CN109125725B - 一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及制药领域，尤其涉及一种具有磁靶向性的缓释可控光热‑磁热‑抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法。本发明首先以氟化石墨为原料制得部分氟化石墨烯，再以氨基修饰四氧化三铁，后修饰到氟化石墨烯中，然后负载抗癌药物米托蒽醌，得到四氧化三铁‑氟化石墨烯‑米托蒽醌纳米微粒并以其为芯材，以温敏性材料聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶为壁材，得到一种具有磁靶向性的缓释可控光热‑磁热‑抗癌药物协同作用纳米微粒。它能在磁场作用下，靶向到达患病部位，然后在正交磁场和近红外光照射下，通过磁热和光热，使周围温度升高，然后通过聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶为壁材的温敏作用释放药物，并与抗癌药物协同作用高效快速杀死癌细胞。
Description
技术领域
本发明涉及制药领域，尤其涉及一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法。
背景技术
癌症作为威胁人类生命健康的一类重大疾病，长期以来一直是治愈率低而复发、死亡率高。全球癌症的自2008年以来也呈上升趋势，而且近年来由于人们生活压力大、作息饮食无规律、接触致癌因子机会更多等原因，癌症新发病例也呈现了一定的低龄化趋势。手术、放疗、化疗作为目前癌症治疗的主要手段和方式。而这些方式都存在很大的风险，容易给病人带来大的创伤及并发症，同时在杀死癌细胞的同时也容易对正常细胞造成较大损害。提高药物疗效，降低药物的副作用，出现了利用药物载体传递药物的方案。通过化学结合或物理作用包裹药物，并通过药物扩散、药物结合链断裂或载体的降解，药物以一定速率缓慢释放，达到治疗目的，同时可以减少给药次数，提高药物的生物利用度，从而降低药物对全身的毒副作用。
氟化石墨烯不仅继承了石墨烯材料的优异性能，而且具有其他碳材料所不具备的显著优势（如：稳定的顺磁性，稳定的光致发光，氟在医学上特殊的功效），具有作为新型肿瘤药物的载体的潜在价值，同时它还被发现具有良好的光热性。但其疏水性导致的生物相容性差，苛刻的制备条件以及繁琐的合成步骤等因素严重限制了氟化石墨烯在生物领域的应用。所以探究如何将氟化石墨烯应用于生物领域是十分有意义的。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法。本发明首先以氟化石墨为原料制得部分氟化石墨烯，再以氨基修饰四氧化三铁，后修饰到氟化石墨烯中，然后负载抗癌药物米托蒽醌，得到四氧化三铁-氟化石墨烯-米托蒽醌纳米微粒并以其为芯材，以温敏性材料聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶为壁材，得到一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒。它能在磁场作用下，靶向到达患病部位，然后在正交磁场和近红外光照射下，通过磁热和光热，使周围温度升高，然后通过聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶为壁材的温敏作用释放药物，并与抗癌药物协同作用高效快速杀死癌细胞。与单一的磁热或光热或抗癌药物治疗相比，该方法制备的纳米微粒具有良好的靶向性，同时能够产生更短的时间产生更高的热能，更加高效快速地杀死癌细胞。同时还通过温敏性材料聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶包裹药物，可以达到控释效果，达到治疗目的，同时可以减少给药次数，提高药物的生物利用度，从而降低药物对全身的毒副作用。它将有望成为一种很有前途的药物载体，同时该方法不会在后期的实验过程中对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性，实验流程简单、操作方便、不需要苛刻的反应条件和特殊的反应装置。
本发明的具体技术方案为：一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，以g、mg和mL计，包括以下步骤：
1）将9 g-18 g氢氧化钾粉末与3-4 g氟化石墨均匀混合，在氦气保护下加热至250-280 ℃反应1.5-2 h，反应终止后冷却到室温，倒入去离子水中超声处理，离心后，除去上层溶液，过滤洗涤多次，将所得样品于55-65℃下干燥10-12 h。
本发明以廉价的氟化石墨为原料，通过氢氧化钾对氟化石墨进行活化，减少其氟含量的同时，引入共价键修饰的羟基，增强氟化石墨的反应活性，改变了其疏水性。
2）将样品加入18-20 mL浓硫酸中，超声，加热至70-90 ℃，再加入2.5-3 g过硫酸钾和2.5-3 g五氧化二磷，并搅拌3-4 h，再加入500-550 mL离子水，静置一晚后，除去上清液，用去离子水洗涤过滤，55-65 ℃下干燥10-12 h得到预处理的样品。
本发明将步骤1）中活化后的氟化石墨进行预氧化处理，用浓硫酸对其进行差层，增大氟化石墨层间的距离，降低层间范德华力。
3）在22-23 mL浓硫酸和2-5 mL磷酸的混合溶液中加入预处理的样品，在冰水浴中不断搅拌下分批加入5-6 g高锰酸钾，调温至45-55 ℃保温反应10-14 h，依次加入70-80mL去离子水和20-25 mL体积分数为25-35 %的过氧化氢溶液；然后加入35-40 mL体积分数为8-12%的HCl溶液，静置4-5天，除去上清液，取下层微粒加去离子水稀释后离心处理，在35-45 ℃下干燥10-12 h，得到部分氟化石墨烯。
本发明分批次加高锰酸钾可以使反应较为温和，便于控制反应体系温度，防止反应过于猛烈，产生不必要的杂质，同时能在其和磷酸的氧化作用下被硫酸插层，生成氟化石墨-硫酸一阶插层物。通过与水反应，同时水进入层间替代其中的酸从而剥离得到部分氟化石墨烯。
4）取0.3-0.5 g 四氧化三铁纳米粒子加到100-150 mL去离子水中，超声分散，升温至55-65 ℃，在氮气保护下搅拌反应1-1.5 h，期间用0.008 mol·L-1的氢氧化钠溶液维持溶液pH为9-10；后加入体积分数为4-6%的稀盐酸调节溶液至中性，取300-400 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到分散液中，搅拌2-3 h，滴加3-4 mL 氨水，继续反应1-2 h后，静置4-8 h，抽滤，用去离子水洗涤微粒3-4次，55-65 ℃干燥10-14 h，得到纳米颗粒。
本发明将四氧化三铁纳米粒子在pH为是的溶液中搅拌反应进行表面羟基活化，然后再通过氨基偶联剂3-氨丙基三乙氧基硅烷对活化后的四氧化三铁进行修饰得到氨基修饰四氧化三铁纳米粒子。
5）取0.3-0.5 g 部分氟化石墨烯加入至50-75 mL去离子水中，超声处理；后加入0.45-0.5 g的氢氧化钠和0.45-0.5 g的次氯酸钠，超声3-4 h。
本发明利用超声波细胞粉碎机得到在水中均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液，为后面反应带来了方便。同时加入氢氧化钠和次氯酸钠，将部分氟化石墨烯中部分羟基，醛基转化为羧基。
6）对步骤5）中超声后溶液离心并除去上清液，再加入去离子水，超声0.5-1.5 min后得到均匀分散液，加入稀盐酸至调节pH为中性，置于去离子水中透析48-72 h；
7）向步骤6）所得溶液中加入步骤4）所得的纳米颗粒，超声0.5-1 min，边搅拌边加入0.25-0.30 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.25-0.30 g N-羟基琥珀酰亚胺，超声2-2.5 h后，2000-4000 rpm离心3-7 min，除去上层悬浮液，得到下层微粒。
本发明在步骤7）中，通过加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺来对部分氟化石墨烯中的羧基进行活化。以便与氨基修饰四氧化三铁中的氨基进行酰胺反应，从而具有磁靶向功能。
8）将下层微粒加入到20-30 mL去离子水中，使用pH=8的碳酸氢钠溶液对其透析处理，每3-4 h换一次水，48-60 h后转移至去离子水中继续透析24-36 h；得到部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒水溶液；
9）取20-25 mL浓度为15-25 mg/ mL的米托蒽醌溶液缓慢滴入部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒水溶液中；避光搅拌24-30 h，离心，收集微粒，将下层微粒冷冻干燥，得到米托蒽醌-部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒。
步骤9）中，本发明在通过π-π堆积力物理将抗肿瘤药物米托蒽醌负载到氟化石墨烯上。
10）将0.5-1 g聚乙烯吡咯烷酮溶于5-10 mL去离子水中配成溶液；
11）将步骤9）所得纳米微粒分散于5-10 mL二甲基亚砜溶液中，超声1-3 min；
12）将步骤10）中的有机相慢慢滴加到步骤11）所得溶液中，随后加入0.5-1 g阿拉伯胶，1-1.5 mg油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠，超声乳化，得到复乳液。
在步骤10）、12）中，将聚乙烯吡咯烷酮溶于水，与阿拉伯胶在油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠的乳化作用下形成控释系统，基于聚乙烯吡咯烷酮大分子链上的亲水性，使水凝胶都呈现出温度敏感特性；从而通过温度的变化来控制药物的释放。
13）将复乳液逐滴加入到 10-20 mL水中，搅拌，陈化处理0.5-1.5 h，待有机溶剂挥发完全后，离心处理，收集微粒；
14）用去离子水将微粒洗涤2-3次以除去表面残留的试剂，冷冻干燥保存，制得具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒。
作为优选，步骤1）中，超声时间为2-3 h；离心转速为3000-5000 r/m，离心时间为5-10 min；过滤洗涤多次具体为：用碳酸氢钠和去离子水多次洗涤样品，至滤液呈中性。
作为优选，步骤2）中，超声时间为0.5h；
作为优选，步骤3）中，分批加入5-6 g高锰酸钾具体为：每隔15 min加入五分之一的高锰酸钾；
加入70-80 mL去离子水具体为：在在冰水浴及搅拌辅助下，缓慢滴加预冷至0 ℃的去离子水；
静置过程中：每1-2 d除去上清液，加入等量去离子水；
离心处理具体为：使用高速离心机，分别在4000 rpm，6000 rpm，8000 rpm，10000rpm下离心3-4 min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水。
作为优选，步骤4）中，超声分散时间为2 min。
作为优选，步骤5）中，超声处理具体为：利用超声波细胞粉碎机630 W功率下超声波处理3 h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液。
作为优选，步骤6）中，透析具体为：将分散液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于去离子水中透析48-72 h；
步骤8）中，透析具体为：将步骤7）中所得溶液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于碳酸氢钠溶液透析处理，每3-4 h换一次水，48-60 h后将其转移至去离子水中继续透析24-36 h。
作为优选，步骤9）中，离心转速为12000-16000 rpm，离心时间为7-15 min。
作为优选，步骤12）中，超声乳化时间为30 s，振幅为30。
作为优选，步骤13）中，离心转速为14000 r/m，时间为5 min。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明首先以氟化石墨为原料制得部分氟化石墨烯，再以氨基修饰四氧化三铁，后修饰到氟化石墨烯中，然后负载抗癌药物米托蒽醌，得到四氧化三铁-氟化石墨烯-米托蒽醌纳米微粒并以其为芯材，以温敏性材料聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶为壁材，得到一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒。它能在磁场作用下，靶向到达患病部位，然后在正交磁场和近红外光照射下，通过磁热和光热，使周围温度升高，然后通过聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶为壁材的温敏作用释放药物，并与抗癌药物协同作用高效快速杀死癌细胞。与单一的磁热或光热或抗癌药物治疗相比，该方法制备的纳米微粒具有良好的靶向性，同时能够产生更短的时间产生更高的热能，更加高效快速地杀死癌细胞。同时还通过温敏性材料聚乙烯吡咯烷酮和阿拉伯胶包裹药物，可以达到控释效果，达到治疗目的，同时可以减少给药次数，提高药物的生物利用度，从而降低药物对全身的毒副作用。它将有望成为一种很有前途的药物载体，同时该方法不会在后期的实验过程中对细胞产生显著影响，不影响实验结果的科学性，实验流程简单、操作方便、不需要苛刻的反应条件和特殊的反应装置。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
1）将9 g氢氧化钾的粉末与3 g氟化石墨均匀的混合，在氦气保护下加热至250 ℃反应1.5 h。反应终止后冷却到室温，将混合物倒入去离子水中超声2 h。在3000 r/m下离心5-10 min后，除去上层溶液，过滤，用碳酸氢钠和去离子水多次洗涤样品，至滤液呈中性，得到的样品60 ℃干燥10 h。
2）上述干燥好的样品加入18 mL浓硫酸中，超声0.5 h，后加热至70 ℃，再加入2.5g过硫酸钾和2.5 g五氧化二磷，并搅拌3 h。再加入500 mL离子水，静置一晚后，除去上清液，后用去离子水洗涤过滤，60 ℃干燥10 h得到预处理的样品。
3）在22 mL浓硫酸和2 mL磷酸的混合溶液中加上述预处理的样品，在冰水浴中不断的搅拌分批次加入5 g高锰酸钾，每隔15 min加入五分之一。将温度调至50 ℃保温反应12 h，在冰水浴及搅拌辅助下，缓慢滴加70 mL预冷至0 ℃的去离子水，再加入20 mL体积分数为30 %的过氧化氢溶液。然后加入35 mL体积分数为10%的HCl溶液。将产物在烧杯中静置4-5 d，每1-2 d除去上清液，加入等量去离子水。后除去上清液，再取下层微粒加去离子水稀释后离心处理，分别在4000 rpm，6000 rpm，8000 rpm，10000 rpm下离心3 min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水，后在40 ℃下干燥10 h，得到部分氟化石墨烯。
4）取0.3 g 四氧化三铁纳米粒子加到100 mL去离子水中，超声分散2 min，升温至60 ℃，在氮气保护下搅拌反应1 h，期间用氢氧化钠溶液（0.008 mol·L-1）维持溶液pH为9。后加入体积分数为5%的稀盐酸调节溶液至中性，取300 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到分散液中，搅拌2 h，滴加3 mL 氨水，继续反应1 h后，静置6 h，抽滤，用去离子水洗涤微粒3次，60 ℃干燥12 h。
5）取0.3-0.5 g 部分氟化石墨烯加入50 mL去离子水中，利用超声波细胞粉碎机630 W功率下超声波处理2.5 h，得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯；后加入0.45g的氢氧化钠和0.45 g的次氯酸钠，超声3 h；
6）对步骤5）中超声后溶液进行离心并除去上清液，再加入去离子水，超声1 min得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，后将其置于去离子水中将分散液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于去离子水中透析48 h；
7）向步骤6）中透析后的溶液中加入步骤4）中干燥后的纳米颗粒，超声0.5 min，后边搅拌边向混合物中加入0.25 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.25-0.30 g N-羟基琥珀酰亚胺，超声2 h后，3000 rpm离心5 min，除去上层悬浮液。
8）将步骤7）中的下层微粒加入到20 mL去离子水中，后将溶液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于碳酸氢钠溶液（pH=8）进行透析处理，每3 h换一次水，48 h后将其转移至去离子水中继续透析24 h；得到部分四氧化三铁-氟化石墨烯纳米微粒水溶液。
9）取20 mL质量浓度为20 mg/ mL的米托蒽醌缓慢滴入盛有步骤9）中部分氟化石墨烯溶液的烧杯中；避光搅拌24 h，使用冷冻高速离心机，在12000 rpm的转速下离心7min，收集微粒，将下层微粒冷冻干燥，得到米托蒽醌-部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒。
10）将0.5 g聚乙烯吡咯烷酮溶解于5 mL的去离子水中配成溶液。
11）将步骤9）所得的微粒分散于5 mL二甲基亚砜溶液中，超声2 min。
12）将步骤10）中的有机相慢慢滴加到步骤11）所得的溶液中，随后加入0.5 g阿拉伯胶，1 mg油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠，使用超声乳化仪超声30 s，振幅为30。
13）将所述复乳液逐滴加入到 10 mL水中，磁力搅拌，陈化处理1 h，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000 r/m的转速下离心5 min，收集微粒。
14）用去离子水将步骤13）得到的微粒洗涤2次以除去表面残留的试剂，冷冻干燥保存，制得具有磁靶向性缓释可控负载有抗癌药物纳米微粒。
实施例2：
1）将18 g氢氧化钾的粉末与4 g氟化石墨均匀的混合，在氦气保护下加热至280℃反应2 h。反应终止后冷却到室温，将混合物倒入去离子水中超声3 h。在5000 r/m下离心10 min后，除去上层溶液，过滤，用碳酸氢钠和去离子水多次洗涤样品，至滤液呈中性，得到的样品60 ℃干燥10-12 h。
2）上述干燥好的样品加入20 mL浓硫酸中，超声0.5 h，后加热至90 ℃，再加入3 g过硫酸钾和3 g五氧化二磷，并搅拌4 h。再加入550 mL离子水，静置一晚后，除去上清液，后用去离子水洗涤过滤，60 ℃干燥12 h得到预处理的样品。
3）在23 mL浓硫酸和5 mL磷酸的混合溶液中加上述预处理的样品，在冰水浴中不断的搅拌分批次加入6 g高锰酸钾，每隔15 min加入五分之一的高锰酸钾。将温度调至50℃保温反应12 h，在冰水浴及搅拌辅助下，向溶液中缓慢滴加80 mL预冷至0 ℃的去离子水，再加入25 mL体积分数为30 %的过氧化氢溶液。然后加入40 mL体积分数为10%的HCl溶液。将产物在烧杯中静置5 d，每2 d除去上清液，加入等量去离子水。后除去上清液，再取下层微粒加去离子水稀释后，使用高速离心机，分别在4000 rpm，6000 rpm，8000 rpm，10000rpm下离心4 min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水，后在40 ℃下干燥12 h，得到部分氟化石墨烯。
4）取0.5 g 四氧化三铁纳米粒子加到150 mL去离子水中，超声分散2 min，升温至60 ℃，在氮气保护下搅拌反应1.5 h，期间用氢氧化钠溶液（0.008 mol·L-1）维持溶液pH为10。后加入体积分数为5%的稀盐酸调节溶液至中性，取400 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到分散液中，搅拌3 h，滴加4 mL 氨水，继续反应2 h后，静置6 h，抽滤，用去离子水洗涤微粒4次，60 ℃干燥12 h。
5）取0.5 g 部分氟化石墨烯加入75 mL去离子水中，利用超声波细胞粉碎机630 W功率下超声波处理3 h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液；后加入0.5 g的氢氧化钠和0.5 g的次氯酸钠，超声4 h；
6）对步骤5）中超声后溶液进行离心并除去上清液，再加入去离子水，超声1 min得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，后将分散液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于去离子水中透析72 h；
7）向步骤6）中透析后的溶液中加入步骤4）中干燥后的纳米颗粒，超声1 min，后边搅拌边向混合物中加入0.30 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.30 g N-羟基琥珀酰亚胺，超声2.5 h后，3000 rpm离心5 min，除去上层悬浮液。
8）将步骤7）中的下层微粒加入到30 mL去离子水中，后将所得溶液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于碳酸氢钠溶液（pH=8）进行透析处理，每4 h换一次水，60 h后将其转移至去离子水中继续透析36 h；得到部分四氧化三铁-氟化石墨烯纳米微粒水溶液。
9）取25 mL质量浓度为20 mg/ mL的米托蒽醌缓慢滴入盛有步骤9）中部分氟化石墨烯溶液的烧杯中；避光搅拌30 h，使用冷冻高速离心机，在16000 rpm的转速下离心15min，收集微粒，将下层微粒冷冻干燥，得到米托蒽醌-部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒。
10）将1 g聚乙烯吡咯烷酮溶解于10 mL的去离子水中配成溶液。
11）将步骤9）所得的微粒分散于10 mL二甲基亚砜溶液中，超声2 min。
12）将步骤10）中的有机相慢慢滴加到步骤11）所得的溶液中，随后加入1 g阿拉伯胶，1.5 mg油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠，使用超声乳化仪超声30 s，振幅为30。
13）将所述复乳液逐滴加入到 20 mL水中，磁力搅拌，陈化处理1 h，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000 r/m的转速下离心5 min，收集微粒。
14）用去离子水将步骤13）得到的微粒洗涤3次以除去表面残留的试剂，冷冻干燥保存，制得具有磁靶向性缓释可控负载有抗癌药物纳米微粒。
实施例3：
1）将12 g氢氧化钾的粉末与3.5 g氟化石墨均匀的混合，在氦气保护下加热至265℃反应1.5 h。反应终止后冷却到室温，将混合物倒入去离子水中超声2.5 h。在4000 r/m离心7 min，除去上层溶液，过滤，用碳酸氢钠和去离子水多次洗涤样品，至滤液呈中性，得到的样品60 ℃干燥11 h。
2）上述干燥好的样品加入19 mL浓硫酸中，超声0.5 h，后加热至80 ℃，再加入2.75 g过硫酸钾和2.75 g五氧化二磷，并搅拌3-4 h。再加入525 mL离子水，静置一晚后，除去上清液，后用去离子水洗涤过滤，60 ℃干燥11 h得到预处理的样品。
3）在22.5 mL浓硫酸和3.5 mL磷酸的混合溶液中加上述预处理的样品，在冰水浴中不断的搅拌分批次加入5.5 g高锰酸钾，每隔15 min加入五分之一。将温度调至50 ℃保温反应12 h，后在冰水浴及搅拌辅助下，缓慢滴加75 mL预冷至0 ℃的去离子水，再加入22.5 mL体积分数为30 %的过氧化氢溶液。然后加入37.5 mL体积分数为10%的HCl溶液。将产物在烧杯中静置4.5 d，每1.5 d除去上清液，加入等量去离子水，除去上清液，再取下层微粒加去离子水稀释，后使用高速离心机，分别在4000 rpm，6000 rpm，8000 rpm，10000rpm下离心3-4 min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水，后在40 ℃下干燥11 h，得到部分氟化石墨烯。
4）取0.4 g 四氧化三铁纳米粒子加到125 mL去离子水中，超声分散2 min，升温至60 ℃，在氮气保护下搅拌反应1 h，期间用氢氧化钠溶液（0.008 mol·L-1）维持溶液pH为9.5。后加入体积分数为5%的稀盐酸调节溶液至中性，取350 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到分散液中，搅拌2.5 h，滴加3-4 mL 氨水，继续反应1.5 h后，静置6 h，抽滤，用去离子水洗涤微粒3次，60 ℃干燥12 h。
5）取0.4 g 部分氟化石墨烯加入70 mL去离子水中，利用超声波细胞粉碎机630 W功率下超声波处理2.5 h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液；后加入0.45 g的氢氧化钠和0.45 g的次氯酸钠，超声3-4 h；
6）对步骤5）中超声后溶液进行离心并除去上清液，再加入去离子水，超声1 min得到均匀分散液，加入稀盐酸至pH为中性，后将分散液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于去离子水中透析60 h；
7）向步骤6）中透析后的溶液中加入步骤4）中干燥后的纳米颗粒，超声0.5 min，后边搅拌边向混合物中加入0.25 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.25 gN-羟基琥珀酰亚胺，超声2 h后，3000 rpm离心5 min，除去上层悬浮液。
8）将步骤7）中的下层微粒加入到25 mL去离子水中，后将溶液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于碳酸氢钠溶液（pH=8）进行透析处理，每3.5 h换一次水，55 h后将其转移至去离子水中继续透析30 h；得到部分四氧化三铁-氟化石墨烯纳米微粒水溶液。
9）取23 mL质量浓度为20 mg/ mL的米托蒽醌缓慢滴入盛有步骤9）中部分氟化石墨烯溶液的烧杯中；避光搅拌26 h，使用冷冻高速离心机，在14000 rpm的转速下离心10min，收集微粒，将下层微粒冷冻干燥，得到米托蒽醌-部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒。
10）将0.8 g聚乙烯吡咯烷酮溶解于8 mL的去离子水中配成溶液。
11）将步骤9）所得的微粒分散于8 mL二甲基亚砜溶液中，超声2 min。
12）将步骤10）中的有机相慢慢滴加到步骤11）所得的溶液中，随后加入0.8 g阿拉伯胶，1.3 mg油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠，使用超声乳化仪超声30 s，振幅为30。
13）将所述复乳液逐滴加入到 15 mL水中，磁力搅拌，陈化处理1 h，待有机溶剂挥发完全后，使用冷冻高速离心机，在14000 r/m的转速下离心5 min，收集微粒。
14）用去离子水将步骤13）得到的微粒洗涤2次以除去表面残留的试剂，冷冻干燥保存，制得具有磁靶向性缓释可控负载有抗癌药物纳米微粒。
Claims (10)
1.一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，以g、mg和mL计，包括以下步骤：
1）将9 g-18 g氢氧化钾粉末与3-4 g氟化石墨均匀混合，在氦气保护下加热至250-280℃反应1.5-2 h，反应终止后冷却到室温，倒入去离子水中超声处理，离心后，除去上层溶液，过滤洗涤多次，将所得样品于55-65℃下干燥10-12 h；
2）将样品加入18-20 mL浓硫酸中，超声，加热至70-90 ℃，再加入2.5-3 g过硫酸钾和2.5-3 g五氧化二磷，并搅拌3-4 h，再加入500-550 mL离子水，静置一晚后，除去上清液，用去离子水洗涤过滤，55-65 ℃下干燥10-12 h得到预处理的样品；
3）在22-23 mL浓硫酸和2-5 mL磷酸的混合溶液中加入预处理的样品，在冰水浴中不断搅拌下分批加入5-6 g高锰酸钾，调温至45-55 ℃保温反应10-14 h，依次加入70-80 mL去离子水和20-25 mL体积分数为25-35 %的过氧化氢溶液；然后加入35-40 mL体积分数为8-12%的HCl溶液，静置4-5天，除去上清液，取下层微粒加去离子水稀释后离心处理，在35-45℃下干燥10-12 h，得到部分氟化石墨烯；
4）取0.3-0.5 g 四氧化三铁纳米粒子加到100-150 mL去离子水中，超声分散，升温至55-65 ℃，在氮气保护下搅拌反应1-1.5 h，期间用0.008 mol·L-1的氢氧化钠溶液维持溶液pH为9-10；后加入体积分数为4-6%的稀盐酸调节溶液至中性，取300-400 μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷加入到分散液中，搅拌2-3 h，滴加3-4 mL 氨水，继续反应1-2 h后，静置4-8 h，抽滤，用去离子水洗涤微粒3-4次，55-65 ℃干燥10-14 h，得到纳米颗粒；
5）取0.3-0.5 g 部分氟化石墨烯加入至50-75 mL去离子水中，超声处理；后加入0.45-0.5 g的氢氧化钠和0.45-0.5 g的次氯酸钠，超声3-4 h；
6）对步骤5）中超声后溶液离心并除去上清液，再加入去离子水，超声0.5-1.5 min后得到均匀分散液，加入稀盐酸至调节pH为中性，置于去离子水中透析48-72 h；
7）向步骤6）所得溶液中加入步骤4）所得的纳米颗粒，超声0.5-1 min，边搅拌边加入0.25-0.30 g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和0.25-0.30 g N-羟基琥珀酰亚胺，超声2-2.5 h后，2000-4000 rpm离心3-7 min，除去上层悬浮液，得到下层微粒；
8）将下层微粒加入到20-30 mL去离子水中，使用pH=8的碳酸氢钠溶液对其透析处理，每3-4 h换一次水，48-60 h后转移至去离子水中继续透析24-36 h；得到部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒水溶液；
9）取20-25 mL浓度为15-25 mg/ mL的米托蒽醌溶液缓慢滴入部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒水溶液中；避光搅拌24-30 h，离心，收集微粒，将下层微粒冷冻干燥，得到米托蒽醌-部分氟化石墨烯-四氧化三铁纳米微粒；
10）将0.5-1 g聚乙烯吡咯烷酮溶于5-10 mL去离子水中配成溶液；
11）将步骤9）所得纳米微粒分散于5-10 mL二甲基亚砜溶液中，超声1-3 min；
12）将步骤10）所得水溶液慢慢滴加到步骤11）所得有机溶液中，随后加入0.5-1 g阿拉伯胶，1-1.5 mg油酸单乙醇酰胺磺基琥珀酸单酯二钠，超声乳化，得到复乳液；
13）将复乳液逐滴加入到 10-20 mL水中，搅拌，陈化处理0.5-1.5 h，待有机溶剂挥发完全后，离心处理，收集微粒；
14）用去离子水将微粒洗涤2-3次以除去表面残留的试剂，冷冻干燥保存，制得具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒。
2.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤1）中，超声时间为2-3 h；离心转速为3000-5000 r/m，离心时间为5-10 min；过滤洗涤多次具体为：用碳酸氢钠和去离子水多次洗涤样品，至滤液呈中性。
3.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤2）中，超声时间为0.5h。
4.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤3）中，分批加入5-6 g高锰酸钾具体为：每隔15 min加入五分之一的高锰酸钾；
加入70-80 mL去离子水具体为：在在冰水浴及搅拌辅助下，缓慢滴加预冷至0 ℃的去离子水；
静置过程中：每1-2 d除去上清液，加入等量去离子水；
离心处理具体为：使用高速离心机，分别在4000 rpm，6000 rpm，8000 rpm，10000 rpm下离心3-4 min，每次离心后除去离心管中上清液并加入等量去离子水。
5.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤4）中，超声分散时间为2 min。
6.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤5）中，超声处理具体为：利用超声波细胞粉碎机630 W功率下超声波处理3 h得到均匀分散的纳米尺寸的部分氟化石墨烯溶液。
7.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤6）中，透析具体为：将分散液装入规格为8000-14000D的透析袋中置于去离子水中透析48-72 h；
步骤8）中，透析具体为：将步骤7）中所得下层微粒加入到20-30 mL去离子水中，装入规格为8000-14000D的透析袋中置于碳酸氢钠溶液透析处理，每3-4 h换一次水，48-60 h后将其转移至去离子水中继续透析24-36 h。
8.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤9）中，离心转速为12000-16000 rpm，离心时间为7-15min。
9.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤12）中，超声乳化时间为30 s，振幅为30。
10.如权利要求1所述的一种具有磁靶向性的缓释可控光热-磁热-抗癌药物协同作用纳米微粒的制备方法，其特征在于，步骤13）中，离心转速为14000 r/m，时间为5 min。
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