CN115444942B - 一种纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用，所述纳米抗菌光热材料包括：聚多巴胺/金光热复合纳米粒子、包裹于所述聚多巴胺/金光热复合纳米粒子表面的磷脂分子修饰的红细胞膜、以及连接于所述磷脂分子的细菌靶向分子。其中聚多巴胺/金光热复合纳米粒子在近红外II区具有光热效应，可以利用光热效应杀死细菌；其表面包裹的红细胞膜来源方便，易于提取，免疫原性低，能够极大延长纳米材料在血液环境的循环时间，不易被免疫系统识别清除，生物相容性好；而且利用表面靶向修饰基团能够捕捉血液中的致病细菌，进一步提高材料的抗菌效果。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有细菌靶向功能的纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用。
背景技术
金黄色葡萄球菌感染已经成为世界范围内的健康问题，它是菌血症相关感染的主要原因，细菌随着血液流动，可能会导致深部组织器官感染，比如心内膜炎、骨髓炎、肺部感染、化脓性关节炎和败血症等。这使金黄色葡萄球菌菌血症，成为全球最严重的细菌感染之一。目前，菌血症主流的治疗方法是抗生素治疗，但其因细菌耐药性的出现使其治疗难度越来越大。因此，迫切希望开发出新的治疗方法以应用于抗菌领域。
光热疗法由于具有无创性、无耐药性以及深层组织穿透性等优势，引起人们日益关注。近红外光谱窗口中有两个常用的治疗窗口，一个是近红外I区窗口，波长范围650-950nm；另一个是近红外II区窗口，波长范围1000-1350nm。在近红外光的照射下，光热材料的温度会快速升高进而破坏细菌膜和蛋白质，导致细菌死亡。值得一提的是，近红外II区窗口比近红外I区窗口具有更深的组织穿透力。
红细胞膜(CM)对纳米材料的表面修饰已经引起人们的广泛关注，用红细胞膜成份包覆纳米材料并参与血液循环时，将极大延长纳米材料在血液环境的循环时间，不易被免疫系统识别清除，提升材料的血液相容性，进而实现药物的高效运输以提升治疗效果。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用，尤其涉及一种具有细菌靶向功能的纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种纳米抗菌光热材料，所述纳米抗菌光热材料包括：聚多巴胺/金光热复合纳米粒子、包裹于所述聚多巴胺/金光热复合纳米粒子表面的磷脂分子修饰的红细胞膜、以及连接于所述磷脂分子的细菌靶向分子。
本发明所涉及的纳米抗菌光热材料中的聚多巴胺/金光热复合纳米粒子在近红外II区具有光热效应，可以利用光热效应杀死细菌；其表面包裹的红细胞膜来源方便，易于提取，免疫原性低，能够极大延长纳米材料在血液环境的循环时间，不易被免疫系统识别清除，生物相容性好；而且利用表面靶向修饰基团能够捕捉血液中的致病细菌，进一步提高材料的抗菌效果。本发明开发的对纳米材料进行CM及APT的修饰技术有望成为一种通用的修饰方法，用于提高纳米材料的生物相容性及靶向选择性，对纳米药物载体的设计提供了一个新思路，使该类纳米药物载体在生物医药及医疗卫生领域发挥重要作用。
优选地，所述磷脂分子包括二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺、二油酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺或胆固醇聚乙二醇马来酰亚胺中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述细菌靶向分子包括特异性识别金黄色葡萄球菌的核酸适配体。
第二方面，本发明提供一种根据第一方面所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，所述制备方法包括：
(1)将聚多巴胺/金光热复合纳米粒子与磷脂分子修饰的红细胞膜共混，超声，挤压，得到红细胞膜/聚多巴胺/金纳米粒子；
(2)将红细胞膜/聚多巴胺/金纳米粒子与细胞靶向分子混合孵育，得到所述纳米抗菌光热材料。
本发明提供了上述纳米抗菌光热材料的制备方法，通过对材料表面的特异性修饰，能够应用于清除血液中感染的细菌。首先制备出在近红外II区具有光热效应的聚多巴胺/金纳米粒子(PDA/Au NPs)，以及从血液中提取空化的CM；使用功能磷脂与CM融合，用融合后的CM对聚多巴胺/金纳米粒子表面进行包覆(CM-(PDA/Au)NPs)，并且在材料表面修饰一种能够靶向识别细菌的靶向分子。该靶向分子与功能磷脂偶联后，修饰在光热材料的外表面，能够赋予材料靶向识别细菌的功能。
优选地，步骤(1)所述超声的功率为80-140W，例如80W、90W、100W、110W、120W、130W、140W等；超声的时间为2-10min，例如2min、3min、4min、5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，步骤(1)所述挤压使用100-300nm孔径滤膜，例如100nm、120nm、150nm、200nm、250nm、300nm等；挤压的次数为5-7次，例如5次、6次、7次。
优选地，步骤(2)所述孵育在2-8℃(例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等)下进行12-24h(例如12h、15h、18h、20h、22h、23h、24h等)。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述聚多巴胺/金光热复合纳米粒子的制备方法包括：
将多巴胺与氯金酸共混于缓冲液中，搅拌，离心洗涤，重悬，即得。
优选地，所述缓冲液为Tris-base溶液。
优选地，所述搅拌的温度为15-35℃，例如15℃、18℃、20℃、22℃、25℃、28℃、30℃、35℃等；搅拌的时间为8-10h，例如8h、8.5h、9h、9.5h、10h等；搅拌的速率为400-600rpm，例如450rpm、500rpm、550rpm等。
优选地，所述离心的速率为10000-15000rpm，例如10000rpm、11000rpm、12000rpm、13000rpm、14000rpm、15000rpm等；离心的时间为15-20min，例如15min、16min、17min、18min、19min、20min等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，所述磷脂分子修饰的红细胞膜的制备方法包括：
将血液用缓冲液离心洗涤，收集红细胞，然后加入低渗溶液溶血，用低渗溶液离心洗涤，超声，挤压，收集空化的红细胞膜囊泡；再将空化的红细胞膜囊泡与磷脂分子溶液混合振荡，即得。
优选地，所述离心的温度为2-8℃，例如2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等；离心的时间为5-10min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min等；离心的速率为2000-4000rpm，例如2000rpm、2500rpm、3000rpm、3500rpm、4000rpm等。
优选地，所述超声的功率为80-120W，例如80W、90W、100W、110W、120W等；超声的时间为5-10min，例如5min、6min、7min、8min、9min、10min等。
优选地，所述挤压使用100-300nm孔径滤膜，例如100nm、120nm、150nm、200nm、250nm、300nm等；挤压的次数为15-25次，例如15次、18次、20次、22次、23次、25次等。
优选地，所述磷脂分子溶液的溶剂包括甲醇、乙醇或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述磷脂分子与溶剂的比例为(1-5)mg:200μL。
优选地，所述振荡的温度为30-50℃，例如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃等；振荡的时间为1-3h，例如1h、1.5h、2h、2.5h、3h等；振荡的速率为100-200rpm，例如100rpm、120rpm、150rpm、180rpm、200rpm等。
上述各项数值范围内的其他具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
第三方面，本发明提供一种根据第一方面所述的纳米抗菌光热材料在制备光热杀菌材料或光热杀菌药物中的应用。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明所涉及的纳米抗菌光热材料中的聚多巴胺/金光热复合纳米粒子在近红外II区具有光热效应，可以利用光热效应杀死细菌；其表面包裹的红细胞膜来源方便，易于提取，免疫原性低，能够极大延长纳米材料在血液环境的循环时间，不易被免疫系统识别清除，生物相容性好；而且利用表面靶向修饰基团能够捕捉血液中的致病细菌，进一步提高材料的抗菌效果。本发明开发的对纳米材料进行CM及APT的修饰技术有望成为一种通用的修饰方法，用于提高纳米材料的生物相容性及靶向选择性，对纳米药物载体的设计提供了一个新思路，使该类纳米药物载体在生物医药及医疗卫生领域发挥重要作用。
附图说明
图1是本发明所涉及的纳米抗菌光热材料的制备过程示意图；
图2是实施例1制备的PDA/Au NPs的透射电镜图；
图3是实施例1制备的CM-(PDA/Au)NPs的透射电镜图；
图4是实施例1制备的PDA/Au NPs、CM和CM-(PDA/Au)NPs的zeta电位图；
图5是实施例2进行光热测试的温度变化曲线图；
图6是实施例2进行光热测试的热成像图；
图7是实施例3进行光热测试的光热效果曲线图；
图8是实施例4进行光热杀菌的光热效果曲线图；
图9是实施例4进行的光热杀菌后培养过夜的培养皿图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例提供一种纳米抗菌光热材料，其制备方法如下：
(1)制备PDA/Au NPs
取14.4mg多巴胺溶于3.6mL去离子水中，另取87mg Tris-base溶于72mL去离子水中，另取7.2mg氯金酸溶于7.2mL去离子水中。于25℃搅拌的条件下将多巴胺水溶液加入到Tris-base水溶液中，搅拌3分钟后，加入氯金酸水溶液，搅拌8小时后，离心洗涤3次，去离子水重悬。
(2)制备空化的CM
取5mL小鼠血液，3000转/min、4℃离心5min，然后用1×PBS溶液洗涤5次以去除血清。将红细胞重悬于0.25×PBS溶液中溶血1h以诱导细胞膜破裂，9000转/min、4℃离心7min除去上清液，然后用0.25×PBS溶液洗涤3次，120W超声5min后使用挤压器挤压过200nm膜19次，-20℃保存备用。
(3)制备磷脂分子修饰的CM
将步骤(2)中提取的CM解冻摇匀。取250μL悬液加入750μL1×PBS溶液重悬，将3mg二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺加入到200μL甲醇溶液中溶解，再加入到红细胞膜悬液中，37℃、150rpm振荡2h，得到磷脂分子修饰的CM。
(4)将磷脂分子修饰的CM包裹在PDA/Au NPs表面形成CM-(PDA/Au)NPs
将步骤(3)制备的囊泡悬液与PDA/Au NPs溶液体积比1:2混合，120W超声5min后使用挤压器挤压过200nm膜5次，10000rpm离心10min，1×PBS洗涤，得到CM-(PDA/Au)NPs。
(5)制备APT修饰的纳米抗菌光热材料
将步骤(4)制备的CM-(PDA/Au)NPs与10OD金黄色葡萄球菌的APT(核酸序列为：GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCATCCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA)在4℃的条件下孵育12h，得到APT修饰的APT-CM-(PDA/Au)NPs，即所述纳米抗菌光热材料。
上述制备过程的示意图如图1所示。
本实施例制备的PDA/Au NPs和CM-(PDA/Au)NPs的透射电镜图像分别如图2和图3所示，由图2和图3可知：Au表面衬度较低的部分是聚合在其表面的PDA形成的壳，将CM包裹在图2粒子表面后形成了包裹完好的CM-(PDA/Au)NPs。
本实施例制备的PDA/Au NPs、CM和CM-(PDA/Au)NPs的zeta电位图如图4所示，由图4可知：制备完成的CM-(PDA/Au)NPs表面电位与PDA/Au NPs表面电位不同而与细胞膜表面电位相同，说明PDA/Au NPs表面完全被CM包裹。
实施例2
将50mm厚的鸡胸组织放置在内置有实施例1制备的CM-(PDA/Au)NPs的1×PBS分散液的比色皿和激光源(照射功率为1.5W/cm2)之间，分别在808nm和1064nm处的红外光下进行光照，通过分散液的升温程度来模拟深层组织的光热性能。，照射时间为25min，照射距离为10cm。
结果如图5和图6所示，可知：在808nm光源的照射下，溶液升温10℃左右，而在1064nm处的光源在同等条件下升温20℃左右，说明同等条件下该材料在1064nm处具有更好的光热响应。在50mm厚鸡胸组织遮挡的情况下，相对于808nm的光源，1064nm光源照射的分散液升温效果明显，具有更加良好的穿透深度。
实施例3
为对比合成后的材料与合成前的各种原材料产生的光热效果，将实施例1制备的CM-(PDA/Au)NPs、PDA/Au NPs和CM以相同质量浓度分散在1×PBS中，在1064nm处照射功率为1.25W/cm2的红外光下进行光热性能的测试，PBS作为对照。，照射时间为15min，照射距离为10cm。
光热效果曲线图如图7所示，由图7可知：CM的分散液与PBS都没有明显的升温效果，PDA/Au NPs的分散液的升温效果明显，而包被了细胞膜形成的CM-(PDA/Au)NPs升温效果虽然略次于PDA/Au NPs的分散液的升温效果，但由于细胞膜的包裹，其生物相容性大大提升。对于治疗效果的收益明显提升。
实施例4
将实施例1制备的APT-CM-(PDA/Au)NPs与CM-(PDA/Au)NPs分散在1×PBS中，通过投入分散均匀的金黄色葡萄球菌分散液(108CFU/mL)使不带有APT和带有APT的CM-(PDA/Au)NPs通过吸附作用和识别作用分别捕获金黄色葡萄球菌12h后，将分散液离心，离心转速为1200rpm，取离心后底物重悬，进行光热杀菌测试，PBS作为对照组。照射功率为1.25W/cm2，照射时间为15min，照射距离为10cm。照射完毕，稀释，涂培养皿，37℃培养24h。
光热效果曲线图如图8所示，由图8可知：带有APT的CM-(PDA/Au)NPs由于抓获细菌，在同等离心转速下损失在上清液中的物质较少，故升温温度相对于未抓获细菌而损失较多的CM-(PDA/Au)NPs来说要更高。PBS对照组由于只有细菌接收激光能量，升温效果最差。
本实施例进行光热杀菌后培养24h后的培养皿图片如图9所示，由图9可知：带有APT的CM-(PDA/Au)NPs由于抓获了细菌并升温效果明显，细菌被彻底消除；而不带有APT的CM-(PDA/Au)NPs由于只有吸附作用吸附了少量细菌且升温效果未达到导致细菌完全死亡的温度，培养皿中出现少量菌落。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种纳米抗菌光热材料及其制备方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (16)
1.一种纳米抗菌光热材料，其特征在于，所述纳米抗菌光热材料包括：聚多巴胺/金光热复合纳米粒子、包裹于所述聚多巴胺/金光热复合纳米粒子表面的磷脂分子修饰的红细胞膜、以及连接于所述磷脂分子的细菌靶向分子；
所述磷脂分子为二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-马来酰亚胺；
所述细菌靶向分子为特异性识别金黄色葡萄球菌的核酸适配体，其序列为GCAATGGTACGGTACTTCCTCGGCACGTTCTCAGTAGCGCTCGCTGGTCAT CCCACAGCTACGTCAAAAGTGCACGCTACTTTGCTAA；
所述纳米抗菌光热材料由包括如下的方法制得：
(1)将聚多巴胺/金光热复合纳米粒子与磷脂分子修饰的红细胞膜共混，超声，挤压，得到红细胞膜/聚多巴胺/金纳米粒子；
(2)将红细胞膜/聚多巴胺/金纳米粒子与细胞靶向分子混合孵育，得到所述纳米抗菌光热材料；
所述聚多巴胺/金光热复合纳米粒子的制备方法为：将多巴胺与氯金酸共混于缓冲液中，搅拌，离心洗涤，重悬，即得。
2.根据权利要求1所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
(1)将聚多巴胺/金光热复合纳米粒子与磷脂分子修饰的红细胞膜共混，超声，挤压，得到红细胞膜/聚多巴胺/金纳米粒子；
(2)将红细胞膜/聚多巴胺/金纳米粒子与细胞靶向分子混合孵育，得到所述纳米抗菌光热材料；
所述聚多巴胺/金光热复合纳米粒子的制备方法为：将多巴胺与氯金酸共混于缓冲液中，搅拌，离心洗涤，重悬，即得。
3.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述超声的功率为80-140W，超声的时间为2-10min。
4.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述挤压使用100-300nm孔径滤膜，挤压的次数为5-7次。
5.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述孵育在2-8℃下进行12-24h。
6.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述缓冲液为Tris-base溶液。
7.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述搅拌的温度为15-35℃，搅拌的时间为8-10h，搅拌的速率为400-600rpm。
8.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述离心的速率为10000-15000rpm，离心的时间为15-20min。
9.根据权利要求2所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述磷脂分子修饰的红细胞膜的制备方法包括：
将血液用缓冲液离心洗涤，收集红细胞，然后加入低渗溶液溶血，用低渗溶液离心洗涤，超声，挤压，收集空化的红细胞膜囊泡；再将空化的红细胞膜囊泡与磷脂分子溶液混合振荡，即得。
10.根据权利要求9所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为2-8℃，离心的时间为5-10min，离心的速率为2000-4000rpm。
11.根据权利要求9所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述超声的功率为80-120W，超声的时间为5-10min。
12.根据权利要求9所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述挤压使用100-300nm孔径滤膜，挤压的次数为15-25次。
13.根据权利要求9所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述磷脂分子溶液的溶剂包括甲醇、乙醇或二甲基亚砜中的任意一种或至少两种的组合。
14.根据权利要求13所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述磷脂分子与溶剂的比例为(1-5)mg:200μL。
15.根据权利要求9所述的纳米抗菌光热材料的制备方法，其特征在于，所述振荡的温度为30-50℃，振荡的时间为1-3h，振荡的速率为100-200rpm。
16.根据权利要求1所述的纳米抗菌光热材料在制备光热杀菌材料或光热杀菌药物中的应用。
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