CN115015542A - 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法 - Google Patents

一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN115015542A
CN115015542A CN202210402234.3A CN202210402234A CN115015542A CN 115015542 A CN115015542 A CN 115015542A CN 202210402234 A CN202210402234 A CN 202210402234A CN 115015542 A CN115015542 A CN 115015542A
Authority
CN
China
Prior art keywords
colloidal gold
chitosan
solution
zinc oxide
detection line
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202210402234.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN115015542B (zh
Inventor
王洪波
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jilin Xunzhun Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Jilin Xunzhun Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jilin Xunzhun Biotechnology Co ltd filed Critical Jilin Xunzhun Biotechnology Co ltd
Priority to CN202210402234.3A priority Critical patent/CN115015542B/zh
Publication of CN115015542A publication Critical patent/CN115015542A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN115015542B publication Critical patent/CN115015542B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56944—Streptococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56927—Chlamydia
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56933—Mycoplasma
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56938—Staphylococcus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法，属于医疗检测装置领域。样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜和吸收垫分别粘贴在塑料板，所述免疫硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫胶体金玻璃纤维膜搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接；所述免疫硝酸纤维素膜上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、设置第四检测线T4、第五检测线T5、第六检测线T6和质控线C。本发明可实现呼吸道感染性疾病的灵敏、特异、全面快速检测。置操作简便，不需要专业人员操作，实用性强，检测成本低。

Description

一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法
技术领域
本发明涉及医疗检测装置领域，特别涉及一种肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、MP、CP的IgM抗体联合检测装置及其制备方法，利用胶体金免疫层析技术以及捕获法原理定量检测全血、血清、血浆标本中人肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的IgM抗体的检测装置及其制备方法，可实现呼吸道感染性疾病的灵敏、特异、全面快速检测。
背景技术
肺炎是指终末气道、肺泡和肺间质的炎症，可由病原微生物、理化因素、免疫损伤、过敏及药物所致；细菌性肺炎是最常见的肺炎，也是最常见的感染性疾病之一，患者常有发烧、咳嗽、呼吸困难等典型表现；细菌性肺炎如肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、甲型溶血性链球菌、肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌肺炎和鲍曼不动杆菌等；非典型病原体所致肺炎如军团菌、支原体和衣原体等。
肺炎链球菌于1881年首次由巴斯德(Louis Pasteur)及G.M.Sternberg分别在法国及美国从患者痰液中分离出。为革兰染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的荚膜。肺炎链球菌肺炎是由肺炎链球菌引起的肺部炎症。肺炎链球菌至今仍然是社区获得性肺炎(CAP)的主要致病原。近年来，随着抗菌药物的广泛应用，肺炎链球菌的耐药性发生了变化，从而使本病的起病方式、临床表现和影像学改变均变得不典型，治疗方案也发生变化。
流感嗜血杆菌是一种对人有致病性的细菌，一般寄居于正常人上呼吸道，当菌数呈异常生长时能够引起原发性化脓性感染和呼吸道继发感染；本菌通过呼吸道在人与人之间传播，也可通过孕妇产道感染；流感嗜血杆菌以冬季带菌率较高，全年均可发病，本病遍布世界各国；以病人和鼻咽带菌者为传染源；呼吸道分泌物通过空气、飞沫和密切接触、孕妇产道进行传播。流感杆菌由鼻咽部侵入血流，引起化脓性脑膜炎，也可由中耳炎和乳突炎等引起脑膜炎；人群普遍易感，婴幼儿、免疫力低下为主要好发人群，5岁以下儿童是该病的高危人群；流感嗜血杆菌较广泛地寄居于正常人的上呼吸道,该病主要由呼吸道分泌物通过空气飞沫和密切接触进行传播，在咽喉部获得感染,可导致咽喉无症状携带,并可持续数月,在感染者中少数人发生侵袭性疾病。
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus)，有"嗜肉菌"的别称，是革兰氏阳性菌的代表，可引起许多严重感染；金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在，空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到，因此，食品受其污染的机会很多；金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点：季节分布，多见于春夏季；中毒食品种类多，如奶、肉、蛋、鱼及其制品；此外，剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道；上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83％，所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。
肺炎克雷伯杆菌是一种致病性细菌，通常在中老年人群中发生，主要表现是急性肺炎，症状是发热，伴有咳嗽和咳痰的症状。肺炎克雷伯杆菌是肠杆菌科克雷伯氏菌属中最为重要的一类菌(俗称肺炎杆菌)，其所致疾病占克雷伯氏菌属感染的95％以上。常存在于人体上呼吸道和肠道，当机体抵抗力降低时，便经呼吸道进入肺内而引起大叶或小叶融合性实变，是肠杆菌科克雷伯菌属中对人致病性较强的重要条件致病菌和医源性感染菌。在院内感染的败血症中，克雷白杆菌以及绿脓杆菌和沙雷菌等均为重要病原菌，病死率较高。
肺炎是一种常见的呼吸内科疾病。肺炎由于病原体不同分为很多类型。支原体肺炎和衣原体肺炎就是两种常见的肺炎。支原体肺炎和衣原体肺炎都会出类似的临床症状，但是它们是有区别的。支原体肺炎和衣原体肺炎就是两种常见的肺炎。虽然支原体肺炎和衣原体肺炎会出现一些相同的症状，但是它们是有区别的。支原体肺炎和衣原体肺炎在致病原因，临床症状，治疗方法等方面都有所不同。患了肺炎一定要进行及时的治疗。支原体肺炎和衣原体肺炎的致病原因是不一样的。支原体肺炎的主要病原为肺炎支原体。而衣原体肺炎由衣原体感染引起的。支原体肺炎和衣原体肺炎都是通过呼吸道分泌物进行传播的。支原体肺炎和衣原体肺炎的临床症状也是不一样的。支原体肺炎常见的症状包括发热、厌食、咳嗽、畏寒、头痛、咽痛、胸骨下疼痛等。多数患者咳嗽重，初期干咳，随后有痰。婴儿患者会出现喘鸣及呼吸困难。重症患者可能会出现胸腔积液、肺不张，纵隔积气、气胸、坏死性肺炎等并发症。而衣原体肺炎早期表现为上呼吸道感染症状。患者会出现发热、寒战、肌痛、干咳，非胸膜炎性胸痛，头痛、不适和乏力等症状。相对支原体肺炎来说，衣原体肺炎的症状较轻。
肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、MP、CP临床治疗方案有所差异，因此需要进行鉴别诊断出究竟是哪种致病因素，然后针对性治疗；因此肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、MP、CP的IgM抗体联合定性检测项目能够及时、便捷、精准、全面检测出感染了哪种病毒，给临床诊疗带来极大收益，也给各级医疗机构、疾控中心等场景提供一个有力的、全面的、精准的筛查和诊断工具。其次其检测样本为全血或者血清、血浆，取材方便安全；肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、MP、CP的IgM抗体为现症感染指标，不存在假阳性问题，因此更加精准，对临床诊断价值非常大。
呼吸道细菌感染类型的确认，一般采用细菌培养等防范，耗时比较长。随着快速诊断技术的发展和应用，目前市场上检测呼吸道细菌感染的产品类型基本可以分为3大类：核酸诊断类(PCR法)、酶联免疫吸附法(ELISA法)和胶体金免疫层析法。PCR法准确度最高，是确诊的首选方法，但检测成本较高，检测时间较长；ELISA法是医院检验科和疾控系统实验室的经典方法；胶体金法速度最快、技术成熟稳、简便易行，适合于各级医疗机构、疾控中心等场合的普遍筛查和诊断。
胶体金免疫层析技术(gold immunochromatography assay，GICA)是一种将胶体金标记技术和蛋白质层析技术结合的以微孔滤膜为载体的固相膜免疫分析技术。胶体金免疫层析技术是一种常用的免疫层析检测方法，由于其操作简单、省时、制造成本较低、结果易判读等特点，非常适合于现场检测，广泛用于生物、医药、食品等领域。由于胶体金免疫层析技术是一步完成检测，因此检测过程的干扰因素较多，其灵敏度低是限制胶体金免疫层析应用范围的主要因素，传统的胶体金免疫层析技术的检测限高于ELISA等方法。
在胶体金免疫层析检测中，蛋白质固着于硝酸纤维素膜(NC膜)作为待测样本的捕获试剂。由于检测结果完全取决于捕获试剂在膜上达到良好的吸附效果，因此蛋白质在膜上均一、良好的吸附对胶体金检测结果非常重要。如果NC膜上结合的蛋白量不足或者蛋白结合力不够强，就会出现相当多的问题，在检测结果的检测线上非常明显。如果膜上结合的蛋白量太低，那么在结果中检测线显色较弱而且检测灵敏度降低。如果蛋白不能牢固的吸附于NC膜，那么在蛋白吸附于NC膜以前发生扩散，从而导致检测线较宽、显色较弱而不是鲜艳而清晰，使检测结果难以解释。在极端条件下，如果蛋白与NC膜的物理吸附作用太弱，流过的蛋白检测物和表面活性剂溶液可能将固着的蛋白从NC膜上洗掉，从而显示较宽或者根本不清晰的检测线，难以解释检测结果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法，解决了现有技术存在的NC膜吸附蛋白量不足、结合力不强的问题。本发明制备的肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、MP、CP的IgM抗体六合一定性联合检测装置，提高了对呼吸道疾病患者进行合理综合、全面判定，能够快速、准确进行呼吸道感染疾病的病情风险判断。
本发明采取的技术方案是：
一种呼吸道细菌联合检测装置，样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜和吸收垫分别粘贴在塑料板，所述免疫硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫胶体金玻璃纤维膜搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接；所述免疫硝酸纤维素膜上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、设置第四检测线T4、第五检测线T5、第六检测线T6和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有肺炎链球菌抗原，第二检测线T2上固相有流感嗜血杆菌抗原，第三检测线T3上固相有金黄色葡萄球菌抗原，第四检测线T4上固相有肺炎克雷伯杆菌抗原，第五检测线T5上固相有肺炎支原体抗原，第六检测线T6上固相有肺炎衣原体抗原，质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设置的第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、第四检测线T4、第五检测线T5和第六检测线T6分别设置在六条线上，并在每条线上分别设置质控线C。
一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有95-105ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10-12分钟后，待烧瓶中水即沸腾之时、开启转数控制开关，调至350-400rpm，并用注射器缓慢加入1ml 1％氯化金溶液，之后快速加入1％柠檬酸三钠溶液1-2ml，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥20-24h；
(b)氧化锌-壳聚糖-胶体金交联记抗人IgM抗体，取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1-2min后，再到超声波上超声20-30秒，然后再反应2-3小时，加BSA进行封闭24小时，封闭好后进行离心，速度为10000-12000r/min，20-25min，保留离心后的沉淀，待用；
(c)采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，1)N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为8000-12000g/mol。
本发明所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，2)纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5、100/8或100/10。
本发明所述步骤(c)所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为1％，BSA浓度为1％，pH为8.5。
本发明所述步骤(d)中聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
本发明所述步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液包括浓度为0.1mol/LTris-HCL液、浓度为1％牛血清白蛋白BSA、浓度为1％表面活性剂。
多巴胺(dopamine,DA)因其结合儿茶酚官能团和赖氨酸的氨基官能团，也被证明具有超强的黏附性能。DA在碱性溶液中可发生氧化自聚合，在材料表面形成具有超强黏性的聚多巴胺(PDA)层，从而实现在各种材料表面的超强黏附。PDA形成过程简单且不需要有机溶剂，仅需将材料浸入含DA的碱性Tris-Hcl缓冲液或其他碱性溶液中，即可在表面形成PDA层，因此，PDA被广泛应用于材料的表面改性。综上，聚多巴胺可以从电荷作用和疏水作用两方面来提高NC膜蛋白的包被效率。
甲壳素是地球上储量仅次于纤维素的可再生资源，壳聚糖是其脱乙酰基衍生物，由2-氨基2-脱氧-β-D-葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接形成的聚合物。由于壳聚糖具有良好的生物相容性、生物可降解性、广谱抗菌性、防腐性、无抗原性，以及可止血和促进伤口愈合等特殊功能，使得壳聚糖成为组织工程支架材料中最有应用前景的生物大分子之一。纳米氧化锌(ZnO)，白色六方晶系结晶或球形粒子，粒径小于100nm，平均粒径50nm，比表面积大于4m2/g。具有极高的化学活性及优异的催化性和光催化活性。本研究探讨了氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒对NC膜包被抗体的影响，先将划膜用的抗体先与氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒结合，封闭，离心纯化，去掉未结合的抗体，然后复溶到一定比例，然后划膜，这样一个氧化锌-壳聚糖-胶体金粒子可以结合多个抗体，从而增加了包被抗体效率，借助其更大的表面积增加抗体的包被效率，提高胶体金免疫层析实验的灵敏度。
为了提高胶体金免疫层析技术的灵敏度，我们通过对硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液进行了预处理，将包被NC的抗体与氧化锌-壳聚糖-胶体金结合，达到了提高试纸灵敏度的目的。
本发明的有益效果在于：
1、本发明的检测装置结构新颖，将肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原包被于硝酸纤维膜膜上，特异性强，既能同时检测标本中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的IgM抗体，又没有增加生产操作的复杂度。
2、免疫胶体金制备步骤中，通过配合合适的喷金缓冲液和样品垫处理液，可保证免疫胶体金释放完全，同时这样的结合方式，会使标记物与抗体牢牢吸附在一起，从而抗体或抗原不会从标记物表面脱落，提高标记效率及免疫层析方法学的稳定性、灵敏度和精准度；且同样的阈值下，还可降低胶体金的用量，节约成本。
3、本发明对硝酸纤维素膜进行聚多巴胺预处理，对包被硝酸纤维素膜的抗体进行了修饰，增加抗体的包被效率、提高吸附效果、蛋白分布更加均一，从而提高了免疫层析方法学的灵敏度、精准度和稳定性。
4、本发明的检测装置不需要任何特殊仪器设备，检测成本低。
5、本发明的检测装置操作简便，不需要专业人员操作。实用性强。
附图说明
图1是本发明的结构示意图；
图2是图1的A-A剖视图；
图3是图1的B-B剖视图；
图4是图1的C-C剖视图；
图5是图1的D-D剖视图；
图6是图1的E-E剖视图；
图7是图1的F-F剖视图。
具体实施方式
如图1～7所示，一种呼吸道细菌联合检测装置，样品垫1、免疫胶体金玻璃纤维膜2、免疫硝酸纤维素膜3和吸收垫4分别粘贴在塑料板5，所述免疫硝酸纤维素膜3的两端分别与吸收垫4、免疫胶体金玻璃纤维膜2搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜2的另一端与样品垫1搭接；所述免疫硝酸纤维素膜3上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、设置第四检测线T4、第五检测线T5、第六检测线T6和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有肺炎链球菌抗原，第二检测线T2上固相有流感嗜血杆菌抗原，第三检测线T3上固相有金黄色葡萄球菌抗原，第四检测线T4上固相有肺炎克雷伯杆菌抗原，第五检测线T5上固相有肺炎支原体抗原，第六检测线T6上固相有肺炎衣原体抗原，质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜3上设置的第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、第四检测线T4、第五检测线T5和第六检测线T6分别设置在六条线上，并在每条线上分别设置质控线C。
实施例1
包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为8000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖3.6g，产率90％；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊，继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有95ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10分钟后，待烧瓶中水即沸腾之时、开启转数控制开关，调至350rpm，并用注射器缓慢加入1ml 1％氯化金溶液，之后快速加入1％柠檬酸三钠溶液1ml，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥20h；
(b)氧化锌-壳聚糖-胶体金交联记抗人IgM抗体，取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应2小时，加BSA进行封闭24小时，封闭好后进行离心，速度为10000r/min，20min，保留离心后的沉淀，待用；
(c)采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为1％，BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜3；其中所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用，将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
(e)将预处理的样品垫1、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜2、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜3、吸水纸4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳；所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液包括浓度为0.1mol/LTris-HCL液、浓度为1％牛血清白蛋白BSA、浓度为1％表面活性剂。
实施例2
包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至11，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，透析膜截取分子量为10000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/8，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有100ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热11分钟后，待烧瓶中水即沸腾之时、开启转数控制开关，调至380rpm，并用注射器缓慢加入1ml 1％氯化金溶液，之后快速加入1％柠檬酸三钠溶液1.5ml，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥22h；
(b)氧化锌-壳聚糖-胶体金交联记抗人IgM抗体，取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1.5min后，再到超声波上超声25秒，然后再反应2.5小时，加BSA进行封闭24小时，封闭好后进行离心，速度为11000r/min，23min，保留离心后的沉淀，待用；
(c)采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为1％，BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜3；其中所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用，将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
(e)将预处理的样品垫1、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜2、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜3、吸水纸4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳；所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液包括浓度为0.1mol/LTris-HCL液、浓度为1％牛血清白蛋白BSA、浓度为1％表面活性剂。
实施例3
包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析,透析膜截取分子量为12000g/mol，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL新配制的5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，使得N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/10，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有105ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热12分钟后，待烧瓶中水即沸腾之时、开启转数控制开关，调至400rpm，并用注射器缓慢加入1ml 1％氯化金溶液，之后快速加入1％柠檬酸三钠溶液2ml，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥24h；
(b)氧化锌-壳聚糖-胶体金交联记抗人IgM抗体，取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应2min后，再到超声波上超声30秒，然后再反应3小时，加BSA进行封闭24小时，封闭好后进行离心，速度为12000r/min，25min，保留离心后的沉淀，待用；
(c)采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜2；
所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为1％，BSA浓度为1％，pH为8.5；
(d)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜3；其中所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用，将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥；
(e)将预处理的样品垫1、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜2、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜3、吸水纸4依次粘贴在塑料板5上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳；所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液包括浓度为0.1mol/LTris-HCL液、浓度为1％牛血清白蛋白BSA、浓度为1％表面活性剂。
下边通过实验例来进一步说明本发明。
实验例1聚多巴胺处理液对硝酸纤维素膜抗体吸附能力的比较
1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司，聚多巴胺购自Sigma公司
2硝酸纤维素膜处理方法
2.1配制聚多巴胺处理液
配制聚多巴胺处理液：聚多巴胺由蒸馏水配置成浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
2.2硝酸纤维素膜处理方法
将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
3实验方法
分别将未处理和已处理过的硝酸纤维素膜按照上述实施例工艺流程制备肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、肺炎支原体、肺炎衣原体的IgM联合检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较硝酸纤维素膜未处理和处理后吸附力和稳定性指标差异。
4结果:
4.1蛋白吸附力比较
取聚多巴胺处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表1。结果显示，处理后的硝酸纤维素膜在溶液浸润性方面要明显优于未处理膜，处理后膜阳性条带颜色略深，尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。聚多巴胺组吸附效果明显优于未处理组。
表1硝酸纤维素膜吸附能力比较
Figure BDA0003600061260000131
4.2硝酸纤维素膜稳定性比较
取聚多巴胺处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断处理后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表2。表2结果与表1结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表2硝酸纤维素膜加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600061260000132
实验例2氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒修饰抗人IgM抗体
1材料与方法
1.1材料：硝酸纤维素膜，孔径4.5um，购自美国通用电气公司
1.2氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒修饰抗人IgM抗体以氧化锌-壳聚糖-胶体金作为载体，取200μL氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒(1mg/mL)溶液和25μ抗人IgM抗体(40μmol/L)溶液加入到超纯水中，使最终反应体系1mL。充分混匀后，设置摇床温度为25℃，转速为200r/m条件下，将上述混合溶液在摇床内避光震荡培养2h。反应后的混合溶液用超速离心机在13 000r/m转速条件下，使用超纯水彻底离心洗涤4次，去除上清液中过量的未反应的抗体。所得沉淀物即为氧化锌-壳聚糖-胶体金-抗人IgM抗体探针复合物，用超纯水将其定容至1mL并在4℃条件储存。
2实验方法
分别将氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒修饰的抗人IgM抗体与未修饰的抗人IgM抗体按照上述实施例工艺流程制备检测试纸，测试流程参照试纸说明书，比较氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒处理和未处理对蛋白吸附力和稳定性指标差异。
3结果
3.1蛋白吸附力比较
取氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒处理组和未处理组试纸，分别加入待检样品，通过观察显色情况判断处理后膜对蛋白吸附能力，结果见表3。结果显示，氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒修饰组膜尤其在浓度较低时，提高了反应的灵敏度，表明蛋白吸附能力明显增强，提高了反应灵敏度。
表3氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒修饰对蛋白吸附能力比较
Figure BDA0003600061260000141
3.2稳定性比较
取氧化锌-壳聚糖-胶体金纳米颗粒处理组和未处理组试纸，通过37℃加速实验观察显色情况来判断氧化锌-壳聚糖-胶体金修饰后硝酸纤维素膜上吸附蛋白的稳定性，结果见表4。表4结果与表3结果比较发现，处理后硝酸纤维素膜颜色变化与10天前基本一致，稳定性好。
表4加速稳定性比较(37℃放置10天)
Figure BDA0003600061260000151
实验例3：一种呼吸道细菌联合检测装置在实际应用于临床标本中检测能力研究
1研究对象一般资料
此次临床试验吉林省中医药科学院第一临床医院、吉林省人民医院共入选334例病人的血清，对血样进行检测，并且其中任一一检测线阳性率至少达到30％。所有入选样本均完成了试验，这些数量的样本有足够的统计学意义来评价本检测试纸血清检测结果与对照试纸检测的一致性。
1.2肺炎链球菌IgM测定结果的一致性分析
在血清的肺炎链球菌IgM定性检测过程中，试验试剂与对照试剂的均为阳性的有133例；试验试剂阳性，对照试剂阴性的有3例；试验试剂阴性，对照试剂阳性的0例；试验试剂与对照试剂均为阴性的有198例；采用McNemar检验，P＝0.2500，P＞0.05，组间差异无统计学意义。Kappa检验系数为0.95，大于0.75，表示一致性较好。试验试剂阳性一致例数为133例，符合率为97.8％，阴性一致例数为298例，符合率为100.00％，试验试剂的整体一致例数为331例，整体符合率为99.10％。表示试验试剂与对照试剂的检测结果的组间差异无统计学意义，一致性较好。结果见表5、6：
表5两种试剂肺炎链球菌IgM抗体定性测定结果
Figure BDA0003600061260000161
表6考核试剂相对于参比试剂的符合率
Figure BDA0003600061260000162
3流感嗜血杆菌IgM测定结果的一致性分析
在血清的流感嗜血杆菌IgM定性检测过程中，试验试剂与对照试剂的均为阳性的有134例；试验试剂阳性，对照试剂阴性的有2例；试验试剂阴性，对照试剂阳性的1例；试验试剂与对照试剂均为阴性的有197例；采用McNemar检验，P＝1，P＞0.05，组间差异无统计学意义。Kappa检验系数为0.95，大于0.75，表示一致性较好。试验试剂阳性一致例数为134例，符合率为98.5％，阴性一致例数为197例，符合率为99.995％，试验试剂的整体一致例数为331例，整体符合率为99.10％。表示试验试剂与对照试剂的检测结果的组间差异无统计学意义，一致性较好。结果见表7、8；
表7两种试剂流感嗜血杆菌IgM抗体定性测定结果
Figure BDA0003600061260000171
表8考核试剂相对于参比试剂的符合率
Figure BDA0003600061260000172
4金黄色葡萄球菌IgM测定结果的一致性分析
在血清的金黄色葡萄球菌IgM定性检测过程中，试验试剂与对照试剂的均为阳性的有153例；试验试剂阳性，对照试剂阴性的有1例；试验试剂阴性，对照试剂阳性的0例；试验试剂与对照试剂均为阴性的有180例；P＝1，P＞0.05，组间差异无统计学意义。Kappa检验系数为0.86，大于0.75，表示一致性较好。试验试剂阳性一致例数为153例，符合率为99.35％，阴性一致例数为180例，符合率为100％，试验试剂的整体一致例数为333例，整体符合率为99.70％。表示试验试剂与对照试剂的检测结果的组间差异无统计学意义，一致性较好。结果见表9、10；
表9两种试剂金黄色葡萄球菌IgM抗体定性测定结果
Figure BDA0003600061260000181
表10考核试剂相对于参比试剂的符合率
Figure BDA0003600061260000182
5肺炎克雷伯杆菌IgM测定结果的一致性分析
在血清的肺炎克雷伯杆菌IgM抗体定性检测过程中，试验试剂与对照试剂的均为阳性的有183例；试验试剂阳性，对照试剂阴性的有4例；试验试剂阴性，对照试剂阳性的2例；试验试剂与对照试剂均为阴性的有145例；采用McNemar检验，P＝0.6875，P＞0.05，组间差异无统计学意义。Kappa检验系数为1，大于0.75，结果表示试验试剂与对照试剂的一致性较好。试验试剂阳性一致例数为183例，符合率为97.3％，阴性一致例数为145例，符合率为98.7％，试验试剂的整体一致例数为328例，整体符合率为98.20％。结果表示试验试剂与对照试剂的检测结果的组间差异无统计学意义，一致性较好。结果见表11、12；
表11两种试剂肺炎克雷伯杆菌IgM抗体定性测定结果
Figure BDA0003600061260000191
表12考核试剂相对于参比试剂的符合率
Figure BDA0003600061260000192
6人类肺炎支原体(MP)IgM测定结果的一致性分析
在血清的人类肺炎支原体(MP)IgM抗体定性检测过程中，试验试剂与对照试剂的均为阳性的有162例；试验试剂阳性，对照试剂阴性的有0例；试验试剂阴性，对照试剂阳性的0例；试验试剂与对照试剂均为阴性的有172例；采用McNemar检验，P＝1，P＞0.05，组间差异无统计学意义。Kappa检验系数为1，大于0.75，结果表示试验试剂与对照试剂的一致性较好。试验试剂阳性一致例数为162例，符合率为100％，阴性一致例数为172例，符合率为100％，试验试剂的整体一致例数为334例，整体符合率为100％。表示试验试剂与对照试剂的检测结果的组间差异无统计学意义，一致性较好。结果见表13、14；
表13两种试剂人类肺炎支原体(MP)IgM抗体定性测定结果
Figure BDA0003600061260000201
表14考核试剂相对于参比试剂的符合率
Figure BDA0003600061260000202
7人类肺炎衣原体(CP)IgM测定结果的一致性分析
在血清的人类肺炎衣原体(CP)IgM抗体定性检测过程中，试验试剂与对照试剂的均为阳性的有195例；试验试剂阳性，对照试剂阴性的有1例；试验试剂阴性，对照试剂阳性的1例；试验试剂与对照试剂均为阴性的有137例；P＝1，P＞0.05，组间差异无统计学意义。Kappa检验系数为1，大于0.75，结果表示试验试剂与对照试剂的一致性较好。试验试剂阳性一致例数为195例，符合率为99.5％，阴性一致例数为137例，符合率为99.3％，试验试剂的整体一致例数为332例，整体符合率为99.4％。结果表示试验试剂与对照试剂的检测结果的组间差异无统计学意义，一致性较好。结果见表15、16；
表15两种试剂人类肺炎衣原体(CP)IgM抗体定性测定结果
Figure BDA0003600061260000211
表16考核试剂相对于参比试剂的符合率
Figure BDA0003600061260000212
以上所述仅为本发明的优选实例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡对本发明所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种呼吸道细菌联合检测装置，其特征在于：样品垫、免疫胶体金玻璃纤维膜、免疫硝酸纤维素膜和吸收垫分别粘贴在塑料板，所述免疫硝酸纤维素膜的两端分别与吸收垫、免疫胶体金玻璃纤维膜搭接，所述免疫胶体金玻璃纤维膜的另一端与样品垫搭接；所述免疫硝酸纤维素膜上设置第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、设置第四检测线T4、第五检测线T5、第六检测线T6和质控线C；所述的第一检测线T1上固相有肺炎链球菌抗原，第二检测线T2上固相有流感嗜血杆菌抗原，第三检测线T3上固相有金黄色葡萄球菌抗原，第四检测线T4上固相有肺炎克雷伯杆菌抗原，第五检测线T5上固相有肺炎支原体抗原，第六检测线T6上固相有肺炎衣原体抗原，质控线C上喷点羊抗鼠IgG多克隆抗体，所述免疫硝酸纤维素膜上设置的第一检测线T1、第二检测线T2、第三检测线T3、第四检测线T4、第五检测线T5和第六检测线T6分别设置在六条线上，并在每条线上分别设置质控线C。
2.一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于，包括下列步骤：
(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备
1)N-羧乙基壳聚糖的合成：将4.0g壳聚糖加入到含有2.80mL丙烯酸的200mL水中，在50℃下，持续搅拌2天，反应完成后，在反应混合液中加入1mol/L的NaOH溶液，调节溶液的pH值至10-12，使其所有的羧酸全部转化为钠盐，将混合溶液倒入到丙酮中进行重沉淀，然后在水溶液中透析，除去未反应的丙烯酸，透析两天后，冷冻干燥得到N-羧乙基壳聚糖；
2)纳米氧化锌颗粒制备：称取1.3225gZnAc2·2H2O溶解在20mL的蒸馏水中,缓慢滴加9mL 5mol/L的NaOH溶液，溶液先出现白色浑浊,继续滴加则浑浊完全消失，再加入11mL的蒸馏水，搅拌均匀，然后倒入低压反应釜中，将反应釜放入烘箱中，在170℃下加热12个小时，自然冷却至室温后,得到沉淀后，分别用水和乙醇清洗、离心两次，将沉淀放入烘箱内于60℃烘干备用；
3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备：将5.00gN-羧乙基壳聚糖加入到300mL去离子水中，在室温下剧烈搅拌0.5h，充分溶解得到水溶性壳聚糖溶液，将上述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌按一定的比例混合，将混合液剧烈搅拌3h，使其混合均匀；
4)胶体金的制备：
将装有95-105ml纯化水的圆底烧瓶放入电热套指定位置加热，接通电热套电源，加热10-12分钟后，待烧瓶中水即沸腾之时、开启转数控制开关，调至350-400rpm，并用注射器缓慢加入1ml 1％氯化金溶液，之后快速加入1％柠檬酸三钠溶液1-2ml，待溶液冷却到室温后，加水称重补足重量；
5)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备：以苯二甲醛作为交联剂，在常温下进行交联；交联结束，将所得的氧化锌-壳聚糖-胶体金洗涤，真空干燥20-24h；
(b)氧化锌-壳聚糖-胶体金交联记抗人IgM抗体，取1ml氧化锌-壳聚糖-胶体金悬浮液，超声分散均匀，然后边搅拌边滴加抗体，加入抗体后，反应1-2min后，再到超声波上超声20-30秒，然后再反应2-3小时，加BSA进行封闭24小时，封闭好后进行离心，速度为10000-12000r/min，20-25min，保留离心后的沉淀，待用；
(c)采用胶体金抗体缓冲液分别稀释步骤(b)离心后的沉淀氧化锌-壳聚糖-胶体金抗体，使其分散均匀，分别获得免疫胶体金抗体溶液，分别用免疫胶体金抗体溶液喷涂于玻璃纤维垫，制得免疫胶体金抗体玻璃纤维膜；
(d)将硝酸纤维素膜用聚多巴胺处理液预处理后，喷点肺炎链球菌抗原、流感嗜血杆菌抗原、金黄色葡萄球菌抗原、肺炎克雷伯杆菌抗原、肺炎支原体抗原、肺炎衣原体抗原作为检测线，喷点羊抗鼠IgG抗体作为质控线，制得免疫硝酸纤维素膜；
(e)将预处理的样品垫、步骤(c)制备的免疫胶体金玻璃纤维膜、步骤(d)制备的免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在塑料板上，切裁制得检测试剂条，最后将检测试剂条装入塑料外壳。
3.根据权利要求2所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，1)N-羧乙基壳聚糖的合成，在水溶液中透析时，采用的透析膜截取分子量为8000-12000g/mol。
4.根据权利要求2所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，2)纳米氧化锌颗粒制备，缓慢滴加9mL5mol/L的NaOH溶液，该NaOH溶液为新配制的溶液。
5.根据权利要求2所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(a)氧化锌-壳聚糖-胶体金制备中，3)N-羧乙基壳聚糖与纳米氧化锌混合溶液的制备，所述水溶性壳聚糖溶液和纳米氧化锌的混合比例是，N-羧乙基壳聚糖与氧化锌的质量之比为100/5、100/8或100/10。
6.根据权利要求2所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(c)所述的胶体金抗体缓冲液包括：浓度为20mM Tris-HCL液、蔗糖浓度为5％、海藻糖浓度为1％、proclin浓度为1％，BSA浓度为1％，pH为8.5。
7.根据权利要求2所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(d)中聚多巴胺处理液预处理硝酸纤维素膜：将硝酸纤维素膜放入聚多巴胺处理液中浸泡1h，并慢速振荡摇晃，取出后用蒸馏水清洗3遍，最后在真空干燥箱中干燥。
8.根据权利要求7所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述的聚多巴胺处理液，聚多巴胺浓度为1％，经0.22μm滤膜过滤，备用。
9.根据权利要求2所述的一种呼吸道细菌联合检测装置的制备方法，其特征在于：所述步骤(e)所述的预处理的样品垫采用的样品垫处理液包括浓度为0.1mol/LTris-HCL液、浓度为1％牛血清白蛋白BSA、浓度为1％表面活性剂。
CN202210402234.3A 2022-04-17 2022-04-17 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法 Active CN115015542B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210402234.3A CN115015542B (zh) 2022-04-17 2022-04-17 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210402234.3A CN115015542B (zh) 2022-04-17 2022-04-17 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN115015542A true CN115015542A (zh) 2022-09-06
CN115015542B CN115015542B (zh) 2023-02-28

Family

ID=83067104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210402234.3A Active CN115015542B (zh) 2022-04-17 2022-04-17 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115015542B (zh)

Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007068310A1 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 The Jordanian Pharmaceutical Manufacturing Co. Device for the early and rapid immunochromatographic detection of hiv and uses thereof
EP1947458A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-23 The Jordanian Pharmaceutical Manufacturing Co. Ltd. Using colour conjugated chitosan and chitosan oligo-saccharides in the manufacture of a lateral-flow test device
US20100330025A1 (en) * 2002-07-19 2010-12-30 Northwestern University Surface Independent, Surface-Modifying, Multifunctional Coatings and Applications Thereof
CN102430392A (zh) * 2011-09-14 2012-05-02 江苏益通生物科技有限公司 一种复合纳米胶体金壳聚糖免疫载体及其制备方法
WO2014056896A2 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg One-step biomolecular immobilisation procedure and products thereof
WO2016156939A1 (en) * 2015-03-27 2016-10-06 Uniwersytet Jagielloński Composite containing chitosan and zinc oxide nanoparticles and a process for its preparation
GB201709827D0 (en) * 2017-06-20 2017-08-02 Tripod Tech Corp Method of making colloidal metal nanoparticles
WO2017132319A2 (en) * 2016-01-27 2017-08-03 Regents Of The University Of Minnesota Methods of attaching probes to microorganisms and methods of use thereof
CN109265757A (zh) * 2018-08-30 2019-01-25 暨南大学 一种纳米氧化锌/壳聚糖复合微球及其制备方法和应用
CN111638372A (zh) * 2020-04-30 2020-09-08 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 一种心肌标志物的联合检测装置及其制备方法
CN112345753A (zh) * 2020-10-30 2021-02-09 江西维邦生物科技有限公司 一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条
CN112444544A (zh) * 2019-08-28 2021-03-05 华南理工大学 一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器及其制备方法与应用
US20210164970A1 (en) * 2016-08-31 2021-06-03 Board Of Trustees Of Michigan State Universtiy Functionalized magnetic particle compositions and related methods
CN113702643A (zh) * 2021-07-12 2021-11-26 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置

Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100330025A1 (en) * 2002-07-19 2010-12-30 Northwestern University Surface Independent, Surface-Modifying, Multifunctional Coatings and Applications Thereof
WO2007068310A1 (en) * 2005-12-14 2007-06-21 The Jordanian Pharmaceutical Manufacturing Co. Device for the early and rapid immunochromatographic detection of hiv and uses thereof
EP1947458A1 (en) * 2007-01-17 2008-07-23 The Jordanian Pharmaceutical Manufacturing Co. Ltd. Using colour conjugated chitosan and chitosan oligo-saccharides in the manufacture of a lateral-flow test device
CN102430392A (zh) * 2011-09-14 2012-05-02 江苏益通生物科技有限公司 一种复合纳米胶体金壳聚糖免疫载体及其制备方法
WO2014056896A2 (en) * 2012-10-08 2014-04-17 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg One-step biomolecular immobilisation procedure and products thereof
WO2016156939A1 (en) * 2015-03-27 2016-10-06 Uniwersytet Jagielloński Composite containing chitosan and zinc oxide nanoparticles and a process for its preparation
WO2017132319A2 (en) * 2016-01-27 2017-08-03 Regents Of The University Of Minnesota Methods of attaching probes to microorganisms and methods of use thereof
US20210164970A1 (en) * 2016-08-31 2021-06-03 Board Of Trustees Of Michigan State Universtiy Functionalized magnetic particle compositions and related methods
GB201709827D0 (en) * 2017-06-20 2017-08-02 Tripod Tech Corp Method of making colloidal metal nanoparticles
CN109265757A (zh) * 2018-08-30 2019-01-25 暨南大学 一种纳米氧化锌/壳聚糖复合微球及其制备方法和应用
CN112444544A (zh) * 2019-08-28 2021-03-05 华南理工大学 一种基于羧基化纳米氧化锌的甘油酶生物传感器及其制备方法与应用
CN111638372A (zh) * 2020-04-30 2020-09-08 吉林省格瑞斯特生物技术有限公司 一种心肌标志物的联合检测装置及其制备方法
CN112345753A (zh) * 2020-10-30 2021-02-09 江西维邦生物科技有限公司 一种以聚多巴胺包菊花金纳米粒子为信标载体制备的免疫层析试纸条
CN113702643A (zh) * 2021-07-12 2021-11-26 杭州奥泰生物技术股份有限公司 一种联合检测新型冠状病毒中和抗体及核衣壳蛋白抗体的装置

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
陶满兰等: "氧化锌纳米簇-金纳米颗粒-壳聚糖复合膜修饰电极用于示差脉冲伏安法测定吗啡", 《理化检验(化学分册)》 *
黄小梅等: "基于氧化锌-壳聚糖-纳米金复合杂化膜修饰的过氧化氢生物传感器的研究", 《重庆文理学院学报(自然科学版)》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN115015542B (zh) 2023-02-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105548538B (zh) 柯萨奇病毒A16和肠道病毒71的IgM抗体联合检测装置及制法
EP0089938B1 (en) Compositions for therapeutic or diagnostic use containing oligosaccharides
CN111089962A (zh) 联合检测新型冠状病毒IgM/IgG抗体的胶体金试剂盒及制备方法
WO2023202271A1 (zh) 一种多项病原体联合检测装置及其制备方法
CN106018800B (zh) 一种布鲁氏菌感染的检测装置
CN1214816C (zh) 使用纯化的抗原特异性抗体快速检测肺炎链球菌的体外方法和材料
CA2342141C (en) Method for detection of legionella bacteria employing purified antigen-specific antibodies
Zawaneh et al. Factors influencing adherence of group B streptococci to human vaginal epithelial cells
CN109709319A (zh) 一种沙门氏菌免疫磁珠的制备方法
CN115015542B (zh) 一种呼吸道细菌联合检测装置及其制备方法
Knutton et al. Ultrastructural study of adherence to and penetration of cultured cells by two invasive Escherichia coli strains isolated from infants with enteritis
CN109342740A (zh) 一种检测人幽门螺旋杆菌抗体的荧光免疫层析试剂盒及其制备方法
CN105866434B (zh) 一种九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测用免疫层析试剂盒及其制备方法
JP5302993B2 (ja) 標的細菌またはその標的糖質抗原成分の存在を検出する方法
WO2024066037A1 (zh) 一种幽门螺旋杆菌抗体检测用抗原、试剂盒及其制备方法
CN1279358C (zh) 一种检测布鲁氏菌感染的免疫层析试纸及其制备方法
CN105753982B (zh) 抗人肺炎链球菌fam1家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒
CN106916809A (zh) 败血症中革兰氏阴性病原菌分离的新方法
CN1866015B (zh) 检测鹦鹉热衣原体感染的免疫层析试纸及其制备方法
CN1282877C (zh) 一种检测类鼻疽菌感染的免疫层析试纸及其制备方法
CN113817032A (zh) 一种检测抗肺炎支原体抗体的天然抗原p1及其制备方法和应用
CN112394051A (zh) 一种利用荧光微纳米马达检测毒素的方法
CN110501493A (zh) 一种人副流感病毒3型IgM抗体的检测试剂盒
CN219434850U (zh) 沙眼衣原体与淋病奈瑟菌联检的试纸条、检测卡及试剂盒
CN1632586A (zh) 一种检测土拉菌感染的免疫层析试纸及其制备方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant