CN115645545B - 一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法及应用 - Google Patents
一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒制备方法及应用，制备方法包括人体黑发来源的原料通过碱提取法制备出头发纳米颗粒，利用头发纳米颗粒的主要构成物质—黑色素，对肝癌进行光热治疗。通过挤推法制备红细胞膜，并通过超声融合法给红细胞膜修饰cRGD多肽并将头发纳米颗粒裹入其中，可以有效增强头发纳米颗粒对肿瘤区域的靶向性、延长血液循环时间和提高生物兼容性。与现有的无机、有机纳米颗粒相比，cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒均来源于人体或小鼠的生物体内，属于天然生物材料，具有制备快捷、造价便宜、绿色环保、人体毒性低等特点，对肝癌的治疗精确性高、疗效显著，在肿瘤精准治疗领域具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医用材料领域，具体涉及一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法和应用。
背景技术
肝癌是目前最常见恶性肿瘤之一，严重威胁人类的生命和健康。近年来肝癌的外科治疗、介入治疗、药物治疗、放射治疗等均取得了显著的进步，但单一的治疗方法已出现“天花板效应”，亟需更精准的靶向治疗手段以进一步提高肝癌的治疗。
近年来，纳米医学技术在药物递送领域受到极大的关注和广泛应用，其中基于红细胞膜包裹的纳米材料是研究最多、应用最广的一种。红细胞来源于机体自身，具有极高的生物相容性和生物安全性。利用红细胞与免疫细胞之间存在的识别、对话机制，通过细胞膜修饰移用到纳米材料中，便能够以此获得伪装来逃避免疫细胞对纳米载体的清除，提高纳米颗粒的血液半衰期，以递送多种药物至靶器官/组织。
通常，纳米载体通过EPR效应被动靶向至肿瘤部位的效果有限，为提高给药系统的靶向性，采用一些小的靶向基团或配体来修饰纳米载体表面，可有效促进药物靶向递送至肿瘤部位并促进细胞摄取。因为αvβ3整合素受体在多种肿瘤血管内皮细胞中高度表达，精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD环肽，cRGD)序列是已知的αvβ3整合素靶向序列，因此，通过cRGD序列靶向肿瘤细胞αvβ3整合素受体，可促进肿瘤细胞的摄取纳米颗粒。
人的头发具有许多种功能，从保护皮肤到社会交往等方方面面都起着相应的作用，因此它被许多科学领域所广泛研究，包括医学、生物学等领域的研究。并且头发可以被处理成纳米颗粒(HNP)，具备良好的光热转换能力，在生物材料领域有着广阔的前景亟待开发。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒，相比现有的靶向肝癌的纳米治疗载体，具有更好的靶向能力，并且可结合光热杀伤肿瘤。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：第一方面，本发明提供了一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，通过碱提取法从人体头发中制备出头发纳米颗粒，并通过挤推法得到红细胞膜，之后再用超声融合法以cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒，得到一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒。
进一步地，以质量比2：1的比例取头发纳米颗粒与cRGD多肽修饰的红细胞膜进行融合，超声水浴将头发纳米颗粒包裹入cRGD多肽修饰的红细胞膜中。
进一步地，超声水浴条件为220W,冰水浴20分钟。
进一步地，所述头发纳米颗粒的粒径和cRGD多肽修饰的红细胞膜粒径均小于100nm。
进一步地，头发纳米颗粒的制备过程包括：将人体来源的头发剪碎，加入热碱性溶液中用玻璃棒搅拌至完全溶解，再依次经过离心、透析、蒸干、超声的过程后，得到所述的头发纳米颗粒。
进一步地，所述加热后的碱性溶液温度为80℃，碱性溶液为1M NaOH溶液，搅拌时间为5分钟；透析条件为7000kD分子量截留，1×PBS溶液中透析24小时；搅拌条件为在磁力搅拌器中100rpm/min转速，室温搅拌1.5小时；离心条件为2000rpm/min离心6分钟后取上清，将上清12000rpm/min离心10分钟后取黑色沉淀，用ddH2O溶液清洗后再次重复12000rpm/min离心2次，每次10分钟；超声条件为用520W功率的超声探头在冰水浴中震碎头发微米颗粒1小时，条件为超声开3秒，停1秒。
进一步地，cRGD多肽修饰的红细胞膜制备过程包括：摘眼球法取小鼠血液至抗凝管，离心后抽取最下层血细胞至低渗PBS溶液破碎红细胞，高速离心收集红细胞膜过挤推器，得到均匀粒径的红细胞膜溶液；取DSPE-PEG-cRGD粉末加入红细胞膜溶液，超声水浴将cRGD多肽嵌入红细胞膜中。
进一步地，离心血液速度为3000rpm/min，时间为15分钟，温度为4℃；低渗PBS溶液浓度为25％(v/v)；裂解条件为冰上2小时，高速离心转速为12000rpm/min，时间为10分钟，温度为4℃；挤推器孔径为400nm；称量DSPE-PEG-cRGD的量为，每1mL小鼠血液对应2mg粉末，超声水浴条件为220W,冰水浴5分钟。
第二方面，本发明还提供了一种基于上述方法制备的cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒。
第三方面，本发明还提供了一种基于所述cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒在制备靶向杀伤肝癌肿瘤的药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1)本发明提供了一种基于红细胞膜包裹的头发纳米颗粒，红细胞膜可以将纳米颗粒伪装成内源性物质，保留原细胞膜结构的相应功能和表面理化特性，可以躲避免疫学上的识别，如减少网状内皮系统的摄取等，提高抗免疫清除能力，具有更好的血液长循环能力。纳米颗粒表面具有cRGD修饰，能够增加对于肝癌等肿瘤的靶向能力，增加肿瘤细胞吞噬纳米颗粒；
2)头发作为纳米颗粒的核心，有良好的光热转换能力，在808nm的激光照射下，放出大量的热能，对于肿瘤有较强的杀伤能力；
3)红细胞膜以及头发均来源于天然生物，制作出的材料组合的生物兼容性高、毒性低，造价便宜，反应的环境温和，操作便捷，反应非常稳定。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图做简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。
图1为本发明的头发纳米颗粒HNP的制备过程示意图。
图2红细胞膜RBCM-cRGD的制备过程示意图。
图3为HNP的透射电镜图像。
图4为RBCM-cRGD的透射电镜图像。
图5为HNP@RBCM-cRGD的透射电镜图像。
图6为HNP、RBCM-cRGD以及HNP@RBCM-cRGD的平均Zeta电位值统计图。
图7为RBCM表面特殊红细胞蛋白成分CD47的示意图。
图8为制备成HNP@RBCM-cRGD后蛋白表达丰度的鉴定。
图9为HNP以及HNP@RBCM-cRGD在808nm激光器照射下的体外升温曲线。
图10为HNP以及HNP@RBCM-cRGD在808nm激光器光照下的热稳定性(1.0W/cm2,0.5mg/mL)示意图。
图11为不同肿瘤细胞Hepa 1-6，CT26，PANC-2的整合素αv的蛋白表达水平。
图12为免疫荧光下RBCM-cRGD-DiI对不同肿瘤细胞的亲和性(标尺＝50μm)。
图13为HNP@RBCM-cRGD在体外杀伤肿瘤细胞的效果(50μg/mL，808nm激光器，1.0W/cm2)。
图14和图15为HNP@RBCM-cRGD在裸鼠荷瘤情况下杀伤肿瘤效果和量化情况(1.5mg/mL,200μL，808nm激光器，1.0W/cm2)。
图16为PBS、HNP、RBCM-cRGD以及HNP@RBCM-cRGD在体外细胞的安全性研究(20μg/mL)。
图17为PBS、HNP、RBCM-cRGD以及HNP@RBCM-cRGD在注射后第1天和第30天体内的肝肾功能测定(1.5mg/mL)。
图18为PBS、HNP、RBCM-cRGD以及HNP@RBCM-cRGD在注射后第1天和第30天体内各大重要器官的安全性研究(1.5mg/mL，标尺＝100μm)。
具体实施方式
下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。
实施例1：如图1所示，头发纳米颗粒的制备：
1)称取2.0g成年人未经过处理的黑发剪碎，剪至约2-3mm。配置100mL 1M的NaOH溶液常压下在烧杯中加热至80℃，将碎发加入烧杯中用玻璃棒快速搅拌5分钟，使其溶解，然后冷却至室温。准备7000kb分子量的透析袋将冷却后的头发溶液加入，透析袋两端用封口夹夹紧，分装至2-3个透析袋中，配置5L的1×PBS溶液，避光放入PBS中透析24小时。透析结束后，倒出头发溶液在磁力搅拌器中室温避光搅拌1.5小时，磁力搅拌器的转速为100rpm/min。然后在2000rpm/min转速下离心，离心时间为6分钟，离心后取上清。取上清后加30mL 1×PBS溶液吹打混匀后继续离心，转速为12000rpm/min，离心时间为10分钟，取上清继续重复12000rpm/min离心10分钟3次，得到头发微米颗粒溶液，在常压下60℃进行蒸干，得到头发微米颗粒。
2)称量头发微米颗粒，取200mg头发微米颗粒加入1mL纯水后呈分散态，在冰水浴中用超声探头震碎头发微米颗粒，功率为520W，开3秒，停1秒，持续1小时，得到头发纳米颗粒溶液，即HNP，浓度为200mg/mL，备用，如图3所示，为制备得到的HNP的透射电镜图像。
实施例2：如图2所示，修饰cRGD多肽的小鼠红细胞膜制备：
1)通过摘眼球法采取2只8周龄C57雄性小鼠血液，用EDTA管收集，采集约4mL匀摇置于冰上。EDTA管于4℃离心机离心后，条件为3000rpm/min，15分钟，小心吸取底部红细胞，注意避免吸到淡黄色上层，将底部红细胞等分成2份置于2管30mL的1×PBS溶液中轻柔吹吸，12000rpm/min条件下4℃离心机离心15分钟，弃去上清，保留沉淀。PBS重复清洗3次，离心条件为12000rpm/min条件下4℃离心15分钟，离心后收集沉淀。清洗完毕后置于冰上，加入220mL 25％(v/v)PBS溶液裂解红细胞，体积为小鼠血液的55倍，每半小时吹打混匀。2小时后，将红细胞裂解液离心，12000rpm/min条件下4℃离心机离心10分钟弃上清。加入PBS清洗2次使膜沉淀，离心条件为12000rpm/min条件下4℃离心10分钟，离心后得到最终红细胞膜沉淀，将红细胞膜溶液通过400nm膜孔径的Avanti挤推器连续挤推11次，得到呈囊泡形态的红细胞膜溶液(RBCM)1mL，并进行蛋白定量，明确溶液浓度为10mg/mL。按实验需求短期存放于4℃冰箱，长期则存放于-80℃冰箱。
2)称量聚乙二醇功能化修饰多肽(DSPE-PEG-cRGD)粉末8mg，加入80μL的1×PBS溶液溶解。随后，加入1mL呈囊泡形态的红细胞膜溶液(RBCM)中，用220W超声水浴锅进行冰水浴超声处理5分钟，则可得到cRGD多肽修饰的红细胞膜溶液，即RBCM-cRGD，如图4所示，为制备得到的RBCM-cRGD的透射电镜图像。
实施例3：修饰RGD的小鼠红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备：
1)取200μL头发纳米颗粒(HNP)与1mL cRGD多肽修饰的红细胞膜RBCM-cRGD混合，进行220W超声水浴锅进行冰水浴超声处理20分钟，可获得cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒，即HNP@RBCM-cRGD，如图5所示，为HNP@RBCM-cRGD的透射电镜图像，HNP、RBCM-cRGD以及HNP@RBCM-cRGD的平均Zeta电位值统计图如图6所示，RBCM表面特殊红细胞蛋白成分CD47如图7所示，HNP@RBCM-cRGD后蛋白表达丰度如图8所示。从图5可以看到RBCM-cRGD紧紧包裹在HNP外层，图6平均Zeta电位值提示RBCM-cRGD对HNP的包覆是明确的。图7表明，RBCM在嵌入cRGD后其红细胞标志性分子CD47的表达没有改变，且细胞骨架蛋白β-actin的缺失提示了膜提取的成功。图8表明包覆HNP不会影响RBCM-cRGD的膜蛋白丰度，即不影响RBCM-cRGD的生物学功能。
实施例4：修饰cRGD多肽的小鼠红细胞膜包裹头发纳米颗粒的体内、外实验
1)体外实验中测定PBS、RBCM-cRGD、HNP和HNP@RBCM-cRGD的光热效果，如图9和图10所示，808nm激光照射下，PBS组和RBCM-cRGD组的升温稍高于室温，单纯HNP组具有良好的升温效果，且0.5mg/mL浓度的HNP比0.2mg/mL浓度的升温效果好，可以从40℃升至68℃。HNP组(0.5mg/mL)最高温为68.4℃，与HNP组相比，HNP@RBCM-cRGD最高温为64.9℃；关闭激光器后，HNP@RBCM-cRGD和HNP组均可以恢复室温。这说明包膜后，HNP的光热性能依然保持良好并且有优异的光稳定性。
2)由于红细胞膜连接cRGD多肽可以靶向整合素αvβ3，考虑到肿瘤组织表面高表达的整合素αvβ3，可用来增强红细胞膜包裹材料后，对肝脏肿瘤组织的靶向性图11和图12。在增强靶向性的同时，由于红细胞来源于机体自身，具有极高的生物相容性和生物安全性。通过细胞膜修饰移用到纳米材料中，便能够以此获得伪装来逃避免疫细胞对纳米载体的清除，增加纳米材料的在血液中的循环时间，以递送多种药物。在体外细胞实验中(图13)，808nm激光照射下(1.0W/cm2)，HNP@RBCM-cRGD相比PBS、RBCM-cRGD和HNP组对肝癌细胞的的杀伤效果最明显，肿瘤细胞死亡率超过半数以上。在体内裸鼠移植瘤中，HNP@RBCM-cRGD由于对肿瘤的靶向优势得到了体现，局部升温情况优于HNP组。并且从治疗效果上看，808nm激光器照射进行光热治疗后，HNP@RBCM-cRGD+激光治疗肝癌的效果是最好的，比单纯HNP+激光的效果更好；激光组的肿瘤大小总体低于非激光组(图14和图15)。
实施例5：修饰cRGD多肽的小鼠红细胞膜包裹头发纳米颗粒的生物安全性
1)为了考察天然生物材料组合HNP@RBCM-cRGD在体外细胞的生物安全性，以50μg/mL的浓度在肝癌细胞中孵育PBS、RBCM-cRGD、HNP和HNP@RBCM-cRGD12小时，测定细胞活性发现没有统计学差异(图16)。
2)为了考察天然生物材料组合HNP@RBCM-cRGD在体内的生物安全性，将PBS、RBCM-cRGD、HNP和HNP@RBCM-cRGD按照治疗剂量尾静脉注射至8周龄ICR鼠体内，并于注射后第1天和第30天取血清测定肝肾功能以及对重要脏器进行石蜡包埋切片，如对心、肝、脾、肺、肾、脑进行H&E染色判断是否存在结构改变。图17提示，在注射PBS、RBCM-cRGD、HNP和HNP@RBCM-cRGD后的第1天和第30天的各组之间肝肾功能没有明显的差异；图18提示，在治疗后的第1天和第30天，PBS、RBCM-cRGD、HNP和HNP@RBCM-cRGD组的重要器官没有明显的结构改变。由此可见，HNP和HNP@RBCM-cRGD具有良好的生物安全性。
上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明作出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，其特征在于，将人体来源的头发剪碎，加入热碱性溶液中用玻璃棒搅拌至完全溶解，再依次经过透析、离心、蒸干、超声的过程后，从人体头发中制备出头发纳米颗粒，并通过挤推法得到红细胞膜，取DSPE-PEG-cRGD粉末加入红细胞膜溶液，超声水浴将cRGD多肽嵌入红细胞膜中；之后再用超声融合法以cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒，得到一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒；
加热后的碱性溶液温度为80 ℃，碱性溶液为1M NaOH溶液，搅拌时间为5分钟；透析条件为7000 kD分子量截留，1 × PBS溶液中透析24小时；透析结束后在磁力搅拌器中100rpm/min转速，室温搅拌1.5小时；离心条件为2000 rpm/min离心6分钟后取上清，将上清12000 rpm/min离心10分钟后取黑色沉淀，用ddH2O溶液清洗后再次重复12000 rpm/min离心2次，每次10分钟；超声条件为用520 W功率的超声探头在冰水浴中震碎头发微米颗粒1小时，条件为超声开3秒，停1秒。
2.根据权利要求1所述的一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，其特征在于，以质量比2：1的比例取头发纳米颗粒与cRGD多肽修饰的红细胞膜进行融合，超声水浴将头发纳米颗粒包裹入cRGD多肽修饰的红细胞膜中。
3.根据权利要求2所述一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，其特征在于，超声水浴条件为220 W,冰水浴20分钟。
4.根据权利要求1所述的一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述头发纳米颗粒的粒径和cRGD多肽修饰的红细胞膜粒径均小于100 nm。
5.根据权利要求1所述的一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，其特征在于，cRGD多肽修饰的红细胞膜制备过程包括：摘眼球法取小鼠血液至抗凝管，离心后抽取最下层血细胞至低渗PBS溶液破碎红细胞，高速离心收集红细胞膜过挤推器，得到均匀粒径的红细胞膜溶液。
6.根据权利要求5所述的一种cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹头发纳米颗粒的制备方法，其特征在于，离心血液速度为3000 rpm/min，时间为15分钟，温度为4°C；低渗PBS溶液浓度为25%（v/v）；裂解条件为冰上2小时，高速离心转速为12000 rpm/min，时间为10分钟，温度为4°C；挤推器孔径为400 nm；称量DSPE-PEG-cRGD的量为，每1 mL小鼠血液对应2 mg粉末，超声水浴条件为220 W,冰水浴5分钟。
7.一种基于权利要求1-6任一项所述方法制备的cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒。
8.一种基于权利要求7所述cRGD多肽修饰的红细胞膜包裹的头发纳米颗粒在制备靶向杀伤肝癌肿瘤的药物中的应用。
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