殖检测试剂CFSE购自Invitrogen公司；其他化学试剂购自国药集团。

1.3仪器

电子分析天平和pH计购自梅特勒-托利多公司；漩涡振荡仪购自ScientificIndustries公司；电泳仪，垂直电泳槽、水平电泳槽、凝胶成像系统购自天能公司；半干转膜仪、电转仪购自Bio-Rad公司；化学发光检测仪购自UVITEC公司；高压灭菌锅购自Hirayama公司；台式冷冻离心机(Centrifuge5810R、Centrifuge5415R)购自eppendorf公司；超净工作台、摇床、恒温培养箱购自上海智诚公司；PCR仪购自德国Biometra公司；微量移液器购自法国Gilson公司；细胞培养箱购自Themo公司；AKTAexplorer、Labscale TFF System和Pellicon XL(10kDa)购自Millipore公司；

115Benchtop Fermentor购自New Brunswick Scientific公司；Flex Stand system和0.45μmmicrofiltration cartridge购自GE healthcare；流式细胞仪FACSCalibur购自BDBioscience公司。

1.4溶液

1.Binding buffer for Ni column：

300mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.5；

2.Wash buffer for Ni column：

20mM imidazole，300mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH7.5；

3.Elution buffer for Ni column：

250mM imidazole，300mM NaCl，20mM Tris-HCl，pH6.0；

1.5引物

1.CD83-Fw-Xho I：

5’-TCTCTCGAGAAAAGAACGCCGGAGGTGAAGGTGGCTTGC-3’

2.CD83-his-Rv-EcoR1：

5’-CTGAATTCTCAATGGTGATGGTGATGATGAATCTCCGCTCTGTATTTC-3’

实施例1.sCD83表达载体构建

一、sCD83基因的扩增

以质粒pCMV6-XL4-CD83(购自OriGene公司)为模板，在引物CD83-Fw-Xho I和CD83-his-Rv-EcoR1的引导下进行PCR扩增，PCR反应条件为：先94℃2分钟；然后94℃30秒，55℃40秒，72℃40秒，共30个循环；最后72℃10分钟。反应结束后，将得到的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，得到一条大小约400bp的条带，与预期结果相符。用PCR产物回收试剂盒回收目的条带，该片段命名为“-sCD83-His”。

二、重组sCD83的毕赤酵母表达载体的构建

用限制性内切酶Xho I和EcoR I对上步获得的PCR产物(-sCD83-His)进行双酶切，再将酶切片段与经相同酶双酶切的质粒pPIC9K用T4DNA连接酶进行连接(16℃，120min)，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞(具体地，将5μL质粒加入含有100μL感受态细胞的EP管中，冰浴30min，42℃热激90s，冰浴3min。然后向此EP管中加入400μLLB培养基(Tryptone1％，Yeast Extract0.5％，NaCl1％)，混匀后，放置于30℃摇床培养45min，吸取200μL涂布LA平板)，筛选阳性重组子(筛选方法如下：转化入目的基因的阳性重组子可以在LA平板生长，反之不能够生长)，提质粒(采用AXYGEN公司质粒抽提试剂盒)，酶切鉴定，将鉴定后的阳性克隆命名为pPIC9K-sCD83-His，并送上海生工测序，测序结果显示插入pPIC9K的Xho I和EcoR I的识别位点间的DNA序列与预期结果完全一致。

三、结果

全长CD83为一种膜结合蛋白，具有205个氨基酸，其预测信号肽为1-20位氨基酸，sCD83为其21-145位氨基酸部分。我们将碳端his-tag的sCD83的编码序列(sCD83编码DNA序列如SEQID No.1所示)连接到毕赤酵母α-Factor信号肽3’末端，并仅保留kex2蛋白酶的酶切位点，最后通过Xho I和EcoR I酶切位点克隆到pPIC9K酵母表达载体中。这样通过甲醇诱导AOX I启动子驱动其下游蛋白的表达。sCD83表达载体结构示意图如图1所示。

实施例2.重组sCD83表达克隆的转化和筛选

一、质粒线性化和回收：

将以上获得的含有重组表达载体的pPIC9K-sCD83-His的E.coli菌于50ml LA培养基(Tryptone1％，Yeast Extract0.5％，NaCl1％，Ampicillin50μg/mL)中扩增，抽提约100μg质粒(采用AXYGEN公司质粒抽提试剂盒)，取20μg质粒使用SalI线性化质粒，然后使用乙醇沉淀回收线性化的质粒。方法如下：

(1)于1.5ml EP管中加入2倍体积无水乙醇和0.1倍体积的3M NaAC(pH5.2)，混匀并于-80℃静置大于半小时；

(2)12,000g离心15分钟，小心吸弃上清；

(3)加入750μl70％乙醇润洗，高速离心10分钟后，弃上清，重复一遍；

(4)EP管倒置于超静台吸水纸上约10分钟，尽量去除水分和残留乙醇，20μl ddH2O重溶，定量后备用。

二、毕赤酵母菌株GS115感受态细胞制备：

(1)在5ml YPD(Tryptone2％，Yeast Extract1％，Glucose2％)中接种GS115单克隆(提前2天从冻存GS115菌液中划线YPD板)，30℃，250rpm，摇菌24-48h，然后取1ml菌液接种到50ml YPD中，同时留1ml YPD作空白对照，继续摇菌约4-6h，到OD600＝11～1.3，以下每步都注意保持低温操作，以保证感受态活性；

(2)菌液转入50ml离心管，离心1500g，4℃，5min，尽弃上清；

(3)用40ml冰水重悬，震荡，同上离心，弃上清；重复一遍；

(4)用10ml1M冰冷d-Sorbitol重悬，同上离心，尽弃上清；

(5)每管用约300μl1M冰冷d-Sorbitol重悬，每管100μl分装，置于冰上备用。

三、电转化和涂板：

(1)100μl GS115感受态细胞加入10μl线性化质粒(约5-10μg)，用枪打匀，冰浴5min，加入0.2cm电转化杯(Catalog No.165-2086，购自BIO-RAD公司)中，轻轻将液体震到杯底，立即冰浴；

(2)设定电转化参数，电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，一般放电时间在4-5ms之间，电转后立即加入1ml4℃预冷的1M d-Sorbitol，迅速混合均匀。注意事项：若放电时间小于4ms或有电击穿现象，可能原因有：感受态浓度不够或者体积不够；DNA含盐量太高；

(3)涂MD板(YNB1.34％，Glucose2％，Agar2％)，200-250μl/块MD板，共2-3块；30℃烘箱培养3-5天，至菌落直径1mm即可。

(4)挑选若干MD板上克隆，划线转接到YPDG(Tryptone2％，Yeast Extract1％，Glucose2％，Agar1.5％，G4181mg/ml)板继续筛选，30℃烘箱培养3-5天，至菌落直径1mm即可。

四、重组酵母转化子的小量表达：

(1)从1mg/ml YPDG板挑单克隆入4ml/管MGY(YNB1.34％，Glycerol1％)接种，30℃，250rpm，培养2天左右至OD600＝2-6；

(2)取1ml菌液于EP管中保种，1ml菌液离心，1500g，5min，菌体换3ml BMMY(Tryptone2％，Yeast Extract1％，YNB1.34％，磷酸盐缓冲液0.1M pH＝5，methanol0.5％)诱导表达，每24h加0.5％甲醇；表达3天后收集菌液，12000g高速离心5min，分别收集上清和沉淀；

(3)上清用作抗体表达鉴定，用Western blotting方法分析鉴定。

五、表达上清Western blotting鉴定：

(1)取30μl高速离心后的表达上清，加入适量10μl loading buffer(Tris-HCl250mM，SDS10％，BPB0.5％，Glycerol50％)和1μlβ-巯基乙醇(购自天津博美科生物技术有限公司)，沸煮5分钟，快速离心混匀；

(2)直接上样15％胶浓度的SDS-PAGE经行电泳，按浓缩胶110V，分离胶160V进行电泳；

(3)转膜：使用半干转膜仪(型号VE-386，购自Tanon公司)将胶上蛋白转移到PVDF(购自Millipore公司)膜上，参数：恒压18V转膜25min；

(4)封闭：取出膜，使用TBST(在TBS内加入0.1％Tween-20)润洗两次，用含有5％BSA的TBS(NaCl8g，KCl0.2g，Tris base3g，加水定容至1L，调pH为7.4)封闭1小时；

(5)孵育抗体：去除封闭液，用TBST洗3次，5分钟/次；使用一抗anti-his(购自Abmart公司)和二抗anti-mouse IgG-HRP conjugate室温杂交孵育1小时，TBST洗5次，5分钟/次；

(6)ECL显影。

六、结果

使用SalI将pPIC9K-sCD83-His线性化之后，电转入毕赤酵母GS115菌株。从培养sCD83的YPDG平板上各挑选十几个克隆进行诱导表达。使用Western Blotting检测这些克隆培养上清中sCD83表达的情况。大多数的克隆均有效地表达出sCD83，且2、3和13号等克隆表达量相对较高。接下来我们进一步研究了不同温度和pH条件下的sCD83表达情况，结果显示表达量在25℃和30℃的条件下相对20℃较高，pH对于表达量的影响不显著(如图2所示)。

实施例3.重组sCD83的发酵表达

(1)一级种：将表达重组sCD83的GS115菌液100μL接种到5ml MGY培养基(YNB1.34％，Glycerol1％)，30℃，250rpm培养36-48h至OD₆₀₀＝2-6，此为发酵一级种；

(2)二级种：将1ml发酵一级种接种到200ml pH5.0BMGY培养基(Tryptone2％，YeastExtract1％，YNB1.34％，PPB0.1M pH＝5，Glycerol1％)中，30℃，250rpm培养12-18h，至OD₆₀₀＝2-6，此为发酵二级种；

(3)发酵准备：发酵罐(BioFlo/CelliGen115，Eppendorf，New Brunswick)组装及相关试剂(BSM培养基，Glycerol，甲醇，氨水)准备、灭菌(脉动真空灭菌)等工作；

(4)Batch阶段：将发酵二级种接入含6L pH5.0的BSM培养基(Phosphoric acid，85％26.7mL，Calcium sulfate0.93g，Potassium sulfate18.2g，Magnesiumsulfate-7H2O14.9g，Potassium hydroxide4.13g，Glycerol40.0g，定容到1L，配制6L)的14L发酵罐中，补充6ml/L的PTM1溶液(Cupric sulfate-5H₂O6.0g，Sodium iodide0.08g，Manganese sulfate-H₂O3.0g，Sodiummolybdate-2H₂O0.2g，Boric Acid0.02g，Cobalt chloride0.5g，Zinc chloride20.0g，Ferrous sulfate-7H₂O65.0g，Biotin0.2g，Sulfuric Acid5.0ml，定容到1L)，温度控制在30℃，初始搅拌速度：400rpm，通过补加氨水将pH维持在5.0左右，初始DO90％以上，随着菌体的生长DO会逐渐下降并维持平衡，将平衡控制在20％-40％之间；

(5)转换期：当DO开始急速上升时意味着原有培养基中甘油耗尽，需要持续补充含有12ml/L PTM1的50％甘油溶液，流速为12ml/h/L，这个过程维持2-3h至湿重在180g/L附近；

(6)甲醇诱导阶段：当湿重达到180g/L附近时，停止甘油流加，溶解氧会迅速上升，随后开始按“invitrogen发酵手册三步法”流加含有12ml/L PTM1的甲醇溶液。温度控制在25℃；搅拌速度1000rpm左右，DO控制在20％-40％之间，到发酵后期需要通纯氧维持DO稳定。发酵持续120h左右终止。

结果：

我们按照invitrogen公司发酵手册上推荐的甲醇流加三步法进行表达菌分批补料培养(fed-batch cultivation)。我们首先使用含有4％甘油的基础盐培养基(pH5.0)在batch阶段扩增菌体，培养温度30℃。等到DO急剧上升时，batch阶段结束，菌体湿重达到118.7g/L。随后进入转换期即甘油流加期，经过约3个小时的生长菌体湿重进一步增加，达到175.3g/L。此时停止流加甘油，菌体呼吸活力下降，DO迅速上升；随后开始进行甲醇诱导，菌体呼吸活力恢复，DO开始逐渐下降。在甲醇诱导阶段，因为菌体对甲醇有一个适应阶段(3-4小时)，因此需要逐步提高甲醇浓度，避免甲醇过量积累对菌体产生毒性。发酵结束之后，菌体湿重接近600g/L。尽管菌体湿重在诱导过程中一直在增加，但是蛋白的表达量在培养80小时基本达到平衡，不再累计。因此在此时结束发酵比较适合。参见图3。

实施例4.重组sCD83的纯化

(1)固液分离：发酵结束之后，使用NaOH缓缓地将发酵液pH调节到7.5，使用10000g离心力，离心20min，收集上清液；

(2)样品的澄清：使用Flex Stand system和0.45μm microfiltration cartridge将上步获得上清液进一步过滤；

(3)蛋白的捕获：使用XK26/20column(购自GE healthcare公司)和Ni-agarose(购自GE healthcare公司)组装Ni-柱，binding buffer(见1.4)平衡后，直接上样上步澄清样品，流速700ml/h；上样结束之后先用binding buffer冲洗5个柱体积，再用wash buffer(见1.4)冲洗5个柱体积，最后用Elution buffer(见1.4)洗脱目的蛋白；

(4)浓缩：使用Labscale TFF system和Pellicon XL50(10kDa)对上步洗脱下来的蛋白进行浓缩，浓缩至50ml，并使用0.45μm滤膜过滤；

(5)精细纯化：使用AKTA Explorer System，用PBS平衡320ml S200HR分子筛柱(购自GE healthcare公司)，直接上样15ml上步过滤后的样品，上样完成之后，先用PBS冲洗，分别收集不同的洗脱峰，最后用ddH₂O和20％乙醇冲洗并保存柱子；

(6)鉴定和保存：将上步洗脱下来的不同峰样品，用SDS-PAGE鉴定，并将目的峰样品冻存备用。

结果：

发酵结束之后离心和澄清，通过SDS-PAGE估算sCD83的浓度超过300mg/L。

经过两步纯化实际获得200mg/L，内毒素含量低于0.1EU/μg蛋白。由于sCD83带有his-tag，因此，将发酵液直接上样Ni柱。洗脱之后经SDS-PAGE检测，在25kDa上下有两片蛋白条带，根据之前Western blot检测，25kDa下面两条带均为sCD83。接下来我们首先尝试用分子筛S200HR进行纯化，纯度进一步提高，仅含25kDa下的两条分子量很接近的条带。参见图4。

经过ExPASy数据库N-glycosylation预测软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)分析，sCD83具有三个潜在的N-glycosylation位点，此外，相关文献也报道重组表达的sCD83具有一定程度的糖基化，因此推测上下两条带可能是不同程度的N-glycosylation造成的。因此，我们使用N-糖基化酶PNGase对纯化的sCD83进行分析，结果表明，经过糖基化酶消化，sCD83带型变成一条均一的低分子量条带，因此，SDS-PAGE中分子量较大的条带为sCD83的糖基化形式，分子量较小的条带为非糖基化形式，该形式的蛋白分子量更加接近其预测分子量(15.3kDa，含his-tag)。参见图5。

实施例5.制备sCD83的多克隆抗体

抗sCD83的兔多克隆抗体委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备。经检测，多抗浓度为2mg/ml。通过8％的SDS-PAGE检测多抗的纯度，非还原(-DTT)条件下，该多抗为一条均一的条带，位于170kDa和130kDa之间；还原(+DTT)条件下，为两个条带，分别对应抗体的重链和轻链，凝胶扫描显示该多抗的纯度大于90％(图6A)。为了检测该多抗结合抗原sCD83的能力，我们使用了Western blot的方法(参考实施例2步骤五)，并使用对照蛋白(Ctr.，一种含有his-tag分子量约为10-15kDa的重组蛋白)检测该多抗识别his-tag的能力。

结果：

该抗体可以在1∶1000～1∶5000稀释度的条件下，可以很好的识别抗原sCD83，且与对照蛋白Ctr.几乎无结合能力(图6B)。且由图6C，可知，sCD83和Ctr.均可与抗his-tag的抗体结合。因此，我们认为该多抗(sCD83pAb)识别sCD83的蛋白序列而非his-tag序列。

实施例6.重组sCD83特异性检测

成熟树突状细胞表面高表达CD83分子，本实验采用sCD83及所制备多克隆抗体竞争性阻断树突状细胞膜CD83与商品化CD83单克隆抗体的结合效果。

(1)由健康人外周血液以密度梯度离心方法先后分离得到外周血液单个核细胞(PBMC)及单核细胞(monocyte)，将单核细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中进行培养，并添加重组人粒细胞和巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF，50ng/mL)及重组人白细胞介素4(rhIL-4，50ng/mL)诱导5天形成未成熟树突状细胞(immature DC)，并进一步添加脂多糖(LPS，50ng/mL，购自Sigma公司)活化细胞48小时后成为为成熟树突状细胞(mature DC)；(参考本文：Transcription Factor E2F1SuppressesDendritic Cell Maturation(PMID：20421650))

(2)收取成熟树突状细胞，以PBS清洗两次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(3)以4％小鼠血清(由本实验室制备。6周龄Blab/c品系小鼠购自军事医学科学院，采用摘眼球放血，获得血液1mL，4℃静置1小时，5000g离心力离心10分钟，取上清，使用PBS稀释25倍即为所得。)封闭，4℃，15min；

(4)添加商品化流式抗体(CD83单克隆抗体，CD80单克隆抗体，CD86单克隆抗体，均购自BD公司)进行表面分子标记，并同时添加一定剂量的sCD83及所制备多克隆抗体进行竞争阻断，对照为添加同等剂量的BSA，抗体标记条件为4℃，30min；

(5)以PBS清洗标记好的细胞三次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(6)以PBS重悬细胞，并立即进行流式细胞术检测分析。

结果(图7和图8)：

sCD83及所制备多克隆抗体可以显著地竞争阻断成熟树突状细胞膜表面CD83同商品化单克隆抗体的结合，而对成熟树突状细胞高表达的其他表面分子如CD80、CD86等并无竞争效果，显示了sCD83及所制备多克隆抗体具有良好的特异性。

实施例7.重组sCD83用于CD83受体筛选

由于sCD83具有良好的特异性，本实验用之对细胞膜表面潜在表达CD83受体的细胞进行筛选分析。

(1)由健康人外周血液以密度梯度离心方法分离得到外周血液单个核细胞(PBMC)，之后用于细胞膜表面CD83受体筛选检测；(参考本文：CD83-stimulated monocytes suppress T-cell immune responses throughproduction of prostaglandin E2(Pubmed22065790))

(2)收取PBMC，以PBS清洗两次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(3)以4％小鼠血清封闭，4℃，15min；

(4)添加sCD8320ug/mL，对照为添加同等剂量的BSA，4℃，30min；

(6)添加商品化CD83单克隆抗体(购自BD公司)进行标记，并同时辅以CD14、CD3单克隆抗体(均购自BD公司)等进行多色荧光标记用于特定细胞区分，4℃，30min；

(7)以PBS清洗标记好的细胞三次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(8)以PBS重悬细胞，并立即进行流式细胞术检测分析。

结果(图9)：

人PBMC之中，CD14阳性的单核细胞表面存在潜在CD83受体的表达，而CD3阳性的T细胞表面并无潜在CD83受体表达，提示本sCD83可用于潜在CD83受体细胞的筛选及分析，为研究CD83-CD83受体信号传递及在免疫应答中的意义提供了条件。

实施例8.重组sCD83活性检测

本实验采用sCD83抑制ConA所诱导的PBMC增殖以检测其生物学活性。

(1)由健康人外周血液以密度梯度离心方法先后分离得到外周血液单个核细胞(PBMC)，之后用于sCD83抑制PBMC增殖实验。(参考本文：Productionand characterization of human soluble CD83fused with the fragmentcrystallizable region of human IgG1 in Pichia pastoris.(Pubmed23392767))

(2)收取PBMC，以无菌PBS清洗两次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(3)以无菌的含0.1％BSA的PBS重悬；

(4)添加CFSE，至终浓度1.5uM进行标记，37℃，5min；

(5)以无菌的含0.1％BSA的PBS清洗三次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(6)将细胞接至细胞培养板(Costar3513，12Well Cell Culture Cluster，购自Corning公司)，并添加ConA(5ug/mL)，sCD83(20ug/mL)，置于37℃培养箱进行细胞培养，并于3、4、5、6天后分别收取活化细胞进行后续检测分析；

(7)收取培养后的PBMC，以PBS清洗两次，离心3000rpm，4℃，5min，尽弃上清；

(8)以PBS重悬细胞，并立即进行流式细胞术检测分析。

结果(图10)：

sCD83可以显著性抑制ConA所诱导的PBMC增殖检测，显示了较强的生物学活性。而PBMC之中的单核细胞为潜在表达CD83受体的细胞，提示了CD83可能是通过其产生作用，抑制了细胞的正常增殖。

Claims

2.一种制备可溶性CD83的方法，所述方法包括以下步骤：

使用酵母构建重组可溶性CD83表达菌株；和

3.权利要求1或2的方法，其中所述酵母包括巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、乳酸克鲁维酵母或多形汉逊酵。

4.权利要求1或2的方法，其中所述酵母是甲醇利用型毕赤酵母，优选地，所述甲醇利用型毕赤酵母是巴斯德毕赤酵母，更优选是巴斯德毕赤酵母GS115。

5.权利要求1或2的方法，其中所述使用酵母构建重组可溶性CD83表达菌株的步骤包括：构建可溶性CD83表达载体；和转化和筛选重组可溶性CD83表达菌株。

6.权利要求5的方法，其中所述构建可溶性CD83表达载体包括使用质粒pCMV6-XL4-CD83为模板扩增可溶性CD83基因；使用质粒pPIC9K构建重组可溶性CD83表达载体；和将重组可溶性CD83表达载体转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。

7.权利要求2的方法，所述方法还包括纯化重组可溶性CD83的步骤，优选地，所述纯化包括以下步骤：固液分离；样品澄清；蛋白捕获；浓缩；和精细纯化。

8.一种重组可溶性CD83表达菌株，所述菌株通过权利要求1、3或4的方法获得。

9.通过权利要求1-7中任一项的方法所制备或由权利要求8的重组可溶性CD83表达菌株所表达的可溶性CD83重组蛋白。

10.权利要求9的可溶性CD83重组蛋白用于对细胞膜表面潜在表达CD83受体的细胞进行筛选分析的应用。

11.权利要求9的可溶性CD83重组蛋白用于免疫抑制活性的应用。

12.一种多克隆抗体，其针对通过权利要求1-7中任一项的方法获得的可溶性CD83。