CN112113823B - 酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用 - Google Patents
酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，属于肥料检测技术领域。所述酶联免疫法包括：预处理、增效剂的克隆抗体制备和酶联免疫检测步骤。本发明采用酶联免疫法具备灵敏度高、专一性强、操作简单，富集率高、成本低的特点，为控制肥料质量，管理肥料市场，实现低人工、快速、专一、批量检测提供了可靠依据。
Description
技术领域
本发明涉及酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，属于肥料检测技术领域。
背景技术
我国化肥使用中存在着5大主要问题：肥料使用过量严重浪费；肥料结构失衡；肥料检测技术落后；肥料质量参次不齐造成市场混乱；肥料利用率低。应实施以“质量替代数量”的发展战略。
增效肥料是肥料中添加增效剂赋予肥料特殊功能的肥料，增效剂包括碧护、腐植酸、黄腐酸、海藻提取物、壳聚糖、DA-6、多肽、微生物及其代谢物、脲酶抑制剂和硝化抑制剂、聚谷氨酸、甜菜碱、褪黑素、植物激素类等。增效剂添加方式主要有液态溶于水溶性肥料和喷吐于肥料表面两种。增效型肥料具有生产成本低、环境友好、减肥增效、促生抗逆、增产提质的作用，在农业可持续发展中占有重要的地位，是肥料产业创新发展的原动力和国内外肥料发展的趋势。
增效剂用量阀值范围窄，过量施用易对作物造成毒害，用量不足则作用效果微弱。水溶性肥料在使用过程中对农业设备要求高，大多需要通过滴管、喷雾专用设备，使用成本大。固态增效型肥料通过将增效剂附着在肥料表面可实现精准控量。
目前，如何解决增效剂在增效肥料内定性定量检出问题是规范增效肥料市场，打击假冒伪劣产品、清查药肥掺混行为的关键点。但现有检测方法主要有以下问题：1)单位质量固态肥料内增效剂含量低，杂质分离困难，缺乏可大量分离纯化的设备。例如水溶性肥料海藻提取物含量为20-40％，固态肥料海藻提取物含量为0.2-0.4％，为液态施用浓度的1/1000，这为检测带来了极大的挑战。2)缺乏增效剂在固态增效肥料内的检测手段，例如微生物代谢物、碧护、脲酶抑制剂和硝化抑制剂、聚谷氨酸、甜菜碱、褪黑素、植物激素、DA-6在肥料内的检测目前鲜有报道；3)专一性差，例如腐植酸、黄腐酸的检测大多通过肥料内有机质的检验，无法有效专一性表征腐植酸、黄腐酸，部分不法企业添加淀粉假冒伪劣，给市场和用户带来了不可挽回的损失；4)检测灵敏度低，分析需要分离纯化出的增效剂量大。现有方法集中于生化比色，需要检测样品用量在1-5mg。5)检测成本高、检测设备操作复杂，例如液相、质谱等设备联用，设备价格在200万左右，需要专业人员经过长时间培训才能完成检测任务，为方法的推广带来了较大的阻碍。
发明内容
为解决现有技术中检测肥料中增效剂存在专一性差、灵敏度低、干扰因素多的缺陷，本发明的目的在于提供一种酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用。
为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下：
酶联免疫法在检测固态增效肥料的痕量增效剂含量中的应用，所述酶联免疫法包括预处理、增效剂的克隆抗体制备和酶联免疫检测。
其中，所述预处理步骤，包括：
(1)选取粒径大小均一的固态增效肥料颗粒，制得待检测样品颗粒；
(2)将步骤(1)的待检测样品颗粒用溶剂进行表面溶解，当溶解前的颗粒粒径值与溶解后的粒径值之差为0.2-0.5mm时，停止溶解，将溶解液与颗粒分离，收集颗粒表面的溶液并与溶解液合并，制得待测溶液1；
(3)对步骤(2)制得的待测溶液1进行浓缩，低温结晶，过滤分离处理，制得待测样品溶液2。
进一步的，所述步骤(1)中，固态增效肥料的肥料成分为尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾中的任意一种或两种以上任意比的混合物。
进一步的，所述步骤(2)中，待检测样品颗粒与溶剂的质量比为10-20:1；所述溶剂为水溶液、有机溶剂，或者水与有机溶剂的混合液；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、乙醚、石油醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、正丁醇中的一种或两种以上任意比的组合，溶剂的具体选择可根据增效剂物质的化学性能进行选择。
进一步的，所述步骤(2)中，收集颗粒表面的溶液为将颗粒表面的溶剂吸附于吸附材料上，然后用溶剂冲洗吸附材料，获得颗粒表面的溶液，溶剂与吸附材料的质量比为1:3-5；吸附材料为活性炭。
进一步的，所述步骤(3)中，浓缩为将待测溶液在50℃-70℃的条件下，浓缩至有结晶析出，制得饱和盐溶液；更进一步的，所述浓缩为采用真空旋转蒸发器进行浓缩；结晶为将浓缩后的溶液置于4℃-20℃的条件下结晶30-60min；过滤分离处理为采用抽滤；更进一步的，所述抽滤为三级膜分离过滤系统进行分离过滤；更优的，所述三级膜分离过滤系统为陶瓷-超滤-纳滤过滤分离系统，其中陶瓷膜规格为200nm、超滤膜规格为1～10kD、纳滤膜规格为150D～600D；过滤时间10～20min。本发明采用的三级膜分离过滤系统型号为DMJ60-3；操作方法为用纯水清洗三级膜分离过滤系统，至放料口清洗液电导率小于10μs以下，将抽滤液置于物料罐中，依次打开各级分离泵，调节主泵压力分别为0.2、0.3、0.6MPa，10-20min后，对应物料罐中过滤液接入接样瓶中，定容。
其中，所述增效剂的克隆抗体制备步骤，包括：
(i)将标准增效剂溶液与弗氏完全佐剂充分混合乳化，选择新西兰大白兔脊柱两旁数点位置进行皮下注射；
(ii)将标准增效剂溶液与弗氏不完全佐剂充分乳化，2周后，对经过步骤(i)处理的新西兰大白兔再次进行皮下注射；
(iii)重复步骤(ii)处理1-5次；
(iv)取经步骤(iii)处理后的新西兰大白兔耳静脉血2-5ml，取血清，制备得到增效剂的兔多克隆抗体。
进一步的，所述步骤(i)中，所述标准增效剂溶液与弗氏完全佐剂体积相同；所述标准增效剂溶液的体积用量为0.5-1.6mL，质量为200-1600μg，每点注射100-200μL。
进一步的，所述步骤(ii)中，所述标准增效剂溶液与弗氏不完全佐剂体积相同；所述标准增效剂溶液的体积用量为0.5-1.6mL，质量为100-800μg，每点注射用量为100-200μL。
进一步的，所述步骤(iv)中，所述增效剂的兔多克隆抗体血清效价≥105。上述血清效价采用酶联免疫法进行评价。
其中，所述酶联免疫检测步骤，包括：包被，封闭，孵一抗，孵二抗，显色，绘制标准曲线和计算。
进一步的，所述包被，步骤如下：
将经预处理后的待测样品溶液用碳酸盐包被缓冲液稀释为0.5-5μg/mL，然后加入酶标板中，每孔50-200μL，然后放置于4℃冰箱中孵育过夜，从4℃冰箱拿出酶标板，倒掉包被缓冲液，加入100-200μL洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔，3-5次，每次洗完都要在滤纸上拍干酶标板里的液体。
进一步的，所述封闭，步骤如下：
向酶标板加样孔中，加入质量百分比浓度为1-5％的BSA封闭缓冲液，每孔50-200μL，然后置于37℃恒温干燥箱内孵育2-4h；去除封闭缓冲液，用洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔三次。
进一步的，所述孵一抗，步骤如下：
向封闭后的酶标板加样孔中加入稀释的增效剂的兔多克隆抗体，稀释倍数为1000-5000倍，每孔100μL，然后置于37℃恒温干燥箱内孵育1h；倒掉一抗溶液，加入100-200μL洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔，3-5次。
进一步的，所述孵二抗，步骤如下：
向经孵一抗处理后的酶标板加样孔中加入二抗溶液，二抗为辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔(根据试剂盒稀释倍数稀释1:2500)，每孔50-200μL，然后置于37℃恒温干燥箱内孵育1-2h；倒掉二抗溶液，加入100-200μL洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔，3-5次。
进一步的，所述显色，步骤如下：
向经孵二抗处理后的酶标板加样孔中加入浓度6.24×10-4M的显色液TMB试剂，每孔100μL，避光静置5-20min；待显色充分后，加入终止液1M HCl，每孔50-100μL，然后在5-20min内用酶标仪测定结果，获得OD450nm值，记录数据并保存。
进一步的，所述绘制标准曲线为根据不同浓度的标准增效剂溶液的OD450nm值绘制增效剂OD450标准曲线。
进一步的，所述计算待测样品增效剂含量，步骤如下：
根据OD450标准曲线获得OD450标准曲线方程式，并根据显色获得的待测样品OD450值计算待测样品溶液增效剂浓度值C，然后根据如下公式，计算增效剂含量：
X＝C×VF/M×100％
式中：
X——样品中增效剂含量；
C——根据标准曲线求得的样品中增效剂的质量浓度(mg/ml)；
F——实验过程中增效剂稀释倍数；
M——样品处理前称取质量，单位为毫克(mg)；
V——待测样品溶液2的体积(ml)；
本发明具有以下有益效果：
1、本发明首次将酶联免疫法应用于检测固态增效肥料的痕量增效剂含量中，充分利用了酶联免疫法高灵敏度和专一性的特点，解决了现有技术中由于增效剂多样性而导致无法检测的难题，提供给肥料检测领域新的检测思路；
2、本发明通过采用特定的预处理步骤，解决酶联免疫法应用于肥料检测领域过程中由于检测样品杂质高、待检测样品含量低等原因导致检测准确度不高的问题，从而极大提高了本申请的可适用性，为肥料质量检测，市场管理提供了可靠依据。
附图说明
图1为本发明实施例1中检测宛氏拟青霉代谢物浓度的标准曲线图；
图2为本发明实施例2中检测腐植酸浓度的标准曲线图；
图3为本发明实施例3中检测黄腐酸浓度的标准曲线图；
图4为本发明实施例4中检测碧护浓度的标准曲线图；
图5为本发明实施例5中检测海藻提取物浓度的标准曲线图；
图6为本发明实施例6中检测甜菜碱浓度的标准曲线图；
图7为本发明实施例7中检测鲜胺脂浓度的标准曲线图；
图8为本发明实施例8中检测宛氏拟青霉提取物浓度的标准曲线图；
图9为本发明实施例9中检测宛氏拟青霉提取物浓度的标准曲线图；
图10为本发明实施例10中检测宛氏拟青霉提取物浓度的标准曲线图.
具体实施方式
为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
除特殊说明，本发明所用组分均为市售产品，本发明中测定所使用的固态增效肥料购买于山东蓬勃生物科技有限公司。
实施例1固态增效肥料中的宛氏拟青霉代谢物的痕量测定
本实施例中使用的固态增效肥料为含宛氏拟青霉代谢物的尿素。
预处理：
(1)将5.0kg尿素置于加热转鼓中，加热至80℃后，喷加含有植物诱抗剂宛氏拟青霉代谢物的原液75mg，待烘干后，烘干后即得该肥料成品；
(2)称取每千克含增效剂15毫克的固体增效肥料产品4.0kg，用3.5mm、4.0mm、4.5mm、4.8mm、5.0mm孔径圆孔筛对产品分级，选取5.0mm大粒径肥料称重1kg，采用100ml水溶液冲洗至溶解前的颗粒粒径值与溶解后的粒径值之差为0.5mm时，停止溶解，将溶解液与颗粒分离；将带有溶液的肥料颗粒与活性炭按质量比1:3混合，用水冲洗活性炭，获得洗脱液与溶解液混合，制得待测溶液1；
步骤3：将步骤2制备的含宛氏拟青霉代谢物的溶液置于真空旋转蒸发器50℃旋转至刚有晶体析出；之后置于-20℃冰箱中冷却，20min盐分完全结晶取出，立即用2.5L抽滤瓶，布氏漏斗和2层中速滤纸抽滤，盐分结晶用小烧杯底部压实，至漏斗底端不再有滤液滴出，收集滤液；用纯水清洗三级膜分离过滤系统，清洗至放料口放出的清洗液电动率在10μs以下，将上述步骤所得滤液加入至一级物料罐中，依次开启三级泵，15min后收集各物料罐中浓缩液，浓缩液浓缩至1ml左右，定容到2ml，过0.22μm滤膜待用。
增效剂的克隆抗体的制备
(i)将1.6mL的1600μg的标准增效剂溶液与等体积弗氏完全佐剂充分乳化选脊柱两旁的数点进行皮下注射，每点注射200μL；
(ii)初次免疫2周后，进行加强免疫处理，将1.6mL 800μg增效剂溶液与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化，注射进兔皮下，每点注射200μL，
(iii)重复加强免疫3次；
(iv)：收集新西兰大白兔耳静脉血5ml，得到增效剂的兔抗血清，然后用ELISA法测该抗血清的效价，至效价≥105时，即得增效剂的兔多克隆抗体。
酶联免疫法测定待测样品中的宛氏拟青霉代谢物含量
选用梯度浓度宛氏拟青霉代谢物标准品溶液和样品为免疫抗原，一抗为待检测的增效剂的兔抗血清，兔免疫前血清为阴性对照，二抗为山羊抗兔-HRP(辣根过氧化物酶标记)，显色底物为TMB试剂。用酶标仪测定结果，获得OD450nm值，记录数据并保存。绘制宛氏拟青霉代谢物标准品浓度-OD450nm标准曲线，计算样品内增效剂含量。具体步骤如下：
包被：将宛氏拟青霉代谢物标准溶液用碳酸盐包被缓冲液稀释为1、2、5、10、20μg/mL，样品理论浓度为5μg/mL，然后加入酶标板中，每孔100μL，然后放置于4℃冰箱中孵育过夜，第二天上午，从4℃冰箱拿出酶标板，倒掉包被缓冲液，加入100μL洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔，3次，每次洗完都要在滤纸上拍干酶标板里的液体；
封闭：向酶标板加样孔中，加入封闭缓冲液(含1％BSA)，每孔100μL，然后置于37℃恒温干燥箱内孵育2h；倒掉封闭缓冲液，用洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔三次，每次洗完都要在滤纸上拍干酶标板里的液体；
孵一抗：加入稀释的增效剂兔抗血清，稀释倍数为1000倍，每孔100μL，然后置于37℃恒温干燥箱内孵育1h；倒掉一抗溶液，加入100μL洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔，3次，每次洗完都要在滤纸上拍干酶标板里的液体；
孵二抗：向酶标板加样孔中加入稀释后的二抗溶液(山羊抗兔-HRP用二抗稀释液稀释，稀释倍数为1:2500)，每孔100μL，然后置于37℃恒温干燥箱内孵育1h；倒掉二抗溶液，加入100μL洗涤缓冲液PBST洗酶标板加样孔，3次，每次洗完都要在滤纸上拍干酶标板里的液体；
显色：向经孵二抗处理后的酶标板加样孔中加入浓度6.24×10-4M的显色液TMB试剂，每孔100μL，避光静置20min；待显色充分后，加入终止液(1MHCl)，每孔50μL，使显色终止，然后在10min内用酶标仪测定结果，获得OD450nm值，记录数据并保存。
绘制标准曲线：为根据不同浓度的标准增效剂溶液的OD450nm值绘制增效剂OD450标准曲线。
所述计算待测样品增效剂含量：根据OD450标准曲线获得OD450标准曲线方程式，并根据显色获得的待测样品OD450值计算待测样品溶液增效剂浓度值C，然后根据如下公式，计算增效剂含量：
X＝C×VF/M×100％
式中：
X——样品中增效剂含量；
C——根据标准曲线求得的样品中增效剂的质量浓度(mg/ml)；
F——实验过程中增效剂稀释倍数；
M——样品处理前称取质量，单位为毫克(mg)；
V——待测样品溶液2的体积(ml)；
采用上述方法，测定待测样品中宛氏拟青霉代谢物的含量，为检测该方法的准确性，发明人采用3次生物学重复验证，每次采用3次平行测定，取其平均值，计算含量，相关数据如下表1所示：
表1固态尿素中宛氏拟青霉代谢物的痕量测定结果
对比例1
以实施例1为例，该对比例中的检测宛氏拟青霉次级代谢物的方法中，直接采用1kg的固态增效肥料放入100ml水溶液中搅拌、浸泡10min后，过滤，获得含宛氏拟青霉代谢物的溶液，后续操作步骤与实施例1完全一致，测定待测样品中宛氏拟青霉次级代谢物的含量，测得宛氏拟青霉次级代谢物的含量为1.6mg,回收率10.7％，变异系数0.3。
对比例2
以实施例1为例，该对比例中的检测宛氏拟青霉次级代谢物的方法中，预处理步骤(2)中，选取5.0mm大粒径肥料称重1kg，采用100ml水溶液冲洗至溶解前的颗粒粒径值与溶解后的粒径值之差为1mm时，停止溶解，其他操作步骤与实施例1完全一致，测定待测样品中宛氏拟青霉次级代谢物的含量，测得宛氏拟青霉次级代谢物的含量为6.77mg,回收率45.1％，变异系数。
与对比例相比，本发明中的实施例测定的宛氏拟青霉次级代谢物的含量更加精准，回收率更高。
实施例2
该实施例中，测定的固态增效肥料为含腐植酸的尿素，除增效剂标准品为腐殖酸，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中腐殖酸进行检测。
实施例3
该实施例中，测定的固态增效肥料为含黄腐酸的尿素，除增效剂标准品为黄腐酸，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中黄腐酸进行检测。
实施例4
该实施例中，测定的固态增效肥料为含碧护的尿素，除增效剂标准品为碧护，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中碧护进行检测。
实施例5
该实施例中，测定的固态增效肥料为含海藻提取物的尿素，除增效剂标准品为海藻提取物，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中海藻提取物进行检测。
实施例6
该实施例中，测定的固态增效肥料为含甜菜碱的尿素，除增效剂标准品为甜菜碱，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中甜菜碱进行检测。
实施例7
该实施例中，测定的固态增效肥料为含鲜胺脂的尿素，除增效剂标准品为鲜胺脂，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中鲜胺脂进行检测。
实施例8
该实施例中，测定的固态增效肥料为含宛氏拟青霉代谢产物的磷酸氢二铵肥料，其余测定方法步骤与实施例1相同，对待测样品中宛氏拟青霉代谢产物进行检测。
实施例9
将实施例1中的固态增效肥料替换为含宛氏拟青霉代谢产物的硝酸钾肥料，其余与实施例1中操作步骤一致，按照实施例1中的方法，对样品溶液中宛氏拟青霉代谢产物进行检测。
实施例10
将实施例1中的固态增效肥料替换为水溶性含宛氏拟青霉代谢产物的肥料，其余与实施例1中操作步骤一致，按照实施例1中的方法，对样品溶液中宛氏拟青霉代谢产物进行检测。
由于肥料及增效剂的组合众多，此处不一一赘述，需要说明的是，采用本发明测定其他种类肥料中的增效剂，均属于本发明所保护的范围。
本发明提供了酶联免疫法在增效型肥料中痕量增效剂的检测，通过肥料粒径分级，外涂层溶解，高温饱和，低温析出实现大部分肥料杂质的去除，通过三级膜过滤分离系统，实现增效剂大量富集，排除增效型肥料中其他物料对增效剂检测的干扰，制备各增效剂专一性抗体，探明各类增效剂酶联免疫检测条件，真实客观实现肥料中增效剂的定性定量检测。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所述酶联免疫法包括：预处理、增效剂的克隆抗体制备和酶联免疫检测；所述预处理包括：
(1)选取粒径大小均一的固态增效肥料颗粒，制得待检测样品颗粒；
(2)将步骤(1)的待检测样品颗粒用溶剂进行表面溶解，当溶解前的颗粒粒径值与溶解后的粒径值之差为0.2-0.5mm时，停止溶解，将溶解液与颗粒分离，收集颗粒表面的溶液并与溶解液合并，制得待测溶液1；
(3)对步骤(2)制得的待测溶液1进行浓缩，低温结晶，过滤分离处理，制得待测样品溶液2。
2.根据权利要求1所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所述步骤(1)中，固态增效肥料的肥料成分为尿素、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵、硝酸钾、氯化钾、硫酸钾中的任意一种或两种以上任意比的混合物。
3.根据权利要求1所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，待检测样品颗粒与溶剂的质量比为10-20:1；所述溶剂为水溶液、有机溶剂，或水与有机溶剂的混合液；所述有机溶剂为甲醇、乙醇、乙腈、乙醚、石油醚、丙酮、二氯甲烷、氯仿、正丁醇中的一种或两种以上任意比的组合。
4.根据权利要求1所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所述步骤(2)中，收集颗粒表面的溶液的方法为将颗粒表面的溶剂吸附于吸附材料上，然后用溶剂冲洗吸附材料，获得颗粒表面的溶液；溶剂与吸附材料的质量比为1:3-5；吸附材料为活性炭。
5.根据权利要求1所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所示步骤(3)中，浓缩为将待测溶液在50℃-70℃的条件下，浓缩至有结晶析出，制得饱和盐溶液；结晶为将浓缩后的溶液置于4℃-20℃的条件下结晶30-60min；过滤分离处理为采用三级膜分离过滤系统进行分离过滤；所述三级膜分离过滤系统为陶瓷-超滤-纳滤过滤分离系统，其中陶瓷膜规格为200nm、超滤膜规格为1～10kD、纳滤膜规格为150D～600D；过滤时间10～20min。
6.根据权利要求1所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所述增效剂的克隆抗体制备的方法为采用待测增效剂的标准品制备抗体。
7.根据权利要求1所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，所述酶联免疫检测步骤包括包被，封闭，孵一抗，孵二抗，显色，绘制标准曲线和计算待测增效剂含量。
8.根据权利要求7所述的酶联免疫法在固态增效肥料中检测痕量增效剂含量的应用，其特征在于，计算待测增效剂含量的计算公式为X＝C×VF/M×100％，
式中：
X——样品中增效剂含量；
C——根据标准曲线求得的样品中增效剂的质量浓度(mg/ml)；
F——实验过程中增效剂稀释倍数；
M——样品处理前称取质量，单位为毫克(mg)；
V——待测样品溶液2的体积(ml)。
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2019
- 2019-06-19 CN CN201910532111.XA patent/CN112113823B/zh active Active
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Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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