CN110665004A - 一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法 - Google Patents

一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法 Download PDF

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邬丰任
刘永佳
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Abstract

本发明涉及一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法，金纳米花具有多支化结构、粒径为80‑120nm，表面包覆有厚度为8‑15nm聚多巴胺层，该聚多巴胺修饰金纳米花的近红外吸收范围在650‑740nm。通过(1)还原反应制备金纳米花分散液；(2)在金纳米花分散液中加入多巴胺溶液获得。与现有技术相比，本发明合成方便、快捷，只需在碱性条件下在金纳米花中加入多巴胺溶液就可反应，并可通过多巴胺溶液的浓度控制聚多巴胺层的厚度从而影响材料的最大吸收波长。因此，本发明作为光热治疗材料在生物医学领域具有潜在的应用前景。

Description

一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医药纳米材料领域，尤其是涉及一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花及其制备方法。
背景技术
金纳米花(gold nanoflowers，AuNFs)是一类具有支化结构的金纳米颗粒，具有类似花状的分支结构，相比于金纳米球和金纳米棒，金纳米花具有更大的比表面积及更高的反应活性。此外，金纳米花具有稳定性高、生物相容性好且在近红外存在吸收的特点，因此，可作为纳米生物材料应用于载药、成像、光热治疗等生物医学领域。
聚多巴胺(polydopamine，PDA)是一种受到广泛关注的高分子近红外吸收材料，作为人体内黑色素的重要组成，具有很好的生物安全性。在光学性质方面，在紫外光到可见光范围内有宽波段吸收，且光吸收一直延伸至近红外区，其作为光热治疗剂有一定的可行性。利用聚多巴胺修饰金纳米花不仅可以提高光热转换效率，提高近红外吸收范围，同时也能降低金纳米花本身的细胞毒性，并改善其在溶液中的分散性。
聚多巴胺的合成非常简单、方便。在碱性条件下，多巴胺在水溶液中易被溶解氧氧化，从而引发自聚-交联反应，并在任何一种固体材料表面形成紧密附着的复合层。整个过程在水溶液中进行，反应条件温和，对材料表面的改性一步到位，反应易于控制。
因此，合成便捷，具备光热转换效率高，毒性低，分散性好等特点的聚多巴胺修饰金纳米花是一种具有潜在应用前景的新型光热治疗纳米材料。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种光热转换效率高，毒性低，分散性好、可作为光热治疗材料的聚多巴胺修饰金纳米花纳米及其制备方法。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花，其中金纳米花表面包覆有厚度为8-15nm聚多巴胺层，金纳米花和聚多巴胺的质量比为80～90:10～20，优选87:13。
进一步地，所述的金纳米花具有多支化结构、粒径为80-120nm。
进一步地，该聚多巴胺修饰金纳米花的近红外吸收范围在650-740nm。
一种聚多巴胺修饰的金纳米花的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)0℃反应温度条件下，在氯金酸溶液中加入碳酸钾溶液，均匀搅拌过程中加入抗坏血酸溶液，进行第一次还原反应，使金离子形成金种；然后加入盐酸羟胺溶液，再进行第二次还原反应，金离子还原成金原并在原来的金种上持续生长，形成金纳米花，产物经离心分离、洗涤后，在水中重新超声分散，得到金纳米花分散液；
(2)碱性条件下，在金纳米花分散液中加入多巴胺溶液，反应后离心分离、洗涤后、冷冻干燥即获得聚多巴胺修饰金纳米花。
进一步地，步骤(1)中所述的氯金酸溶液的质量浓度为0.5-2％，碳酸钾溶液的浓度为150-250mM，抗坏血酸溶液浓度为1-10mM，氯金酸溶液、碳酸钾溶液和抗坏血酸溶液的体积比为101：2-6：0.01-0.05。
进一步地，步骤(1)中第一次还原反应时间为1-10min，第二次还原反应的时间为1-10min。
进一步地，步骤(1)中盐酸羟胺溶液浓度为5-20mM，盐酸羟胺溶液与氯金酸溶液的体积比为(1-5)：101。
进一步地，步骤(1)中离心转速为5000-8000r/min，时间为5-10min，离心分离、洗涤重复3次，金纳米花分散液在0-4℃下储存。
进一步地，步骤(2)中所述的碱性条件是将金纳米花分散液分散于pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，然后加入多巴胺溶液；所述的多巴胺溶液的浓度为1-5mg/mL。
进一步地，步骤(2)中反应时间为1-5h，离心转速为5000-8000r/min，时间为5-10min，离心分离、洗涤重复3次。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明中的聚多巴胺修饰金纳米花，细胞毒性低，体外细胞实验表明：当浓度达到200μg/mL时，细胞的存活率依然能不低于90％；
(2)本发明中的聚多巴胺修饰金纳米花具有较高的光热转换效率，体内动物实验表明：小鼠体内用808nm激光器照射5min后，温度可升至60℃；
(3)本发明中的聚多巴胺修饰金纳米花利用多巴胺在碱性溶液中发生聚合反应形成聚多巴胺的特性对金纳米花进行修饰，提高了光热转换能力，同时降低细胞毒性，增强分散性。该过程可通过改变多巴胺用量控制金纳米花表面聚多巴胺层厚度从而影响最大吸收波长红移程度；
(4)本发明所述聚多巴胺修饰金纳米花是一种具有较强光热转换能力的新型光热治疗纳米材料。
附图说明
图1为金纳米花与聚多巴胺修饰金纳米花的透射电镜图；
图2为金纳米花和聚多巴胺修饰金纳米花的水合粒径；
图3为金纳米花和聚多巴胺修饰金纳米花的紫外可见光谱；
图4为金纳米花和聚多巴胺修饰金纳米花及多巴胺的红外光谱；
图5为不同浓度的金纳米花和聚多巴胺修饰金纳米花与L929细胞共培养后的MTT结果；
图6为为金纳米花组和聚多巴胺修饰金纳米花组在动物体内的热成像图；
图7为金纳米花与聚多巴胺修饰金纳米花的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
一、原材料
氯金酸(HAuCl4·4H2O)、抗坏血酸(Ascorbic Acid,AA)、盐酸羟胺(hydroxylaminehydrochloride,NH2OH·HCl)、碳酸钾(K2CO3)、盐酸多巴胺(dopamine hydrochloride)、浓盐酸(HCl，37％)、浓硝酸(HNO3，65-68％)、二甲基亚砜(DMSO)、三羟甲基氨基甲烷(Tris(hydroxymethyl)aminomethane,Tris)均购于国药集团化学试剂有限公司；噻唑蓝(MTT)购于Sigma-Aldrich；细胞培养基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、磷酸盐缓冲液(PBS,6.7mM，pH＝7.2-7.4)购于Life Technologies；小鼠成纤维细胞(L929)购于中科院上海细胞所；BALB/c裸鼠购于上海斯莱克公司；实验用水为超纯水(ρ>18MΩ，美国Milli-Q纯水机)。
二.主要设备
紫外可见分光光度计，Evolution 300型，美国Thermo Scientific公司；纳米粒度Zeta电位仪，omni型，美国Brookhaven公司；生物型透射电镜，Tecnai G2 spirit Biotwin型，美国FEI公司；傅里叶变换红外光谱仪，Nicolet 6700型，美国Thermo Fisher公司；酶标仪，Elx800型，美国Bio Tek公司；红外热像仪，Ti125型，美国Fluke公司；808nm激光器，FC-808-5000-MM型，上海滨崎科技有限公司。
实施例1
(1)金纳米花的制备
a.实验所用烧瓶及磁子用王水(浓盐酸:浓硝酸＝3:1)浸泡后用超纯水冲洗并烘干。
b.在0℃条件下将1mL氯金酸加入100mL超纯水中。
c.不断搅拌下加入4mL 200mM K2CO3与20μL 5mM AA溶液。
d.反应5min后快速加入4mL 10mM NH2OH·HCl，10min后反应结束。
e.在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复离心洗涤3次后，超声均匀分散在超纯水中，置于4℃冰箱储存备用。
(2)聚多巴胺修饰金纳米花的制备
a.将制得金纳米花分散于10mL Tris-HCl缓冲液(50mM,pH＝8.5)中。
b.将1mL多巴胺水溶液(1mg/mL)加入上述金纳米花分散液中。
c.反应3小时后在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复洗涤、离心3次后获得的产物分散在超纯水中进行后续表征。
实施例2
(1)金纳米花的制备
a.实验所用烧瓶及磁子用王水(浓盐酸:浓硝酸＝3:1)浸泡后用超纯水冲洗并烘干。
b.在0℃条件下将1mL氯金酸加入100mL超纯水中。
c.不断搅拌下加入4mL 200mM K2CO3与20μL 5mM AA溶液。
d.反应5min后快速加入4mL 10mM NH2OH·HCl，10min后反应结束。
e.在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复离心洗涤3次后，超声均匀分散在超纯水中，置于4℃冰箱储存备用。
(2)聚多巴胺修饰金纳米花的制备
a.将制得金纳米花分散于10mL Tris-HCl缓冲液(50mM,pH＝8.5)中。
b.将1mL多巴胺水溶液(2mg/mL)加入上述金纳米花分散液中。
c.反应3小时后在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复洗涤、离心3次后获得的产物分散在超纯水中进行后续表征。
实施例3
(1)金纳米花的制备
a.实验所用烧瓶及磁子用王水(浓盐酸:浓硝酸＝3:1)浸泡后用超纯水冲洗并烘干。
b.在0℃条件下将1mL氯金酸加入100mL超纯水中。
c.不断搅拌下加入4mL 200mM K2CO3与20μL 5mM AA溶液。
d.反应5min后快速加入4mL 10mM NH2OH·HCl，10min后反应结束。
e.在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复离心洗涤3次后，超声均匀分散在超纯水中，置于4℃冰箱储存备用。
(2)聚多巴胺修饰金纳米花的制备
a.将制得金纳米花分散于10mL Tris-HCl缓冲液(50mM,pH＝8.5)中。
b.将1mL多巴胺水溶液(5mg/mL)加入上述金纳米花分散液中。
c.反应3小时后在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复洗涤、离心3次后获得的产物分散在超纯水中进行后续表征。
对比例1
(1)金纳米花的制备
a.实验所用烧瓶及磁子用王水(浓盐酸:浓硝酸＝3:1)浸泡后用超纯水冲洗并烘干。
b.在0℃条件下将1mL氯金酸加入100mL超纯水中。
c.不断搅拌下加入4mL 200mM K2CO3与20μL 5mM AA溶液。
d.反应5min后快速加入4mL 10mM NH2OH·HCl，10min后反应结束。
e.在6000r/min下离心6min，弃上清，超纯水重复离心洗涤3次后，超声均匀分散在超纯水中，置于4℃冰箱储存进行后续表征。
对实施例1-3和对比例1中的聚多巴胺修饰金纳米花进行：
(1)体外细胞毒性评价
a.将L929细胞以每孔1.0×104个细胞/200μL DMEM培养基接种于96孔板中，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h。
b.细胞完全贴壁后吸出培养基，重新加入200μL DMEM。
c.将对比例中制备金纳米花及实施例1-3制备得到的聚多巴胺修饰金纳米花配置成10、50、100、250、500、1000μg/mL(金纳米花浓度)溶液。
d.将2个样品每个浓度设置6个孔，每孔50μL的量加入孔板中，使样品的最终浓度分别为2、10、20、50、100和200μg/mL。
e.在培养箱中继续培养48h后，吸出每个孔板中的培养液，用PBS清洗2次，在每个孔中分别加入200μL DMEM培养基与20μL 5mg/mL MTT后继续培养3-4小时。
f.吸出DMEM及MTT溶液，每孔加入200μL DMSO，震荡10min后使用酶标仪在490nm波长下检测光密度(OD)值。
(2)使用动物小鼠体内热成像
a.对小鼠进行分组，3只1组，分别是对照组，金纳米花组和聚多巴胺修饰金纳米花组。
b.将PBS(6.7mM，pH＝7.2-7.4)，金纳米花分散液(2mg/mL)和聚多巴胺修饰金纳米花分散液(2mg/mL)皮下注射至对应组小鼠体内。
c.使用激发器以2W/cm2对小鼠注射部位进行照射，共5min；在0min、3min和5min时，使用红外热像仪对小鼠进行拍摄。
本发明涉及金纳米花的合成与聚多巴胺对金纳米花的修饰。金纳米花经聚多巴胺修饰后，细胞毒性降低，水溶液中的分散性提高，同时其最大吸收波长发生红移，近红外吸收范围进一步扩大，光热转换能力得到增强。为便于描述，将对比例1和实施例1-3中的金纳米花和以1、2与5mg/mL多巴胺溶液制得聚多巴胺修饰金纳米花分别以AuNFs、PDA-Au1、PDA-Au2及PDA-Au5表示。
图1(a)-(d)为AuNFs、PDA-Au1、PDA-Au2与PDA-Au5的透射电镜图，金纳米花本身的粒径在100nm左右，进行聚多巴胺修饰后，金纳米花本身的形态基本没有变化，PDA-Au1、PDA-Au2与PDA-Au5反应时多巴胺溶液浓度的比例为1：2：5，对应的聚多巴胺层厚度依次为8.7nm、9.3nm及14.2nm。可见随着反应过程中多巴胺溶液浓度的增大，聚多巴胺层厚度也随之增大，结合图2，金纳米花进行聚多巴胺修饰后水合粒径显著增大，并且随着反应中加入的多巴胺溶液浓度越高，最后制得的纳米粒子水合粒径也越大。
聚多巴胺的修饰可通过红外光谱进行确证。图3为金纳米花，PDA-Au5与多巴胺的红外光谱。通过比较发现，聚多巴胺修饰的金纳米花的光谱上出现了1285cm-1与1500cm-1吸收峰，前者对应聚多巴胺上芳环的吸收，后者对应聚多巴胺上N-H键的剪切振动。
本发明中最重要的现象就是聚多巴胺层的修饰使金纳米花的最大吸收波长发生红移。图4是AuNFs、PDA-Au1、PDA-Au2与PDA-Au5的紫外可见光谱，对应的最大吸收波长分别是652nm、692nm、704nm与737nm。显然，聚多巴胺层越厚，最大紫外吸收峰的红移程度越明显，以AuNFs作为基准，PDA-Au1、PDA-Au2与PDA-Au5的最大吸收峰分别红移了约40、50及80nm。聚多巴胺的修饰有效扩大了金纳米花的最大吸收波长，扩大了其在近红外区的吸收范围，提高了其光热转换能力。
为进一步证明本发明作为生物材料应用的可行性，通过MTT法评价了AuNFs及PDA-Au5对正常细胞L929(小鼠成纤维细胞)48h体外毒性。如图6所示，AuNFs组达到200μg/mL的浓度时，细胞存活率在75％左右。而对于PDA-Au5组，浓度同样升高到200μg/mL时，细胞存活率不低于90％。显然，聚多巴胺的修饰确实降低了金纳米花的细胞毒性，提高了生物相容性。
作为本发明的最主要目的，聚多巴胺修饰金纳米花的光热转换能力通过小鼠实验进行了验证。如图6所示，本发明在动物体内的热成像实验中，动物的给药部位用808nm，2W/cm2照射5min后温度升高至60℃，高于未修饰的金纳米花接近10℃，这一结果表明聚多巴胺的修饰强化了金纳米花的光热转换能力。
因此，本发明是制备金纳米花并进行聚多巴胺修饰，从而降低细胞毒性并进一步提高材料的光热转换能力。金纳米花本身粒径为100nm左右，其表面聚多巴胺层可在8-15nm进行调控。金纳米花经聚多巴胺修饰后，最大吸收波长显著红移，最大可达约80nm，扩大了金纳米花在近红外区的吸收范围，加强了金纳米花的光热转换效率，小鼠体内的热成像实验也表明，经聚多巴胺修饰后，金纳米花的光热转换能力显著提高，在实验小鼠体内，用808nm激光器照射5min后，温度可上升至60℃。其次，本发明在较高浓度下对于正常细胞的毒性较低，200μg/mL时细胞存活率依旧达到接近90％，这表明本发明是一种毒性低，生物相容性良好的生物材料。最后，本发明的合成方便、快捷，只需在碱性条件下在金纳米花中加入多巴胺溶液就可反应，并可通过多巴胺溶液的浓度控制聚多巴胺层的厚度从而影响材料的最大吸收波长。因此，本发明作为光热治疗材料在生物医学领域具有潜在的应用前景。
实施例4
一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花，参考图1，其中金纳米花表面包覆有厚度为8-15nm聚多巴胺层，金纳米花和聚多巴胺的质量比为80:20。其中，金纳米花具有多支化结构、粒径为80-120nm。该聚多巴胺修饰金纳米花的近红外吸收范围在650-740nm。
一种聚多巴胺修饰的金纳米花的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)在0℃环境下，在质量浓度为2％氯金酸溶液中加入浓度为250mM碳酸钾溶液，均匀搅拌过程中加入浓度为10mM抗坏血酸溶液还原反应10min使金离子形成金种；氯金酸溶液、碳酸钾溶液和抗坏血酸溶液的体积比为101：6：0.05；然后加入浓度为20mM盐酸羟胺溶液，再进行还原反应10min，金离子还原成金原并在原来的金种上持续生长，形成金纳米花，产物经离心分离、洗涤重复3次后，离心转速为8000r/min，时间为10min，在水中重新超声分散，得到金纳米花分散液；盐酸羟胺溶液，盐酸羟胺溶液与氯金酸溶液的体积比为5：101。金纳米花分散液在4℃下储存待用。
(2)在金纳米花分散于pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中形成分散液，然后加入多巴胺溶液，反应5h后离心分离、洗涤重复3次后，离心转速为8000r/min，时间为10min、冷冻干燥即获得聚多巴胺修饰金纳米花。多巴胺溶液为pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其浓度为4mg/mL。
实施例5
一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花，参考图1，其中金纳米花表面包覆有厚度为8-15nm聚多巴胺层，金纳米花和聚多巴胺的质量比为90:10。其中，金纳米花具有多支化结构、粒径为80-120nm。该聚多巴胺修饰金纳米花的近红外吸收范围在650-740nm。
一种聚多巴胺修饰的金纳米花的制备方法，该方法包括以下步骤：
(1)在0℃环境下，在质量浓度为0.5％氯金酸溶液中加入浓度为150mM碳酸钾溶液，均匀搅拌过程中加入浓度为1mM抗坏血酸溶液还原反应1min使金离子形成金种；氯金酸溶液、碳酸钾溶液和抗坏血酸溶液的体积比为101：2：0.01；然后加入浓度为5mM盐酸羟胺溶液，再进行还原反应1min，金离子还原成金原并在原来的金种上持续生长，形成金纳米花，产物经离心分离、洗涤重复3次后，离心转速为5000r/min，时间为5min，在水中重新超声分散，得到金纳米花分散液；盐酸羟胺溶液，盐酸羟胺溶液与氯金酸溶液的体积比为1：101。金纳米花分散液在0℃下储存待用。
(2)在金纳米花在金纳米花分散于pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中形成分散液，然后加入多巴胺溶液，反应1h后离心分离、洗涤重复3次后，离心转速为5000r/min，时间为5min、冷冻干燥即获得聚多巴胺修饰金纳米花。多巴胺溶液为pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液，其浓度为3mg/mL。

Claims (10)

1.一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花，其特征在于，其中金纳米花表面包覆有厚度为8-15nm聚多巴胺层，金纳米花和聚多巴胺的质量比为80～90:10～20。
2.根据权利要求1所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花，其特征在于，所述的金纳米花具有多支化结构、粒径为80-120nm。
3.根据权利要求1所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花，其特征在于，该聚多巴胺修饰金纳米花的近红外吸收范围在650-740nm。
4.一种如权利要求1所述的聚多巴胺修饰的金纳米花的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)0℃反应温度条件下，在氯金酸溶液中加入碳酸钾溶液，均匀搅拌过程中加入抗坏血酸溶液，进行第一次还原反应，使金离子形成金种；然后加入盐酸羟胺溶液，再进行第二次还原反应，金离子还原成金原并在原来的金种上持续生长，形成金纳米花，产物经离心分离、洗涤后，在水中重新超声分散，得到金纳米花分散液；
(2)碱性条件下，在金纳米花分散液中加入多巴胺溶液，反应后离心分离、洗涤后、冷冻干燥即获得聚多巴胺修饰金纳米花。
5.根据权利要求4所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的氯金酸溶液的质量浓度为0.5-2％，碳酸钾溶液的浓度为150-250mM，抗坏血酸溶液浓度为1-10mM，氯金酸溶液、碳酸钾溶液和抗坏血酸溶液的体积比为101：2-6：0.01-0.05。
6.根据权利要求4所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)中第一次还原反应时间为1-10min，第二次还原反应的时间为1-10min。
7.根据权利要求4所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)中盐酸羟胺溶液浓度为5-20mM，盐酸羟胺溶液与氯金酸溶液的体积比为(1-5)：101。
8.根据权利要求4所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(1)中离心转速为5000-8000r/min，时间为5-10min，离心分离、洗涤重复3次，金纳米花分散液在0-4℃下储存。
9.根据权利要求4所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的碱性条件是将金纳米花分散液分散于pH＝8.5的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液中，然后加入多巴胺溶液；所述的多巴胺溶液的浓度为1-5mg/mL。
10.根据权利要求4所述的一种具光热转换效应的聚多巴胺修饰金纳米花的制备方法，其特征在于，步骤(2)中反应时间为1-5h，离心转速为5000-8000r/min，时间为5-10min，离心分离、洗涤重复3次。
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