CN110604816B - 一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用，其中，所述纳米诊疗剂包括具有空腔的囊泡及装载在所述空腔内的H2S供体；所述囊泡的材料是由两亲性两嵌段聚合物修饰金纳米颗粒形成的复合物。本发明的聚合物囊泡层镶嵌有金纳米颗粒的复合物囊泡的结构稳定性强，光热转换效率高；其与其空腔中装载的H2S供体形成的纳米诊疗剂具有光控释放的特点，能够在肿瘤部位控制释放出装载的H2S供体；H2S供体在肿瘤酸环境下分解出内源性H2S可实现对肿瘤进行光热治疗与气体治疗的协同治疗，具有高效的肿瘤治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学材料技术领域，尤其涉及一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用。
背景技术
硫化氢(H2S)是一种具有臭鸡蛋气味的无色气体。过去，人们主要偏重于其毒性方面的研究；然而，1989年Goodwin等在鼠、牛及人的大脑中发现有相对较高浓度的内源性H2S，提示了H2S可能有较重要的生理作用。内源性H2S与一氧化氮、一氧化碳类似，是人体内重要的生物信使分子。
近年来研究发现，内源性H2S可选择性地诱导肿瘤细胞调亡，同时又可以保护正常的细胞。但是，H2S供体(例如：硫化铵、硫氢化铵)稳定性差、释放速度较快，而当前常用的聚合物囊泡难以稳定地将H2S供体运输到肿瘤部位，导致H2S供体与聚合物囊泡形成的诊疗剂对肿瘤的治疗效果差。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用，旨在解决当前常用的聚合物囊泡难以稳定地将H2S供体运输到肿瘤部位，导致H2S供体与聚合物囊泡形成的诊疗剂对肿瘤的治疗效果差的问题。
本发明的技术方案如下：
一种纳米诊疗剂，其中，所述纳米诊疗剂包括具有空腔的囊泡及装载在所述空腔内的H2S供体；所述囊泡的材料是由两亲性两嵌段聚合物修饰金纳米颗粒形成的复合物。
所述的纳米诊疗剂，其中，所述两亲性两嵌段聚合物的结构式为
其中，m＝45,n＝200-500。
所述的纳米诊疗剂，其中，所述金纳米颗粒选自金纳米球、金纳米杯、金纳米笼、金纳米棒、金纳米片、金纳米壳、金纳米膜和金纳米花中的一种或多种。
所述的纳米诊疗剂，其中，所述H2S供体选自硫化钠、硫氢化钠、硫代硫酸钠、硫脲、甲硫氨酸、半胱氨酸、硫化铵和硫氢化铵中的一种或多种。
所述的纳米诊疗剂，其中，所述纳米诊疗剂为球形颗粒，其粒径为100-500nm。
一种如上任一所述的纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
A、两亲性两嵌段聚合物、金纳米颗粒在N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中进行交联反应，反应结束后，反应液经固液分离，清洗，得到复合物；
B、复合物与H2S供体进行自组装，得到纳米诊疗剂。
所述的制备方法，其中，步骤A中，所述两亲性两嵌段聚合物、金纳米颗粒的质量比为1:1-5；所述交联反应的时间6-24h。
所述的制备方法，其中，步骤B中，所述自组装的方法选自薄膜水化法、透析法、微流控法中的一种。
所述的制备方法，其中，步骤B中，所述自组装的方法为透析法，所述复合物与H2S供体进行自组装的具体步骤包括：H2S供体溶于有机溶剂形成H2S供体溶液，将复合物加到H2S供体溶液中形成混合液，然后将混合液转移至透析袋中、封口，将装有混合液的透析袋置于超纯水中进行透析。
一种如上任一所述的纳米诊疗剂在制备肿瘤治疗剂中的应用。
有益效果：本发明的聚合物囊泡层镶嵌有金纳米颗粒的复合物囊泡的结构稳定性强，光热转换效率高；其与其空腔中装载的H2S供体形成的纳米诊疗剂具有光控释放的特点，能够在肿瘤部位控制释放出装载的H2S供体；H2S供体在肿瘤酸环境下分解出内源性H2S可实现对肿瘤进行光热治疗与气体治疗的协同治疗，相对于单一的光热治疗或气体治疗，具有更高效的肿瘤治疗效果。
附图说明
图1为本发明实施例1制得的纳米诊疗剂(GV-AH)的SEM图。
图2为本发明实施例1制得的纳米诊疗剂(GV-AH)的水合粒径分布图。
图3为本发明实施例2中，pH＝6.8时，不同浓度的纳米诊疗剂(GV-AH)溶液的产H2S量的变化图。
图4为本发明实施例3中，不同照射条件下，随着纳米诊疗剂(GV-AH)浓度的升高，U-87MG细胞的细胞存活率变化对比图。
具体实施方式
本发明提供一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种纳米诊疗剂，其中，所述纳米诊疗剂包括具有空腔的囊泡及装载在所述空腔内的H2S供体；所述囊泡的材料是由两亲性两嵌段聚合物修饰金纳米颗粒形成的复合物。
本实施例的聚合物囊泡层镶嵌有金纳米颗粒的复合物囊泡的结构稳定性强，光热转换效率高；其与其空腔中装载的H2S供体形成的纳米诊疗剂具有光控释放的特点，能够在肿瘤部位控制释放出装载的H2S供体；H2S供体在肿瘤酸环境下分解出内源性H2S可实现对肿瘤进行光热治疗与气体治疗的协同治疗，相对于单一的光热治疗或气体治疗，具有更高效的肿瘤治疗效果。
在一种实施方式中，所述两亲性两嵌段聚合物的结构式为
其中，m＝45,n＝200-500。该两亲性两嵌段聚合物具有良好的生物相容性和可降解性。
在一种实施方式中，所述金纳米颗粒可选自但不限于金纳米球、金纳米杯、金纳米笼、金纳米棒、金纳米片、金纳米壳、金纳米膜和金纳米花中的一种或多种。在一种优选的实施方式中，所述金纳米颗粒为金纳米球；进一步在一种优选的实施方式中，所述金纳米球的粒径为26nm。
在一种实施方式中，所述H2S供体可选自但不限于硫化钠、硫氢化钠、硫代硫酸钠、硫脲、甲硫氨酸、半胱氨酸、硫化铵和硫氢化铵中的一种或多种。在一种优选的实施方式中，所述H2S供体为硫化铵。硫化铵遇热易分解，在肿瘤酸环境下可快速分解出内源性H2S。
在一种实施方式中，所述纳米诊疗剂为球形颗粒，其粒径为100-500nm。
本发明实施例提供一种如上任一所述的纳米诊疗剂的制备方法，其中，包括步骤：
A、两亲性两嵌段聚合物、金纳米颗粒在N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中进行交联反应，反应结束后，反应液经固液分离，清洗，得到复合物；
B、复合物与H2S供体进行自组装，得到纳米诊疗剂。
本实施例的纳米诊疗剂的制备方法简单，有利于实现大量生产。本实施例的纳米诊疗剂包括具有空腔的囊泡及装载在所述空腔内的H2S供体；其中，囊泡中，两亲性两嵌段聚合物将金纳米颗粒之间的距离拉近，使得囊泡膜中相邻金纳米颗粒间存在表面等离子耦合效应而具有很强的光热作用，可以增强光声和超声成像，自组装形成的囊泡本身具有空腔，可原位装载H2S供体，形成纳米诊疗剂。
在一种实施方式中，步骤A中，所述两亲性两嵌段聚合物、金纳米颗粒的质量比为1:1-5；所述交联反应的时间6-24h。在一种优选的实施方式中，所述交联反应的时间为12h。上述反应条件下，两亲性两嵌段聚合物和金纳米颗粒可进行充分交联。
在一种实施方式中，步骤A中，反应液经固液分离时，所述固液分离的方式可为但不限于离心、过滤。在一种优选的实施方式中，所述固液分离的方式为离心。
在一种实施方式中，步骤A中，所述清洗次数可为但不限于6-12次。在一种优选的实施方式中，所述清洗次数为8次。进一步在一种实施方式中，所述清洗用的溶剂可为但不限于四氢呋喃。上述清洗条件下，可除去绝大部分过量的两亲性两嵌段聚合物，有利于下一步中囊泡的形成。
在一种实施方式中，步骤B中，所述自组装的方法选自薄膜水化法、透析法、微流控法中的一种。在一种优选的实施方式中，步骤B中，所述自组装的方法为透析法，所述复合物与H2S供体进行自组装的具体步骤包括：H2S供体溶于有机溶剂形成H2S供体溶液，将复合物加到H2S供体溶液中形成混合液，然后将混合液转移至透析袋中、封口，将装有混合液的透析袋置于超纯水中进行透析。进一步在一种实施方式中，所述有机溶剂选自四氢呋喃(THF)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亚砜(DMSO)中的一种或多种。进一步在一种优选的实施方式中，所述有机溶剂为二甲基亚砜。采用二甲基亚砜作为溶剂可大大缩短制备纳米诊疗剂时的透析时间，减少H2S供体与空气接触的时间。进一步在一种实施方式中，步骤B中，所述H2S供体溶液中，H2S供体的浓度为0.001-2mM；所述透析的时间0.5-6h。在上述浓度范围内，H2S供体(例如硫化铵)不会干扰囊泡的形成；上述限定的透析时间较短，可减少H2S供体(例如硫化铵)的变质。
本发明实施例还提供一种如上任一所述的纳米诊疗剂在制备肿瘤治疗剂中的应用。
本实施例的纳米诊疗剂具有光控释放的特点，能够在肿瘤部位控制释放出装载的H2S供体；H2S供体在肿瘤酸环境下分解出内源性H2S可实现对肿瘤进行光热治疗与气体治疗的协同治疗，相对于单一的光热治疗或气体治疗，具有更高效的肿瘤治疗效果。
下面通过实施例对本发明进行详细说明。
实施例1纳米诊疗剂(GV-AH)的制备
(1)金纳米颗粒的制备：将250mL的超纯水，500μL浓度为50mg/mL的HAuCl4·3H2O水溶液转入圆底烧瓶中，混合液加热至回流，在稳定的转速下加入10mL浓度为1wt％的柠檬酸钠水溶液进行还原，反应30min，反应液由淡黄色转变为红色，得到粒径为19nm的金纳米颗粒，其形貌为球形；接着将反应温度降至90℃，迅速加入500μL浓度为50mg/mL HAuCl4·3H2O水溶液和10mL的浓度为1wt％的柠檬酸钠水溶液，重复两次，得到粒径为26nm的金纳米颗粒的水溶液，该金纳米颗粒的形貌为球形。
(2)两亲性两嵌段聚合物的制备，制备反应式为
如上式所示，具体制备步骤为：(2a)在圆底烧瓶中加入50mg聚合物1(PEG2000-OH)，770mg己内酯，无水无氧的条件下加入1滴乙酸锡(SnOct)作为引发剂，135℃反应18h，向反应液中加入适量的无水乙醚，有固体析出，固液分离，干燥固体，得聚合物2(PEG-b-PCL)。
(2b)将干燥的400mg聚合物2(PEG-b-PCL)，15mg N,N-二环己基碳酰亚胺(DCC)，2mg 4-二甲氨基吡啶(DMAP)，12mg硫辛酸共同放入三颈瓶中，加入2mL二氯甲烷，反应过夜，反应结束后向液反应液加入适量的正己烷，有固体析出，固液分离，干燥固体，得聚合物3(PEG-b-PCL-TE)，即两亲性两嵌段聚合物，其中，m＝45,n＝200-500。
(3)复合物的制备：取50mL步骤(1)制得的粒径为26nm的金纳米颗粒的水溶液，将其离心浓缩，去掉多余的水溶液，形成浓缩后的金纳米颗粒溶液；将5mg步骤(2)制得的两亲性两嵌段聚合物溶解到10mL N,N-二甲基甲酰胺中，形成两亲性两嵌段聚合物溶液；接着将浓缩后的金纳米颗粒溶液在超声的条件下缓慢的加入到两亲性两嵌段聚合物溶液中，超声1h，然后静置过夜，金纳米颗粒和两亲性两嵌段聚合物充分进行交联反应。反应结束后对反应液进行离心，用四氢呋喃进行清洗，重复清洗8次，得到复合物。
(4)纳米诊疗剂(GV-AH)的制备：将步骤(3)制得的10mg复合物溶于10mL浓度为1mM的硫化铵的二甲基亚砜溶液中，形成混合液。取2mL混合液转移至透析袋中，两端封住，将透析袋放入超纯水中透析1h，得到纳米诊疗剂(GV-AH)。
该纳米诊疗剂(GV-AH)的扫描电镜(SEM)测试结果如图1所示；可知其形貌为球形。将该纳米诊疗剂(GV-AH)分散到1mL超纯水中，使用马尔文纳米粒度电位仪(型号为MalvernNano-ZS)对其水合粒径进行测试，其水合粒径分布情况如图2所示，可知该纳米诊疗剂(GV-AH)的水合粒径平均值为219.9nm，粒径分布指数(PDI)小于0.2；表明该实施例制得的纳米诊疗剂(GV-AH)粒径分布窄，尺寸均匀。
实施例2纳米诊疗剂(GV-AH)产H2S的性能评价
配置不同浓度(12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL 200μg/mL、400μg/mL)的pH＝6.8的纳米诊疗剂溶液，使用808nm的激光器照射10min，功率为1W/cm2；用标准甲基蓝显色法测量溶液中的H2S的含量。
根据标准图谱对照，计算所产生H2S的含量；同种条件(pH＝6.8)下，不同浓度的纳米诊疗剂溶液的产H2S量变化如图3所示，可知，随着纳米诊疗剂的浓度的升高，纳米诊疗剂溶液的产H2S量逐渐增大。
实施例3采用标准的MTT法评价光热与内源性H2S对U-87MG细胞的协同治疗
将U-87MG细胞(人脑星形胶质母细胞瘤细胞)以每孔5×103密度接种到的96孔板(孔中均含有DMEM培养基)中，并于37℃、体积浓度为5％的CO2条件下培育24h。接着吸出96孔板中的旧培养基，分为两组，向每组的孔中分别加入含有不同浓度的纳米诊疗剂(GV-AH)(0、18.75μg/mL、37.5μg/mL、75μg/mL、150μg/mL、300μg/mL)的DMEM培养基，继续培养24h后；吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔加入100μL DMEM培养基；然后选择其中一组作为光照组,对光照组的每一个孔都使用808nm的激光器照射5min，功率为1W/cm2；另一组作为对照组，不进行光照，培养5min。之后对两组进行同样的操作：吸出96孔板中的旧培养基，在每个孔中加入100μL含10wt％MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide)的培养基溶液，继续培养1h。
然后在Bio-Tel EL×800型酶标仪上检测每孔的OD490值(检测波长为490nm时测试得的光密度(optical density)值)，按照公式：细胞存活率(％)＝(样品的OD490值/空白OD490值)×100％，计算U-87MG细胞的存活率。在不同照射条件下，随着纳米诊疗剂(GV-AH)浓度的升高，U-87MG细胞的细胞存活率变化变化对比如图4所示。可知随着纳米诊疗剂(GV-AH)浓度的升高，U-87MG细胞的存活率会逐渐降低，表明纳米诊疗剂(GV-AH)产生内源性H2S对U-87MG细胞有一定的杀伤作用；可知相对于未进行光照组的U-87MG细胞，进行808nm的激光器照射组的U-87MG细胞的存活率呈显著地降低，表明光照与纳米诊疗剂(GV-AH)对肿瘤(U-87MG细胞)的协同治疗效果更显著。
综上所述，本发明提供一种纳米诊疗剂及其制备方法与应用。本发明的聚合物囊泡层镶嵌有金纳米颗粒的复合物囊泡的结构稳定性强，光热转换效率高；其与其空腔中装载的H2S供体形成的纳米诊疗剂具有光控释放的特点，能够在肿瘤部位控制释放出装载的H2S供体；H2S供体在肿瘤酸环境下分解出内源性H2S可实现对肿瘤进行光热治疗与气体治疗的协同治疗，具有高效的肿瘤治疗效果。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种纳米诊疗剂，其特征在于，所述纳米诊疗剂包括具有空腔的囊泡及装载在所述空腔内的H2S供体；所述囊泡的材料是由两亲性两嵌段聚合物修饰金纳米颗粒形成的复合物。
2.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述两亲性两嵌段聚合物的结构式为
其中，m＝45,n＝200-500。
3.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述金纳米颗粒选自金纳米球、金纳米杯、金纳米笼、金纳米棒、金纳米片、金纳米壳、金纳米膜和金纳米花中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述H2S供体选自硫化钠、硫氢化钠、硫代硫酸钠、硫脲、甲硫氨酸、半胱氨酸、硫化铵和硫氢化铵中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的纳米诊疗剂，其特征在于，所述纳米诊疗剂为球形颗粒，其粒径为100-500nm。
6.一种如权利要求1-5任一所述的纳米诊疗剂的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、两亲性两嵌段聚合物、金纳米颗粒在N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中进行交联反应，反应结束后，反应液经固液分离，清洗，得到复合物；
B、复合物与H2S供体进行自组装，得到纳米诊疗剂。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤A中，所述两亲性两嵌段聚合物、金纳米颗粒的质量比为1:1-5；所述交联反应的时间6-24h。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述自组装的方法选自薄膜水化法、透析法、微流控法中的一种。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤B中，所述自组装的方法为透析法，所述复合物与H2S供体进行自组装的具体步骤包括：H2S供体溶于有机溶剂形成H2S供体溶液，将复合物加到H2S供体溶液中形成混合液，然后将混合液转移至透析袋中、封口，将装有混合液的透析袋置于超纯水中进行透析。
10.一种如权利要求1-5任一所述的纳米诊疗剂在制备肿瘤治疗剂中的应用。
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