CN113082213A - 一种中空硫化铜纳米药物载体、制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种中空硫化铜纳米药物载体、制备方法及应用。其技术方案是：以二水合氯化铜、聚乙烯吡咯烷酮、氢氧化钠、抗坏血酸和硫化钠为原料，制得黑色固体状的中空硫化铜纳米颗粒。将制备的中空硫化铜纳米颗粒通过铜元素与氮元素的配位作用络合肿瘤化疗药物‑‑四价铂药物和修饰氨基功能化的聚乙二醇端甲醚获得中空硫化铜纳米药物载体。本发明具有操作简单、安全性高、反应条件温和、反应过程可控和成本低廉的特点，所制备的中空硫化铜纳米药物载体亲水性好、尺寸小、有利于体内循环和制备过程中试剂毒性小。

Description

一种中空硫化铜纳米药物载体、制备方法及应用
技术领域
本发明属于纳米药物载体技术领域。基体涉及一种中空硫化铜纳米药物载体、制备方法及应用。
背景技术
使用光吸收剂将光能转换成热能的光热疗法(PTT)可以引起癌细胞的热消融，这已被越来越多地认为是常规癌症治疗方法的有效补充。作为光吸收剂，可以在PTT中使用各种具有高吸光度的纳米材料，包括贵金属纳米材料、碳基纳米材料和半导体纳米材料等。近年来，近红外光(700-1100nm)(NIR)诱导的光热响应纳米材料由于具有安全性高和穿透性强等优势而受到了广泛的关注。目前，许多纳米材料作为光热剂对近红外光具有很强的吸收能力，已被广泛研究以提高光热转换效率并同时提高皮下肿瘤的热杀伤力。此外，单一的光热治疗方法具有上调热休克蛋白含量、需要更高剂量的药物和易复发等缺点。为了克服这些问题，技术人员已经采用了联合其他一些治疗策略，例如化学疗法、光动力疗法、甚至基因疗法来提高癌症治疗效果。
在所有PTT制剂中，硫化铜纳米颗粒因其低毒，简单的制备工艺，特别是高的光热转化效率(Guo Liangran,Li Yajuan,Yan Bingfang,Lu Wei,Hollow Copper SulfideNanoparticle-Mediated Transdermal Drug Delivery,Small,2012,8,3143–3150.)等特性而引起了特别关注。硫化铜作为一种重要的光热剂，已被应用于抗菌、生物医用植入材料和光热成像剂等，同时肿瘤学方面也发挥着重要作用。
纳米硫化铜的合成主要包括：超声合成法、水热法、直接沉淀法和模板法等。这些方法合成的纳米硫化铜具有多种形貌，包括硫化铜纳米片、硫化铜纳米棒、中空硫化铜纳米球、和硫化铜量子点等。目前研究中使用较多的是硫脲水热法和油酸油胺法合成硫化铜纳米颗粒。其合成过程相对而言比较繁琐，且反应过程中涉及到有机溶剂的使用，对环境不友好，且最终的纳米硫化铜存在着形貌不均匀和亲水性差的缺点。“硫化铜纳米复合材料的制备”(CN201611023748)专利技术，其制备过程中使用了油胺油酸等材料，制备的硫化铜纳米材料亲水性差。纳米颗粒的尺寸大小同样影响在生物体内的应用，Li Meng等人(Li Meng,Wang Ying,Lin Huiming,Qu Fengyu,Hollow CuS nanocube as nanocarrier forsynergetic chemo/photothermal/photodynamic therapy.Materials Science&Engineering C,2019,96,591–598)报道了一种以CuO为模板，在水溶液中制备硫化铜空心微球的方法，这种方法制备的硫化铜空心微球的尺寸为250-300nm，可用于载药，但此种方法制备的空心微球很容易在重力的作用下聚沉，若用于生物体，很难在体内循环。“硫化铜纳米药物载体、其构建方法及应用”(CN106267196B)专利技术，该技术使用的聚丙烯酸为有毒物质，水合肼为易制爆试剂，对实验人员存在危险。
综上所述，现有的硫化铜纳米药物载体存在亲水性差，尺寸大，不利于体内循环和制备过程中试剂毒性大等缺点。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种操作简单、安全性高、反应条件温和、反应过程可控、成本低廉的中空硫化铜纳米药物载体的制备方法，用该方法制备的中空硫化铜纳米药物载体亲水性好、尺寸小和有利于体内循环；本发明的另一目的在于提供所述硫化铜纳米药物载体的用途。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
步骤1、室温条件下，将二水合氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮分散在水中，搅拌1～100分钟，得到混合溶液A；其中：所述二水合氯化铜∶所述聚乙烯吡咯烷酮的物质的量比为1∶(0.1～10)。
步骤2、向所述混合溶液A中逐滴滴加氢氧化钠溶液，搅拌1-100分钟，得到混合溶液B；其中：所述二水合氯化铜∶所述氢氧化钠溶液中的氢氧化钠的物质的量比为1∶(0.1～10)。
步骤3、向所述混合溶液B中逐滴滴加抗坏血酸溶液，搅拌1-100分钟，得到混合溶液C。其中：所述二水合氯化铜∶所述抗坏血酸溶液中的抗坏血酸的物质的量比为1∶(0.1～10)。
步骤4、向所述混合溶液C中逐滴滴加硫化钠溶液，搅拌1-100分钟，再于30-90℃条件下水浴1-24h，得到混合溶液D；其中：所述二水合氯化铜∶所述硫化钠溶液中的硫化钠的物质的量比为1∶(0.1～10)。
步骤5、室温条件下，先将所述混合溶液D离心，洗涤，得到黑色固体，所述黑色固体为中空硫化铜纳米颗粒；再将所述黑色固体分散于水中，得到混合溶液E；所述混合溶液E的固液比为0.5～10g/L。
步骤6、室温条件下，将所述混合溶液E置于玻璃器皿中，将四价铂药物加入所述玻璃器皿中，在500-5000rpm条件下搅拌2-48h，得到混合溶液F；其中：所述四价铂药物∶所述混合溶液E中黑色固体的物质的量比为(0.01～1)∶1。
步骤7、室温条件下，向所述混合溶液F中加入氨基功能化聚乙二醇端甲醚，在500-5000rpm条件下搅拌2-48h，得到混合溶液G；其中：所述氨基功能化聚乙二醇端甲醚∶所述混合溶液E中黑色固体的物质的量比为(0.01～1)∶1。
步骤8、室温条件下，将所述混合溶液G离心，洗涤，制得中空硫化铜纳米药物载体。
所述的聚乙烯吡咯烷酮的分子量为2000～20000Da。
所述的氨基功能化聚乙二醇端甲醚中的聚乙二醇的分子量为1000～10000Da。
所述四价铂药物为肿瘤治疗药物序列中的一种：cct-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]，ctc-[Pt(NH3)Cl2Br2]，c,t,c-[PtCl2(OH)(O2CCH2CH2CO2H)(NH3)2]，[PtCl2(NH3)2(OOCCH2CH2CH2CH2CH3)2]，ctc-[Pt(NH3)2(aspirin)(OH)Cl2]，ctc-[Pt(NH3)2(PhB)2Cl2]，ctc-[Pt(NH3)2(ethacrynic acid)2(Cl2)]。
在本发明的一实施方案之中，提供了由前述方法制备中空硫化铜纳米药物载体。
在本发明的一实施方案之中，还提供了所述的中空硫化铜纳米药物载体于制备药物，特别是抗肿瘤药物中的用途。
在本发明的一实施方案之中，还提供了一种具有化疗-热疗-光动力协同治疗功能的药物，其包含所述的中空硫化铜纳米药物载体。
本发明将四价铂药物引入所述中空硫化铜纳米药物载体中，可应用于癌症的化学治疗、光动力学治疗和光热治疗的联合治疗。
本发明的中空硫化铜纳米药物载体具有如下优点：
(1)以二水合氯化铜、聚乙烯吡咯烷酮、氢氧化钠、抗坏血酸和硫化钠为原料，制得的黑色固体为中空硫化铜纳米颗粒；然后以四价铂药物、氨基功能化聚乙二醇端甲醚和中空硫化铜纳米颗粒为原料获得中空硫化铜纳米药物载体。本发明采用的原料毒性小，安全性高。
(2)通过采用无毒和易获得的聚乙烯吡咯烷酮作为活性剂和稳定剂在低温水溶液中合成得到了中空硫化铜纳米颗粒，操作简单，反应条件温和可控，成本低廉；在表面修饰氨基功能化聚乙二醇端甲醚，进一步提高所制备的中空硫化铜纳米药物载体在水溶液中的亲水性。
(3)本发明的中空硫化铜纳米药物载体表面电势为负，负电势有利于纳米药物载体的分散，尺寸在50-100nm，尺寸分布均一和分散均匀，有利于在生物体内循环。
(4)本发明通过铜元素与氮元素的配位作用，制得了基于硫化铜的高生物相容性、高稳定性和尺寸合适的中空硫化铜纳米药物载体，本发明能有效地将硫化铜材料的光动力和光热治疗效果与四价铂药物的化疗联合起来，增强了光动力；制备的中空硫化铜纳米药物载体对正常细胞毒性小，对肿瘤细胞有很强的毒性，能实现肿瘤的光热/光动力/化疗联合治疗。
因此，本发明具有操作简单、安全性高、反应条件温和、反应过程可控和成本低廉的特点，所制备的中空硫化铜纳米药物载体亲水性好、尺寸小、有利于体内循环和制备过程中试剂毒性小。
附图说明
图1为本发明所制备的一种中空硫化铜纳米药物载体的透射电镜(TEM)图；
图2为图1所示的中空硫化铜纳米药物载体在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中的温度变化曲线图；
图3为图1所示的中空硫化铜纳米药物载体与HeLa细胞在光照和谷胱甘肽条件下培养24小时后的细胞毒性实验结果图，数据显示为平均值±SD；
图4为图1所示的中空硫化铜纳米药物载体与HeLa细胞培养4小时后，经光照处理后用钙黄绿素/PI染色的倒置荧光显微镜图；
图5为图1所示的中空硫化铜纳米药物载体与HeLa细胞共培养4小时后，经光照处理后用DCFH-DA处理得到的倒置荧光显微镜图；
图6为图1所示的中空硫化铜纳米药物载体与Hela细胞共培养4小时后，经光照处理后经FITC/PI染色得到的流式细胞术图。
具体实施方式
为了进一步了解本发明，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明保护范围的限制。
实施例
一种中空硫化铜纳米药物载体、制备方法及应用。本实施例所述制备方法的步骤是：
步骤1、室温条件下，将34.2mg的二水合氯化铜和200.0mg的聚乙烯吡咯烷酮(分子量10000)分散在水中，搅拌5分钟，得到混合溶液A；(所述二水合氯化铜∶所述聚乙烯吡咯烷酮的物质的量的比为1∶0.1)。
步骤2、向所述混合溶液A中逐滴滴加4mL的0.2M的氢氧化钠溶液，搅拌5分钟，得到混合溶液B；(所述二水合氯化铜∶所述氢氧化钠溶液中的氢氧化钠的物质的量的比为1∶4)。
步骤3、向所述混合溶液B中逐滴滴加4mL的0.1M的抗坏血酸溶液，搅拌5分钟，得到混合溶液C；(所述二水合氯化铜∶所述抗坏血酸溶液中的抗坏血酸的物质的量的比为1∶2)。
步骤4、向所述混合溶液C中逐滴滴加4mL的1.0M的硫化钠溶液，搅拌5分钟，再于60℃条件下水浴3h，得到混合溶液D；(所述二水合氯化铜∶所述硫化钠溶液中的硫化钠的物质的量的比为1∶2)。
步骤5、室温条件下，先将所述混合溶液D离心，洗涤，得到黑色固体，所述黑色固体为中空硫化铜纳米颗粒；再将所述黑色固体分散于水中，得到混合溶液E；所述混合溶液E的固液比为2g/L。
步骤6、室温条件下，将1mL的所述混合溶液E置于玻璃器皿中，将0.2mg的四价铂药物(cct-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2])加入所述玻璃器皿中，在1000rpm条件下搅拌24h，得到混合溶液F；(所述四价铂药物∶所述混合溶液E中黑色固体的物质的量的比为0.03∶1)。
步骤7、室温条件下，向所述混合溶液F中加入2.0mg的氨基功能化聚乙二醇端甲醚(分子量2000)，在1000rpm条件下搅拌24h，得到混合溶液G；(所述氨基功能化聚乙二醇端甲醚∶所述混合溶液E中黑色固体的物质的量的比为0.05∶1)。
步骤8、室温条件下，将所述混合溶液G离心，洗涤，制得中空硫化铜纳米药物载体。
如下是进一步阐述前述中空硫化铜纳米药物载体的形貌及结构表征，表征手段涉及微观形貌及结构、光学性质研究和肿瘤细胞层面应用。
微观形貌及结构
为直观观察本实施例所制备的中空硫化铜纳米药物载体形貌和大小，以实施例得到的中空硫化铜纳米药物载体作为观察对象：将所述中空硫化铜纳米药物载体溶于水中，得到混合液，然后将所述混合液滴加到铜网上，在室温条件下干燥，并通过TEM(JEM-2100(HR)，200KV)成像。得到图1所示的实施例制备的中空硫化铜纳米药物载体的透射电镜(TEM)图；从图1可以观察到：所制备的中空硫化铜纳米药物载体为中空结构，尺寸较小且形貌均一，大小为50-100nm。
光学性质研究
将实施例得到的中空硫化铜纳米药物载体用磷酸盐缓冲溶液(PBS)配制成浓度为100μg/mL的溶液，然后用808nm、1.5W/cm2的近红外光照射，用FLIR热成像仪记录溶液温度的变化。得到图2所示的中空硫化铜纳米药物载体在pH7.4的磷酸盐缓冲溶液中的温度变化曲线图；从图2可以观察到，于808nm、1.5W/cm2的光照条件下，在5min时，温度由25℃上升到70℃左右，可以达到光热治疗所需要的温度。
肿瘤细胞层面应用
1、用MTT实验来检测所述中空硫化铜纳米药物载体对肿瘤细胞的毒性。将HeLa细胞接种在96孔板的孔中，并在37℃孵育24小时。然后除去旧培养基，将含有10mM谷胱甘肽和100μg/mL的所述中空硫化铜纳米药物载体(CuS@Pt(Ⅳ)@PEG)的培养基加入96孔板的每个孔中。对需要光照处理的HeLa细胞，将含有10mM谷胱甘肽和100μg/mL的CuS@Pt(Ⅳ)@PEG的培养基在生理温度(37℃)下与HeLa细胞一起温育4小时，除去旧的培养基，更换新的培养基。用808nm、1.5W/cm2的近红外光照射处理5min，将HeLa细胞在37℃于黑暗中孵育20小时。将噻唑基蓝四唑溴化物溶液(20μL，5mg/mL)加入96孔板的各孔中，并在37℃条件下孵育4小时。然后向96孔板的每个孔中加入200μL二甲基亚砜。使用酶标仪(Bio-Rad550)在570nm条件下测量溶液的吸光度。得到图3所示的中空硫化铜纳米药物载体与HeLa细胞在光照和谷胱甘肽条件下培养24小时后的细胞毒性实验结果图；从图3观察到：当在光照条件下时，加入CuS和CuS@Pt(Ⅳ)@PEG共培养24h后，加入CuS的HeLa细胞存活率为52.80％，加入CuS@PEG的HeLa细胞存活率51.76％，CuS@Pt(Ⅳ)@PEG的HeLa细胞存活率为37％。经光照处理后，与单独的CuS@PEG和Pt(Ⅳ)相比，CuS@Pt(Ⅳ)@PEG能更有效促进肿瘤细胞死亡。
2、用钙黄绿素实验检测所述中空硫化铜纳米药物载体对肿瘤细胞的光毒性。将增殖好的HeLa细胞以5ⅹ104个细胞/mL的浓度接种于六孔板中。CuS@Pt(Ⅳ)@PEG的浓度为100μg/mL。黑暗条件下将CuS@Pt(Ⅳ)@PEG与HeLa细胞在37℃孵育24小时。对需要光照处理的HeLa细胞，将CuS@Pt(Ⅳ)@PEG在生理温度(37℃)下与HeLa细胞一起温育4小时后，除去CuS@Pt(Ⅳ)@PEG，用808nm、1.5W/cm2近红外光照射处理5min。以上处理后，按照钙黄绿素/PI细胞试剂盒说明书的要求加入钙黄绿素/PI。使用荧光显微镜观察HeLa细胞的活/死情况，活细胞显示绿色，而死细胞显示红色。得到如图4所示中空硫化铜纳米药物载体与HeLa细胞培养4小时后，经光照处理后用钙黄绿素/PI染色的倒置荧光显微镜图；由图4观察到：CuS@Pt(Ⅳ)@PEG处理的HeLa细胞视野可见几乎没有HeLa细胞存活。结果显示制备的CuS@Pt(Ⅳ)@PEG:对HeLa细胞具有光毒性。
3、用二氯荧光素(DCFH-DA)检测所述中空硫化铜纳米药物载体对肿瘤细胞的光动力效果。将增殖好的HeLa细胞以5ⅹ104个细胞/mL的浓度接种于六孔板中。CuS@Pt(Ⅳ)@PEG样品的浓度为100μg/mL。黑暗条件下将CuS@Pt(Ⅳ)@PEG与HeLa细胞在37℃孵育24小时。对需要光照处理的HeLa细胞，将CuS@Pt(Ⅳ)@PEG在生理温度(37℃)下与HeLa细胞一起温育4小时后，除去CuS@Pt(Ⅳ)@PEG，用808nm、1.5W/cm2近红外光照射处理5min。光照处理结束后2h，向六孔板的各个孔中加入预先稀释好的DCFH-DA(浓度为10μM，溶剂为PBS)，随后将六孔板避光放置于37℃培养箱中孵育30min。用倒置荧光显微镜观荧光，有活性氧产生的细胞在视野中为绿色。得到如图5所示的中空硫化铜纳米药物载体与HeLa细胞共培养4小时后，经光照处理后用DCFH-DA处理得到的倒置荧光显微镜图；由图5可以观察到：与CuS@Pt(Ⅳ)@PEG共孵育的HeLa细胞，视野中可以观察到明显的绿色荧光，所制备的CuS@Pt(Ⅳ)@PEG经光照处理后可以在HeLa细胞内产生大量活性氧簇。
4、用流式细胞仪检测所述中空硫化铜纳米药物载体对肿瘤细胞的凋亡影响。将增殖好的HeLa细胞以5ⅹ104个细胞/mL的浓度接种于六孔板中。CuS@Pt(Ⅳ)@PEG样品的浓度为100μg/mL。黑暗条件下将CuS@Pt(Ⅳ)@PEG与HeLa细胞在37℃孵育24小时。对需要光照处理的HeLa细胞，将CuS@Pt(Ⅳ)@PEG在生理温度(37℃)下与HeLa细胞一起温育4小时后，除去CuS@Pt(Ⅳ)@PEG，用808nm、1.5W/cm2近红外光照射处理5min。光照处理结束后2h，将六孔板的各孔中的旧培养液分别收集到不同无菌离心管中，然后用无菌PBS将贴壁HeLa细胞冲洗三次，用胰蛋白酶细胞消化液将六孔板中各孔的HeLa细胞消化后收集，调整六孔板中各孔的HeLa细胞的浓度为1×106个/mL。取1mL细胞悬液，用低温高速离心机在4℃下2000rpm离心3分钟，弃去上清液。
加入1mL预冷的PBS，用移液枪轻轻吹打使HeLa细胞重悬，并用低温离心机在4℃以2000rpm的转速离心3分钟，重复此步骤两遍。再根据FITC/PI细胞检测盒说明书的要求处理HeLa细胞，并在1h内通过流式细胞仪的观察和检测。得到如图6所示的中空硫化铜纳米药物载体与Hela细胞共培养4小时后、经光照处理后用FITC/PI染色得到的流式细胞术图，流式细胞术是一种定量分析细胞凋亡率的检测方法。图6中的四个象限分别代表不同状态的细胞：Q1表示坏死细胞，Q2表示晚期凋亡细胞，Q3代表生存细胞，Q4代表早期凋亡细胞。从图6可以观察到：与CuS@Pt(Ⅳ)@PEG共孵育的细胞存活率为31％。结果证明，制备的中空硫化铜纳米药物载体在光照处理后具有更高的促进肿瘤细胞凋亡的能力。

Claims (6)

1.一种中空硫化铜纳米药物载体的制备方法，其特征在于所述制备方法如下：
步骤1、室温条件下，将二水合氯化铜和聚乙烯吡咯烷酮分散在水中，搅拌1～100分钟，得到混合溶液A；其中：所述二水合氯化铜∶所述聚乙烯吡咯烷酮的物质的量比为1∶(0.1～10)；
步骤2、向所述混合溶液A中逐滴滴加氢氧化钠溶液，搅拌1-100分钟，得到混合溶液B；其中：所述二水合氯化铜∶所述氢氧化钠溶液中的氢氧化钠的物质的量比为1∶(0.1～10)；
步骤3、向所述混合溶液B中逐滴滴加抗坏血酸溶液，搅拌1-100分钟，得到混合溶液C；其中：所述二水合氯化铜∶所述抗坏血酸溶液中的抗坏血酸的物质的量比为1∶(0.1～10)；
步骤4、向所述混合溶液C中逐滴滴加硫化钠溶液，搅拌1-100分钟，再于30-90℃条件下水浴1-24h，得到混合溶液D；其中：所述二水合氯化铜∶所述硫化钠溶液中的硫化钠的物质的量比为1∶(0.1～10)；
步骤5、室温条件下，先将所述混合溶液D离心，洗涤，得到黑色固体；再将所述黑色固体分散于水中，得到混合溶液E；所述混合溶液E的固液比为0.5～10g/L；
步骤6、室温条件下，将所述混合溶液E置于玻璃器皿中，将四价铂药物加入所述玻璃器皿中，在500-5000rpm条件下搅拌2-48h，得到混合溶液F；其中：所述四价铂药物∶所述混合溶液E中黑色固体的物质的量比为(0.01～1)∶1；
步骤7、室温条件下，向所述混合溶液F中加入氨基功能化聚乙二醇端甲醚，在500-5000rpm条件下搅拌2-48h，得到混合溶液G；其中：所述氨基功能化聚乙二醇端甲醚∶所述混合溶液E中黑色固体的物质的量比为(0.01～1)∶1；
步骤8、室温条件下，将所述混合溶液G离心，洗涤，制得中空硫化铜纳米药物载体。
2.根据权利要求1所述中空硫化铜纳米药物载体的制备方法，其特征在于所述的聚乙烯吡咯烷酮的分子量为2000～20000Da。
3.根据权利要求1所述中空硫化铜纳米药物载体的制备方法，其特征在于所述的氨基功能化聚乙二醇端甲醚中的聚乙二醇的分子量为1000～10000Da。
4.根据权利要求1所述一种中空硫化铜纳米药物载体的制备方法，其特征在于所述四价铂药物为肿瘤治疗药物序列中的一种：cct-[Pt(NH3)2Cl2(OH)2]，ctc-[Pt(NH3)Cl2Br2]，c,t,c-[PtCl2(OH)(O2CCH2CH2CO2H)(NH3)2]，[PtCl2(NH3)2(OOCCH2CH2CH2CH2CH3)2]，ctc-[Pt(NH3)2(aspirin)(OH)Cl2]，，ctc-[Pt(NH3)2(PhB)2Cl2]，ctc-[Pt(NH3)2(ethacrynic acid)2(Cl2)]。
5.一种中空硫化铜纳米药物载体，其特征在于所述中空硫化铜纳米药物载体是根据权利要求1-4中任一项所述中空硫化铜纳米药物载体制备方法制备的中空硫化铜纳米药物载体。
6.一种具有化疗-热疗-光动力协同治疗功能的药物，其特征在于包含权利要求5所述的中空硫化铜纳米药物载体。
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